利用rna－蛋白融合體篩選蛋白的制作方法

專利名稱：利用rna－蛋白融合體篩選蛋白的制作方法
背景技術：
本發明涉及蛋白篩選方法。
本發明的完成得到了政府的支持，授權號為F32 GM17776-01和F32 GM17776-02。政府擁有對本發明的某些權利。
現在已經存在根據其功能提取RNA和DNA分子的方法。例如，Ellington和Szostak(自然346818(1990)；和自然355850(1992))和Tuerk和Gold(科學249505(1990)；和分子生物學雜志222739(1991))的實驗業已證實，通過反復篩選和擴增可以從復雜的分子庫中提取到極少的(即少于1/1013)具有所需特性的核酸分子。與傳統遺傳學篩選方法相比，上述方法的優點是(i)可以篩選極大的候選庫(＞1015)，(ii)與宿主生活力和體內條件無關，和(iii)即使不存在體內遺傳學篩選，也可以進行篩選。業已證實了所述方法在體外篩選特定的新型RNA和DNA序列的能力，所述新型RNA和DNA序列具有非常特異的蛋白結合功能(例如，參見Tuerk和Gold科學249505(1990)；Irvine等，分子生物學雜志222739(1991)；Oliphant等，分子細胞生物學92944(1989)；Blackwell等，科學2501104(1990)；Pollock和Treisman，核酸研究186197(1990)；Thiesen和Bach，核酸研究183203(1990)；Bartel等，細胞57529(1991)；Stormo和Yoshioka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885699(1991)；和Bock等，自然355564(1992))，小分子結合功能(Ellington和Szostak，自然346818(1990)；Ellington和Szostak，自然355850(1992))，和催化功能(Green等，自然347406(1990)；Robertson和Joyce，自然，34467(1990)；Beaudry和Joyce，科學257635(1992)；Bartel和Szostak，科學2611411(1993)；Lorsch和Szostak，自然37131-36(1994)；Cuenoud和Szostak，自然375611-614(1995)；Chapman和Szostak，化學和生物學2325-333(1995)和Lohse和Szostak，自然381442-444(1996))。用于篩選和擴增蛋白的類似方法尚未得到證實。
發明概述本發明的目的是，將所述體外篩選和體外進化的原理應用于蛋白。本發明有利于從由部分或完全隨機的氨基酸序列組成的大的庫中提取具有所需特性的蛋白。另外，本發明通過將所述mRNA編碼序列共價連接到所述蛋白分子上解決了回收和擴增所需蛋白序列信息的問題。
一般，本發明的方法包括體外或原位轉錄/翻譯方案，該方法能制備與其自身的mRNA 3’端共價連接的蛋白，即RNA-蛋白融合體。這一目的是通過合成和體外或原位翻譯在其3’末端結合有肽受體的mRNA分子而實現的。一種優選的肽受體是嘌呤霉素，一種加在生長肽鏈C-末端并終止翻譯的核苷酸類似物。在一種優選設計中，在所述信使和肽受體之間包括一個DNA序列，將該序列設計成導致核糖體停留在開放讀框的末端，以便在所述肽基-tRNA鍵水解之前提供用于所述肽受體(例如，嘌呤霉素)接受新生肽鏈的額外時間。
如果需要，可以對所得到的RNA-蛋白融合體進行反復地篩選和擴增，因為可以通過逆轉錄和擴增(例如，通過PCR擴增以及任何其它擴增技術，包括基于RNA的擴增技術，如3SR或TSA)回收所述蛋白序列信息。然后可以對擴增的核酸進行轉錄、修飾、以及體外或原位翻譯，以產生用于下一輪篩選的mRNA-蛋白融合體。所述進行多個輪次的篩選和擴增的能力可以富集和提取極其罕見的分子，例如，從由1015個成員組成的庫中篩選出一個需要的分子。這樣又可以提取新的或改進的蛋白，該蛋白實際上能特異識別所有目標，或能催化所需要的化學反應。
因此，第一方面，本發明的特征是一種用于篩選需要的蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一群候選RNA分子，每一個分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于一個候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；和(c)篩選所需要的RNA-蛋白融合體，從而篩選所需要的蛋白。
因此，在一個相關的方面，本發明的特征是一種用于篩選編碼一種需要的蛋白的DNA分子的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一群候選RNA分子，每一個分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于一個候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；(c)篩選所需要的RNA-蛋白融合體；和(d)由所述融合體的RNA部分制備一種編碼所需要的蛋白的DNA分子。
因此，在另一個相關方面，本發明的特征是一種用于篩選相對參考蛋白而言具有改變了的功能的蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)由一群DNA模板產生一群候選RNA分子，所述候選DNA模板各有一個不同于所述參考蛋白編碼序列的候選蛋白編碼序列，所述RNA分子各自包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于所述候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且各自在其3’末端可操作地連接一個肽受體；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；和(c)篩選具有改變了的功能的RNA-蛋白融合體，從而篩選具有改變了的功能的蛋白。
在另一個相關方面，本發明的特征是一種用于篩選編碼一種相對參考蛋白而言具有改變了的功能的蛋白的DNA分子的方法，該方法包括以下步驟(a)由一群候選DNA模板產生一群候選RNA分子，所述候選DNA模板各自具有不同于所述參考蛋白編碼序列的候選蛋白編碼序列，所述RNA分子各自包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于所述候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且各自在其3’末端可操作地連接一個肽受體；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；(c)篩選具有改變了的功能的RNA-蛋白融合體；和(d)由所述融合體的RNA部分制備一種編碼具有改變了的功能的蛋白的DNA分子。
在另一個相關方面，本發明的特征是一種用于篩選需要的RNA的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一群候選RNA分子，其中的每一個RNA分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于所述候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；和(c)篩選所需要的RNA-蛋白融合體，從而篩選所需要的RNA。
在上述方法的優選實施方案中，所述肽受體是嘌呤霉素；所述每一個候選RNA分子還包括間歇序列(pause sequence)或還包括一個共價結合于所述RNA的3’末端的DNA或DNA類似物序列；所述候選RNA分子群體至少包括109，優選至少1010，更優選至少1011、1012或1013，以及最優選至少1014個不同的RNA分子；所述體外翻譯是在用真核細胞或其部分制備的裂解物中進行的(而且，可以是，例如，在網織紅細胞裂解物或小麥胚裂解物中進行的)；所述體外翻譯反應是在由原核細胞(例如，大腸桿菌)或其部分制備的提取物中進行的；所述篩選步驟包括將所需要的蛋白結合在一種固定化的結合配偶體上；所述篩選步驟包括測定所述需要的蛋白的功能活性；所述DNA分子被擴增；所述方法還包括重復上述篩選方法的步驟；所述方法還包括由所述DNA分子轉錄RNA分子，并重復步驟(a)-(d)；在所述體外翻譯步驟之后，該方法還包括一個在有50-100mM Mg2+的條件下進行的溫育步驟；而且，所述RNA-蛋白融合體還包括一個靠近所述肽受體的核酸或核酸類似物序列，它能提高其柔性。
在另一個相關方面，本發明的特征是通過本發明任一種方法篩選的RNA-蛋白融合體；一個通過酰胺鍵共價連接于一個氨基酸序列上的核糖核酸，所述氨基酸序列是由所述核糖核酸編碼的；以及一個包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于候選蛋白編碼序列上的起始密碼子的核糖核酸，所述核糖核酸通過所述候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接于一種肽受體(例如嘌呤霉素)上。
第二方面，本發明的特征是一種用于通過富集一種序列庫篩選需要的蛋白或需要的RNA的方法。該方法包括以下步驟(a)提供一群候選RNA分子，其中的每一個RNA分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于一個候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且各自通過所述候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接于一個肽受體上；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；(c)讓所述RNA-蛋白融合體群體與一種對所述RNA-蛋白融合體的RNA部分或蛋白部分專一的結合配偶體接觸，接觸條件為基本上能將所述結合配偶體-RNA-蛋白融合體的復合體與所述群體的未結合的成員分離；(d)從所述復合體上釋放出結合的RNA-蛋白融合體；和(e)讓來自步驟(d)的RNA-蛋白融合體群體與一種對所需要的RNA-蛋白融合體的蛋白部分具有專一性的結合配偶體接觸，接觸條件為基本上能將所述結合配偶體-RNA-蛋白融合體的復合體與所述群體的未結合的成員分離，從而篩選需要的蛋白和需要的RNA。
在優選實施方案中，所述方法還包括重復步驟(a)-(e)。另外，在重復進行以上步驟時，可以任何順序使用相同或不同的結合配偶體，以便選擇性地富集需要的RNA-蛋白融合體。在另一種優選實施方案中，步驟(d)涉及使用對所述需要的融合體的蛋白部分具有專一性的結合配偶體(例如，單克隆抗體)。該步驟優選在對所述融合體的RNA部分進行逆轉錄之后進行，以制備一種能編碼所需要的蛋白的DNA。如果需要，可以提取該DNA和/或進行PCR擴增。可將這種富集技術用于篩選需要的蛋白或用于篩選相對參考蛋白而言具有改變了的功能的蛋白。
在富集方法的其它優選實施方案中，所述肽受體是嘌呤霉素；所述每一個候選RNA分子還包括間歇序列或還包括一個共價結合于所述RNA的3’末端的DNA或DNA類似物序列；所述候選RNA分子群體至少包括109，優選至少1010，更優選至少1011、1012或1013，以及最優選至少1014個不同的RNA分子；所述體外翻譯是在用真核細胞或其部分制備的裂解物中進行的(而且，可以是，例如，在網織紅細胞裂解物或小麥胚裂解物中進行的)；所述體外翻譯反應是在由原核細胞(例如，大腸桿菌)或其部分制備的提取物中進行的；擴增所述DNA分子；將所述結合配偶體的至少一種固定在一種固體支持物上；在所述體外翻譯步驟之后，所述方法還包括一個在有50-100mM Mg2+的條件下進行的溫育步驟；而且，所述RNA-蛋白融合體還包括一個靠近所述肽受體的核酸或核酸類似物序列，它能提高其柔性。
在一個相關方面，本發明的特征是用于實施本文所披露的任一種篩選方法的試劑盒。
在第三方面，也是最后一個方面，本發明的特征是一種小嵌片，該嵌片包括一系列固定化的單鏈核酸，所述核酸能與RNA-蛋白融合體雜交。優選地，所述RNA-蛋白融合體的蛋白成分是由所述RNA編碼的。
在本文中，“群體”是指一個以上的分子(例如，一個以上的RNA、DNA、或RNA-蛋白融合體分子)。因為本發明的方法有利于在必要時由大量的候選分子開始篩選，本發明的“群體”優選是指109以上的分子，更優選1011、1012或1013以上的分子，最優選1013以上的分子。
“篩選”是指將一種分子從一個群體中的其它分子中基本上分離出來。在本文中，在經過一個篩選步驟之后，該“篩選”步驟能使所需要的分子相對一個群體中不需要的分子富集2倍，優選30倍，更優選100倍，最優選1000倍。正如本文所述的，篩選步驟可以重復進行任意的次數，而且，在一種特定的方法中可以進行不同類型篩選步驟的組合。
“蛋白”是指所有通過一個或幾個肽鍵連接的兩個或兩個以上天然存在的或修飾過的氨基酸。在本文中，“蛋白”和“肽”可以互換使用。
“RNA”是指兩個或兩個以上共價結合的天然存在的或修飾過的核糖核苷酸的序列。該術語所包括的修飾RNA的一種例子是硫代磷酸RNA。
“翻譯起始序列”是指能夠提供功能性核糖體進入位點的所有序列。在細菌系統中，該序列有時被稱為SD序列。
“起始密碼子”是指指示一種蛋白編碼序列開始的三個堿基。一般，這些堿基是AUG(或ATG)；不過，任何能以這種方式使用的其它堿基三聯體均可取代。
與一種肽受體的“共價結合”是指所述肽受體通過一個共價鍵直接地或者通過另一個共價結合的序列(例如，相應于一個間歇位點的DNA)間接地連接于“蛋白編碼序列”上。
“肽受體”是指能通過核糖體肽基轉移酶功能的催化活性添加到一種生長肽鏈的C-末端的所有分子。通常，這種分子包括(i)一個核苷酸或核苷酸-樣部分(例如，腺苷或腺苷類似物(在N-6氨基位置上二-甲基化是可以接受的))，(ii)一個氨基酸或氨基酸-樣部分(例如，20種D-或L-氨基酸的任一種或其所有的氨基酸類似物(例如，由Ellman等在酶學方法202301，1991中所披露的O-甲基酪氨酸或任一種類似物)，和(iii)兩者之間的連鍵，(例如，位于3’位置或不太理想的是位于2’位置的酯鍵、酰胺鍵、或酮鍵)；優選地，所述連鍵不會明顯影響具有天然核糖核苷酸構象的環的折疊。肽受體還可以具有一個親核體，該親核體可以是(但不限于)氨基，羥基或巰基，另外，肽受體可以由核苷酸模擬物、氨基酸模擬物，或組合的核苷酸和/或氨基酸結構的模擬物組成。
肽受體位于一種蛋白編碼序列的“3’末端”是指該肽受體分子位于所述蛋白編碼序列的最終的密碼子之后。該術語包括，但不限于精確位于所述蛋白編碼序列的3’末端的肽受體分子，以及通過間插編碼或非編碼序列(例如，相當于間歇位點的序列)與所述最終的密碼子分離的肽受體分子。該術語還包括這樣的結構，其中，編碼或非編碼序列位于所述肽受體分子之后(即位于所述肽受體分子的3’末端)。另外，該術語包括，但不限于共價結合于(直接地或通過間插核酸序列間接地)所述蛋白編碼序列上的肽受體分子，以及通過某種非共價方式，例如，通過利用第二種核酸序列雜交的方式與所述蛋白編碼序列結合的肽受體分子，所述第二種核酸序列結合于所述蛋白編碼序列的3’末端或接近該末端，而且，它本身結合于一種肽受體分子。
“改變了的功能”是指一種分子的功能的任何定性或定量變化。
“間歇序列”是指能導致核糖體降低或停止其翻譯速率的核酸序列。
本文所說的“結合配偶體”是指對一種需要的RNA-蛋白融合體的一部分具有特異的、共價的或非共價的親和力的所有分子。結合配偶體的例子包括，但不限于抗原/抗體對、蛋白/抑制劑對、受體/配體對(例如，細胞表面受體/配體對，如激素受體/肽激素對)、酶/底物對(例如，激酶/底物對)、凝集素/碳水化合物對、寡聚蛋白或雜聚蛋白凝聚體、DNA結合蛋白/DNA結合位點對、RNA/蛋白對、核酸雙鏈體、異源雙鏈體、或連接的鏈，以及能夠與RNA-蛋白融合體的任意部分形成一個或幾個共價或非共價鍵(例如，二硫鍵)的所有分子。結合配偶體包括，但不限于圖2中所示的篩選基序中的任一種。
“固體支持物”是指，但不限于可以直接或間接地(例如，通過諸如其它抗體或蛋白A的其它結合配偶體中間物)結合一種親和性復合體、或者可以埋入親和性復合體(例如，通過一種受體或通道)的任何柱(或柱材料)、玻璃珠、試管、微量滴定皿、固體顆粒(例如，瓊脂糖或瓊脂糖凝膠)、小嵌片(例如，硅、硅-玻璃、或金嵌片)、或膜(例如，脂質體或小泡)。
