細(xì)胞分離方法

專利名稱：細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含有不同細(xì)胞的混合物的液體中僅分離并回收需要的細(xì)胞的方法。由此得到的細(xì)胞可用于治療各種疾病，如造血干細(xì)胞移植術(shù)，還可用于諸如免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等基礎(chǔ)科學(xué)。
背景技術(shù)：
日本專利JP-A-54-119012公開(kāi)了一種回收淋巴細(xì)胞的技術(shù)，是從體液如含有白細(xì)胞(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和紅細(xì)胞的血液中將白細(xì)胞俘獲于濾器上。
在造血干細(xì)胞移植術(shù)中，臍帶血干細(xì)胞作為造血干細(xì)胞的來(lái)源，不會(huì)對(duì)供血者造成任何侵害，它們的臨床應(yīng)用主要是在歐洲和美洲國(guó)家進(jìn)行了有力的嘗試。不象其他的造血干細(xì)胞移植(即骨髓移植術(shù)和外周血干細(xì)胞移植術(shù))那樣，由于從供血者采集來(lái)的臍帶血干細(xì)胞很少在采集后立即移植給病人，因此它們?cè)诓杉笮枰２?，留在以后使用。這樣的保藏常常是需要的，尤其是在無(wú)關(guān)的環(huán)境下。在對(duì)臍帶血進(jìn)行深低溫保藏前，有必要將有核細(xì)胞分離出來(lái)并除去紅細(xì)胞，以防止融化后紅細(xì)胞裂解的副作用，并減少深低溫保藏過(guò)程中的體積。目前，在多數(shù)情況下，臍帶血在分離后進(jìn)行保藏(“外周血干細(xì)胞移植術(shù)”第173頁(yè)，NANKODO公司)。JP-B-8-69公開(kāi)了用菲可-海帕克(Ficoll-Hypaque)法分離臍帶血的方案細(xì)節(jié)，這是一種使用具有調(diào)整過(guò)的比重的液體的離心方法，下文中稱之為“菲可法”。但是，菲可法也有不足，表現(xiàn)在它僅在實(shí)驗(yàn)室水平上可行，并需要十分麻煩和費(fèi)時(shí)的操作。國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)第WO96/17514號(hào)公開(kāi)了一種袋系統(tǒng)，和通過(guò)使用羥乙基淀粉進(jìn)行凝集和沉淀，以得到濃縮的有核細(xì)胞懸液，從而分離臍帶血中的紅細(xì)胞的方法，以及用該方法得到的細(xì)胞懸液。此方法稍優(yōu)于常規(guī)方法-菲可法，因?yàn)檫@種方法涉及較少的麻煩操作，但由于需要進(jìn)行兩次離心，因而也是一種費(fèi)時(shí)的方法。
另一方面，也報(bào)道了一些分離造血干細(xì)胞的方法，用來(lái)取代菲可法以及紅細(xì)胞的凝集與去除。JP-A-8-104643公開(kāi)了一種回收造血干細(xì)胞的方法，它是通過(guò)將造血干細(xì)胞捕獲于可滲透紅細(xì)胞的濾器上，然后使一液體以與第一液體流向相反的方向流動(dòng)。但是，該方法僅使用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)作為回收用液體。
葡聚糖是一種由葡萄糖單元作為單體單元而組成的多糖，這些單體單元主要由α-1，6鍵連接。葡聚糖很早就被用作分離白細(xì)胞的試劑。但是，運(yùn)用葡聚糖分離白細(xì)胞，利用了葡聚糖作為血凝劑的作用。當(dāng)試管中的紅細(xì)胞凝集并沉淀后，如果需要，可進(jìn)行離心，然后用滴液管回收上清液中的白細(xì)胞(Shiro Miwa，Rinsho Kensa GijutsuZensho，第3卷，“Ketsueki Kensa”第425頁(yè))。此作用不僅僅是葡聚糖的特性，因?yàn)榱u乙基淀粉等具有與葡聚糖相同的血凝作用。
其次，下文描述了分離造血干細(xì)胞的系統(tǒng)。JP-A-7-184991公開(kāi)了一種采集臍帶血的裝置，特別是除去臍帶血中的諸如聚集體(如微聚集體)、組織顆粒、骨顆粒、脂瘤等污染物的濾器，該濾器在血液收集用容器之前提供。但是，該濾器不是用來(lái)俘獲應(yīng)回收的細(xì)胞，而是為了清除污染物。即使偶爾在濾器中使用了能俘獲造血干細(xì)胞的材料，本參考資料也根本未描述被俘獲的造血干細(xì)胞的回收。
JP-A-8-52206公開(kāi)了一種用作采集臍帶血的、包含膜類型血漿分離器的裝置，用于從所采集的臍帶血中分離造血干細(xì)胞。本參考文獻(xiàn)也公開(kāi)了另外一種使用密度梯度分離裝置進(jìn)行分離的方法，即用菲可法進(jìn)行分離。
本發(fā)明旨在提供一種方法，通過(guò)簡(jiǎn)單而快捷的過(guò)程，將期望回收的細(xì)胞(下文稱作“欲回收細(xì)胞”或“所需細(xì)胞”)從所需細(xì)胞和非所需細(xì)胞(下文稱作“欲去除細(xì)胞”)的混合物中分離出來(lái)。該過(guò)程包含一種細(xì)胞分離方法，即利用諸如過(guò)濾含有細(xì)胞混合物的液體等俘獲方式俘獲所需細(xì)胞，然后以高回收率回收被俘獲細(xì)胞。本發(fā)明還提供了將本方法具體實(shí)施于臨床而得到的管線系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了用于所述系統(tǒng)的回收液，以及使用該方法而得到的含細(xì)胞的液體。
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明人注意到了從細(xì)胞俘獲裝置回收細(xì)胞的液體的性能，并認(rèn)真地研究了這些性能，得出結(jié)論認(rèn)為當(dāng)使用具有特定粘度的回收液回收細(xì)胞時(shí)，可以獲得高回收率。對(duì)各種回收液組成進(jìn)行認(rèn)真研究后，結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了這樣一種驚人的效果，即用含有葡聚糖的生理溶液回收細(xì)胞時(shí)，可獲得非常高的回收率。這樣，就實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種細(xì)胞分離方法，它包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入一個(gè)能充分俘獲欲回收細(xì)胞而充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置。然后，將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從該細(xì)胞俘獲裝置中除去。接著，將粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收那些已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面涉及一種細(xì)胞分離和保藏方法，它包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入一個(gè)能充分俘獲欲回收細(xì)胞而充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置。將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從該細(xì)胞俘獲裝置中除去，并將粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收那些已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。然后將所回收的細(xì)胞予以保藏。
本發(fā)明的另一方面涉及一種細(xì)胞分離和保藏方法，它包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入一個(gè)能充分俘獲欲回收細(xì)胞而充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置。將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從該細(xì)胞俘獲裝置中除去，并將粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收那些已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。然后，所回收的細(xì)胞進(jìn)行深低溫保藏和融化。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及一種細(xì)胞分離系統(tǒng)，它包含一個(gè)能充分俘獲欲回收細(xì)胞并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置，該裝置至少有一個(gè)入口和一個(gè)出口。一根用于將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入該細(xì)胞俘獲裝置的管線連接于該細(xì)胞俘獲裝置入口的上游。一根用于將液體加入該細(xì)胞俘獲裝置的管線連接于該細(xì)胞俘獲裝置出口的下游。一根用于從該細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線連接于該細(xì)胞俘獲裝置入口的上游。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及一種細(xì)胞分離方法，它包含以下步驟通過(guò)連接于該細(xì)胞俘獲裝置入口上游的管線，將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲欲回收細(xì)胞，并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)。將所得含有欲去除細(xì)胞的液體通過(guò)該細(xì)胞俘獲裝置的出口除去，然后通過(guò)連接于該細(xì)胞俘獲裝置出口下游的管線，將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中，以通過(guò)連接于該細(xì)胞俘獲裝置入口上游的管線，回收已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面涉及一種含有造血干細(xì)胞的液體，它基本上不合紅細(xì)胞和/或血小板，其粘度為不高于500mPa·s且不低于5mPa·s。