本發明具有多種突出的優點，首先，它是這一類型的用于篩選和擴增蛋白的第一個例子。該技術克服了由于需要回收相應于需要的、提取的蛋白的核苷酸序列而產生的障礙(因為只有核酸能夠復制)。具體地講，很多現有方法都可以通過體內步驟從部分或全部隨機化的庫中提取蛋白。這種類型的方法包括單克隆抗體技術(Millstein，美國科學24366(1980)和Schultz等，J.Chem.Engng.News6826(1990))，噬菌體展示(Smith，科學2281315(9185)；Parmley和Smith，基因73305(1988)；和McCafferty等，自然348552(1990))，肽-乳糖阻抑物融合體(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865(1992))，以及經典的遺傳學篩選。與本發明的方法不同，上述每一種方法依賴于蛋白和核酸之間的拓撲聯系，因此，可以保留所述蛋白的信息，并能以可讀的核酸形式回收。
另外，本發明相對緩慢的翻譯方法(Tuerk和Gold，科學249505(1990)；Irvine等，分子生物學雜志222739(1991)；Korman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791844-1848(1992)；Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919022-9026(1992)；Mattheakis等，酶學方法267195(1996)；和Hanes和Pluackthun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944937(1997))而言具有優點，所述方法是用于篩選仍然與核糖體及其mRNA配合的新生蛋白鏈的某種特性。與所述緩慢的翻譯技術不同的是，本發明方法不依賴于保持mRNA核糖體新生鏈三元復合體的完整性，所述復合體是非常脆弱的，因此，被局限于那些技術上可行的類型的篩選。
本發明還具有優于由Drenner和Lerner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895381-5383(1992))提出的分支合成方法，在其中，制備DNA-肽融合體，并通過一輪篩選從理論上講回收遺傳信息。與所述分支合成方法不同的是，本發明方法不需要由一種融合體的DNA部分再生肽(該再生過程在分支合成方法中通常是通過一輪化學合成而實現的)。因此，本發明方法可以使用成群的候選分子進行重復地篩選。另外，與所述分支合成技術不同的是，該技術通常局限于篩選很短的序列，而本發明方法可用于篩選相當長度的蛋白分子。
另一個優點是，本發明的篩選及直接進化技術可以利用很大而且復雜的候選序列文庫。相反，依賴于體內步驟的現有蛋白篩選方法通常局限于具有有限的復雜性的較小的文庫。這一優點在篩選功能性蛋白序列，例如，從1013個可能的序列中篩選一個僅有10個氨基酸長的肽時顯得特別重要。在經典的遺傳學方法中，lac阻抑物融合方法，和噬菌體展示方法，最大復雜性通常是在1013個成員以下的范圍內。大型文庫還具有直接進化利用的優點，可以更深入地調查任何特定起始序列周圍的序列空間。
本發明技術與現有方法的不同之處還在于其篩選步驟是與環境無關的。在很多其它篩選方法中，表達蛋白所存在的環境能顯著影響所產生的文庫的性質。例如，一種表達蛋白不能在一種特定系統中適當表達，或者不能適當展示(例如，展示在噬菌體顆粒的表面)。另外，一種蛋白的表達可能實際干擾篩選循環中的一個或幾個關鍵步驟，例如，噬菌體的生活力或感染性，或lac阻抑物的結合。以上問題會導致功能性分子的喪失或對可以使用的篩選方法的性質的局限。
最后，本發明的優點還在于它能夠對可以測定的蛋白的所有成分進行控制。在某些技術中(例如，抗體篩選)，對起始庫的性質有很小的控制或無控制。在另一種技術中(例如，lac融合和噬菌體展示)，候選庫必須在融合蛋白的環境中表達。相反，RNA-蛋白融合體結構能夠控制可用于篩選的候選庫的性質。另外，所述候選庫的大小可能與RNA或DNA庫一樣大(大約1015個成員)，僅受所進行的體外翻譯反應的大小的限制。而且，候選庫的制備完全取決于實驗設計；可以在提取時或在一種需要的融合蛋白環境中篩選隨機裂片，而且大部分(如果不是全部的話)可能的序列能夠在RNA-蛋白融合體候選庫中表達。
通過以下詳細說明和權利要求書可以了解本發明的其它特征和優點。
詳細說明首先對附圖進行簡要說明。附圖的簡要說明

圖1A-1C是生產RNA-蛋白融合體時有關步驟的示意圖。圖1A表示用于制備融合體的RNA部分的樣品DNA結構。圖1B表示RNA/嘌呤霉素綴合物的制備。圖1C表示RNA-蛋白融合體的制備。
圖2是本發明的一般化篩選方法的示意圖。
圖3是用于合成含有3’嘌呤霉素的最低翻譯模板的合成方法的示意圖。步驟(A)表示將保護基團添加到嘌呤霉素上的活性官能團(5’-OH和NH2)上；在經過修飾以后，上述基團受到適當的保護，以便用于亞磷酰胺基寡核苷酸合成。用標準方法通過2’OH基團將受到保護的嘌呤霉素連接在可控孔度玻璃(CPG)的氨己基上，以便通過其3’OH結合DNA(Gait，寡核苷酸合成，實用方法，實用方法系列(IRL出版社，牛津，1984))。在步驟(B)中，用標準RNA和DNA化學方法(Millipore，Bedford，MA)合成含有43個核苷酸的最低翻譯模板(稱為“43-P”)，用NH4OH和TBAF去保護，并進行凝膠純化。所述模板在其5’末端含有13個堿基的RNA，隨后是29個堿基的DNA，該DNA通過其5’OH與3’嘌呤霉素連接。所述RNA序列包括(i)一個互補于16S rRNA的5個堿基的SD共有序列(Stormo等，核酸研究102971-2996(1982)；Shine和Dalgarno Proc.Natl.Acad.Sci.USA711342-1346(1974)；和Steitz和Jakes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 724734-4738(1975))，(ii)一個有5個堿基的間隔區，和(iii)一個AUG起始密碼子。所述DNA序列是dA27dCdCP，其中，“P”是嘌呤霉素。
圖4是用于制備受保護的CPG-結合的嘌呤霉素的優選方法的示意圖。
圖5是表示將甲硫氨酸插入本發明模板中的可行方案的示意圖。如反應(A)所示，所述模板與核糖體結合，以便形成70S的起始復合體。Fmet tRNA結合于所述P位點，并且與所述模板堿基配對。位于所述模板的3’末端的嘌呤霉素以分子內方式進入A位點，并通過肽基轉移酶中心與N-甲酰基甲硫氨酸形成酰胺鍵，從而對所述tRNA脫酰化。用苯酚/氯仿萃取所述反應物，得到甲硫氨酸共價連接的模板。反應(B)示出的是不希望有的模板與含有嘌呤霉素的寡核苷酸之間的分子間反應。與以前一樣，所述最低模板能刺激含有fmet tRNA的70S核糖體與所述P位點的結合。隨后進入一個反式的第二模板，以形成共價結合的甲硫氨酸。
圖6A-6H是35S甲硫氨酸(35S met)摻入翻譯模板的照片。圖6A表示該反應對鎂(Mg2+)的依賴性。圖6B表示該產物的堿基穩定性；在該圖中所示出的遷移率的變化相當于失去了43-P的5’RNA序列(也被稱作“Met模板”)，以生成DNA-嘌呤霉素部分，被稱為30-P。在堿處理以后所保留的標記與在35S甲硫氨酸和所述模板的3’嘌呤霉素之間肽鍵的形成一致。圖6C表示在有肽基轉移酶抑制劑的條件下對產物形成的抑制。圖6D表示35S甲硫氨酸摻入一個模板編碼序列的依賴性。圖6E表示35S甲硫氨酸摻入對DNA模板長度的依賴性。圖6F表示用模板43-P和25-P形成的順式與反式產物。圖6G表示用模板43-P和13-P形成的順式與反式產物。圖6H表示用模板43-P和30-P在網織紅細胞裂解物系統中形成的順式與反式產物。
圖7A-7C是用于檢測肽融合體形成和篩選的結構的示意圖。圖7A表示LP77(“連接-產物”，“77”個核苷酸長)(又被稱作“短myc模板”)(SEQ ID NO1)，該序列含有c-myc單克隆抗體表位標記EQKLISEEDL(SEQ ID NO2)(Evan等，分子細胞生物學53610-3616(1985))，其旁側為5’起始密碼子和3’接頭。所述5’區含有與43-P相同的細菌SD序列。對所述編碼序列進行優化，以便在細菌系統中表達。具體地講，43-P的5’UTRs和含有SD的LP77互補于16SrRNA的5個堿基(Steitz和Jakes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 724734-4738(1975))，并以類似于核糖體蛋白序列形式間隔(Stormo等，核酸研究102971-2996(1982))。圖7B表示LP154(連接產物，154個核苷酸長)(又被稱作“長的myc模板”)(SEQ ID NO3)。該序列含有產生用于提取所述c-myc抗體的肽的密碼。其5’末端含有截短形式的TMV上游序列(被命名為“TE”)。該5’UTR含有一個源于TMV5’UTR的22個核苷酸的序列，包括兩個ACAAAUUAC直接重復(Gallie等，核酸研究16883(1988))。圖7C表示1號庫(SEQ ID NO4)，用于肽篩選的一種典型序列。所述模板包括源于最初的myc肽的最后7個氨基酸，用作該模板PCR擴增所需要的3’恒定區。已知該序列不是所述抗體結合表位的一部分。
圖8是驗證利用模板43-P，LP77，和LP154以及網織紅細胞(“Retic”)和小麥胚(“Wheat”)翻譯系統合成RNA-蛋白融合體的照片。該圖的左半部表示35S甲硫氨酸摻入3種模板中的每一種中的情況。該圖的右半部表示用RNaseA處理所述3種模板中的每一種以除去RNA編碼區后所得到的產物；示出了35S甲硫氨酸標記的RNA-蛋白融合體。各個DNA部分與寡聚30-P相同。因此，遷移率的差別與所述編碼區的長度呈正比，與各種情況下不同長度的蛋白的存在一致。
圖9是驗證由LP154合成的RNA-蛋白融合體對蛋白酶的敏感性的照片，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。泳道1含有32P標記的30-P。泳道2-4，5-7和8-10含有35S標記的翻譯模板，所述模板是從網織紅細胞裂解反應物中回收的，所述反應物分別未經處理，用RNaseA處理或用RNaseA和蛋白酶K處理。
圖10是表示使用體外翻譯的33個氨基酸的myc-表位蛋白進行的免疫沉淀反應的結果的照片。泳道1和2分別表示myc-表位蛋白和β-珠蛋白模板的翻譯產物。泳道3-5表示分別使用c-myc單克隆抗體和PBS，DB，和PBSTDS洗滌緩沖液進行的所述myc-表位肽的免疫沉淀的結果。泳道6-8表示相同的免疫沉淀反應，不過使用的是β-珠蛋白翻譯產物。
圖11是驗證源于體外翻譯反應的RNA-蛋白融合體的免疫沉淀的照片。標明了用于所述反應的模板的皮摩爾數。泳道1-4表示RNA124(融合體LP154的RNA部分)，泳道5-7表示RNA-蛋白融合體LP154。用c-myc單克隆抗體和蛋白G瓊脂糖凝膠進行免疫沉淀，然后用RNaseA和T4多核苷酸激酶處理樣品，再加樣到變性尿素聚丙烯酰胺凝膠上，以顯示所述融合體。在泳道1-4中，其樣品要么不含有任何樣品，或者僅含有所述長的myc模板(RNA124)的RNA部分，未發現融合體。在泳道5-7中，相應于所述融合體的帶清晰可見。示出了32P標記的30-P的位置，并且在該圖的頂部示出了所投入的模板量。
圖12是表示由一種體外翻譯反應所獲得的融合材料的量的曲線。在磷顯像板上對圖11中的泳道5-7所示的融合體帶和30-P帶(以類似的方式在dT25上提取，未示出)的強度進行定量，并作為投放的LP154濃度的函數作圖。所回收的修飾過的30-P(左側y軸)與投入的模板(x軸)呈線性正比，而接頭-肽融合體(右側y軸)是恒定的。通過以上分析，可以計算出每毫升翻譯反應樣品產生了大約1012融合體。
圖13是硫代丙基瓊脂糖凝膠和dT25瓊脂糖的示意圖，以及這些底物與本發明的RNA-蛋白融合體的相互作用能力的示意圖。
圖14是表示順序提取本發明融合體的結果的照片。泳道1含有32P標記過的30-P。泳道2和3表示從翻譯反應物中提取的、并用RNaseA處理過的LP154。在泳道2中，LP154是用硫代丙基瓊脂糖凝膠和dT25瓊脂糖順序提取的LP154。泳道表示僅用dT25瓊脂糖提取。以上結果表明，所述產物含有游離的巰基，很可能是myc表位編碼序列上的倒數第二個半胱氨酸。
圖15A和15B是表示用β-珠蛋白模板形成融合產物的照片。通過STS-麥黃酮-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)進行分析。圖15A表示無模板(泳道1)、syn-β-珠蛋白模板(泳道2-4)、或LP-β-珠蛋白模板(泳道5-7)的35S摻入情況。圖15B(泳道標記如圖15A)表示通過寡核苷酸親和層析提取的35S-標記的材料。在沒有30-P尾的情況下(泳道2-4)未提取到材料。
圖16A-16C是表示通過體外篩選富集myc dsDNA與庫dsDNA的示意圖和照片。圖16A是所述篩選方案的示意圖。在體外翻譯myc和庫模板的4種混合物，并在dT25瓊脂糖和TP瓊脂糖凝膠上分離，以便從未修飾過的模板中純化所述模板融合體。然后對mRNA-肽融合體進行逆轉錄，以抑制存在于所述模板中的任何二級或三級結構。在親和篩選之前(圖16B)和之后(圖16C)取每一種混合物的等分試樣，在有標記引物的情況下通過PCR擴增，并用僅能裂解myc DNA的限制酶消化。所投入的模板混合物是純的myc(泳道1)、或1∶20、1∶200、1∶2000的myc庫(泳道2-4)。未篩選過的材料因為myc模板的優勢翻譯和逆轉錄作用而偏離其投入的比例。在篩選步驟中模板的富集作用是通過篩選之前和之后庫myc比例的變化而計算出來的。
圖17是表示myc RNA模板翻譯的照片。使用了下列接頭泳道1-4，dA27dCdCP；泳道5-8，dA27rCrCP；和泳道9-12，dA21C9C9C9dAdCdCP。在每一個泳道中，RNA模板的濃度為600nM，并將35S-Met用于標記。反應條件如下泳道1、5和9，30℃ 1小時；泳道2、6和10，30℃ 2小時；泳道3、7和11，30℃ 1小時，-20℃ 16小時；和泳道4、8和12，30℃ 1小時，-20℃ 16小時，具有50mM Mg2+。在該圖中，“A”表示游離肽，而“B”表示mRNA-肽融合體。
圖18是表示用32P標記的myc RNA模板的翻譯的照片。所使用的接頭是dA21C9C9C9dAdCdCP。翻譯是在30℃下進行90分鐘，而溫育是在不添加Mg2+的條件下在-20℃下進行2天。mRNA模板的濃度為400nM(泳道3)，200nM(泳道4)、100nM(泳道5)和100nM(泳道6)。泳道1表示用35S-Met標記的mRNA-肽融合體。泳道2表示用32P標記的mRNA。在泳道6上，所述反應是在由0.5mM cap類似物的條件下進行的。
圖19是表示用獲自Ambion(泳道1)、Novagen(泳道2)、Amersham(泳道3)的裂解物進行的myc RNA模板翻譯的照片。所使用的接頭是dA27dCdCP。模板的濃度為600nM。用35S-Met標記。翻譯是在30℃下進行1小時，在有50mM Mg2+的條件下在-20℃下溫育過夜。
本文所披露的是一種利用融合體篩選具有需要的功能的蛋白的方法，其中，所述蛋白與其自身的信使RNAs共價連接。這種RNA-蛋白融合體是通過在其3’末端含有肽受體的mRNA庫的體外或原位翻譯而合成的(圖1B)。在一種優選實施方案中，在通讀所述信使的開放讀框之后，核糖體在到達設計的間歇位點之后停留，并由所述受體部分占據核糖體的A位點，接受來自P位點的肽基-tRNA的新生肽鏈，以產生RNA-蛋白融合體(圖1C)。所述蛋白和RNA之間的共價連接(以所述mRNA的3’末端和它所編碼的蛋白的C-末端之間的酰胺鍵的形式連接)使得所述蛋白上的遺傳信息可以在通過所述RNA的逆轉錄進行的篩選之后得到回收和擴增(例如，通過PCR)。一旦產生所述融合體，就可以根據該mRNA-蛋白融合體的特性進行篩選或富集，或者用所述mRNA模板進行逆轉錄，同時該模板與所述蛋白結合，以避免所述單鏈RNA對篩選的一切影響。當使用mRNA-蛋白結構時，可以檢驗篩選的融合體，以確定哪一部分(蛋白、mRNA、或兩者)具有所需要的功能。
在一種優選實施方案中，嘌呤霉素(它類似于酪氨酰腺苷)起著受體的作用，以便將生長肽連接在其mRNA上。嘌呤霉素是一種通過中止肽延伸而起作用的抗生素。作為氨酰基-tRNA的模擬物，它通過結合所述A位點、接納生長肽鏈、和脫落核糖體(Kd＝10-4M)而起著蛋白合成的通用抑制劑的作用(Traut和Monro，分子生物學雜志1063(1964)；Smith等，分子生物學雜志13617(1965))。嘌呤霉素的一個最誘人的特征是，它能與生長肽鏈生成穩定的酰胺鍵，從而可以進行更穩定的融合，這種融合比能形成不穩定的酯鍵的潛在受體穩定。具體地講，所述肽基-嘌呤霉素分子含有一種位于肽和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸部分之間的穩定的酰胺鍵。所述O-甲基酪氨酸又通過一個穩定的酰胺鍵與嘌呤霉素的修飾過的腺苷部分的3’-氨基結合。