本發(fā)明的另一方面涉及一種含有欲回收細(xì)胞且基本上不含欲去除細(xì)胞的液體，它是通過(guò)一種細(xì)胞分離方法得到的，該方法包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入一種細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲欲回收細(xì)胞，并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)。將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從該細(xì)胞俘獲裝置中除去，然后將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面涉及一種用于從細(xì)胞俘獲裝置回收被俘獲細(xì)胞的液體，其粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為本發(fā)明細(xì)胞分離系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案。
圖2為實(shí)施例1中所用細(xì)胞分離系統(tǒng)的示意圖。
圖3為實(shí)施例4中所用細(xì)胞分離系統(tǒng)的示意圖。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式在本說(shuō)明書中，“欲回收細(xì)胞”是指自其分離和回收后可用于某些目的的細(xì)胞?！坝コ?xì)胞”是指上述目的所不需要的細(xì)胞，或者是應(yīng)該明確去除的細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兪抢缰虏⌒约?xì)胞，它們對(duì)欲回收細(xì)胞的污染會(huì)帶來(lái)麻煩。
含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體可以是，但不限于外周血、骨髓、臍帶血(包括從臍帶血管和胎盤血管采集的血液)、淋巴液以及對(duì)上述液體進(jìn)行諸如離心等處理而得到的液體，以及將從任何各種器官或組織提取的細(xì)胞再懸浮于某些液體中而得到的懸液。
術(shù)語(yǔ)“有核細(xì)胞”是指其中有核的細(xì)胞。有核細(xì)胞包括諸如白細(xì)胞、粒細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、髓細(xì)胞、成紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、輔助T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。
“含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分”是指含有造血干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞(下文中將它們統(tǒng)稱為“造血干細(xì)胞”)的單核細(xì)胞群?！皢魏思?xì)胞”是其中具有一個(gè)核的細(xì)胞的統(tǒng)稱，具體的例子包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)、單核細(xì)胞、造血干細(xì)胞、髓細(xì)胞、母細(xì)胞等。
單核細(xì)胞群中造血干細(xì)胞的含量通常為0.01％至99％，并根據(jù)起始細(xì)胞群的種類以及是否對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了處理而不相同。例如，對(duì)于一個(gè)正常人而言，造血干細(xì)胞的含量，在外周血中通常為約0.01％，在臍帶血中通常為0.05％至1.0％，在骨髓中通常為0.5％至2％。在給予了粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的外周血中，不同的個(gè)體之間的造血干細(xì)胞含量顯著不同，從0.1％至百分之幾不等。當(dāng)使用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞分離時(shí)，特別是使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分離時(shí)，在某些情況下，造血干細(xì)胞的含量可達(dá)99％。不管在何種情形下，術(shù)語(yǔ)“含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分”都絲毫未具體指定造血干細(xì)胞的含量。
本說(shuō)明書中所提到的無(wú)核細(xì)胞包括，例如，紅細(xì)胞和血小板。
本說(shuō)明書中所說(shuō)的“欲去除細(xì)胞與欲回收細(xì)胞有不同的表面標(biāo)志”，意思是欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞同樣都是有核細(xì)胞，但其表面標(biāo)志不同(欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞分屬不同的亞群)。例如，欲回收細(xì)胞是輔助T淋巴細(xì)胞(具有抗CD4抗原為表面標(biāo)志)，而欲去除細(xì)胞是抑制性T淋巴細(xì)胞(具有抗CD8抗原為表面標(biāo)志)。
當(dāng)欲回收細(xì)胞是有核細(xì)胞、欲去除細(xì)胞是無(wú)核細(xì)胞時(shí)，它們的組合及其用途的實(shí)例如下所述，但不限于這些1、欲回收細(xì)胞白細(xì)胞；欲去除細(xì)胞紅細(xì)胞；用途干擾素制備。
2、欲回收細(xì)胞淋巴細(xì)胞；欲去除細(xì)胞紅細(xì)胞和血小板；用途過(guò)繼免疫治療。
3、欲回收細(xì)胞含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分；欲去除細(xì)胞紅細(xì)胞和血小板；用途造血干細(xì)胞移植術(shù)。
當(dāng)欲回收細(xì)胞是有核細(xì)胞、欲去除細(xì)胞是具有不同于欲回收細(xì)胞的表面標(biāo)志的有核細(xì)胞時(shí)，它們的組合及其用途的實(shí)例如下所述，但并不限于這些1、欲回收細(xì)胞CD34陽(yáng)性有核細(xì)胞；欲去除細(xì)胞CD34陰性有核細(xì)胞；用途CD34陽(yáng)性細(xì)胞移植術(shù)。
2、欲回收細(xì)胞CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞；欲去除細(xì)胞CD8陰性T淋巴細(xì)胞；用途過(guò)繼免疫治療。
當(dāng)欲回收細(xì)胞為有核細(xì)胞、欲去除細(xì)胞為無(wú)核細(xì)胞和具有不同于欲回收細(xì)胞的表面標(biāo)志的有核細(xì)胞時(shí)，它們的組合及其用途的實(shí)例如下所述，但不限于這些1、欲回收細(xì)胞CD34陽(yáng)性有核細(xì)胞；欲去除細(xì)胞紅細(xì)胞、血小板和CD34陰性有核細(xì)胞；用途CD34陽(yáng)性細(xì)胞移植術(shù)。
2、欲回收細(xì)胞CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞；欲去除細(xì)胞紅細(xì)胞、血小板和CD8陰性T淋巴細(xì)胞；用途過(guò)繼免疫治療。
在本發(fā)明中，能至少俘獲欲回收細(xì)胞、并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置，可以包含一個(gè)容器，該容器有一個(gè)液體入口和一個(gè)液體出口，并裝滿了能俘獲欲回收細(xì)胞而充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的物質(zhì)，和一個(gè)模制容器，該模制容器在其內(nèi)表面有俘獲細(xì)胞的表層。能俘獲欲回收細(xì)胞并能充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的物質(zhì)，可以是任何常規(guī)的細(xì)胞俘獲物質(zhì)，只要它能選擇性地俘獲欲回收細(xì)胞即可。例如，下列物質(zhì)由于其良好的可塑性、可消毒性和低細(xì)胞毒性而成為優(yōu)選的物質(zhì)合成聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸樹(shù)脂、尼龍、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯等；天然聚合物，如瓊脂糖、纖維素、乙酸纖維素、殼多糖、脫乙酰殼多糖、藻酸鹽等；無(wú)機(jī)物，如羥磷灰石、玻璃、礬土、二氧化鈦等；以及金屬，如不銹鋼、鈦、鋁等。
這些俘獲物質(zhì)可以就原樣使用，或?qū)ζ浔砻孢M(jìn)行必要的修飾以選擇性地通過(guò)或俘獲細(xì)胞后再使用。例如，為了提高血小板的通透性，在國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)WO87/05812上記載了一種方法，用具有非離子性的親水基和堿性含氮官能團(tuán)的聚合物進(jìn)行涂覆。作為一種可選擇性地俘獲細(xì)胞的方法，可以使用對(duì)特定細(xì)胞具有親和力的配體，諸如氨基酸、肽、糖或糖蛋白(包括諸如抗體和粘附分子的生物配體)進(jìn)行固定的方法，例如，JP-A-2-261833中所提出的鹵代乙酰胺法。
俘獲物質(zhì)的形狀可以是顆粒、纖維團(tuán)、紡織織物、非紡織織物、海綿結(jié)構(gòu)、平板等。顆粒、纖維團(tuán)、紡織織物、非紡織織物和海綿結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兊膯挝惑w積具有較大的表面積。從便于加工的觀點(diǎn)出發(fā)，多孔結(jié)構(gòu)，如纖維團(tuán)、紡織織物、非紡織織物和海綿結(jié)構(gòu)更為優(yōu)選，其中，從細(xì)胞懸浮液的可流動(dòng)性和生產(chǎn)率角度出發(fā)，非紡織織物和海綿結(jié)構(gòu)是最為優(yōu)選的。