受體的其它可行篩選包括位于所述mRNA的3’末端的tRNA-樣結構，以及以類似于嘌呤霉素的方式起作用的其它化合物。這些化合物包括，但不限于具有一個與腺嘌呤或腺嘌呤-樣化合物連接的氨基酸的所有化合物，如氨基酸核苷酸、苯丙氨酰-腺苷(A-Phe)，酪氨酰腺苷(A-Tyr)和丙氨酰腺苷(A-Ala)，以及酰胺-連接的結構，如苯丙氨酰3’脫氧3’氨基腺苷，丙氨酰3’脫氧3’氨基腺苷，和酪氨酰3’脫氧3’氨基腺苷；在上述任一種化合物中，可以使用任何天然存在的L-氨基酸或其類似物。另外，還可將組合的tRNA-樣-3’結構-嘌呤霉素綴合物用于本發明中。
圖2中示出了本發明的一種優選篩選方案。該篩選方案所涉及的步驟通常是按如下方式進行的。
步驟1制備DNA模板。作為制備本發明的RNA-蛋白融合體的一個步驟，合成該融合體的RNA部分。這一目的可以通過直接化學RNA合成而實現，更常見的是，通過轉錄合適的雙鏈DNA模板而實現。
所述DNA模板可以通過任何標準技術(包括重組DNA技術、化學合成的任一種技術或兩種技術)制備。原則上講，能產生一種或幾種含有一種已知的、隨機的、隨機化的或誘變的序列的模板的方法均可用于這一目的。在一種具體方法中，在轉錄前合成并擴增(例如，通過PCR)一種寡核苷酸(例如，含有隨機堿基)。化學合成還可用于產生隨機框，然后將該框插入已知蛋白編碼序列的中央(例如，參見Ausubel等所著的“現代分子生物學方法”的第8.2章，JohnWiley&Sons和Greene出版公司，1994)。后一種方法能在所述蛋白的感興趣的特定位點附近產生高密度的突變。
DNA模板序列的完全隨機化的替代方案是部分隨機化，而且，用這種方法合成的一種庫通常被稱作“摻雜庫”。例如，在RNA序列上進行的該技術的一個例子由Ekland等披露(核酸研究233231(1995))。部分隨機化可以通過偏離所述合成反應而以化學方法完成，使得每一種堿基添加反應混合物含有過量的一種堿基和少量的每一種其它的堿基；通過小心控制所述堿基的濃度，可以用該方法獲得理想的突變頻率。還可以利用易錯PCR技術制備部分隨機化的庫，例如，由Beaudry和Joyce(科學257635(1992))和Bartel和Szostck(科學2611411(1993))所披露的。
還有用于制備DNA結構的多種方法，該方法由一個已知序列開始，產生一種突變的DNA庫。所述方法的例子披露于Ausubel等的著述(同上，第8章)和Sambrook等的著述中(分子克隆實驗室手冊，第15章，冷泉港出版社，紐約，第2版(1989))。還可以通過披露于Stemmer的著述中的(自然370389(1994))的“改組”技術制備隨機序列。
為了優化本發明的篩選方案，還可以改變一個模板的5’和3’末端的序列和結構。優選地，這一目的是通過兩次獨立的篩選實現的，每一次篩選包括將隨機區插入所述模板的接近合適的末端的部位，然后進行篩選。所述篩選可以起到以下作用(i)將制備的融合體的量最大化(并因此使得文庫的復雜性最大化)或(ii)提供優化的翻譯序列。另外，所述方法具有通用性，可以與誘變PCR結合，以便優化翻譯模板的編碼和非編碼區。
步驟2制備RNA。如上文所述，可以用標準寡核苷酸合成技術，通過化學方法合成RNA-蛋白融合體的RNA部分。另外，特別是在使用較長的RNA序列時，所述RNA部分是通過DNA模板的體外轉錄而制備的。在一種優選方案中，將T7聚合酶用于酶促制備所述RNA鏈。適用于上述目的的其它RNA聚合酶包括，但不限于SP6、T3和大腸桿菌RNA聚合酶(例如，披露于Ausubel等的著述(同上，第3章))。另外，所合成的RNA可以是全部或部分修飾的RNA。在一個具體例子中，可以使用修飾的核糖核苷酸和標準技術產生硫代磷酸RNA(例如，通過T7轉錄)。上述修飾的RNA具有對核酸酶穩定的優點。
步驟3將嘌呤霉素連接到所述模板上。接著，將嘌呤霉素(或任何其它合適的肽受體)共價連接在所述模板序列上。這一步驟可以是通過利用T4 RNA連接酶將所述嘌呤霉素直接連接在所述RNA序列上，或者優選通過利用T4 DNA連接酶或任何其它能夠將兩個核苷酸序列連接在一起的酶將所述嘌呤霉素與DNA“裂片”連接的方式而實現(參見圖1B)(例如，同樣參見Ausubel等，同上，第3章，第14和15節)。還可將tRNA合成酶用于將嘌呤霉素-樣化合物連接在RNA上。例如，苯丙氨酸合成酶能將苯丙氨酸連接在含有3’氨基的苯丙氨酰-tRNA分子上，產生具有嘌呤霉素-樣3’末端的RNA分子(Fraser和Rich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702671(1973))。可以使用的其它肽受體包括，但不限于具有連接于腺嘌呤或腺嘌呤-樣化合物上的氨基酸的所有化合物，如氨基酸核苷酸、苯丙氨酰-腺苷(A-Phe)、酪氨酰-腺苷(A-Tyr)、和丙氨酰-腺苷(A-Ala)、以及腺苷-連接的結構，如苯丙氨酰3’脫氧3’氨基腺苷、丙氨酰3’脫氧3’氨基腺苷、和酪氨酰3’脫氧3’氨基腺苷；在上述任一種化合物中，可以使用任何天然存在的L-氨基酸或其類似物。例如，在Krayevsky和Kukhanova的著述中(核酸研究和分子生物學進展231(1979))披露了多種肽受體。
步驟4RNA-蛋白融合體的制備和回收。為了制備RNA-蛋白融合體，任何體外或原位翻譯系統均可使用。如下文所述，優選真核系統，兩種特別優選的系統包括小麥胚和網織紅細胞裂解物系統。不過，原則上講，任何能夠生成RNA-蛋白融合體，而且不會明顯降解該融合體的RNA部分的翻譯系統均可用于本發明中。另外，為了減少上述任何系統中的RNA降解，可將降解-抑制反義寡核苷酸加入所述翻譯反應混合物中；所述寡核苷酸能與所述分子中引起降解作用的RNA部分的序列特異雜交并覆蓋該序列(例如，參見Hanes和Pluckthun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944937(1997))。
如上文所述，可將多種真核翻譯系統中的任一種用于本發明中。所述系統包括，但不限于源于酵母、腹水、腫瘤細胞(Leibowitz等，酶學方法194536(1991))、和非洲爪蟾卵母細胞的裂解物。源于細菌系統的體外翻譯系統包括，但不限于披露于以下文獻中的系統Zubay(遺傳學年度綜述7267(1973))；Chen和Zubay(酶學方法10144(1983))；和Ellman(酶學方法202301(1991))。
另外，翻譯反應可以原位進行。在一種特定實施例中，翻譯可以通過用標準技術將mRNA注入非洲爪蟾卵中而實現。
一旦產生了RNA-蛋白融合體，就可以通過任何標準的蛋白或RNA純化技術從所述翻譯反應混合物中回收該融合體。通常，使用蛋白純化技術。例如，如下文所示，可以通過使用合適的層析試劑，如dT25瓊脂糖或硫代丙基瓊脂糖凝膠實現融合體的純化。不過，純化還可以涉及基于所述融合體的RNA部分的純化；例如，所述純化技術披露于Ausubel等的著述中(同上，第4章)。
步驟5篩選需要的RNA-蛋白融合體。需要的RNA-蛋白融合體的篩選可以通過任何可用于從一群候選融合體中選擇性地分離或提取需要的融合體的方法實現。提取技術的例子包括，但不限于，與諸如結合配偶體的選擇性結合，所述配偶體直接或間接固定在柱、珠、膜、或其它固體支持物上。并用一種對所述融合體的蛋白部分特異的抗體進行免疫沉淀。所述技術的第一種利用了一種固定篩選基序，該基序可以由任何類型的分子組成，其可以發生結合。在圖2中示出了一系列可以篩選的基序分子。篩選還可以基于連接在一種親和標記物(例如，底物-生物素)上的底物分子的利用，所述標記物能與候選分子起反應，或者基于與融合分子的任何其它類型的相互作用。另外，還可以按照類似于由Bartel和Szostak所披露的用于提取RNA酶(同上)的方法根據其催化活性篩選蛋白；按照特定的技術，根據其將靶分子連接在它本身上面的能力篩選需要的分子，然后根據靶分子的存在提取功能性分子。本發明可以利用相同的方法或任何其它功能性篩選的篩選方法，篩選新型或改進的催化蛋白。
另外，如本文所述，可以通過在一種候選分子庫中富集融合體來篩選所需要的RNA-蛋白融合體(或其DNA拷貝)。為了進行這樣一種任選的富集，將一群候選RNA-蛋白融合體與一種結合配偶體(例如，上述結合配偶體之一)接觸，所述結合配偶體對所述融合體的RNA部分或蛋白部分專一，接觸條件為能基本上將該結合配偶體-融合體從樣品中未結合的成員里分離出來。這一步驟可以重復，而且該技術優選包括至少兩個連續的富集步驟，一個步驟是用一種對RNA部分專一的結合配偶體篩選融合體，另一個步驟是用對蛋白部分專一的結合配偶體篩選融合體。另外，如果重復針對融合體的相同部分(例如，蛋白部分)的富集步驟，優選使用不同的結合配偶體。在本文所披露的一種具體例子中，首先通過使用對融合體的RNA部分專一的結合配偶體從一群分子中富集所需要的融合體，然后在兩個連續的步驟中使用兩個不同的結合配偶體，這兩種結合配偶體都對所述融合體的蛋白部分具有專一性。另外，還可以通過任何標準分離技術從樣品成分中分離，這些技術包括，但不限于柱親和層析、離心、或免疫沉淀。
另外，還可以通過多種方法實現從一種富集(或篩選)復合物中洗脫RNA-蛋白融合體。例如，如本文所述，可以利用一個變性或非特異性化學洗脫步驟分離需要的RNA-蛋白融合體。這樣一個步驟有利于將復合的成分彼此分離或者與結合的固體支持物分離，這種分離是通過破壞所述成分之間和/或所述成分與固體支持物之間的非共價鍵而以相對非特異的方式實現的。如本文所述，一種典型的變性或非特異化學洗脫試劑是4％HOAc/H2O。其它典型的變性或非特異化學洗脫試劑包括鳥嘌呤、尿素、高鹽、洗滌劑、或任何一般能除去非共價加成物的其它方法。另外，可以使用一種特殊的化學洗脫方法，其中，利用一種化合物引起融合分子的特異釋放。在一種具體實例中，如果所需要的融合蛋白的連接臂含有一個或幾個二硫鍵，可以通過添加諸如DTT導致二硫鍵減弱并釋出結合的靶分子，而將結合的融合aptamers洗脫。
另外，洗脫還可以通過特異破壞親和性復合體而實現；這種技術能通過添加過量的該復合物的一種成分而選擇性地分離該復合物的成分。例如，在ATP-結合篩選中，洗脫是通過將過量的ATP加入溫育混合物中而實現的。最后，還可以進行一個酶促洗脫步驟。在該方法中，結合分子本身或外源添加的蛋白酶(或其它合適的水解酶)能裂解并釋放出所述靶或酶。在一種具體例子中，蛋白酶靶位點可以包含在任一種復合成分中，并通過添加蛋白酶洗脫結合分子。另外，在催化篩選中，可將洗脫作為一個篩選步驟，以便分離能夠將其本身從固體支持物上釋出(例如，裂解)的分子。
步驟6利用逆轉錄酶制備所述RNA序列的DNA拷貝。如果需要，通過使用任何標準技術(例如，使用Superscript逆轉錄酶)對RNA序列進行逆轉錄可以方便地獲得特定RNA融合序列的DNA拷貝。這一步驟可以在篩選或富集步驟之前(例如，如圖16所示)或之后進行。另外，所述逆轉錄過程還可以在將所述融合體從體外或原位翻譯混合物中提取出來之前進行。
然后，作為部分或完整長度的雙鏈序列擴增所述DNA模板。優選地，在該步驟中，產生完整長度的DNA模板，利用合適的寡核苷酸和PCR擴增。
下面將采用具體實例的形式詳細說明上述步驟以及用于完成這些步驟的試劑和技術。提供這些實例是為了說明本發明，不應視為對本發明的限定。
制備RNA-蛋白融合體的模板如圖1A和2所示，本發明的篩選方案優選利用包括若干設計元件的雙鏈DNA模板。所述因子的第一個是啟動子，它與所需要的RNA聚合酶一起使用，以便合成mRNA。如圖1A所示，而且如這里所披露的，盡管能夠指導由線性雙鏈DNA進行的合成的任何啟動子均可使用，但優選T7啟動子。
圖1A所示模板的第二個因子被稱為5’非翻譯區(或5’UTR)，它相當于翻譯起始位點的RNA上游，圖1A中示出了一種優選的5’UTR(稱為“TE”)，它是煙草花葉病毒5’非翻譯區的缺失突變型，具體地講，相當于TMV翻譯起點的5’堿基；該UTR的序列如下rGrGrGrArCrArArUrUrArCrUrArUrUrUrArCrArArUrUrArCrA(其頭三個G核苷酸被插入以增強轉錄)(SEQ ID NO5)。任何其它合適的5’UTR均可使用(例如，參見Kozak，微生物學綜述471(1983))。
圖1A中所示的第三個因子是翻譯起始位點。一般，它是一個AUG密碼子。不過，存在著將除AUG之外的密碼子用于天然存在的編碼序列中的例子，這些密碼子也可被用于本發明的篩選方案中。
圖1A的第四個因子是編碼所述蛋白序列的蛋白的開放讀框(稱作ORF)。該開放讀框可編碼任何天然存在的、隨機的、隨機化的、誘變的、或完全合成的蛋白序列。
圖1A所示的第五個因子是3’恒定區。該序列有利于所述庫序列的PCR擴增，以及含有嘌呤霉素的寡核苷酸與mRNA的連接。如果需要，該區還可以包括一個間歇位點，該位點是一個能引起核糖體停留，并因此使得受體部分(例如，嘌呤霉素)具有接受來自肽基-tRNA的新生肽鏈的額外時間；該間歇位點將在下面作更詳細的討論。
為了完成本發明的方法，首先利用高度簡化的含有1-2個密碼子的mRNA模板制備RNA-蛋白融合體。實施上述方法是出于兩種考慮。首先，這種大小的模板容易通過化學合成制備。其次，小的開放讀框使得所述反應的重要特征，包括連接的效率、末端異質性、模板依賴性、和翻譯精確性能夠方便地加以測定。
結構設計。將一種基本結構用于制備試驗RNA-蛋白融合體。所述分子由含有用于啟動翻譯的SD序列的mRNA組成，該分子包括源于核糖體蛋白L1的SD序列的三個堿基的缺失，而且它互補于16S rRNA的5個堿基(即rGrGrArGrGrArCrGrArA)(SEQ ID NO6)(Stormo等，核酸研究102971-2996(1982)；Shine和Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.USA711342-1346(1974)；和Steitz和Jakes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA724734-4738(1975))，(ii)一個AUG起始密碼子，(iii)一個用作間歇位點的DNA接頭(即5’-(dA)27)，(iv)dCdC-3’，和(v)一個3’嘌呤霉素(P)。選擇poly dA序列是因為已知它在A位點作為tRNA的模板的能力較差(Morgan等，分子生物學雜志26477-497(1967)；Ricker和Kaji，核酸研究196573-6578(1991))，并將其設計成良好的間歇位點。選擇所述寡聚dA接頭的長度，使其跨過解碼位點和所述核糖體的肽基轉移中心之間的大約60-70埃的距離。所述dCdCP模擬tRNA的CCA末端，設計它是為了有利于嘌呤霉素與核糖體的A位點的結合。
最低模板43-P的化學合成。為了合成結構43-P(如圖3所示)，首先將嘌呤霉素連接在一種固體支持物上，使其適用于標準亞磷酰胺寡核苷酸合成化學。在圖3中示意性地示出了這種寡聚物的合成方案，并將在下文作更詳細的說明。為了將嘌呤霉素連接在可控孔度玻璃(CPG)固體支持物上，用三氟乙酰基保護氨基，如在DNA合成儀380型的Applied Biosystem用戶簡報#49(9188)中所披露的。然后，用標準的DMT-C1方法對5’OH進行保護(Gait，寡核苷酸合成，實用方法，實用方法系列(IRL出版社，牛津，1984))，并通過2’OH連接在氨己基CPG上，其連接方式與將3’OH用于連接脫氧核苷的方式相同(參見圖3和Gait，同上，p.47)。5’DMT-CPG-連接的保護嘌呤霉素適合于用亞磷酰胺單體進行鏈的延伸。所述寡聚物的合成沿3’→5’方向以以下順序進行(i)3’嘌呤霉素，(ii)pdCpdC，(iii)大約27個單位的dA作為接頭，(iv)AUG，和(v)SD序列。43-P結構的序列如下文所示。
CPG嘌呤霉素的合成。保護的CPG嘌呤霉素的合成遵循上文所述的用于脫氧核苷合成的一般途徑(Gait，寡核苷酸合成，實用方法，實用方法系列(IRL出版社，牛津，1984))。主要差別包括篩選合適的N封閉基團，結合在固體支持物的2’OH，以及與該固體支持物的連接反應。在后一種情況下，反應是在極低濃度的活化核苷酸中進行的，因為該材料顯著優于所述固體支持物。就所述稀釋反應條件而言，所得到的產量(大約20μmol/g支持物)是十分理想的。
合成N-三氟乙酰嘌呤霉素。首先將267mg(0.490mmol)嘌呤霉素*HCl溶于水中，加入pH11的碳酸緩沖液，并萃取(3X)到氯仿中，以便將其轉化成游離堿的形式。將有機相蒸發干燥，并稱重(242mg，0.513mmol)。然后將所述游離堿溶解在11ml無水吡啶和11ml無水乙腈中，并攪拌添加139μl(2.0mmol)三乙胺(TEA)和139μl(1.0mmol)三氟乙酸酐(TFAA)，然后將TFAA加入20μl等分試樣的渾濁溶液中，直到不再有原始材料，通過薄層層析(tlc)(937，氯仿/MeOH)(共280μl)測定。讓所述反應進行1小時。此時，通過薄層層析發現了兩條帶，這兩條帶的遷移率均高于原始材料的。用NH4OH和水調節所述反應，將其產物還原成一條帶。硅層析(93∶7氯仿/MeOH)得到293mg(0.515mmol)的產物N-TFA-Pur。該反應的產物示意性地示于圖4中。