當(dāng)使用非紡織織物時(shí)，若織物表面上未固定所謂的能與特定細(xì)胞特異性結(jié)合的生物配體，如抗CD34單克隆抗體，則其纖維直徑一般不超過(guò)30μm并不小于1.0μm。優(yōu)選為不超過(guò)20μm并不小于1.0μm，更優(yōu)選為不超過(guò)10μm并不少于1.5μm。當(dāng)纖維直徑小于1.0μm時(shí)，欲回收細(xì)胞易被緊緊俘獲而變得難以回收，這是我們所不期望的。當(dāng)纖維直徑大于30μm時(shí)，欲回收細(xì)胞極易通過(guò)非紡織物質(zhì)，而不被纖維俘獲。這兩種結(jié)果都不理想，因?yàn)槎紝⒔档突厥章省?br> 當(dāng)使用海綿結(jié)構(gòu)時(shí)，其孔大小一般不超過(guò)25μm并不低于2.0μm，優(yōu)選為不超過(guò)20μm并不低于3.0μm，更優(yōu)選為不超過(guò)15μm并不低于4.0μm。當(dāng)孔的大小小于2.0μm時(shí)，流動(dòng)性會(huì)很低，由此使得經(jīng)過(guò)該海綿結(jié)構(gòu)的液體難以從其通過(guò)。當(dāng)孔的大小超過(guò)25μm時(shí)，欲回收細(xì)胞的俘獲率不期望地下降，導(dǎo)致回收率降低。
裝滿了能俘獲欲回收細(xì)胞而充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的物質(zhì)的容器，優(yōu)選但不限于使用下列具有良好可塑性、可消毒性和低細(xì)胞毒性的材料合成聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸樹(shù)脂、尼龍、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯、聚氯乙烯等；無(wú)機(jī)物，如羥磷灰石、玻璃、礬土、二氧化鈦等；以及金屬，如不銹鋼、鈦、鋁等。
在其內(nèi)表面上具有細(xì)胞俘獲表面的模制容器，即裝滿了細(xì)胞俘獲物質(zhì)的容器以外的細(xì)胞俘獲裝置的例子，可以是瓶、皿、錐形管、注射管、血袋等。
在本說(shuō)明書中，“充分俘獲欲回收細(xì)胞”是指俘獲了含細(xì)胞液體中的60％以上欲回收細(xì)胞。“充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)”是指含細(xì)胞液體中的60％以上欲去除細(xì)胞能夠通過(guò)。
在本發(fā)明中，已被細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞，通過(guò)使用具有特定粘度的液體(下文中也稱作“回收液”或“回收用液體”)進(jìn)行回收。此液體的粘度應(yīng)該不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s，優(yōu)選為不超過(guò)100mPa·s且不低于5mPa·s，更優(yōu)選為不超過(guò)50mPa·s且不低于7mPa·s。當(dāng)粘度低于5mPa·s時(shí)，回收率低，當(dāng)粘度高于500mPa·s時(shí)，液體很難從細(xì)胞俘獲裝置通過(guò)，即使是使用泵也很難，從而導(dǎo)致工作效率很低。并且，會(huì)導(dǎo)致壓力升高，使得管線中管之間連接處易發(fā)生滲漏。因此，這些粘度值都不是所期望的。測(cè)定粘度的優(yōu)選方法是使用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，因?yàn)樗詈?jiǎn)便，并具有較高的精密度。
任何液體都可用作回收液，只要其對(duì)細(xì)胞沒(méi)有什么不期望的影響即可。例如，可以使用合成聚合物溶液，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等的溶液；天然聚合物溶液，如甲基纖維素、明膠、羥乙基淀粉、葡聚糖、殼多糖衍生物、膠原蛋白、纖連蛋白、白蛋白、球蛋白等的溶液；有機(jī)物溶液，如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、山梨糖醇、甘油、二甲基亞砜、硅油等的溶液；以及它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明人的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用葡聚糖可以獲得特別高的回收率。因此，下文詳述葡聚糖的使用。
本文中的葡聚糖是指葡萄糖聚合物，其中多數(shù)葡萄糖單元由α-1，6鍵連接。葡聚糖包括其部分水解產(chǎn)物及其衍生物，如硫酸酯。盡管對(duì)葡聚糖的分子量沒(méi)有限制，但從其可溶性、可獲得性等考慮，其平均分子量?jī)?yōu)選為1,000-10,000,000，更優(yōu)選為5,000-5,000,000，最優(yōu)選為10,000-1,000,000。由于粘度即使在相同濃度時(shí)仍取決于分子量，因此濃度的分子量應(yīng)當(dāng)適當(dāng)調(diào)整，使得粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s。無(wú)菌葡聚糖40注射液(分子量為約40,000的葡聚糖在生理鹽水中的10w/v％溶液)是一種上市的、已獲得批準(zhǔn)的藥品，因而可以適當(dāng)?shù)厥褂?。為了將粘度調(diào)整為不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s，葡聚糖可以單獨(dú)使用或者與其他物質(zhì)混合使用。這些物質(zhì)的實(shí)例是合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等；天然聚合物，如甲基纖維素、明膠、羥乙基淀粉、葡聚糖、殼多糖衍生物、膠原蛋白、纖連蛋白、白蛋白、球蛋白等；有機(jī)物，如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、山梨糖醇、甘油、二甲基亞砜等。盡管目前仍不知道使用葡聚糖可以較高回收率回收細(xì)胞的機(jī)理，本發(fā)明人推測(cè)葡聚糖有降低細(xì)胞對(duì)俘獲物質(zhì)的粘附性的性能。
在配制粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體時(shí)，用于溶解溶質(zhì)的溶劑可以是生理鹽水，緩沖溶液，如Dulbecco磷酸鹽緩沖溶液(D-PBS)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)等，以及諸如RPMI1640等培養(yǎng)基。如有必要，為了提供營(yíng)養(yǎng)物、保護(hù)細(xì)胞膜或是提供抗凝效果等，可以在該液體中摻入葡聚糖、羥乙基淀粉、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、球蛋白、檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖(CPD)、酸-檸檬酸鹽-葡萄糖(ACD)、EDTA、肝素等。
按照本發(fā)明的具有特定粘度的液體優(yōu)選為能用于欲回收細(xì)胞的深低溫保藏或者以液態(tài)保藏細(xì)胞的液體。如上所述，對(duì)于造血干細(xì)胞移植術(shù)，特別是用臍帶血進(jìn)行造血干細(xì)胞移植術(shù)時(shí)，要對(duì)用菲可法或類似方法分離的不含紅細(xì)胞的細(xì)胞群進(jìn)行洗滌(因?yàn)榉瓶扇芤菏怯卸镜?，并向其中加入冷凍保護(hù)劑或類似物，以制備細(xì)胞懸液，接著在液氮或冰箱中進(jìn)行深低溫保藏，直到需要使用時(shí)。在本發(fā)明中，在完成細(xì)胞分離后配制擬保藏的細(xì)胞懸液時(shí)無(wú)需麻煩的操作，只需使用一種具有特定粘度的液體，該液體不僅適于保藏，特別是深低溫保藏，而且適合于回收。適于深低溫保藏并作為冷凍保護(hù)劑的回收用液體的具體實(shí)例是營(yíng)養(yǎng)物或細(xì)胞膜保護(hù)組分等。冷凍保護(hù)劑根據(jù)作用機(jī)制分為兩類1)胞外冷凍保護(hù)劑，和2)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑。在第一類中，一般使用水溶性聚合物，如羥乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等。在第二類中，一般使用低分子量有機(jī)化合物，如二甲基亞砜、甘油等。營(yíng)養(yǎng)物包括糖類，如葡萄糖等，以及各種細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞膜保護(hù)組分一般使用白蛋白。在有些情形下使用血漿作為營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞膜保護(hù)組分的混合物。如上所述，這些組分優(yōu)選單獨(dú)使用，或與具有本發(fā)明特定粘度的回收用液體結(jié)合使用。上述組分可以在細(xì)胞回收后進(jìn)行深低溫保藏時(shí)加入。
通常使用兩種冷凍方法，即使用-80℃下的深度冷凍機(jī)的單一方法，或包括在程控冰箱中緩慢冷卻并在液氮中保藏等步驟的方法。在對(duì)進(jìn)行了深低溫保藏的細(xì)胞進(jìn)行融化時(shí)，一般是在37℃的溫浴中進(jìn)行快速融化。
將本說(shuō)明書中所提到的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置的方法，可以采用下列兩種之一一是通過(guò)管子連接上含有含細(xì)胞液體的袋子或瓶子，然后利用其落差、滾柱泵或擠壓袋子使該液體流動(dòng)，從而加入該液體；二是將含有含細(xì)胞液體的注射器與其相連，通過(guò)手動(dòng)或使用諸如注射器泵等設(shè)備推動(dòng)該注射器的活塞而加入該液體。用手推動(dòng)的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單方便，而使用設(shè)備的特點(diǎn)是便于控制回收液加入時(shí)的流速。因此，應(yīng)根據(jù)不同目的而選擇合適的方法。