合成N-三氟乙酰5’-DMT嘌呤霉素。等分來自上述反應的產物，并與無水吡啶共蒸發2次，以除去水。準備多個試管，以便實驗多種反應條件。在一種小規模反應中，將27.4mg(48.2mmol)N-TFA-Pur溶解在480μl含有0.05當量DMAP和1.4當量TEA的吡啶中。將20.6mg的三苯甲基氯(60μmol)加入該混合物中，并攪拌讓反應進行到結束。通過向該溶液中添加等體積的水(大約500μl)中止該反應。因為該反應似乎是成功的，進行大規模的反應。具體地講，將262mg(0.467mmol)N-TFA-Pur溶解在2.4ml吡啶中，然后添加1.4當量的TEA，0.05當量的DMAP，和1.2當量的三苯甲基氯。大約2小時之后，再添加50mg(0.3當量)二甲氧基三苯甲基*Cl(DMT*Cl)，讓反應再繼續進行20分鐘，通過添加3ml的水中止反應，CH3CN共蒸發3次。在2mm直徑的100ml硅(干燥)柱上通過95∶5氯仿/MeOH純化所述反應物。由于純化不徹底，在第二個相同的柱上用97.5∶2.5的氯仿/MeOH進一步純化。總產量為325mg或0.373mmol(或產率為72％)。該反應的產物示意性地示于圖4中。
合成N-三氟乙酰，5’-DMT，2’琥珀酰嘌呤霉素。在小規模反應中，將上面合成的32mg(37mmol)的產物與1.2當量的DMAP混合溶解在350μl的吡啶中。將溶解在44μl的無水CH3CN中的1.2當量的琥珀酸酐加入該溶液中，并攪拌過夜。薄層層析發現僅存很少的原始材料。在大規模的反應中，將292mg(336mmol)的上述產物與1.2當量的DMAP混合于3ml的吡啶中。將403μl的1M溶于無水CH3CN中的琥珀酸酐加入該混合物中，并將該混合物攪拌過夜。薄層層析再次發現了僅存很少的原始材料。合并以上兩種反應物，再添加0.2當量的DMAP和琥珀酸鹽。該產物與甲苯共蒸發1次，并在高真空中干燥成黃色泡末。加入CH2Cl2(20ml)，用15ml的10％的冰鎮檸檬酸萃取2次，然后再用純水萃取2次。干燥該產物，重新溶解在2ml CH2Cl2中，并通過攪拌添加50ml的己烷沉淀。然后對該產物進行渦旋攪拌，并在臨床離心機上以600rpm的速度離心10分鐘。排出大部分洗脫液，并干燥其余的產物，首先在低真空下干燥，然后在干燥器中以高真空干燥。該反應的產量大約為260μmol，分級產率為大約70％。
合成N-三氟乙酰5’-DMT，2’琥珀酰，CPG嘌呤霉素。隨后將來自上一步驟的產物溶解在1ml的二噁烷中，隨后用0.2ml二噁烷/0.2ml吡啶溶解。將40mg對-硝基苯酚和140mg的二烷己基碳二亞胺(DCC)加入該溶液中，并讓該反應進行2小時。通過離心除去由該反應產生的不可溶的環己基尿素，將該產物溶液加入懸浮在22ml無水DMF中的5g氨己基可控孔度玻璃(CPG)中，并攪拌過夜。然后用DMF、甲醇、和乙醚洗滌該樹脂，并干燥。分析證實，所得到的樹脂每克含有22.6μmol三苯甲游基，處于這種類型的支持物的可接受的范圍內。然后，通過與15ml吡啶、1ml乙酸酐、和60mg的DMAP一起溫育30分鐘封閉該支持物。所得到的柱材料能產生一種負的(無色)水合茚三酮實驗，與封閉之前獲得的結果相反，在封閉之前所獲得的結果中，所述材料能產生一種深蘭色反應。該反應的產物示意性地示于圖4中。
合成mRNA-嘌呤霉素綴合物。如上文所述，可將嘌呤霉素固定的寡聚物用于由兩種方法中的任一種制備能起著翻譯模板作用的mRNA-嘌呤霉素綴合物。對于極短的開放讀框來說，通常通過化學方法用RNA或DNA單體延伸嘌呤霉素寡聚物，以產生完全合成的模板。當需要較長的開放讀框時，通常利用DNA裂片和T4 DNA連接酶將RNA或DNA寡聚物連接在mRNA的3’末端，如Moore和Sharp所披露的(科學256992(1992))。
RNA-蛋白融合體的體外翻譯和測定用如下的細菌和真核體外翻譯系統體外翻譯上面制備的模板。
最低模板的體外翻譯。將43-P和相關的RNA-嘌呤霉素綴合物加入幾個不同的體外翻譯系統中，所述系統包括(i)源于大腸桿菌MRE600的S30系統(Zubay，遺傳學年度綜述7267(1973)；Collins，基因629(1979)；Chen和Zubay，酶學方法10144(1983)；Pratt，轉錄和翻譯實踐方法，B.D.Hammes，S.J.Higgins著(IRL出版社，牛津，1984)pp.179-209；和Ellman等，酶學方法202301(1991))，通過Ellman等所披露的方法制備(酶學方法202301(1991))；(ii)源于相同菌株的核糖體部分，通過Kudlicki等所述的方法制備(分析化學206389(1992))；和(iii)源于大腸桿菌BL21的S30系統，通過Lesley等所述方法制備(生物學化學雜志2662632(1991))。在每一種情況下，所使用的預混合物是Lesley等的混合物(生物學化學雜志2662632(1991))，溫育持續30分鐘。
測定所述融合體的性質。首先用源于大腸桿菌S30的翻譯提取物檢驗43-P模板。圖5(反應“A”)證實了希望的分子內(順式)反應，其中，43-P結合核糖體，并起著fMet的模板和受體的作用。首先測定35S-甲硫氨酸的摻入及其在所述模板中的位置，結果示于圖6A和6B中。用苯酚/氯仿萃取所述體外翻譯反應混合物，并通過SDS-PAGE分析該產物，然后，一個35S標記的帶以與43-P模板相同的遷移率出現。所合成的該材料的量取決于Mg2+的濃度(圖6A)。最佳Mg2+濃度為9-18mM，這一濃度類似于在該系統中進行翻譯的最佳濃度(Zubay，遺傳學年度綜述7267(1973)；Collins，基因629(1979)；Chen和Zubay，酶學方法10144(1983)；Pratt，轉錄和翻譯實踐方法，B.D.Hammes，S.J.Higgins著(IRL出版社，牛津，1984)pp.179-209；Ellman等，酶學方法202301(1991)))；Kudlicki等(分析化學206389(1992))；和Lesley等(生物學化學雜志2662632(1991))。另外，結合的標記物在用NH4OH處理時是穩定的(圖6B)，表明該標記物位于該分子的3’半邊(堿穩性DNA部分)，并通過堿穩性鍵連接，這正是嘌呤霉素和fMet之間的酰胺鍵所出現的情形。
核糖體和模板依賴性。為了證實上面所觀察到的發生在核糖體上的反應，檢驗核糖體的肽基轉移酶功能的特異抑制劑的作用(圖6C)，并檢驗改變編碼甲硫氨酸的序列的作用(圖6D)。圖6C清楚地表明所述反應受到肽基轉移酶抑制劑維及尼霉素、谷氏菌素、和氯霉素的有效抑制(Monro和Vazquez，分子生物學雜志28161-165(1967)；和(Vazquez和Monro，生物化學和生理學學報142155-173(1967))。圖6D表明，所述模板中發生的一個堿基由A到C的變化，可破壞35S甲硫氨酸在9mM Mg2+下的摻入，并在18mM下大大減弱其摻入(這一結果與高濃度的Mg2+容許信息的錯讀的事實一致)。上述實驗表明，所述反應以模板依賴形式發生在核糖體上。
接頭長度。還試驗了所述反應對接頭長度的依賴性(圖6E)。將原始模板設計成使得所述接頭跨越從解碼位點(由該模板的AUG占據)到受體位點(由嘌呤霉素部分占據)的距離，該距離的長度大約與tRNA上的反密碼子環和受體臂之間的距離相同，或者大約為60-70埃。試驗過的第一個接頭為30個核苷酸長，基于每個堿基最少3.4埃(≥102埃)。在30-21個核苷酸的長度范圍內(n＝27-18；長度≥102-71埃)，在所述反應的效率上很少出現變化。因此，接頭長度可以改變。盡管21-30個核苷酸的接頭代表優選的長度，短于80個核苷酸，優選短于45個核苷酸的接頭也可用于本發明中。
分子內與分子間反應。最后，我們檢驗了所述反應是否如希望的那樣以分子內方式發生(圖5，反應“A”)或以分子間方式發生(圖5，反應“B”)。這一試驗是這樣進行的將具有3’嘌呤霉素，但沒有核糖體結合序列的寡核苷酸(模板25-P，13-P，和30-P)加入含有43-P模板的翻譯反應物中(圖6F、6G、和6H)。如果該反應是通過分子間機制發生，則較短的寡聚物也會被標記。如圖6F-H所示，摻入3種較短寡聚物中的35S甲硫氨酸很少，這表明該反應主要是以分子內方式進行。下面示出了序列25-P(SEQ ID NO10)、13-P(SEQ ID NO9)、30-P(SEQ ID NO8)。
網織紅細胞裂解物。圖6H表明，除了上面所使用的大腸桿菌裂解物之外，還可在將35S-甲硫氨酸摻入43-P之前，利用兔網織紅細胞裂解物(參見下文)進行體外翻譯。該反應主要是以希望的分子內機制進行。
含有c-myc肽標記的融合體的合成和試驗還制備了代表性的融合體，該融合體在其蛋白部分含有c-myc單克隆抗體9E10的表位標記(Evan等，分子細胞生物學53610(1985))。
模板設計。設計了三種原始表位標記模板(即LP77、LP154和1號庫)，如圖7A-C所示。前兩個模板含有c-myc表位標記序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO2)，而第三個模板被設計成用于合成隨機篩選庫。LP77編碼12個氨基酸的序列，將其密碼子優化用于細菌翻譯。LP154及其衍生物含有33個氨基酸的mRNA序列，其中，將其密碼子優化用于真核翻譯。其所編碼的氨基酸序列MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO7)，相當于用于提取9E10抗體的原始肽。1號庫含有NNG/C的27個密碼子(用于產生隨機肽)，其后是一個相當于myc肽的最后7個氨基酸的序列(這7個氨基酸不是myc表位序列的一部分)。上述序列如下文所示。
網織紅細胞與小麥胚體外翻譯系統。在兔網織紅細胞和小麥胚提取物(Promega，Boehringer Mannheim)翻譯系統中試驗43-P、LP77、和LP154模板(圖8)。翻譯是在30℃的條件下進行60分鐘，模板是用dT25瓊脂糖在4℃下提取的。用15mM NaOH、1mM EDTA將模板從瓊脂糖上洗脫，用乙酸鈉/乙酸緩沖液中和，立即用乙醇沉淀(2.5-3體積)，洗滌(用100％的乙醇)，并在真空離心蒸發濃縮器上干燥。圖8表示在小麥胚和網織紅細胞系統中35S甲硫氨酸摻入到所有三種模板中。在源于網織紅細胞系統的融合反應物中觀察到較少的模板降解作用，因此，該系統被優選用于制備RNA-蛋白融合體。另外，一般真核系統優于細菌系統。因為真核細胞傾向于含有較低水平的核酸酶，在這種細胞中mRNA的壽命通常比在細菌細胞中的壽命長10-100倍。在使用一種特定大腸桿菌翻譯系統的試驗中，使用編碼c-myc表位的模板未觀察到融合體的產生；通過在不同的位點標記該模板證實了這可能是由于模板的RNA和DNA部分的降解所致。
為了檢驗所述融合體的肽部分，用RNase處理樣品，以除去編碼序列。在該處理之后，43-P產物大體上以與32P標記的30-P寡聚物相同的遷移率運動，這一結果與很小的肽(也許僅有甲硫氨酸)添加到30-P上一致。對于LP77來說，除去編碼序列所產生的產物具有低于30-P寡聚物的遷移率，這一結果與發現有12個氨基酸的肽添加到嘌呤霉素上一致。最后，對于LP154來說，除去編碼序列產生一種具有更低遷移率的產物，這一結果與有33個氨基酸序列連接到30-P寡聚物上一致。由于加樣誤差，在RNase-處理過的LP154網織紅細胞泳道上未發現寡聚物。在圖9中，證實該產物的遷移率與在小麥胚提取物中所產生的產物的遷移率相同。總之，以上結果表明能抗RNase的產物被添加到30-P寡聚物的末端，該產物的大小與所述編碼序列的長度成正比，而且，該產物的大小相當一致。另外，盡管兩種系統都能產生類似形式的產物，但由于網織紅細胞系統具有較高的模板穩定性，該系統是優選的。
對RNase A和蛋白酶K的敏感性。在圖9中用LP154融合體試驗了對RNase A和蛋白酶K的敏感性。如泳道2-4所示，在LP154模板上證實了35S甲硫氨酸的摻入。當用RNase A處理該產物時，該融合體的遷移率降低，但明顯高于32P標記的30-P寡核苷酸的遷移率，這一結果與33個氨基酸的肽添加到其3’末端一致。當同樣用蛋白酶K處理該材料時，35S的信號完全消失，這一結果同樣與發現該標記物存在于位于30-P片段的3’末端的一個肽上的事實一致。在使用43-P和LP77融合體的等同實驗中獲得了類似結果。
為了證實35S Met對所述模板的標記是由翻譯造成的，更具體地講，是由核糖體的肽基轉移酶活性造成的，試驗了各種抑制劑對標記反應的影響。真核肽基轉移酶的特定抑制劑茴香霉素、谷氏菌素、和稀疏霉素(Vazquez，蛋白合成的抑制劑(Springer-Verlag，紐約)，pp.312(1979))，以及轉運抑制劑環己酰亞胺和吐根堿(Springer-Verlag，紐約)，pp.312(1979))均能降低利用長的myc模板和網織紅細胞裂解物翻譯提取物形成RNA-肽融合體大約95％。
免疫沉淀實驗。在設計用于說明免疫沉淀一種mRNA-肽融合體效力的實驗中，試圖免疫沉淀通過體外翻譯產生的游離c-myc肽。圖10表示在SDS-PAGE肽凝膠上測定的上述實驗的結果。泳道1和2表明源于翻譯反應的標記材料含有RNA124(LP154的RNA部分)或β-珠蛋白mRNA。泳道3-8表示在幾個不同的緩沖條件下(如下文所述)使用c-myc單克隆抗體9E10的上述反應樣品的免疫沉淀。泳道3-5表示源于RNA124的肽能有效進行免疫沉淀，最好的結果出現在第四泳道，其中，提取了總TCA可沉淀部分的大約83％。泳道6-8顯示很少的β-珠蛋白，表明純化程度＞100倍。以上結果表明由RNA124以及LP154編碼的肽可以通過該免疫沉淀方法定量提取。
融合體的免疫沉淀。隨后，我們用LP154翻譯反應物和c-myc單克隆抗體9E10試驗了對嵌合RNA-肽產物進行免疫沉淀的能力(圖11)，通過免疫沉淀提取源于網織紅細胞反應的翻譯產物(如本文所披露的)，并用1μg RNaseA在室溫下處理30分鐘，以除去編碼序列。由此產生的5’OH通過T4多核苷酸激酶用32P標記，并通過變性PAGE測定。圖11表明，提取到的產物具有類似于用RNase處理LP154融合體所產生的c-myc表位與30-P的融合體的遷移率(參見上文)，不過，當僅翻譯所述模板的RNA部分(RNA124)時，不能產生相應的產物。在圖12中，測定了所提取的融合蛋白的量，并相對未修飾的30-P的量(在該圖中未示出)作圖。未修飾的接頭與接頭-myc融合體的比例的定量表明，0.2-0.7％的輸入信息被轉化成了融合產物。在存在較高的核糖體/模板比例的情況下，有較大比例的輸入RNA轉化成融合產物；在試驗過的輸入mRNA濃度范圍內，每毫升的翻譯提取物大約產生0.8-1.0×1012融合分子。
另外，我們的結果表明，連接在所述類型RNA上的肽是由其mRNA編碼的，即新生肽未轉移到某些其它mRNA的嘌呤霉素上。當接頭(30-P)與長的myc模板以高達20∶1的比例在翻譯提取物中共溫育時，未發現交叉轉移的跡象，而且游離接頭的存在也不會明顯降低所產生的長myc融合體的量。類似的，短模板43-P和長模板LP154的共翻譯僅產生所述模板單獨翻譯時出現的融合產物，而未發現具有中間遷移率的產物，這種產物是預計中的短模板與長myc肽的融合體。以上結果表明，融合體的形成主要出現在與同一個核糖體結合的新生肽和mRNA之間。
順序提取。為了進一步證實體外翻譯的LP154模板產物的性質，我們在兩種不同類型的層析介質上檢驗了上述產物的特征。硫代丙基(TP)瓊脂糖凝膠可以分離含有游離半胱氨酸的產物(例如，LP154產物，該產物具有一個靠近其C末端的半胱氨酸殘基)(圖13)。類似地，dT25瓊脂糖可以分離含有poly dA序列的模板(例如，30-P)(圖13)。圖14表明依次在TP瓊脂糖凝膠上和在dT25瓊脂糖上分離所產生的產物與僅在dT25瓊脂糖上分離的產物相同。所述體外翻譯產物含有poly-A尾和游離巰基的事實有力地說明，該翻譯產物是需要的RNA-肽融合體。
上述結果與合成mRNA-肽融合體并從體外翻譯提取物中回收完整的融合體的能力吻合。所合成的融合體的肽部分似乎具有需要的序列，這一點通過免疫沉淀和利用合適的層析技術進行提取得到了證實。根據上述結果，上述反應是分子內的，而且以模板依賴形式發生。最后，即使模板的修飾低于1％，該系統也有利于基于大約1013個分子的候選復雜性的篩選。
C-Myc表位回收篩選。為了篩選其它的c-myc表位，制備一個含有隨機化區域(參見圖7C和后述)的大的翻譯模板文庫(例如，1015個成員)。將該文庫用于制備大約1012-1013融合體(如本文所披露的)，用抗-c-myc抗體處理所述融合體(例如，通過免疫沉淀或使用固定在柱上或其它固體支持物上的抗體)，以便通過反復的體外篩選富集c-myc-編碼模板。