當(dāng)將含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置時(shí)，欲回收細(xì)胞會(huì)被俘獲，而欲去除細(xì)胞會(huì)流走，但在某些情形下，容器中仍會(huì)剩余少數(shù)欲去除細(xì)胞。因此，優(yōu)選清洗細(xì)胞俘獲裝置，以洗去少量剩余的欲去除細(xì)胞?？梢允褂萌魏吻逑磩?，只要它是生理溶液即可。其例子有生理鹽水、緩沖溶液如Dulbecco磷酸鹽緩沖液(D-PBS)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)等，以及諸如RPMI1640等培養(yǎng)基。如有必要，可以向上述生理溶液中加入葡聚糖、羥乙基淀粉、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、球蛋白、檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖(CPD)、酸-檸檬酸鹽-葡萄糖(ACD)、EDTA或肝素等，為的是提供營(yíng)養(yǎng)物，保護(hù)細(xì)胞膜或是提供抗凝效果等。
加入清洗劑有兩種方向，即與含細(xì)胞液體加入方向相同的方向，和與其相反的方向。這二者中，相同的方向是優(yōu)選的。在相反方向的情形中，已被俘獲的欲回收細(xì)胞易因清洗而漏走。清洗劑的粘度優(yōu)選小于5mPa·s。當(dāng)粘度為5mPa·s或更高時(shí)，已被俘獲的欲回收細(xì)胞易漏出。
在本發(fā)明中，可以采用兩種方法將粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體加入上述細(xì)胞俘獲裝置，一種是通過(guò)管子將含有該液體的袋子或瓶子與該細(xì)胞俘獲裝置相連，利用其落差、滾泵、通過(guò)擠壓袋子而將該液體加入。另一種是將含有該液體的注射器與其相連，通過(guò)用手或使用諸如注射器泵之類的設(shè)備推動(dòng)注射器的活塞而將該液體加入細(xì)胞俘獲裝置。在這種情形下，該液體有兩種加入方向，即與含細(xì)胞液體加入方向相同的方向，和與其相反的方向。這二者中，后者通常是優(yōu)選的，因?yàn)橛懈叩募?xì)胞回收率?；厥找旱牧魉賰?yōu)選比較快，因?yàn)檫@將提高回收率。流速除以過(guò)濾截面積所得的線速率通常為0.5厘米/分鐘或以上，優(yōu)選為5厘米/分鐘或以上，更優(yōu)選為10厘米/分鐘或以上。
通過(guò)在加入回收液后再加入另一種液體，也有可能回收殘留在細(xì)胞俘獲裝置中的少量細(xì)胞(或其組分)。通過(guò)這種回收，可以在細(xì)胞分離過(guò)程的同時(shí)采集用于HLA分型的樣品，這種HLA分型在例如造血干細(xì)胞移植術(shù)中是必需的。殘留在細(xì)胞俘獲裝置中的少量細(xì)胞(或其組分)可用于HLA分型以外的多種目的，如對(duì)造血干細(xì)胞的離體膨脹的研究、基因診斷，或與第一次回收所得細(xì)胞一起用于細(xì)胞移植術(shù)中。下文進(jìn)一步簡(jiǎn)要解釋HLA分型。
HLA分型是利用有核細(xì)胞的核中存在的DNA進(jìn)行的。因此，回收DNA比回收細(xì)胞本身更為優(yōu)選，因?yàn)檫@樣比較省力。相應(yīng)地，優(yōu)選用能裂解或破裂細(xì)胞的液體作為回收液。這種液體包括例如低滲溶液，如表面活性劑溶液(例如十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉和曲通X-100)、蒸餾水、離子交換水等。利用這種液體回收的DNA可通過(guò)眾所周知的酚·氯仿法或類似方法進(jìn)行純化，然后用于HLA分型。
在本發(fā)明中，所回收的細(xì)胞可以保藏到使用。保藏的方法有兩種，一種是以液態(tài)保藏，一種是深低溫保藏。通常采用深低溫保藏，因?yàn)橐簯B(tài)保藏的時(shí)間有限，以造血干細(xì)胞為例，最多能保藏2至3天。
接下來(lái)解釋一下本發(fā)明的細(xì)胞分離系統(tǒng)。在本說(shuō)明書中提到的管線，即連接于細(xì)胞俘獲裝置入口上游、用于將含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置的管線，是一根能與例如儲(chǔ)備含細(xì)胞液體的容器相連接的管線，或是一根能與活體組織相連的管線，該活體組織中存在含細(xì)胞液體。前者的具體實(shí)例有當(dāng)儲(chǔ)備含細(xì)胞液體的容器是血袋時(shí)，可合適地選用配備有刺突(spike)的管子或配備有路厄接頭(外接頭或內(nèi)接頭)的管子；當(dāng)用無(wú)菌連接管連接(下文稱之為“SCD連接”)時(shí)，可合適地選用一純粹的管子。另外，當(dāng)儲(chǔ)備含細(xì)胞液體的容器是配備有針頭的注射器時(shí)，可合適地選用帶有隔膜的可刺入針的管子作為管線；或者，當(dāng)該容器是帶有路厄口而非針頭的注射器時(shí)，可合適地選用路厄接頭(內(nèi)接頭)作為管線。后者的具體實(shí)例如下例如，當(dāng)使用臍帶血、前述活體組織為臍帶和/或胎盤時(shí)，可作為管線的是配備有可刺入臍帶或胎盤的金屬針頭的管子。當(dāng)使用管子時(shí)，可以在其兩端之間裝配一個(gè)用于開(kāi)閉該管線的夾子，用于調(diào)節(jié)流速的滾夾，用于去除聚集體的篩網(wǎng)室，用于提供流速的注射器(包括改變流路的裝置)，等等。當(dāng)使用注射器時(shí)，它可以不經(jīng)管子而直接與細(xì)胞俘獲裝置的入口相連。
本說(shuō)明書中所提到的另一種管線，即連接于前述細(xì)胞俘獲裝置出口下游、用于將液體加入前述細(xì)胞俘獲裝置的管線，包括按照下述方法劃分的各類管線。這些管線的劃分方法是含有擬加入細(xì)胞俘獲裝置的液體的容器是否事先已連接好，還是可隨后再連接的，以及用于加入該液體的裝置是怎樣的。也就是說(shuō)，當(dāng)含有擬加入細(xì)胞俘獲裝置的液體的容器是以前就連接好的，這些管線包括諸如配備有袋子的管子以及注射器。在使用袋子的情況下，將液體加入細(xì)胞俘獲裝置的方法包括利用該液體落差的方法、擠壓袋子的方法、使用滾泵的方法等。當(dāng)含有擬加入細(xì)胞俘獲裝置的液體的容器是后面連接的，則選用下列管子當(dāng)用注射器時(shí)，管線包括可與該注射器相連的帶有隔膜的可刺入針的管子、配備有路厄接頭(內(nèi)接頭)的管子、配備有三路活塞的管子等。當(dāng)使用袋子時(shí)，可合適地選用可與該袋子相連的管線，即配備有刺突的管子，或配備有路厄接頭(外接頭或內(nèi)接頭)的管子作為前述管線。當(dāng)進(jìn)行SCD連接時(shí)，可合適地選用一純粹的管子作為前述管線。當(dāng)使用注射器時(shí)，它可以不經(jīng)管子而直接與細(xì)胞俘獲裝置的出口相連接。
本說(shuō)明書中所提到的另一種管線，即連接于前述細(xì)胞俘獲裝置入口上游、用于從前述細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線，包括下列按照用于回收從細(xì)胞俘獲裝置流出的細(xì)胞的容器進(jìn)行劃分的管線。也就是說(shuō)，當(dāng)將細(xì)胞回收到袋子里時(shí)，可合適地選用與袋子相連或可與其相連的管線，即配備有刺突的管子或配備有路厄接頭(外接頭或內(nèi)接頭)的管子作為前述管線。當(dāng)進(jìn)行SCD連接時(shí)，可合適地選用一純粹的管子作為前述管線。當(dāng)將細(xì)胞采集到錐形管中時(shí)，可以使用任何末端開(kāi)口的管線。當(dāng)使用帶有路厄口的注射器采集細(xì)胞時(shí)，可以使用路厄接頭(內(nèi)接頭)、三路活塞等。當(dāng)使用注射器時(shí)，它可以不經(jīng)管子而直接與細(xì)胞俘獲裝置的入口相連。
除了這些管線外，例如，用于回收從細(xì)胞俘獲裝置流出的細(xì)胞的容器最好能經(jīng)得住冰凍和融化，如是冰凍袋，因?yàn)檫@樣可以省略將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到冰凍袋的過(guò)程。深低溫保藏袋的例子有冰凍袋，如Baxter生產(chǎn)的“Cryocyte”，Charter Med生產(chǎn)的“細(xì)胞冰凍袋”，NPBI生產(chǎn)的“血液冰凍袋”等。
在回收已被細(xì)胞俘獲裝置俘獲的細(xì)胞之前，為了清洗掉細(xì)胞俘獲裝置中殘留的少量欲去除細(xì)胞，可以將一根管線加到本發(fā)明的細(xì)胞分離系統(tǒng)上，用于將液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中。這類管線包括按照以下方法劃分的管線。劃分的方法是含有液體的容器是否事先已連接好，還是可隨后再連接的，以及用于加入該液體的裝置是怎樣的。也就是說(shuō)，當(dāng)含有液體的容器是事先就連接好的時(shí)，這些管線包括例如配備有袋子的管子以及注射器。當(dāng)含有液體的容器是后面連接的，則選用以下類型的管子當(dāng)用注射器時(shí)，管線包括可與該注射器相連的帶有隔膜的可刺入針的管子，和配備有路厄接頭(內(nèi)接頭)的管子。當(dāng)使用袋子時(shí)，可合適地選用可與該袋子相連的管線，即配備有刺突的管子，或配備有路厄接頭(外接頭或內(nèi)接頭)的管子作為該管線。當(dāng)進(jìn)行SCD連接時(shí)，可合適地選用一純粹的管子作為所述管線。當(dāng)使用注射器時(shí)，它可以不經(jīng)管子而直接與細(xì)胞俘獲裝置的出口相連接。盡管所述管線可以連接到細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)或出口側(cè)，但從易于操作的角度出發(fā)，優(yōu)選連接到入口一側(cè)。
本細(xì)胞分離系統(tǒng)中可以增加一根管線，用于在回收完欲回收細(xì)胞后再進(jìn)一步加入一種液體，從而收集細(xì)胞俘獲裝置中殘留的細(xì)胞(或其組分)。當(dāng)回收的細(xì)胞與第一次回收的細(xì)胞具有不同使用目的時(shí)，例如，當(dāng)使用能裂解或破裂細(xì)胞的溶液來(lái)收集細(xì)胞俘獲裝置中殘留的細(xì)胞(或其組分)以用于HLA分型時(shí)，該管線應(yīng)當(dāng)包含一個(gè)用于改變流路的裝置，和眾多分支，以使后來(lái)收集的細(xì)胞(或其組分)不與前面回收的細(xì)胞相混。改變流路的裝置可以包括夾子、刺突等。
利用上述管線系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞分離的方法包括以下步驟通過(guò)連接于上游的管線，將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入一個(gè)能充分俘獲欲回收細(xì)胞并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置中。將所得含有欲去除細(xì)胞的液體通過(guò)該細(xì)胞俘獲裝置的出口除去，然后，通過(guò)連接于細(xì)胞俘獲裝置出口下游的管線，將粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中，以回收細(xì)胞。保藏回收后的細(xì)胞時(shí)，將連接于細(xì)胞俘獲裝置入口上游并含有所回收細(xì)胞的管線(如冰凍袋)封閉并分離開(kāi)。例如，可如下所述進(jìn)行密封和分離用熱封機(jī)或類似裝置通過(guò)熱熔合將管線封閉，然后將其切斷，或是將通過(guò)路厄接頭連接的管子從主體上卸下來(lái)，然后用熱封機(jī)或類似裝置進(jìn)行熱熔合。在任何情形下，術(shù)語(yǔ)“封閉與分離”絲毫未指定操作的順序(如密封后再分離)。
本發(fā)明還提供了一種含有造血干細(xì)胞的液體，其中基本不含紅細(xì)胞和/或血小板，且粘度不超過(guò)500mPa·s、不低于5mPa·s。這里所說(shuō)的“基本不含”是指該含細(xì)胞液體是從一含細(xì)胞的起始液體中去除了60％以上的紅細(xì)胞和/或血小板后制得的。雖然臍帶血除含有造血干細(xì)胞外，還含有紅細(xì)胞，但通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的細(xì)胞分離方法就可獲得基本不含紅細(xì)胞的造血干細(xì)胞懸液。此外，該含細(xì)胞液體中可以含有深低溫保藏劑。
本發(fā)明還提供了一種含有欲回收細(xì)胞且基本不含欲去除細(xì)胞的液體，該液體可以用包括以下步驟的細(xì)胞分離方法獲得將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入一個(gè)能充分俘獲所述欲回收細(xì)胞而充分允許所述欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置中。將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從該細(xì)胞俘獲裝置中除去，然后向該細(xì)胞俘獲裝置中加入粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體，以回收已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的細(xì)胞。當(dāng)本發(fā)明的分離方法用于含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的懸液時(shí)，就有可能有效地提供一種基本含有欲回收細(xì)胞的懸液。
本發(fā)明還提供了一種粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體作為從細(xì)胞俘獲裝置回收被俘獲細(xì)胞用的液體。該液體優(yōu)選是也可用作細(xì)胞保護(hù)劑的一種液體。進(jìn)行液態(tài)保藏時(shí)，保護(hù)劑的具體實(shí)例有糖類(如葡萄糖)、營(yíng)養(yǎng)物(如各種細(xì)胞培養(yǎng)基)、細(xì)胞膜保護(hù)組分(如白蛋白)、以及營(yíng)養(yǎng)物與細(xì)胞膜保護(hù)組分的混合物(如血漿)。進(jìn)行深低溫保藏時(shí)，除了上述實(shí)例外，保護(hù)劑還包括冷凍保護(hù)劑。根據(jù)作用機(jī)制，冷凍保護(hù)劑可分為兩類1)胞外冷凍保護(hù)劑，2)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑。在第一類中，一般使用水溶性聚合物，如羥乙基淀粉、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等。在第二類中，一般使用低分子量的有機(jī)化合物，如二甲基亞砜、甘油等。
下面參照附圖，解釋按照本發(fā)明細(xì)胞分離系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案，該方案不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
圖1顯示了本發(fā)明細(xì)胞分離系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案。在該系統(tǒng)中，以下所有連接都是用刺突完成的起始細(xì)胞袋(內(nèi)裝含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體)與本發(fā)明系統(tǒng)主體的連接；用于回收從細(xì)胞俘獲裝置出口流出的液體的袋子與本發(fā)明系統(tǒng)主體的連接；用于從細(xì)胞俘獲裝置的出口側(cè)回收細(xì)胞的袋子與本發(fā)明系統(tǒng)主體的連接。在該系統(tǒng)中有一個(gè)三路活塞，用來(lái)連接帶有外路厄開(kāi)口的注射器，以用于將液體加入細(xì)胞俘獲裝置中。
在圖1中，數(shù)字1表示能充分俘獲欲回收細(xì)胞并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)的細(xì)胞俘獲裝置。數(shù)字2表示用于將含細(xì)胞液體從起始細(xì)胞袋加入細(xì)胞俘獲裝置中的管線，它包含刺突2-1，夾子2-2和管子2-3。數(shù)字3表示用于將從細(xì)胞俘獲裝置1的出口流出的液體排出去的管線，它包含刺突3-1和管子3-2。數(shù)字4表示用于將液體從細(xì)胞俘獲裝置1的出口側(cè)加入該細(xì)胞俘獲裝置的管線，它與管線3共用管道，并有與注射器相連的三路活塞4-1。數(shù)字5表示用于從細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線，它包含刺突5-1，夾子5-2，管子5-3和管子2-3的一部分。該管線從細(xì)胞俘獲裝置1的入口到管子5-3與管子2-3分岔的那一點(diǎn)之間與管線2共用管子2-3。
下面解釋細(xì)胞俘獲裝置的使用方法。最初，關(guān)閉夾子2-2，僅在與注射器相連的方向上關(guān)閉三路活塞4-1，并關(guān)閉夾子5-2。然后，將刺突2-1刺入起始細(xì)胞袋中，將刺突3-1刺入一個(gè)空袋中。打開(kāi)夾子2-2時(shí)，含細(xì)胞液體就通過(guò)管線2的管子2-3流入細(xì)胞俘獲裝置1中。欲回收細(xì)胞被俘獲，而欲去除細(xì)胞流出，然后通過(guò)管線3的管子3-2收集到空袋中。在完成了對(duì)含細(xì)胞液體的處理后，關(guān)閉夾子2-2，從起始細(xì)胞袋中抽出刺突2-1，并刺入商業(yè)上可獲得的生理鹽水瓶中。打開(kāi)夾子2-2時(shí)，生理鹽水即清洗細(xì)胞俘獲裝置1，并通過(guò)管線3收集到已收集了欲去除細(xì)胞的袋子里。清洗完成后，關(guān)閉夾子2-2和管子3-2。隨后，將含有粘度不超過(guò)500mPa·s且不低于5mPa·s的液體的注射器與三路活塞4-1相連，將刺突5-1刺入細(xì)胞回收袋中。轉(zhuǎn)動(dòng)三路活塞，使注射器僅與細(xì)胞俘獲裝置1相通。打開(kāi)夾子5-2后，推動(dòng)注射器的活塞以將液體從細(xì)胞俘獲裝置1的出口側(cè)加入其中，這樣，被細(xì)胞俘獲裝置俘獲的細(xì)胞就通過(guò)管線5回收到細(xì)胞回收袋中。
下面參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1本工作實(shí)施例顯示了一個(gè)分離細(xì)胞的例子，其中含細(xì)胞液體為臍帶血，欲回收細(xì)胞是含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分，欲去除細(xì)胞是紅細(xì)胞和血小板。
①細(xì)胞分離器外部尺寸(長(zhǎng)×寬×厚度)為41×41×18mm的聚碳酸酯容器在對(duì)角線上有一個(gè)液體出口和一個(gè)液體入口，在其入口側(cè)填充了12塊平均纖維直徑為2.3μm的聚酯非紡織織物，在其出口側(cè)填充了25塊平均纖維直徑為12μm的聚酯非紡織織物，填充密度為0.24g/cm3，有效過(guò)濾面積為9cm2，有效過(guò)濾長(zhǎng)度為12.4mm。為了使血小板能夠滲過(guò)所得濾器，用親水聚合物進(jìn)行涂層。具體而言，從該濾器的入口側(cè)讓甲基丙烯酸羥乙酯·甲基丙烯酸二甲胺基乙酯共聚物(甲基丙烯酸羥乙酯與甲基丙烯酸二甲胺基乙酯的摩爾比為97∶3)的1％乙醇溶液通過(guò)該濾器，然后導(dǎo)入氮?dú)馐篂V器干燥。
②回收液的制備將商業(yè)上可獲得的葡聚糖40的生理鹽水溶液(可從綠十字公司購(gòu)得，商品名為葡聚糖40 Injection-Midori)與人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液體，作為回收液A。該回收液A用生理鹽水分別稀釋1.2倍或1.3倍，以獲得回收液B和回收液C。這些回收液的粘度分別為回收液A 10.5mPa·s，回收液B 8.0mPa·s，回收液C 5.3mPa·s。
③細(xì)胞分離過(guò)程和管線系統(tǒng)分娩后，從胎盤和臍帶中采集200ml臍帶血，這些血含有15vol％CPD，將其分成四份。利用所分成的相同血樣，在四種回收液粘度值(包括對(duì)比例1中的值)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
如圖2所示，一血袋與上述①中制得的細(xì)胞分離器6的入口側(cè)相連，相連是通過(guò)一根管子實(shí)現(xiàn)的，在這根管子的兩端之間有一個(gè)三路活塞9、一個(gè)篩網(wǎng)室8、和一個(gè)配備了將與清洗用生理鹽水瓶連接的刺突13的管子的分叉點(diǎn)，有一個(gè)用于回收細(xì)胞的袋子10與三路活塞9相連。引流袋12與細(xì)胞分離器6的出口側(cè)通過(guò)一根管子相連，該管子在其兩端之間有一個(gè)用于連接回收用注射器的三路活塞11。