融合體生成模型。在不囿于具體理論的前提下，我們提出了一種融合體形成機制的模型，其中，翻譯正常開始，并且延伸進展到開放讀框的末端。當核糖體到達該模板的DNA部分時，翻譯停止。此時，所述復合體面臨兩種結果解離新生肽，或將新生肽轉移到位于該模板3’-末端的嘌呤霉素上。轉移反應的效率很可能受到多種因素的控制，這些因素影響停止翻譯的復合體的穩定性，并使得3’-嘌呤霉素殘基進入肽基轉移酶中心的A位點。在轉移反應之后，mRNA-肽融合體很可能仍然與核糖體配合，因為已知的釋放因子不能水解RNA和肽結構域之間的穩定的酰胺鍵。
延伸的經典模式(Watson，Bull.Soc.Chim.Biol.461399(1964))和中間狀態模式(Moazed和Noller，自然342142(1989))需要A位點空出，以便嘌呤霉素進入肽基轉移酶中心。為了讓嘌呤霉素進入空的A位點，所述接頭必須是環繞核糖體外面的環或者直接由解碼位點通過A位點到達肽基轉移酶中心。本文所披露的資料不能清楚地區分這些不同模式，因為試驗過的最短的接頭(21個核苷酸)仍然長到足于環繞核糖體的外面。在核糖體結構的某些模式中(Frank等，自然376441(1995))，mRNA穿過沿所述解碼位點的任一側分布的通道，在這種情況下，有必要不讓接頭穿過上述通道，以便嘌呤霉素能通過A位點到達肽基轉移酶中心。
連接在所述接頭上的肽的同質性和長度，證實了新生肽向嘌呤霉素的轉移似乎比延伸過程慢。如果在延伸期間嘌呤霉素能與氨酰基tRNAs有效競爭，出現在融合產物中的接頭-肽融合體在大小方面將會不一致。另外，Met-融合體和未修飾的接頭之間在凝膠遷移率方面的相似性表明，核糖體似乎沒有讀入接頭區。dA3n應當編碼(賴氨酸)n，這肯定能降低接頭的遷移率。未穿過的mRNA的較慢的速率可以解釋融合體形成的速率慢于翻譯速率。初步結果表明，在低溫下延長翻譯后溫育之后，所產生的融合體量明顯增加，這也許是因為增加了用于將新生肽轉移到嘌呤霉素的時間。
詳細材料和方法下面披露了與體外翻譯和試驗包括具有myc表位標記的融合體在內的RNA-蛋白融合體相關的詳細材料和方法。
序列。上面將多種寡核苷酸用于制備RNA-蛋白融合體。這些寡核苷酸具有如下序列。名稱 序列30-P5′AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP(SEQ IDNO8)13-P5′AAA AAA AAA ACCP(SEQ ID NO9)25-P5′CGC GGT TTT TAT TTT TTT TTT TCC P(SEQ ID NO10)43-P5′rGrGrA rGrGrA rGrGrA rArArU rGAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA ACCP(SEQ ID NO11)43-P[CUG]5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA AAA ACCP(SEQ ID NO12)40-P5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA ACCP(SEQ ID NO13)37-P5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA ACCP(SEQ ID NO14)34-P5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA AAAACCP(SEQ ID NO15)31-P5′rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA AAA AAA AAA AAA ACC P(SEQ ID NO16)LP775′rGrGrG rArGrG rArCrG rArArA rUrGrG rArArC rArGrArArArCrUrGrA rUrCrU rCrUrG rArArG rArArG rArCrC rUrGrA rArC AAA AAA AAAAAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP(SEQ ID NO1)LP1545′rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArArGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArGrCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArCrUrCrU rUrGrC rGrCrU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCP(SEQ ID NO3)LP1605′5′rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrSrNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrSrNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rCrArG rCrUrGrCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA CCP(SEQ ID NO17)所有寡核苷酸是沿5’→3’方向排列的。核糖核苷酸堿基通過在該核苷酸符號前面加上小寫“r”表示的；P是嘌呤霉素；rN表示相同量的rA、rG、rC和rU；rS表示相同量的rG和rC；而且，所有其它堿基符號都表示DNA寡核苷酸。
化合物。鹽酸嘌呤霉素、長鏈烷基胺可控孔度玻璃、谷氏菌素、氯霉素、維及尼霉素、DMAP、二甲基三苯甲基氯、以及乙酸酐獲自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。吡啶、二甲基甲酰胺、甲苯、琥珀酸酐、和對硝基苯酚獲自Fluka Chemical(Ronkonkoma，NY)。β-珠蛋白mRNA獲自Novagen(Madison，WI)。TMV RNA獲自Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
酶。蛋白酶K獲自Promega(Madison，WI)。無DNase的RNase酶通過Sambrook等的方法(同上)生產或者從Boehringer Mannheim公司購買。T7聚合酶是通過由Zawadzki和Gross改進的(核酸研究191948(1991))、由Grodberg和Dunn公開的方法(細菌學雜志1701245(1988))制備的。T4 DNA連接酶獲自New EnglandBiolabs(Beverly，MA)。
放射性標記物摻入的定量。對于放射性凝膠帶來說，通過在一臺Betagen 603印跡分析儀(Betagen，Waltham，MA)上定量或使用磷成像板(分子動力學，Sunnyvale，CA)測定每一條帶中所存在的放射性標記物(35S或32P)的量。對于液體和固體樣品而言，通過閃爍計數(Beckman，Columbia，MD)測定存在的放射性標記物35S或32P的量。
凝膠成像。通過放射自顯影(使用柯達XAR膠片)或使用磷成像板(分子動力學)獲得凝膠圖象。
CPG嘌呤霉素的合成。合成CPG-嘌呤霉素的詳細方案如上文所述。
酶促反應。一般，利用大腸桿菌提取物制備激酶、轉錄、PCR、和翻譯反應的核酸的方法是相同的。每一種制備方法均由用等體積的1∶1的苯酚-氯仿萃取開始，然后離心并分離水相。分別以300mM和1mM的最終濃度加入乙酸鈉(pH5.2)和亞精胺，添加3倍體積的100％乙醇，并在-70℃下溫育20分鐘以使所述樣品沉淀。以大于12,000g的速度離心樣品，除去上清液，用過量的、溫度為0℃的95％乙醇洗滌沉淀。然后在真空條件下干燥所得到的沉淀，并重新懸浮。
寡核苷酸。合成的所有DNA和RNA都是在一臺MilliporeExpedite合成儀上使用由生產商(Milligen，Bedford，MA)提供的各自的標準化學法合成的。含有3’嘌呤霉素的寡核苷酸是使用裝有30-50mg固體支持物的CPG嘌呤霉素柱合成的(大約20μmol嘌呤霉素/克)。含有3’生物素的寡核苷酸是使用購自Glen Research(Sterling VA)的1μmol bioteg CPG柱合成的。含有5’生物素的寡核苷酸是通過添加bioteg亞磷酰胺(Glen Research)作為5’堿基而合成的。待連接到RNA分子3’末端的寡核苷酸要么在去保護之前通過化學方法將其5’末端磷酸化(使用購自Glen Research的化學磷酸化試劑)，要么在去保護之后使用ATP和T4多核苷酸激酶(NewEngland Biolabs)酶促磷酸化。通過添加25％的NH4OH并在55℃下溫育12小時將僅含有DNA(以及3’嘌呤霉素或3’生物素)的樣品去保護。通過將乙醇(25％(v/v))添加到NH4OH溶液中并在55℃下溫育12小時將含有RNA單體(例如，43-P)的樣品去保護。在室溫下，用溶解在THF(Sigma)中的1M TBAF將2’OH去保護48小時。用NAP-25Sephadex柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)除去TBAF。
然后，通過使用變性PAGE純化去保護的DNA和RNA樣品，然后浸泡或使用Elutrap(Schleicher和Schuell，Keene，NH)從凝膠中電洗脫，并使用上述的NAP-25 Sephadex柱或乙醇沉淀方法脫鹽。
Myc DNA構建。構建兩種含有c-myc表位標記的DNA模板。第一種模板是通過以下兩種寡核苷酸的組合制成的64.27(5’-GTT CAGGTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATAGTG AGT CGT ATT A-3’)(SEQ ID NO18)和18.109(5’-TAA TACGAC TCA CTA TAG-3’)(SEQ ID NO19)。用該模板轉錄產生的RNA47.1能編碼肽MEQKLISEEDLN(SEQ ID NO20)。將RNA47.1連接到30-P上得到圖7A所示的LP77。
首先，以單鏈寡核苷酸的形式制備第二種模板，該模板長99個堿基，名稱為RWR99.6，序列為5’-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTCCAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTCTTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3’)(SEQ ID NO21)。通過PCR構建含有該序列的雙鏈轉錄模板，PCR是使用寡聚物RWR21.103(5’-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3’)(SEQ ID NO22)和RWR63.26(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTATTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3’)(SEQ ID NO23)按照公開的方案進行的(Ausubel等，同上，第15章)。用該模板轉錄產生的RNA被稱為RNA124，它編碼肽MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO24)。該肽含有用于制備(與載體蛋白結合)單克隆抗體9E10的序列(癌基因科學技術公報)。RNA124的長度為124個核苷酸，將RNA124與30-P連接產生如圖7B所示的LP154。RNA124的序列如下(SEQ ID NO32)5′-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrGrGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArArGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrGrArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrUrUrGrC rGrCrU-3′
隨機化庫的構建。以單鏈寡核苷酸的形式構建隨機化庫，其長度為130個堿基，并命名為RWR130.1。從3’末端開始，其序列為3’-CCCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC(NNS)27GTC GAC GCA TTG AGA TACCGA-5’(SEQ ID NO25)。N表示隨機位點，該序列是通過標準合成方法產生的。S表示dG和dC堿基的等量混合物。PCR是使用寡核苷酸42.108(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTTACA ATT ACA)(SEQ ID NO26)和21.103(5’-AGC GCA AGA GTTACG CAG CTG)(SEQ ID NO27)進行的。該模板轉錄所產生的RNA被命名為庫130.1。將庫130.1與30-P連接得到圖7C所示的1號庫(也被稱作LP160)。
按照公開的方法(Ausubel等，同上)進行7輪PCR，僅有以下例外(i)RWR130.1的起始濃度為30納摩爾，(ii)每一種引物的使用濃度為1.5μM，(iii)每一種堿基的dNTP濃度為400μM，和(iv)Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的使用濃度為每100μl五個單位。在非變性PAGE上純化雙鏈產物，并通過電洗脫提取。通過260nm波長下的UV吸收值和與已知的標準物進行溴化乙啶熒光比較測定DNA的量。
RNA的酶促合成。由雙鏈PCR DNA進行的轉錄反應和寡核苷酸的合成是按照以前披露的方法進行的(Milligan和Uhlenbeck，酶學方法18051(1989))。按照上述方法通過變性PAGE純化完整長度的RNA，電洗脫，并脫鹽。估算庫RNA濃度時使用的消光系數為1300O.D./μM；RNA124，1250O.D./μM；RNA47.1，480O.D./μM。由雙鏈庫DNA轉錄產生大約90納摩爾的庫RNA。
RNA嘌呤霉素綴合物的酶促合成。通過類似于由Moore和Sharp(科學250992(1992))所披露的方法，用被稱為19.35(5’-TTTTTT TTT TAG CGC AAG A)(SEQ ID NO28)的DNA裂片將myc和庫mRNA序列連接到含有嘌呤霉素的寡核苷酸上。反應物由摩爾比為0.8∶0.9∶1.0的mRNA、裂片、和嘌呤霉素寡核苷酸(30-P，dA27dCdCP)組成，并且，每皮摩爾庫mRNA含有1-2.5單位的DNA連接酶。反應在室溫下進行1小時。為了構建庫RNA融合體，mRNA的濃度為大約6.6μM。在連接之后，按照上述酶促反應的方法制備RNA-嘌呤霉素綴合物。重新懸浮沉淀，在變性PAGE上純化全長融合體，并通過上述電洗脫提取。使用1650O.D./μM的消光系數估算庫RNA濃度，并用1600O.D./μM的消光系數估算myc模板的濃度。這樣，制備了2.5納摩爾的綴合物。
制備dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖。在室溫下，在TE(10mM Tris-HClpH8.2，1μM EDTA)中以1-10μM的濃度將含有3’生物素的dT25(在bioteg亞磷酰胺柱(Glen Resesarch)上合成)與鏈霉抗生物素瓊脂糖漿體(體積為50％的瓊脂糖，Pierce，Rockford，IL)一起溫育1小時，并洗滌。然后通過生物素-dT25從溶液中的消失和/或通過用已知量的互補寡核苷酸滴定所述樹脂，通過光學方法估計所述瓊脂糖的結合能力。
用大腸桿菌產生的提取物和核糖體進行的翻譯反應。一般，翻譯反應是用購買的試劑盒(例如，用作線性模板的的大腸桿菌S30提取物，Promega，Madison，WI)進行的。不過，也可使用大腸桿菌MRE600(獲自ATCC，Rockville，MD)按照公開方法(例如，Ellman等，酶學方法202301(1991))制備S30提取物，并通過Kudlicki等所披露的方法(分析生物化學206389(1992))制備核糖體部分。標準反應是在以20-40μCi的35S甲硫氨酸為標記的50μl體積中進行的。該反應混合物包括30％的提取物v/v，9-18mM MgCl2，40％的無甲硫氨酸預混合物(Promega)v/v和5μM模板(例如，43-P)。為了進行共溫育試驗，以5μM的濃度添加寡聚物13-P和25-P。對于使用核糖體的試驗來說，將3μl核糖體溶液加入每一個反應中，取代所述裂解物。所有反應物均在37℃下溫育30分鐘。在酶促反應下按上述方法純化模板。