將起始血袋7中的含有有核細(xì)胞的液體以約60cm的落差加入細(xì)胞分離器中，將從細(xì)胞分離器6流出的含有紅細(xì)胞和血小板的液體排出到引流袋12中。然后，將刺突13刺入生理鹽水瓶中，打開(kāi)夾子14，用約20ml生理鹽水沖洗濾器的內(nèi)部，以洗掉濾器中殘留的少量紅細(xì)胞和血小板。隨后，將含有25ml每種回收液的30ml一次性注射器與三路活塞11相連，并調(diào)整三路活塞11的方向，使注射器只與細(xì)胞分離器相通。將三路活塞9的方向調(diào)整為細(xì)胞分離器6僅與細(xì)胞回收袋10相通。然后，推動(dòng)注射器的活塞，將細(xì)胞分離器中俘獲的細(xì)胞回收到細(xì)胞回收袋10中。
④分析用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定有核細(xì)胞的數(shù)量、單核細(xì)胞的數(shù)量、紅細(xì)胞的數(shù)量和血小板的數(shù)量。按照包含顯示SSC-FITC的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，利用FITC標(biāo)記的抗CD34抗體，測(cè)量基于有核細(xì)胞總數(shù)的CD34陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(Miyazaki等人，“Nichijo Shinryo toKetsueki(實(shí)用血液學(xué))”第5卷，第2期，第21-24頁(yè)，1995年)。
回收與去除率是用下列公式計(jì)算的回收率(％)＝100×(回收細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù))去除率(％)＝100-100×(回收細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù))⑤結(jié)果完成推壓注射器活塞所需時(shí)間為3秒。線速率計(jì)算為55.6厘米/分鐘。表1總結(jié)了結(jié)果。從中可以看出，有核細(xì)胞、單核細(xì)胞和CD34-陽(yáng)性細(xì)胞可以較高百分率回收到回收后的細(xì)胞懸液中，而紅細(xì)胞和血小板以較高百分率被去除。表1

按照由Kyokuto制藥工業(yè)有限公司生產(chǎn)的冷凍保護(hù)劑“CP-1”的用戶說(shuō)明中描述的方案，對(duì)利用回收液回收的細(xì)胞進(jìn)行深低溫冷藏。具體而言，在回收的細(xì)胞懸液中加入二甲基亞砜，將其終濃度調(diào)節(jié)到5％，將所得混合物在-80℃的深度冷凍機(jī)中進(jìn)行深低溫保藏。深低溫保藏30天后，將該混合物在37℃的溫浴中迅速融化，用傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)其保持了較高值，為90.4％。對(duì)比例1在本對(duì)比例中，將利用低粘度的、不含葡聚糖的回收液得到的結(jié)果與實(shí)施例1中得到的結(jié)果進(jìn)行比較。與實(shí)施例1中相同，本對(duì)比便中含細(xì)胞液體為臍帶血，欲回收細(xì)胞是含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分，欲去除細(xì)胞是紅細(xì)胞和血小板。
①細(xì)胞分離器與實(shí)施例1中所用的細(xì)胞分離器相同。
②細(xì)胞分離過(guò)程和管線系統(tǒng)將實(shí)施例1中得到的臍帶血的一部分用作起始臍帶血。重復(fù)實(shí)施例1的步驟，唯一不同的是用25ml生理鹽水作為回收液。使用與實(shí)施例1相同的管線系統(tǒng)，回收液的粘度為1.0mPa·s。
③分析進(jìn)行和實(shí)施例1相同的分析。
④結(jié)果完成推壓注射器活塞所需時(shí)間為3秒，表2總結(jié)了結(jié)果。回收的細(xì)胞懸液中有核細(xì)胞、單核細(xì)胞和CD34陽(yáng)性細(xì)胞的回收百分率比實(shí)施例1中的低。
表2

實(shí)施例2本工作實(shí)施例顯示了一個(gè)細(xì)胞分離的例子，其中含細(xì)胞液體是外周血，欲回收細(xì)胞是白細(xì)胞，欲去除細(xì)胞是紅細(xì)胞和血小板。
①細(xì)胞分離器外部尺寸(長(zhǎng)×寬×厚度)為41×41×18mm的聚碳酸酯容器在對(duì)角線上有一個(gè)液體出口和一個(gè)液體入口，在其入口側(cè)填充了25塊平均纖維直徑為12μm的聚酯非紡織織物，在其出口側(cè)填充了12塊平均纖維直徑為2.3μm的聚酯非紡織織物，填充密度為0.24g/cm3，有效過(guò)濾面積為9cm2，有效過(guò)濾長(zhǎng)度為12.4mm。為了使血小板濾過(guò)所得濾器，用親水性聚合物進(jìn)行涂層。從該濾器的入口側(cè)讓甲基丙烯酸羥乙酯·甲基丙烯酸二甲胺基乙酯共聚物(甲基丙烯酸羥乙酯與甲基丙烯酸二甲胺基乙酯的摩爾比為97∶3)的1％乙醇溶液通過(guò)該濾器，然后向其中導(dǎo)入氮?dú)馐篂V器干燥。
②細(xì)胞分離過(guò)程利用落差(約60cm；流速約為5毫升/分鐘)將一健康人的50ml全外周血(含15vol％CPD)通過(guò)液體入口加入所得細(xì)胞分離器中。然后，借助落差(約60cm)使30ml生理鹽水通過(guò)該細(xì)胞分離器，以清洗掉殘留在細(xì)胞分離器中的紅細(xì)胞和血小板。然后，利用泵將聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量360,000)的3.5％生理鹽水溶液30ml以100毫升/分鐘的速度通過(guò)液體出口加入細(xì)胞分離器中，并通過(guò)液體入口回收細(xì)胞。該回收液的粘度為20.3mPa·s。
③分析用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定白細(xì)胞的數(shù)量、紅細(xì)胞的數(shù)量和血小板的數(shù)量。
④結(jié)果表3中總結(jié)了結(jié)果。白細(xì)胞以較高百分率回收于回收的細(xì)胞懸液中，而紅細(xì)胞和血小板以較高百分率被去除。線性速率計(jì)算為11.1厘米/分鐘。
表3

實(shí)施例3本工作實(shí)施例顯示了一個(gè)細(xì)胞分離的例子，其中含細(xì)胞液體是臍帶血，欲回收細(xì)胞是造血干細(xì)胞(CD34陽(yáng)性細(xì)胞)，欲去除細(xì)胞是紅細(xì)胞和血小板。
①細(xì)胞分離器外部尺寸(長(zhǎng)×寬×厚度)為41×41×18mm的聚碳酸酯容器在對(duì)角線上有一個(gè)液體出口和一個(gè)液體入口，在其入口側(cè)填充了12塊平均纖維直徑為12μm的聚酯非紡織織物，在其出口側(cè)填充了25塊平均纖維直徑為2.3μm、帶有固定其上的抗人CD34單克隆小鼠抗體(克隆名Immu133，可從Coulter公司獲得；下文簡(jiǎn)稱為“CD34抗體”)的聚苯乙烯非紡織織物，所得濾器的填充密度為0.2g/cm3?？谷薈D34單克隆小鼠抗體是利用JP-A-2-261833中提出的有名的鹵代乙酰胺方法固定到聚苯乙烯上的。具體而言，將聚苯乙烯非紡織織物(事先剪成上述大小)浸入一處理液中，在室溫下反應(yīng)5小時(shí)以活化該聚苯乙烯非紡織織物，該處理液是通過(guò)將3.6g羥基甲基碘乙酰胺和25g三氟甲磺酸加入165ml四氫噻吩砜中而制得的。由此活化的非紡織織物用D-PBS洗滌，之后，為了將抗體固定其上，將其浸入已用D-PBS將濃度調(diào)節(jié)到20μg/ml的10ml CD34抗體溶液中這2小時(shí)。隨后，用D-PBS洗滌并冷凍干燥，由此得到有抗體固定其上的非紡織織物。
②回收液的配制將商業(yè)上可獲得的葡聚糖40的生理鹽水溶液(可從綠十字公司購(gòu)得，商品名為葡聚糖40 Injection-Midori)與人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液體，作為回收液。該回收液的粘度為9.8mPa·s。
③細(xì)胞分離方法將含有50ml新鮮人臍帶血(含15vol％的抗凝劑CPD)的血袋通過(guò)一根管子與上述①中制得的細(xì)胞分離器的入口側(cè)相連，該管子在其兩端之間有分別向生理鹽水袋和細(xì)胞回收袋分叉的岔口。引流血袋通過(guò)一根在其兩端之間有三路活塞的管子與細(xì)胞分離器的出口側(cè)相連。利用其落差(約60cm)將50ml新鮮臍帶血加入細(xì)胞分離器中。已流出濾器的含有紅細(xì)胞的液體(也含CD34陰性細(xì)胞和血小板)回收到引流袋中。然后，讓30ml生理鹽水通過(guò)該濾器，以清洗掉殘留在濾器中的紅細(xì)胞、血小板和CD34陰性細(xì)胞。
隨后，將含有30ml在上述②中配制的回收液的注射器與在細(xì)胞分離器出口側(cè)的管子的三路活塞相連。推動(dòng)注射器的活塞，將回收液加入細(xì)胞分離器中，以將俘獲的細(xì)胞回收到與入口側(cè)相連的袋子中。
④分析進(jìn)行與實(shí)施例1相同的分析。
⑤結(jié)果完成推壓注射器活塞所需時(shí)間為3秒，線性速率計(jì)算為55.6厘米/分鐘。表4總結(jié)了結(jié)果。從中可以看出，CD34陽(yáng)性細(xì)胞能以較高百分率回收于回收的細(xì)胞懸液中，而紅細(xì)胞、血小板和CD34陰性細(xì)胞以較高百分率去除。
表4

實(shí)施例4本工作實(shí)施例顯示了一個(gè)細(xì)胞分離的例子，其中含細(xì)胞液體是臍帶血，欲回收細(xì)胞是含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分，欲去除細(xì)胞是紅細(xì)胞和血小板，并且同時(shí)采集用于HLA分型的DNA。
①細(xì)胞分離器與實(shí)施例1中所使用的細(xì)胞分離器相同。
②回收液的配制將商業(yè)上可獲得的葡聚糖40的生理鹽水溶液(可從綠十字公司購(gòu)得，商品名為葡聚糖40 Injection-Midori)與人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液體，作為第一回收液(用于細(xì)胞回收)。注射用蒸餾水和低滲溶液用作補(bǔ)充回收液(用于回收細(xì)胞組分)。第一回收液的粘度為10.5mPa·s。
③管線系統(tǒng)圖3顯示的細(xì)胞分離系統(tǒng)可通過(guò)將上述①中所描述的細(xì)胞分離器接入到管線中而得到。在該系統(tǒng)中，含細(xì)胞液體的袋子與本發(fā)明系統(tǒng)主體的連接、用于回收從細(xì)胞俘獲裝置出口流出的液體的袋子與本發(fā)明系統(tǒng)主體的連接，都是利用刺突實(shí)現(xiàn)的。用于從細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線裝配了一個(gè)用于轉(zhuǎn)移細(xì)胞的回收細(xì)胞用冷凍袋，和一根末端帶有刺突的管子，以用于將HLA分型用的DNA回收到錐形管中。在該管線系統(tǒng)中，可利用夾子來(lái)改變流路。
④細(xì)胞分離過(guò)程利用圖3所示的管線系統(tǒng)完成細(xì)胞分離過(guò)程。
起初，關(guān)閉夾子21，三路活塞25只關(guān)閉與注射器相通的方向，關(guān)閉夾子27和28。
將刺突20刺入含有50ml新鮮人臍帶血(含15vol％的抗凝劑CPD)的血袋，將刺突23刺入一個(gè)空袋。打開(kāi)夾子21時(shí)，含細(xì)胞液體通過(guò)管線16的管子22流入細(xì)胞俘獲裝置中，含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分被俘獲，而紅細(xì)胞和血小板通過(guò)管線17的管子24排入空袋中。
在完成對(duì)所述含細(xì)胞液體的處理后，關(guān)閉夾子21并抽出刺突20，然后刺入商業(yè)上可獲得的100ml生理鹽水瓶。打開(kāi)夾子21時(shí)，生理鹽水清洗掉殘留在細(xì)胞俘獲裝置15中的少量紅細(xì)胞和血小板，生理鹽水通過(guò)管線17排出。然后，關(guān)閉夾子21。接下來(lái)，將含有25ml上述②中配制的回收液的30ml注射器與三路活塞25相連。然后將三路活塞25的方向調(diào)整為注射器只通過(guò)管線18與細(xì)胞俘獲裝置15相通，打開(kāi)夾子27。推動(dòng)注射器的活塞，以通過(guò)管線19將細(xì)胞回收到冷凍袋29中。隨后，從三路活塞25上卸下該注射器，在三路活塞25上連接另一個(gè)含有25ml注射用蒸餾水的注射器。關(guān)閉夾子27，打開(kāi)夾子28，夾子28連結(jié)在能通過(guò)Y型管26與管線19的管子32相通的管子31上。在刺突30下放置一個(gè)錐形管，然后通過(guò)推動(dòng)注射器的活塞將注射用蒸餾水加入細(xì)胞俘獲裝置中，以裂解所俘獲的細(xì)胞，并將這些細(xì)胞中的粗DNA回收到錐形管中。所回收的粗DNA用常規(guī)方法進(jìn)行純化，包括使用蛋白酶K進(jìn)行脫蛋白作用和酚·氯仿法。
⑤分析用實(shí)施例1中所述的相同方法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。用常規(guī)方法測(cè)定純DNA的量，包括利用分光光度計(jì)測(cè)量260nm處的吸光度(Nakayama等人，細(xì)胞工藝學(xué)，附刊“生物實(shí)驗(yàn)說(shuō)明”①分子生物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，1995年)。
⑥結(jié)果完成推壓注射器活塞所需時(shí)間為3秒，線性速率計(jì)算為55.6厘米/分鐘。表5總結(jié)了結(jié)果。從中可以看出，真核細(xì)胞、單核細(xì)胞和CD34陽(yáng)性細(xì)胞能以較高百分率回收于回收的細(xì)胞懸液中，而紅細(xì)胞和血小板以較高百分率去除。同時(shí)還可以看出，所得DNA的量約為10μm，足以用于HLA分型。
表5

實(shí)施例5本工作實(shí)施例顯示了一個(gè)細(xì)胞分離的例子，其中含細(xì)胞液體為骨髓，欲回收細(xì)胞是含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分，欲去除細(xì)胞是紅細(xì)胞和血小板。
①細(xì)胞分離器使用與實(shí)施例1中相同的細(xì)胞分離器。
②回收液的配制將商業(yè)上可獲得的葡聚糖40的生理鹽水溶液(可從綠十字公司購(gòu)得，商品名為葡聚糖40 Injection-Midori)與人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液體，作為回收液。該回收液的粘度為10.1mPa·s。
③細(xì)胞分離過(guò)程和管線系統(tǒng)如圖2所示，含有30ml骨髓(含15單位/ml抗凝劑肝素)的血袋與①中所述的細(xì)胞分離器6的入口側(cè)通過(guò)一根管子相連，在該管子的兩端之間有一個(gè)三路活塞9、篩網(wǎng)室8和一個(gè)向?qū)⑴c清洗用生理鹽水瓶連接的帶有刺突13的管子的分叉點(diǎn)，有一個(gè)用于回收細(xì)胞的袋子10與三路活塞9相連。引流袋12與細(xì)胞分離器6的出口側(cè)通過(guò)一根管子相連，該管子在其兩端之間有一個(gè)用于連接回收用注射器的三路活塞11。將起始血袋7中的含有有核細(xì)胞的液體以約60cm的落差加入細(xì)胞分離器中，將從細(xì)胞分離器6流出的含有紅細(xì)胞的液體排出到引流袋12中。然后，將刺突13刺入生理鹽水瓶，打開(kāi)夾子14，用約20ml生理鹽水沖洗濾器的內(nèi)部，以洗掉濾器中殘留的少量紅細(xì)胞和血小板。隨后，將含有25ml回收液的30ml一次性注射器與三路活塞11相連，并調(diào)整三路活塞11的方向，使注射器只與細(xì)胞分離器相通。將三路活塞9的方向調(diào)整為細(xì)胞分離器6僅與細(xì)胞回收袋10相通。然后，推動(dòng)注射器的活塞，將細(xì)胞分離器中俘獲的細(xì)胞回收到細(xì)胞回收袋10中。
④分析用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定有核細(xì)胞的數(shù)量、單核細(xì)胞的數(shù)量、紅細(xì)胞的數(shù)量和血小板的數(shù)量。按照包含在SSC-FITC上顯影的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，利用FITC標(biāo)記的抗CD34抗體，測(cè)量基于有核細(xì)胞總數(shù)的CD34陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(Miyazaki等人，“Nichijo Shinryo toKetsueki(常規(guī)診斷與治療，以及血液)”第5卷，第2期，第21-24頁(yè)，1995年)。
回收與去除率是用下列公式計(jì)算的回收率(％)＝100×(回收細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù))去除率(％)＝100-100×(回收細(xì)胞數(shù)/起始細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù))⑤結(jié)果完成推壓注射器活塞所需時(shí)間為3秒，線性速率計(jì)算為55.6厘米/分鐘。表6中總結(jié)了結(jié)果。從中可以看出，有核細(xì)胞、單核細(xì)胞和CD34陽(yáng)性細(xì)胞能以較高百分率回收于回收的細(xì)胞懸液中，而紅細(xì)胞和血小板以較高百分率去除。
表6

工業(yè)實(shí)用性如上所述，按照本發(fā)明，可以用一種簡(jiǎn)單而快速的方法，高回收率地回收造血干細(xì)胞等有用細(xì)胞，而由此得到的含細(xì)胞液體無(wú)需隨后麻煩的細(xì)胞懸液制備過(guò)程，就可以進(jìn)行深低溫保藏，因此可以作為一種省力的細(xì)胞加工方法，可應(yīng)用于與醫(yī)療保健相關(guān)的產(chǎn)業(yè)，如造血干細(xì)胞移植術(shù)領(lǐng)域、過(guò)繼免疫治療領(lǐng)域等。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞分離方法，它包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲所述欲回收細(xì)胞，并充分允許所述欲去除細(xì)胞從其通過(guò)；將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從所述細(xì)胞俘獲裝置中除去；然后將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收已被所述細(xì)胞俘獲裝置俘獲的所述欲回收細(xì)胞。
2.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中所述欲回收細(xì)胞是有核細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求2所述的細(xì)胞分離方法，其中有核細(xì)胞是含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分。
4.按照權(quán)利要求2所述的細(xì)胞分離方法，其中有核細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求1的細(xì)胞分離方法，其中所述欲去除細(xì)胞是無(wú)核細(xì)胞。
6.按照權(quán)利要求5所述的細(xì)胞分離方法，其中無(wú)核細(xì)胞至少是紅細(xì)胞和血小板中的一種。
7.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中所述欲去除細(xì)胞是具有不同于欲回收細(xì)胞的表面標(biāo)志的細(xì)胞。
8.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體是臍帶血。
9.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體是骨髓。
10.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體是外周血。