小麥胚翻譯反應。圖8所示的翻譯反應是使用購買的缺少甲硫氨酸的試劑盒(Promega)，按照生產商的推薦進行的。對于43-P來說，模板濃度為4μM，而對于LP77和LP154來說，模板濃度為0.8μM。反應是在25℃下進行，在總體積為25μl的反應物中含有30μCi的35S甲硫氨酸。
網織紅細胞翻譯反應。用購買的試劑盒(Novagen，Madison，WI)或使用按照公開方案(Jackson和Hunt，酶學方法96∶50(1983))制備的提取物進行翻譯反應。富含網織紅細胞的血液獲自Pel-FreezBiologicals(Rogers，AK)。在以上兩種情況下，反應條件為推薦用于Red Nova裂解物(Novagen)的方法。反應物包括100mM KCl，0.5mM乙酸鎂，2mM DTT，20mM HEPES pH7.6，8mM磷酸肌酸，25μM的每一種氨基酸(甲硫氨酸例外，如果使用35S Met的話)，和40％v/v的裂解物。在30℃下溫育1小時。模板濃度取決于試驗，但通常在50nM-1μM的范圍內，43-P除外(圖6H)，它的濃度是4μM。
為了制備隨機化庫，以大約0.1μM的模板濃度(1.25納摩爾的模板)進行10ml的翻譯反應。另外，在該反應中包括32P標記的模板，以便確定在純化和篩選過程的每一個步驟中所存在的材料的量。在30℃下翻譯1小時，然后將反應物在冰上冷卻30-60分鐘。
用dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖提取融合體。溫育之后，將翻譯反應物用提取緩沖液(1.0M NaCl，0.1M Tris-HCl pH8.2，10mM EDTA，1mm DTT)稀釋大約150倍，該緩沖液含有摩爾數超過10倍以上的dT25-生物素-鏈霉抗生物素瓊脂糖，其dT25濃度為大約10μM(漿體的體積等于或大于裂解物的體積)，并在4℃下攪拌溫育1小時。然后通過過濾(Millipore ultrafree MC濾器)或離心從該混合物中除去瓊脂糖，并用冷卻的提取緩沖液洗滌2-4次。然后用50-100μl的15mM NaCl，1mM EDTA反復洗滌，將所述模板從dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖上釋出。將洗脫液立即中和在3M乙酸鈉pH5.2，10mM亞精胺中，并用乙醇沉淀。對于所述庫反應來說，回收到的總的放射性表明，大約回收到了50-70％的投入模板。
用硫代丙基瓊脂糖凝膠分離融合體。如圖13所示，可以使用硫代丙基瓊脂糖凝膠6B(Pharmacia)純化含有半胱氨酸的融合體。在本文所披露的實驗中，分離是直接用翻譯反應物進行的或者在初步分離所述融合體之后(例如，用鏈霉抗生物素瓊脂糖)進行的。例如，直接純化時使用比例為1∶10(v/v)的裂解物和瓊脂糖凝膠。對于所述庫來說，將0.5ml的瓊脂糖凝膠漿體用于從5ml反應混合物中分離所有的融合材料。將樣品稀釋到溶解在1XTE8.2(10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.2)中的硫代丙基瓊脂糖凝膠的50∶50(v/v)漿體中，所述緩沖液含有無RNase的DNase(Boehringer Mannheim)，并在4℃下旋轉溫育1-2小時，以便充分反應。除去多余的液體，用含有20mM DTT的提取緩沖液反復洗滌瓊脂糖凝膠，并通過離心或過濾回收。用溶解在10mM Tris-Cl pH8.2，1mM EDTA的25-30mM二硫蘇糖醇(DTT)溶液將融合體從瓊脂糖凝膠上洗脫。然后通過上述在高真空下蒸發和乙醇沉淀的組合方法濃縮該融合體。對于庫反應來說，所回收到的總的放射活性表明，大約1％的模板被轉化成融合體。
對某些用途來說，將dT25加入該洗出物中，并在4℃下旋轉溫育1小時。用冰鎮的提取緩沖液漂洗瓊脂糖3次，通過過濾分離，并按照上述方法洗脫結合材料。加入載體tRNA，并用乙醇沉淀融合產物。將樣品重新懸浮在含有無RNaseA的DNase的TE pH8.2中，以除去所述模板的RNA部分。
免疫沉淀反應。從翻譯反應物中分離肽的免疫沉淀(圖10)是這樣進行的將4μl網織紅細胞翻譯反應物、2μl正常小鼠血清、和20μl蛋白G+A瓊脂糖(Calbiochem，La Jolla，CA)與200μl的PBS(58mM磷酸氫二鈉、17mM磷酸二氫鈉、68mM氯化鈉)、稀釋緩沖液(10mM Tris-ClpH8.2，140mM氯化鈉，1％v/v TritonX-100)、或PBSTDS(PBS+1％Triton X-100，0.5％脫氧膽酸，0.1％SDS)混合。然后在4℃下轉動樣品1小時，接著以2500rpm的速度離心15分鐘。除去洗脫液，加入10μl c-myc單克隆抗體9E10(Calbiochem，La Jolla，CA)和15μl蛋白G+A瓊脂糖，并在4℃下轉動2小時。然后用1ml體積的PBS、稀釋緩沖液、或PBSTDS洗滌樣品2次，將40μl的凝膠加樣緩沖液(Calbiochem產品簡報)加入所述混合物中，并將20μl混合物加樣到變性PAGE上，如Schagger和von Jagow所披露的(分析生物化學166368(1987))。
將8μl網織紅細胞翻譯反應物與300μl稀釋緩沖液(10mMTris-Cl pH8.2，140mM氯化鈉，1％v/v Triton X-100)，15μl蛋白G瓊脂糖凝膠(Sigma)，10μl(1μg)c-myc抗體9E10(Calbiochem)混合，然后在4℃下轉動數小時。分離之后洗滌樣品，用無RNase A的DNase處理，用多核苷酸激酶和32PγATP標記，并通過變性尿素PAGE分離(圖11)。
融合體庫的逆轉錄。按照Superscript II的生產商的推薦進行逆轉錄反應，所不同的是，模板、水和引物僅在70℃下溫育2分鐘(Gibco BRL Grand Island，NY)。為了監測延伸反應，將50μCiα32P dCTP加入某些反應物中。在其它反應中，用5’32P-標記的引物監測逆轉錄，所述引物是用32PαATP(New England Nuclear，Boston，MA)和T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)制備的。
制備蛋白G和抗體瓊脂糖凝膠。用稀釋緩沖液(10mM Tris-HClpH8.2，140mM NaCl，0.025％的NaN3，1％v/v Triton X-100)洗滌2份50μl的蛋白G瓊脂糖凝膠漿體(體積百分比為50％的固體)(Sigma)，并通過離心分離。保存第一份樣品，以便用作篩選基質之前預裝柱。將第二份樣品重新懸浮在稀釋緩沖液里，然后加入40μg c-myc AB-1單克隆抗體(Oncogene Science)，在4℃下旋轉溫育該反應物過夜。在微量離心機中以1500-2500rpm的速度離心15分鐘，純化抗體瓊脂糖凝膠，并用稀釋緩沖液洗滌1-2次。
篩選。提取融合體并合成互補鏈，然后將整個逆轉錄反應物直接用于篩選過程。本文披露了兩種方法。第一輪，將逆轉錄反應物直接加入按上述方法制備的抗體瓊脂糖凝膠中，并溫育2小時。在隨后的輪次中，將所述反應物與洗滌過的蛋白G瓊脂糖凝膠溫育大約2小時，然后再加入抗體柱上，以減少與蛋白G而不是固定化抗體相互作用的結合體的數量。
為了從所述基質上洗脫所述庫，可以采用幾種方法。第一種方法是用4％的乙酸洗滌所述篩選基質。該方法能將肽從所述基質上釋出。另外，可以用更嚴格的洗滌(例如使用尿素或其它變性劑)取代所述乙酸方法或者與該方法一起使用。
篩選的融合體的PCR。用上文所述的用于構建所述庫的標準方法，通過PCR擴增篩選的分子。
β-珠蛋白融合體的合成和測試為了合成β-珠蛋白融合體結構，按照生產商推薦的方法通過用200皮摩爾引物18.155(5’GTG GTA TTT GTG AGC CAG)(SEQ ID NO29)和Superscript逆轉錄酶(Gibco BRL)進行逆轉錄，由2.5μg珠蛋白mRNA制備β-珠蛋白cDNA。引物的序列互補于β-珠蛋白的5’終止密碼子的18個核苷酸。為了增加一個T7啟動子，取出20μl逆轉錄反應物，并用引物18.155和40.54(5’TAA TAC GAC TCA CTATAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C)(SEQ ID NO30)進行6個輪次的PCR。然后按照Milligcn和Uhlenbeck披露的方法(酶學方法18051(1989))，通過T7失控轉錄制備“合成-β-珠蛋白”mRNA，按照本文所披露的方法對該RNA進行凝膠純化，電洗脫，并脫鹽。然后按照Moore和Sharp的方法(科學256992(1992))使用引物20.262(5’TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G)(SEQ ID NO31)作為裂片，通過將合成-β-珠蛋白結構連接到30-P上產生“LP-β-珠蛋白”。然后對連接反應的產物進行上文所述的凝膠純化，電洗脫，以及脫鹽。通過其在260nm波長下的吸收值測定最終產物的濃度。
然后如表1所示各自在25μl的總體積中體外翻譯上述β-珠蛋白模板。添加25mM的Mg2+母液。所有反應均在30℃下溫育1小時，并放在-20℃下過夜。然后用6μl的裂解物和平均負背景測定可由dT25沉淀的CPM’s兩次。
表1用β-珠蛋白模板進行的翻譯反應反應樣品 Mg2+35S-Met TCA CPM dT25CPM(mM) (μl)(2μl)(6μl)1 --- 1.0 2.0(20μCi) 3312 02 2.5μg 0.5 2.0(20μCi) 33860 36合成-β-珠蛋白3 2.5μg 1.0 2.0(20μCi) 22470 82合成-β-珠蛋白4 2.5μg 2.0 2.0(20μCi) 15696 86合成-β-珠蛋白5 2.5μg 0.5 2.0(20μCi) 32712 218LP-β-珠蛋白6 2.5μg 1.0 2.0(20μCi) 24226 402LP-β-珠蛋白7 2.5μg 2.0 2.0(20μCi) 15074 270LP-β-珠蛋白為了制備凝膠分析所使用的樣品，將6μl的每一種翻譯反應物與1000μl的提取緩沖液(1M NaCl 100mM Tris-Cl pH8.2。10mMEDTA，0.1mM DTT)，1μl RNase A(無Dnase，Boehringer Mannheim)，和20μl的20μM的dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖混合。在4℃下旋轉溫育樣品1小時。除去過量的提取緩沖液，將該樣品加入Millipore MC濾器中，以除去所有殘留的提取緩沖液。然后用50μl的水洗滌樣品4次，用50μl的15mM NaOH，1mM EDTA洗滌兩次。用100μl TE pH6.8(10mM Tris-Cl，1mM EDTA)中和樣品(300μl)，加入1μl的1mg/mlRNaseA(同上)，在37℃下溫育樣品，然后加入10μl的2XSDS加樣緩沖液(125mM Tris-Cl pH6.8，2％ SDS，2％ β-巰基乙醇，20％甘油，0.001％溴酚蘭)，將該樣品凍干，并重新懸浮在20μl水和1％β-巰基乙醇中。然后按照Schagger和von Jagow所披露的方法(分析生物化學166368(1987))將樣品加樣到肽分離凝膠上，并通過放射自顯影觀察。
以上實驗的結果示于圖15A和15B中。如圖15A所示，35S-甲硫氨酸結合到了合成-β-珠蛋白和LP-β-珠蛋白融合體的蛋白部分中。該蛋白是不一致的，不過一條強的帶表明了預期的β-珠蛋白mRNA的遷移率。另外，如圖15B所示，在dT25分離和RNaseA消化之后，在合成-β-珠蛋白泳道上不再有35S-標記的材料(圖15B，泳道2-4)。相反，在LP-β-珠蛋白泳道上，觀察到了大小一致的35S-標記的產物。
上面的結果表明，只有當模板含有3’嘌呤霉素時才能通過寡核苷酸親和層析提取到融合產物。這一結果得到了閃爍計數(參見表1)的證實。所獲得的材料預計含有與β-珠蛋白的某一部分融合的30-P接頭。通過凝膠分析判斷該融合產物的大小似乎十分均勻。不過，由于該產物具有非常類似于天然β-珠蛋白的遷移率(如15A和15B，對照泳道)，難于確定該融合產物的蛋白部分的確切長度。進一步優化RNA-蛋白融合體的形成業已發現某些因素能進一步提高RNA-肽融合體形成的效率。融合體的形成，即新生肽鏈由其tRNA向位于mRNA 3’末端的嘌呤霉素的轉移是一種緩慢的反應，該反應是繼最初的、較快的開放讀框的翻譯之后進行的，所述翻譯過程產生新生肽。通過翻譯后在高Mg2+條件下(優選地，在50-100mM范圍內)溫育和/或在RNA和嘌呤霉素部分之間使用更有柔性的接頭可明顯加強融合體形成的程度。另外，在低溫下(優選-20℃)長時間(12-48小時)溫育，也能導致融合體產量的提高，與在30℃下溫育相比，有較少的mRNA降解。通過綜合以上因素，可將高達40％的投入的mRNA轉化成mRNA-肽融合產物，如下文所述。
mRNA-嘌呤霉素綴合物的合成。在這些優化實驗中，在有互補DNA裂片的條件下用噬菌體T4 DNA連接酶將含有嘌呤霉素的接頭寡核苷酸連接到mRNA的3’末端，基本上如上文所述，因為T4 DNA連接酶傾向于在連接接點附近的精確堿基配對，T7、T3、或SP6 RNA聚合酶的失控轉錄產物在其3’末端通常是不一致的(核酸研究158783(1987))，僅有含有正確的3’-末端核苷酸的RNA能有效地連接。當使用標準DNA裂片時，大約有40％的失控轉錄產物連接到嘌呤霉素寡聚物上。使用過量的RNA可以提高連接產物的量，但使用過量的嘌呤霉素核苷酸不能提高連接產物的量。并不囿于特定的理論，連接的限制因素似乎是完全互補于所述DNA裂片的相應部分的RNA的量。
為了連接其3’末端具有一個額外的非模板核苷酸的轉錄物(被稱為“N+1產物”)，使用標準DNA裂片和在連接結合點處具有一個額外的隨機堿基的新的DNA裂片的混合物。在有上述混合DNA裂片的情況下，可將一種代表性myc RNA模板(即RNA124)的連接效率提高到高于70％。
除了上述改進的DNA裂片方法之外，通過考慮以下3個因素可進一步優化mRNA-嘌呤霉素綴合物形成的效率。首先，優選設計或使用這樣的mRNAs它缺少具有任何明顯的穩定二級結構的3’末端，這種結構會干擾與裂片寡核苷酸的退火。另外，由于高濃度的鹽有時會導致連接反應的失敗，該方法優選包括一個用NAP-25柱對所述寡核苷酸進行徹底脫鹽的步驟。最后，由于連接反應比較迅速，而且，在室溫下通常在40分鐘之內結束，一般不會使用較長的溫育時間，而且，較長的溫育時間通常會導致RNA的不必要降解。
使用上述條件按如下方法合成了mRNA-嘌呤霉素綴合物。用標準DNA裂片(例如，5’-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA)或在連接點處含有隨機堿基(N)的裂片(例如，5’-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA)將myc RNA序列(RNA124)連接到含有嘌呤霉素的寡核苷酸上。反應物包括mRNA、DNA裂片、和嘌呤霉素寡核苷酸，其摩爾比為1.0∶1.5-2.0∶1.0。首先將上述成分的混合物在94℃下加熱1分鐘，然后在冰上冷卻15分鐘。連接反應是在室溫下，在50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25μg/ml BSA、15μM嘌呤霉素寡聚物、15μM mRNA、22.5-30μM DNA裂片、濃度為1U/μl的RNase蛋白抑制劑(Promega)、和每皮摩爾嘌呤霉素寡聚物1.6單位的T4 DNA連接酶中進行的。在溫育之后，將EDTA以30mM的終濃度加入，并用苯酚/氯仿萃取反應混合物。通過變性PAGE純化完整長度的綴合物，并通過電洗脫提取。
通用網織紅細胞翻譯條件。除了改善mRNA-嘌呤霉素的綴合物的合成之外，還要對翻譯反應作如下進一步的優化。反應是在由不同商業渠道獲得的兔網織紅細胞裂解物中進行的(Novagen，Madison，WI；Amersham，Arlington Heights，IL；Boehringer Mannheim，Indinapolis，IN；Ambion，Austin，TX；和Promega，Madison，WI)。典型的反應混合物(25μl終體積)包括20mM HEPES pH7.6，2mM DTT，8mM磷酸肌酸，100mM KCl。0.75mM乙酸鎂，1mMATP，0.2mMGTP，25μM的每一種氨基酸(如果使用35S-Met的話，0.7μM的甲硫氨酸)，濃度為1U/μl的RNase蛋白抑制劑，和60％(v/v)裂解物。模板的終濃度在50-800nM的范圍內。對于每一種溫育來說，將除裂解物之外的所有成分在冰上仔細混合，并在使用之前將冰凍的裂解物解凍。在添加裂解物之后，通過溫和的移液重復混合該反應混合物，并在30℃下溫育以便開始翻譯。對于不同的mRNAs來說，Mg2+和K+的最佳濃度分別在0.25-2mM和75-200mM的范圍內變化，并且優選通過預備實驗確定。特別地，對于翻譯較差的mRNAs來說，有時也要優化氯高鐵血紅素、磷酸肌酸、tRNA、和氨基酸的濃度。對于融合反應來說，KCl通常要優于乙酸鉀，不過，氯化鉀和乙酸鉀的混合物有時能產生更好的效果。