11.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中細(xì)胞俘獲裝置是通過(guò)將一種多孔結(jié)構(gòu)填充到具有液體入口和液體出口的容器中而得到的。
12.按照權(quán)利要求11所述的細(xì)胞分離方法，其中所述多孔結(jié)構(gòu)包含非紡織織物和海綿結(jié)構(gòu)中的一種。
13.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中所述細(xì)胞俘獲裝置包含一個(gè)具有抗體固定于其中的細(xì)胞分離器，該抗體與存在于欲回收細(xì)胞上、而欲去除細(xì)胞上并不存在的抗原能夠反應(yīng)。
14.一種細(xì)胞分離和保藏方法，它包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲所述欲回收細(xì)胞，并充分允許所述欲去除細(xì)胞從其通過(guò)；將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從所述細(xì)胞俘獲裝置中除去；將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收已被所述細(xì)胞俘獲裝置俘獲的所述欲回收細(xì)胞；然后保藏這些回收的細(xì)胞。
15.按照權(quán)利要求14的細(xì)胞分離和保藏方法，其中保藏是深低溫保藏。
16.一種細(xì)胞分離和保藏方法，它包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲所述欲回收細(xì)胞，并充分允許所述欲去除細(xì)胞從其通過(guò)；將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從所述細(xì)胞俘獲裝置中除去；將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收已被所述細(xì)胞俘獲裝置俘獲的所述欲回收細(xì)胞；將這些回收后的細(xì)胞進(jìn)行深低溫保藏；然后將進(jìn)行了深溫度保藏的細(xì)胞融化。
17.按照權(quán)利要求1、14和16中任一項(xiàng)所述的方法，其中粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的所述液體是一種能用作欲回收細(xì)胞的保藏劑的液體。
18.按照權(quán)利要求1、14和16中任一項(xiàng)所述的方法，其中粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的所述液體是一種含有葡聚糖的溶液。
19.按照權(quán)利要求1、14和16中任一項(xiàng)所述的方法，它還包含以下步驟在將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的所述液體加入細(xì)胞俘獲裝置之前，先加入一種粘度小于5mPa·s的液體。
20.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分離方法，其中在通過(guò)加入粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體而將欲回收細(xì)胞回收后，再向該細(xì)胞俘獲裝置中加入另一種液體，以收集所述細(xì)胞俘獲裝置中的剩余細(xì)胞或細(xì)胞組分。
21.按照權(quán)利要求20的細(xì)胞分離方法，其中在加入粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體之后再加入的液體是能溶解被俘獲細(xì)胞或使其破裂的溶液。
22.按照權(quán)利要求21所述的細(xì)胞分離方法，其中能溶解細(xì)胞或使其破裂的溶液是表面活性劑或低滲溶液。
23.按照權(quán)利要求1、14和16中任一項(xiàng)所述的方法，其中粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體的加入方向與含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體的加入方向相反。
24.一種細(xì)胞分離系統(tǒng)，它包含一個(gè)細(xì)胞俘獲裝置，該裝置能充分俘獲欲回收細(xì)胞，而充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò)，并具有至少一個(gè)入口和一個(gè)出口；一根用于將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中的管線，其連接于所述細(xì)胞俘獲裝置入口的上游；一根用于將液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置的管線，其連接于所述細(xì)胞俘獲裝置出口的下游；和一根用于從所述細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線，其連接于所述細(xì)胞俘獲裝置入口的上游。
25.按照權(quán)利要求24的細(xì)胞分離系統(tǒng)，其中連接于所述細(xì)胞俘獲裝置入口的上游、用于從該細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線是用能經(jīng)得起冰凍和融化的材料制成的。
26.按照權(quán)利要求25的細(xì)胞分離系統(tǒng)，其中用于回收細(xì)胞的管線是一種包含冰凍袋的管線。
27.按照權(quán)利要求24的細(xì)胞分離系統(tǒng)，它還包含一根用于將液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置的管線，其連接于該細(xì)胞俘獲裝置入口的上游，或連接于該細(xì)胞俘獲裝置出口的下游。
28.按照權(quán)利要求24的細(xì)胞分離系統(tǒng)，其中連接于所述細(xì)胞俘獲裝置入口的上游、用于從該細(xì)胞俘獲裝置的入口側(cè)回收細(xì)胞的管線是一種具有流路變換裝置和大量支管的管線。
29.一種細(xì)胞分離方法，它包含以下步驟通過(guò)連接于細(xì)胞俘獲裝置入口上游的管線，將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲所述欲回收細(xì)胞，并充分允許所述欲去除細(xì)胞從其通過(guò)；將所得含有欲去除細(xì)胞的液體通過(guò)所述細(xì)胞俘獲裝置的出口除去；通過(guò)連接于所述細(xì)胞俘獲裝置出口下游的管線，將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置中；由此通過(guò)連接于所述細(xì)胞俘獲裝置入口上游的管線，回收已被所述細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。
30.按照權(quán)利要求29的細(xì)胞分離方法，它包含以下步驟通過(guò)連接于細(xì)胞俘獲裝置入口上游的管線回收細(xì)胞，然后封閉并分離所述管線。
31.一種含有造血干細(xì)胞的液體，它基本不含紅細(xì)胞和血小板，粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s。
32.按照權(quán)利要求31的含細(xì)胞液體，它含有至少一種深低溫保藏劑。
33.按照權(quán)利要求32的含細(xì)胞液體，其中所述深低溫保藏劑是胞外冷凍保護(hù)劑和胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑中的一種。
34.按照權(quán)利要求31的含細(xì)胞液體，其中含有葡聚糖。
35.一種含有欲回收細(xì)胞、且基本不含欲去除細(xì)胞的液體，它是通過(guò)一種細(xì)胞分離方法得到的，該方法包含以下步驟將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置中，該裝置能充分俘獲所述欲回收細(xì)胞，并充分允許所述欲去除細(xì)胞從其通過(guò)；將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從所述細(xì)胞俘獲裝置中除去；然后將粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s的液體加入所述細(xì)胞俘獲裝置中，以從中回收已被所述細(xì)胞俘獲裝置俘獲的所述欲回收細(xì)胞。
36.一種用于從細(xì)胞俘獲裝置中回收被俘獲細(xì)胞的液體，它的粘度不超過(guò)500mPa·s且不小于5mPa·s。
37.按照權(quán)利要求36所述的回收用液體，它也可用作這些細(xì)胞的保藏劑。
38.按照權(quán)利要求37所述的回收用液體，其中細(xì)胞的保藏是深低溫保藏。
39.按照權(quán)利要求36到38中任一項(xiàng)所述的回收用液體，它是一種含有葡聚糖的溶液。
40.按照權(quán)利要求36所述的回收用液體，其中所述細(xì)胞是含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分。
41.按照權(quán)利要求36所述的回收用液體，其中所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
全文摘要
一種細(xì)胞分離方法,它包含以下步驟:將含有欲回收細(xì)胞和欲去除細(xì)胞的含細(xì)胞液體加入細(xì)胞俘獲裝置中,該裝置能充分俘獲欲回收細(xì)胞,并充分允許欲去除細(xì)胞從其通過(guò);將所得含有欲去除細(xì)胞的液體從該細(xì)胞俘獲裝置中除去;然后將粘度不超過(guò)500MPa·s且不小于5MPa·s的液體加入該細(xì)胞俘獲裝置中,以從中回收已被該細(xì)胞俘獲裝置俘獲的欲回收細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1249000SQ98802828
公開(kāi)日2000年3月29日 申請(qǐng)日期1998年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月24日
發(fā)明者澄田政哉, 寺嶼修司 申請(qǐng)人:旭醫(yī)學(xué)株式會(huì)社 被以下專利引用 (2),