在30℃下翻譯30-90分鐘，然后將該反應物放在冰上冷卻40分鐘，并加入Mg2+。將在這一步驟中加入的Mg2+終濃度相對不同的mRNA模板優化，不過，通常在50-100mM范圍內(對于混合模板庫來說優選使用50mM)。將所得到的混合物在-20℃下溫育16-48小時。為了觀察標記過的融合產物，將2μl反應混合物與4μl加樣緩沖液混合，并將該混合物在75℃下加熱3分鐘。然后將所得到的混合物加樣到6％甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠上(32P-標記的模板)或加樣到8％麥黃酮SDS-聚丙烯酰胺凝膠上(35S-Met-標記的模板)。除了該方法之外，還可以用dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖或硫代丙基瓊脂糖凝膠(或同時用這兩種材料)分離所述融合產物，基本上如本文所披露的。
為了除去RNA-接頭-嘌呤霉素-肽綴合物的RNA部分，以便隨后通過SDS-PAGE進行分析，在翻譯后溫育之后添加適量的EDTA，并用microcon-10(或microcon-30)柱將所述反應混合物脫鹽。將所得到的混合物(大約共25μl)與18μl RNaseH緩沖液(30mMTris-HCl，pH7.8，30mM硫酸銨，8mM氯化鎂，1.5β-巰基乙醇，和適量的互補DNA裂片)混合，并將該混合物在4℃下溫育45分鐘。然后加入RNaseH，并在37℃下消化20分鐘。
嘌呤霉素寡聚物的質量。對于有效制備融合產物來說，嘌呤霉素寡核苷酸的質量同樣是重要的。5’-DMT，2’-琥珀酰，N-三氟乙酰嘌呤霉素與CPG的連接不如標準寡核苷酸的連接有效。因此，要仔細監測連接反應，以避免CPG與太低濃度的偶聯嘌呤霉素的形成，而且將CPG上的未反應的氨基完全淬火，以避免隨后合成缺少3’-末端嘌呤霉素的寡核苷酸。避免使用含有極細目數的顆粒的CPG同樣很重要，因為這種顆粒會導致在隨后的自動寡核苷酸合成步驟中出現堵塞閥的問題。
另外，優選在大規模使用之前試驗合成的嘌呤霉素寡聚物，以確保嘌呤霉素在3’-末端的存在。在我們的實驗中，如果嘌呤霉素被主要在其3’-末端含有氨基的脫氧腺苷所取代，則監測不到融合體。為了監測3’羥基的存在(即缺少3’-末端嘌呤霉素的不希望的寡核苷酸的合成)，可以首先用放射性標記嘌呤霉素寡聚物(例如，通過5’-磷酸化)，然后將其用作引物，由末端脫氧核苷酸基轉移酶進行延伸。在有3’-末端嘌呤霉素部分存在的情況下，不會出現延伸產物。
翻譯和翻譯后溫育的時間過程。翻譯反應比較迅速，而且，通常在30℃下在25分鐘內完成。不過，所述融合反應比較慢。當在30℃下使用標準接頭(dA27dCdCP)時，再用45分鐘融合體的合成會達到最高水平。翻譯后溫育可以在低溫度下進行，例如在室溫、0℃、或-20℃下進行。在-20℃下發現mRNA模板的降解較少，在-20℃下溫育兩天之后，獲得了最佳的融合效果。
Mg2+濃度的作用。在翻譯后溫育中，高濃度的Mg2+可大大促進融合體的形成。例如，對于上述mycRNA模板來說，在-20℃下進行的16小時的溫育中，在有50mM Mg2+的條件下，用標準接頭(dA27dCdCP)可提高融合體形成3-4倍(圖17，比較泳道3和4)。類似地，當所述反應是在室溫下進行30-45分鐘時，在有50-100mM Mg2+的濃度下進行的翻譯后溫育中也會出現有效的融合體形成。
接頭長度和序列。還實驗了接頭長度對融合反應的影響。在21-30個核苷酸(n＝18-27)的范圍內，觀察到了融合反應效率的較小的變化(如上文所述)。接頭越短(例如，13個核苷酸長)，效率越低。另外，盡管特定的較大長度的接頭(即，45個核苷酸和54個核苷酸)有時也會導致較低的效率，但仍然有可能將較長的接頭用于優化融合反應的效率。
就接頭序列而言，用核糖核苷酸殘基取代靠近3’末端的脫氧核糖核苷酸不會顯著改變其融合效率。不過，位于接頭3’末端dCdCP(或rCrCP)序列對于融合體形成來說很重要。用dUdUP取代dCdCP明顯較低融合體形成的效率。
接頭柔性。還實驗了接頭柔性對融合反應的影響。在這些實驗中，如果所述接頭的剛性因為與位于其3’末端的互補核苷酸退火而提高，則測得的融合效率低。類似地，當使用柔性更大的接頭(例如，dA27C9C9C9dAdCdCP，其中，C9表示HO(CH2CH2O)3PO2)，可明顯提高其融合效率。與標準接頭(dA27dCdCP)，采用柔性更大的接頭(dA27C9C9C9dAdCdCP)可以提高RNA124的融合效率4倍以上(圖17，比較泳道1和9)。另外，與具有標準接頭的模板相反，這種模板在缺少高濃度Mg2+的條件下其翻譯后融合進行的很差(圖17，比較泳道3和4)，具有柔性接頭的模板不需要高濃度Mg2+以便在-20℃下進行的延長的翻譯后溫育中產生高產量的融合產物(圖17，比較泳道11和12)。因此，如果不需要翻譯后添加高濃度的Mg2+的話，這種接頭是非常有用的。另外，柔性接頭也能在有高濃度Mg2+的條件下產生最佳的融合產率。
融合效率的定量。融合效率可以用翻譯肽轉化成融合產物的比率或投入的模板轉化成融合產物的比率表示。為了測定翻譯肽轉化成融合產物的比率，使用35S-Met標記的翻譯肽。在這些實驗中，當使用dA27dCdCP或dA27rCrCP接頭時，在30℃下進行1小時的翻譯溫育之后，有大約3.5％的翻譯肽與其mRNA融合。在-20℃下進行溫育過夜之后，這一數值可提高到12％。當翻譯后溫育是在有高濃度的Mg2+的條件下進行時，50％以上的翻譯肽與所述模板融合。
對于具有柔性接頭的模板來說，在30℃下翻譯溫育1小時之后，大約25％的翻譯肽與模板融合。在-20℃下進行溫育過夜之后，這一數值可提高到超過50％，而且如果翻譯后溫育是在有50mM Mg2+的條件下進行，可提高到超過75％。
為了測定所投入的模板轉化成融合產物的百分比，用32P-標記的mRNA-接頭模板進行翻譯。當使用柔性接頭，而且翻譯后溫育是在不添加Mg2+的條件下在-20℃下進行的時，當投入的RNA模板的濃度分別為800、400、200、100、和50nM時，所投入的模板的大約20％、40％、40％、35％、和20％被轉化成mRNA-肽融合體(圖18)。當翻譯后溫育是在有50mM Mg2+的條件下進行時，獲得了類似結果。用獲自Novagen、Amersham、或Ambion的裂解物獲得了最佳結果(圖19)。
如果mRNA模板較長的話，通過SDS-PAGE測定的mRNAs和mRNA-肽融合體之間的遷移率差別很小。在這種情況下，可以用32P標記模板的接頭的5’末端。然后在翻譯/溫育之后，在有互補DNA裂片的條件下，用RNaseH消化長的RNA部分，并通過定量未修飾過的接頭與接頭-肽融合體的比率測定融合效率。與RNaseA消化相比，這種酶的消化能產生3’-P和5’-OH，該方法所具有的優點是，位于接頭5’末端的32P不會被除去。
在翻譯后溫育中進行的分子內與分子間融合。除了上述實驗之外，我們還試驗了在有Mg2+的條件下在-20℃下進行的融合反應是分子內性質的還是分子間性質的。在上述翻譯和翻譯后溫育條件下，將游離接頭(dA27dCdCP或dA21C9C9C9dAdCdCP，其中C9是-O(CH2CH2O)3PO2)與含有一個DNA接頭但在其3末端沒有嘌呤霉素的模板共溫育。在這些實驗中，沒有可檢測量的(即低于正常水平的2％)35S-Met摻入接頭-肽產物中，表明翻譯后融合主要是發生在新生肽與結合于相同核糖體上的mRNA之間。
優化結果。如上文所述，通過使用柔性接頭和/或在有高濃度Mg2+的條件下進行翻譯后溫育，融合效率可提高到大約為投入mRNA的40％。以上結果表明，每1毫升的體外翻譯反應混合物可以產生多達1014個mRNA-肽融合體分子，產生用于體外篩選實驗中的具有極高復雜性的mRNA-肽融合體庫。RNA-蛋白融合體的篩選富集我們業已證實了通過基于其所編碼的肽將一種特定的RNA-肽融合體從隨機序列融合體的復合庫中富集起來而將RNA-肽融合體用于篩選和進化實驗的可行性。具體地講，我們制備了一系列混合物，其中，將少量的已知序列(在這種情況下是長myc模板LP154)與某種量的隨機序列庫(即LP160)混合。翻譯該混合物，并通過本文所披露的寡核苷酸和二硫親和層析篩選RNA-肽融合產物。用抗-myc單克隆抗體選擇性地免疫沉淀myc-模板融合體(圖16A)。為了測定在該篩選步驟中獲得的富集程度，在有放射性標記的引物的條件下通過PCR擴增來自免疫沉淀之前和之后的cDNA/mRNA-肽融合體混合物的等分試樣。用能裂解myc模板序列不能裂解所述庫的限制性內切酶消化擴增的DNA(圖16B和16C)。對裂解和非裂解DNA的比例的定量表明，通過免疫沉淀使myc序列相對隨機文庫富集了20-40倍。
以上實驗是按如下方法進行的。
翻譯反應。翻譯反應的進行大體上如上文所述。具體地講，是按照生產商的說明(Novagen)在30℃下進行反應1小時，并在-20℃下冷凍過夜。制備了兩種形式的六個樣品，一種含有35S甲硫氨酸，而另一種含有以52μM的終濃度添加的冷卻甲硫氨酸。反應物1-6含有表2所示量的模板。表2中的所有數字表示每25μl反應混合物中的模板的皮摩爾數。
表2用于摻雜篩選中的模板比例反應 LP154 LP1601 --- ---25---312040.12050.01 206---20dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖的制備。用TE8.2(10mM Tris-ClpH8.2，1mM EDTA)洗滌鏈霉抗生物素瓊脂糖(Pierce)3次，并以1∶1(v/v)漿液的比例重新懸浮于TE8.2中。然后加入用Bioteg CPG(Glen Research)合成的3’生物素酰T25至需要的最終濃度(通常為10或20μM)，并在攪拌條件下溫育1小時。然后用TE8.2洗滌dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖3次，并在4℃下保存待用。
從翻譯反應物中純化模板。為了從翻譯反應物中純化模板，取出每一種反應物25μl，并加入7.5ml的提取緩沖液(1M NaCl，100mMTris-Cl pH8.2，10mM EDTA，0.1mM DTT)和125μl的20μM dT25鏈霉抗生物素瓊脂糖中。在4℃下旋轉溫育該溶液1小時。對所述試管進行離心，并除去洗脫劑。添加1ml的提取緩沖液，重新懸浮該漿體，并將該混合物轉移到1.5ml的微量離心管中。然后用1ml的冰鎮提取緩沖液的等分試樣洗滌所述樣品4次。將來自相同反應的熱的和冷的樣品合并在Millpore MC過濾裝置中，并通過用2體積的100μl水，0.1mM DTT和2體積的15mM NaOH，1mM EDTA從dT25瓊脂糖上洗脫。
向該洗脫液中添加40μl洗滌過的50％硫代丙基瓊脂糖凝膠(Pharmacia)漿體，并在4℃下旋轉溫育1小時。然后用1ml體積的TE8.2洗滌所述樣品3次，除去洗脫液。將1μl的1MDTT加入固體中(總體積大約為20-30μl)，并溫育該樣品若干小時，取出，并用20μl的水洗滌4次(總體積90μl)。通過UV吸收值判斷洗脫液中含有2.5mM的硫代吡啶酮。通過加入6μl 3M乙酸鈉pH5.2，10mM亞精胺，1μl糖原(10mg/ml，Boehringer Mannheim)，和170μl 100％的乙醇，并在-70℃下溫育30分鐘對50μl的上述樣品進行乙醇沉淀，并在微量離心機中以13,000pm的速度離心30分鐘。
逆轉錄酶反應。按如下方法對乙醇沉淀的和硫代吡啶酮洗脫的樣品進行逆轉錄反應。對于乙醇沉淀的樣品來說，向30μl的再懸浮模板中加水至48μl，并讓200皮摩爾的引物21.103(SEQ ID NO22)在70℃下退火5分鐘，并在冰上冷卻。向該樣品中加入16μl的第一鏈緩沖液(250mM Tris-Cl pH8.3，375mM KCl，和15mM MgCl2；購自Gibco BRL Grand Island，NY)，8μl 100mM DTT和4μl 10mMNTP，并在4℃下平衡，加入4μl Superscript II逆轉錄酶(GibcoBRL Grand Island，NY)。將水(13μl)加入TP瓊脂糖凝膠洗脫液(35μl)中，并按上述方法進行反應。溫育1小時，然后合并相同數目的樣品(總體積160μl)。保存每一種未篩選樣品的10μl樣品，用于PCR，并保存150μl的樣品用于免疫沉淀。
免疫沉淀。為了進行免疫沉淀，將170μl的逆轉錄反應物加入1ml的稀釋緩沖液(10mM Tris-Cl，pH8.2，140mM NaCl，1％v/v TritonX-100)和20μl蛋白G/A綴合物(Calbiochem，La Jolla CA)中，并在4℃下旋轉溫育1小時進行預澄清。除去洗脫液，加入20μl G/A綴合物和20μl單克隆抗體(2μg，12皮摩爾)，并將該樣品在4℃下旋轉溫育2小時。通過以2500rpm的速度離心5分鐘對該綴合物進行沉淀，除去洗脫液，并用1ml等分試樣的冰鎮稀釋緩沖液洗滌該綴合物3次。然后用1ml的冰鎮10mM Tris-Cl pH8.2，100mM NaCl洗滌該樣品。用3倍體積的冷凍4％乙酸除去結合的片段，并將該樣品凍干。
篩選過的和未篩選過的樣品的PCR。通過將20μl的濃縮NH4OH添加到10μl的未篩選的材料和全部篩選材料中并分別在55℃和70℃下溫育5分鐘進行PCR反應，并在90℃溫育以分解存在于該樣品中的所有RNA。并用真空離心蒸發濃縮器蒸發干燥該樣品。向每一種樣品中添加200μl的PCR混合物(1μM引物21.103和42.108，200μM溶解在PCR緩沖液+Mg2+中的dNTP(Boehringer Mannheim)，和2μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim))。對未篩選過的樣品2進行16個輪次的PCR，而對所有的其它樣品進行19個輪次的PCR。
然后按照表3所示，在有5’32P-標記的引物21.103的條件下對樣品進行擴增，并用Wizard直接PCR純化試劑盒(Promega)分別純化2次，以便除去所有引物和較短的片段。
表3篩選過的和未篩選過的PCR樣品的擴增樣品類型 體積輪次1 未篩選過的20μl 52 未篩選過的5μl 43 未篩選過的20μl 54 未篩選過的20μl 55 未篩選過的20μl 56 未篩選過的20μl 51 篩選過的 20μl 52 篩選過的 5μl 43 篩選過的 20μl 54 篩選過的 20μl 75 篩選過的 20μl 76 篩選過的 20μl 7限制性消化。將由上述每一種PCR反應制備的32P標記的DNA以相同的量(以樣品的cpm計)加入表4所示的限制消化反應物中。每一個反應的總體積為25μl。將0.5μl的AlwnI(5個單位，NewEngland Biolabs)加入每一種反應物中。在37℃溫育樣品1小時，通過在65℃下溫育20分鐘使酶失活。然后將該樣品與10μl的變性加樣緩沖液(1ml超純甲酰胺(USB)，20μl 0.5M EDTA和20μl 1MNaOH)混合，加熱到90℃保持1分鐘，冷卻，并加樣到含有8M尿素的12％的變性聚丙烯酰胺凝膠上。電泳以后，用10％(v/v)乙酸，10％(v/v)甲醇，水固定所述凝膠。
表4限制性消化條件w/AlwnI樣品類型加入反應中的DNA的體積總體積1 未篩選過的 20μl 25μl2 未篩選過的 4μl 25μl3 未篩選過的 20μl 25μl4 未篩選過的 20μl 25μl5 未篩選過的 4μl 25μl6 未篩選過的 20μl25μl1 篩選過的20μl25μl2 篩選過 8μl 25μl3 篩選過的12μl25μl4 篩選過的12μl25μl5 篩選過的20μl25μl6 篩選過的20μl25μl消化物的定量。用磷成像儀(Molecular Dynamics)對存在于樣品中的myc與庫DNA的量進行定量。存在于每一條帶中的材料量通過凝膠帶周圍的相同的矩形的總體積確定。存在于每一條帶中的總的cpm通過所述體積減去背景來計算。使用了背景的三個數值(1)在凝膠上進行計數的部位外面的相同方形的平均數；(2)可能出現myc帶的(在凝膠上的這一位置上不會出現帶)未篩選的庫的泳道中的cpm數；和(3)可以再現未篩選的泳道之間的10倍模板增量的近似值的歸一化值。圖16B和16C中的泳道2、3、和4表示靶序列與庫序列的富集。由于所述信號與該樣品的噪聲比的優化，在泳道3中可證明的富集(未篩選過的/篩選過的)產生了最大值(用方法1-3分別為17、43和27倍)。以上結果歸納于表5中。
表5Myc模板與庫的富集方法泳道2(20)泳道3(200) 泳道4(2000)1 7.016.6 5.72 10.4 43 393 8.727 10.2在第二組實驗中，用Wizard直接PCR純化試劑盒將這些相同的PCR產物純化一次，通過上面的方法(2)定量消化物。在這些實驗中，獲得了類似結果；測出相應于上面的泳道2、3和4的樣品分別富集了10.7、38和12倍。
蛋白篩選系統的應用本發明的篩選系統在很多領域具有商業用途，其中，蛋白質技術被用于解決治療、診斷或工業問題。這種篩選方法可用于改進或改變現有蛋白，并用于提取具有需要的功能的新的蛋白。所述蛋白可以是天然存在的序列，可以是天然存在的序列的改變形式，或者是部分或完全合成的序列。
新型結合試劑的提取。在一種具體用途中，本文所披露的RNA-蛋白融合技術可用于提取具有特定結合(例如，配體結合)特征的蛋白。具有高度特異的結合相互作用的蛋白可被用作非抗體識別劑，使得RNA-蛋白融合技術超過傳統的單克隆抗體技術。通過該方法提取的抗體-型試劑可用于使用傳統抗體的任何領域，包括診斷和治療目的。
人抗體的改進。本發明還可以用于改進人或人源化抗體，以便治療多種疾病中的任一種。在這種用途中，形成抗體文庫，并在體外篩選，消除了對諸如細胞融合或噬菌體展示技術的需要。在一種重要用途中，本發明可用于改善單鏈抗體文庫(Ward等，自然341544(1989)；和Goulot等，分子生物學雜志213617(1990))。為了這一用途，其可變區可以由人源構建(以便降低受體不利的免疫反應的可能性)或者可以含有完全隨機化的框(以使該文庫的復雜性最大)。為了篩選改進的抗體分子，檢驗候選分子庫對一種靶分子(例如，如圖2所示的固定化抗原)的結合能力。隨著篩選從一輪進行到下一輪，對結合步驟施加越來越高的嚴格條件。為了提高嚴格性，改變諸如洗滌步驟的次數、過量競爭劑的濃度、緩沖條件、結合反應的時間長度、以及固定化基質篩選的條件。
可將單鏈抗體直接用于治療或者間接用于標準抗體的設計。這種抗體具有多種潛在用途，包括提取抗-自身免疫抗體，免疫抑制，以及開發諸如Aids的病毒性疾病的疫苗。
新型催化劑的提取。本發明還可用于篩選新型催化蛋白。以前，業已將體外篩選和進化用于提取新型催化RNAs和DNAs，而在本發明中，將其用于提取新型蛋白酶。在該方法的一種具體實例中，可以通過篩選對催化劑轉變狀態的化學類似物的結合，間接提取催化劑。在另一種具體實例中，可以通過篩選與一種底物(例如，使用與一種親和標記連接的底物)形成的共價鍵或通過裂解(例如，通過篩選裂解特殊鍵并因此從固體支持物上釋放出一個文庫中的催化性成分的能力)進行直接提取。
這種提取新型催化劑的方法與催化性抗體技術相比至少具有兩個重要優點(參見Schultz等的綜述，J.Chem.Engng.News6826(1990))。首先，在催化抗體技術中起始庫通常被局限于免疫球蛋白折疊；相反，RNA-蛋白融合體的起始文庫可以是完全隨機的或者可以包括，但不限于已知酶結構或蛋白支架的變體。另外，催化抗體的提取通常取決于首先篩選對轉變態反應類似物的結合，隨后是對活性抗體的費勁的篩選；同樣，相反，可以用RNA-蛋白融合體文庫方法直接篩選催化劑，正如早先用RNA文庫所證實的。在提取蛋白酶的另一種方法中，可以組合使用轉變-態-類似物和直接篩選方法。
通過該方法獲得的酶具有很高的價值。例如，目前就存在著需要新型、有效的工業催化劑的壓力，這種催化劑可以改進化學過程。本發明的一個主要優點是，所述篩選可以在任意的條件下進行，而且舉例來說，并不局限于體內條件。因此，本發明有利于提取新型酶或現有酶的改進的變體，這種酶能進行高度特異的轉化(因此降低不需要的副產物的形成)，同時可以在預定的環境下起作用，在高溫、高壓、或高溶質濃度環境下工作。
體外相互作用阱。RNA-蛋白融合技術還可用于篩選cDNA文庫和根據蛋白-蛋白相互作用克隆新的基因。通過該方法，可以從需要的來源制備cDNA文庫(例如，通過Ausubel等的方法，同上，第5章)。對每一種候選cDNAs分子來說，連接(例如，使用上文所披露的用于制備LP77、LP154和LP160的技術)一個肽受體(例如，嘌呤霉素尾)。然后按照本文所披露的方法制備RNA-蛋白融合體，并按照上述方法測定該融合體(或該融合體的改進形式)與特定分子的相互作用的能力。如果需要，可以通過以下方法在上述過程中避免終止密碼子和3’UTR區(i)添加抑制劑tRNA，以便能通讀其終止區，(ii)通過免疫沉淀除去翻譯反應物中的釋放因子，(iii)組合(i)和(ii)，或(iv)除去所述DNA序列上的終止密碼子和3’UTR。
由于相互作用步驟是在體外進行的，這樣可以利用非特異競爭劑、溫度、和離子條件仔細控制反應嚴格性。具有非可水解類似物(例如ATP與ATPgS)的正常小分子的改變，提供了篩選相同分子不同構象子的區別特征。由于篩選的結合配偶體的RNA序列是共價連接的，該方法可用于許多蛋白的克隆和功能性鑒定，并因此便于提取。另外，該技術可用于鑒定大約50-100,000個人基因的功能和相互作用，所述基因的序列目前正通過人類基因組工程進行測定。
將RNA-蛋白融合體用于小嵌片方案“DNA嵌片”包括固定化寡核苷酸或cDNA或基因組DNA的克隆片段的空間特定排列，并可具有諸如快速測序和轉錄仿型的用途。通過讓RNA-蛋白融合體的混合物(例如，由細胞DNA或RNA庫制備)與這樣的DNA嵌片退火，可以產生一種“蛋白展示嵌片”，其中，相應于一個固定化序列的每一個點能夠與所述RNA-蛋白融合體庫中的其相應的RNA序列退火。通過該方法，相應的蛋白因為其與自身mRNA的連接被以空間限定的方式固定，而含有DNA序列組的嵌片展示相應的蛋白組。另外，如果所述融合體文庫是由cDNAs或基因組DNAs的較小片段產生的，可以展示這些蛋白的肽片段。
這種級別的蛋白和肽的展示具有很多用途。例如，它是一種用于鑒定以前未知的蛋白-蛋白相互作用的有效工具。在一種具體方案中，對一種探針蛋白進行可檢測的標記(例如，用熒光染料標記)，并將標記過的蛋白與蛋白展示嵌片一起培養。通過該方法，能夠確定能與探針蛋白結合的蛋白，所述測定是根據所述嵌片上由于結合了所述探針而被標記的斑點的位置而作出的。另一種用途是快速測定通過修飾酶的作用(例如，蛋白激酶，乙酰轉移酶，和甲基轉移酶)而被化學修飾過的蛋白。通過與感興趣的酶和放射性標記過的底物一起培養所述蛋白展示嵌片，然后進行洗滌和放射自顯影，可以方便地確定作為所述修飾過的酶的底物的蛋白的位置和性質。另外，該方法在有序展示小的肽的方面的應用，可以進一步定位所述修飾位點。
蛋白展示技術可以用固定在任何合適的固體支持物上的一系列核酸(包括RNA，但優選DNA)進行。典型的固體支持物可以由諸如玻璃(例如，玻璃板)、硅或硅玻璃(例如小嵌片)、或金(例如，金板)的材料制成。用于將核酸連接在上述固體表面的特定部位上的方法，例如，光能無機營養方法在本領域中是眾所周知的，并可將其用于制備本發明使用的固體支持物(如DNA嵌片)。用于這一目的的典型方法包括，但不限于Schena等，科學270467-470(1995)；Kozal等，自然醫學2753-759(1996)；Cheng等，核酸研究24380-385(1996)；Lipshutz等，生物技術19442-447(1995)；Pease等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915022-5026(1994)；Fodor等，自然364555-556(1993)；Pirrung等，美國專利US5,143,845；和Fodor等，WO92/10092。
權利要求
1.一種用于篩選需要的蛋白的方法，包括以下步驟a)提供一群候選RNA分子，每一個分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于一個候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；和c)篩選所需要的RNA-蛋白融合體，從而篩選所需要的蛋白。
2.一種用于篩選編碼一種需要的蛋白的DNA分子的方法，該方法包括以下步驟a)提供一群候選RNA分子，每一個分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于一個候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；c)篩選所需要的RNA-蛋白融合體；和d)由所述融合體的RNA部分制備一種編碼所需要的蛋白的DNA分子。
3.一種用于篩選相對參考蛋白而言具有改變了的功能的蛋白的方法，該方法包括以下步驟a)由一群DNA模板產生一群候選RNA分子，所述候選DNA模板各有一個不同于所述參考蛋白編碼序列的候選蛋白編碼序列，所述RNA分子各自包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于所述候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；和c)篩選具有改變了的功能的RNA-蛋白融合體，從而篩選具有改變了的功能的蛋白。
4.一種用于篩選編碼一種相對參考蛋白而言具有改變了的功能的蛋白的DNA分子的方法，該方法包括以下步驟a)由一群候選DNA模板生產一群候選RNA分子，所述候選DNA模板各自具有不同于所述參考蛋白編碼序列的候選蛋白編碼序列，所述RNA分子各自包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于所述候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且各自在其3’末端可操作地連接一個肽受體；b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群RNA-蛋白融合體；c)篩選具有改變了的功能的RNA-蛋白融合體；和d)由所述融合體的RNA部分制備一種編碼具有改變了的功能的蛋白的DNA分子。
5.一種用于篩選需要的RNA的方法，該方法包括以下步驟a)提供一群候選RNA分子，其中的每一個RNA分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于所述候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且在所述每一個候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接一個肽受體；b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；和c)篩選所需要的RNA-蛋白融合體，從而篩選所需要的RNA。
6.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述肽受體是嘌呤霉素。
7.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述每一個候選mRNA分子還包括一個間歇序列或還包括一個共價連接于該RNA分子3’末端的DNA或DNA類似物序列。
8.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述候選RNA分子群至少包括1013個不同的RNA分子。
9.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述體外翻譯反應是在由真核細胞或其部分制備的裂解物中進行的。
10.如權利要求9中的方法，其中，所述體外翻譯反應是在網織紅細胞裂解物中進行的。
11.如權利要求9中的方法，其中，所述體外翻譯反應是在小麥胚裂解物中進行的。
12.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述體外翻譯反應是在由細菌細胞或其部分制備的裂解物中進行的。
13.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述篩選步驟包括將所述需要的蛋白結合到一種固定的結合配偶體上。
14.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述篩選步驟包括測定所述所需蛋白的功能活性。
15.如權利要求2或4的方法，其中，所述DNA分子是擴增的。
16.如權利要求1、3或5的方法，其中，所述方法還包括重復步驟(a)-(c)。
17.如權利要求2或4的方法，其中，所述方法還包括由所述DNA分子轉錄RNA分子，并重復步驟(a)-(d)。
18.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述RNA通過一個酰胺鍵共價連接于所述RNA-蛋白融合體中的蛋白上。
19.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述RNA共價連接于所述RNA-蛋白融合體中的蛋白上，所述共價鍵能夠抗核糖體的裂解。
20.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，在體外翻譯步驟之后，在有50-100mM Mg2+的條件下進行培養。
21.如權利要求1-5中任一項的方法，其中，所述RNA-蛋白融合體還包括一個靠近所述肽受體的核酸或核酸類似物序列，它能提高其柔性。
22.一種通過權利要求1-5中任一項的方法篩選的RNA-蛋白融合體。
23.一種分子，包括通過酰胺鍵共價連接于蛋白上的核糖核酸。
24.如權利要求23分子，其中，所述蛋白是由所述核糖核酸編碼的。
25.如權利要求23分子，其中，所述核糖核酸是mRNA。
26.一種分子，包括共價連接于蛋白上的核糖核酸，所述蛋白完全是由所述核糖核酸編碼的。
27.如權利要求26分子，其中，所述核酸是mRNA。
28.一種分子，包括共價連接于蛋白上的核糖核酸，所述共價鍵能抗核糖體的裂解。
29.如權利要求28分子，其中，所述核糖核酸是mRNA。
30.一種核糖核酸，包括可操作地連接于候選蛋白編碼序列上的翻譯起始序列和起始密碼子，所述核糖核酸共價連接于所述候選蛋白編碼序列3’末端的肽受體上。
31.一種篩選需要的蛋白或需要的RNA的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一群候選RNA分子，其中的每一個RNA分子包括一個翻譯起始序列和一個可操作地連接于一個候選蛋白編碼序列上的起始密碼子，而且各自通過所述候選蛋白編碼序列的3’末端可操作地連接于一個肽受體上；(b)體外或原位翻譯所述候選蛋白編碼序列，以產生一群候選RNA-蛋白融合體；(c)讓所述RNA-蛋白融合體群體與一種對所述RNA-蛋白融合體的RNA部分或蛋白部分專一的結合配偶體接觸，接觸條件為基本上能將所述結合配偶體-RNA-蛋白融合體復合體與所述群體的未結合的成員分離；(d)從所述復合體上釋放出結合的RNA-蛋白融合體；和(e)讓來自步驟(d)的RNA-蛋白融合體群體與一種對所需要的RNA-蛋白融合體的蛋白部分具有專一性的結合配偶體接觸，接觸條件為基本上能將所述結合配偶體-RNA-蛋白融合體的復合體與所述群體的未結合的成員分離，從而篩選需要的蛋白和需要的RNA。
32.如權利要求31的方法，其中，所述方法還包括重復步驟(a)-(e)。
33.如權利要求31的方法，其中，所述肽受體是嘌呤霉素。
34.如權利要求31的方法，其中，所述每一個候選RNA分子還包括一個間歇序列或還包括一個共價連接于所述RNA分子的3’末端的DNA或DNA類似物序列。
35.如權利要求31的方法，其中，所述候選RNA分子群體至少包括1013種不同的RNA分子。
36.如權利要求31的方法，其中，所述體外翻譯反應是在由真核細胞或其部分制備的裂解物中進行的。
37.如權利要求36的方法，其中，所述體外翻譯反應是在網織紅細胞裂解物或小麥胚裂解物中進行的。
38.如權利要求31的方法，其中，所述體外翻譯反應是在由真核細胞或其部分制備的提取物中進行的。
39.如權利要求31的方法，其中，將所述結合配偶體中的至少一個固定在固體支持物上。
40.如權利要求31的方法，其中，在體外翻譯步驟之后，在有50-100mM Mg2+的條件下進行培養。
41.如權利要求31的方法，其中，所述RNA-蛋白融合體還包括一個靠近所述肽受體的核酸或核酸類似物序列，它能提高其柔性。
42.一種小嵌片，包括一系列固定化的單鏈核酸，所述核酸能與RNA-蛋白融合體雜交。
43.如權利要求42的小嵌片，其中，所述蛋白是由所述RNA編碼的。
全文摘要
本發明披露了用于篩選蛋白分子的方法和試劑,所述方法和試劑利用了RNA－蛋白融合體。
文檔編號G01N33/68GK1251593SQ98803511
公開日2000年4月26日 申請日期1998年1月14日 優先權日1997年1月21日
發明者J·W·索斯塔克, R·W·羅伯茨, 劉日河 申請人:綜合醫院公司