一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及制法的制作方法

專利名稱：一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及制法的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人HnudC的cDNA序列，該序列的編碼蛋白是大鼠RnudC的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
nudC、nudA、nudF、RnudC和DnudC是在構巢曲霉(Aspergillus nidulans)大鼠及果蠅中發現的幾個基因，它們被認為與細胞器正確定位、細胞內物質小泡轉運及細胞核的運動等作用有關。在高等生物體內，催乳素(PRL)調節著淋巴細胞的增殖、活化及衰亡。而PRL對淋巴細胞的調節作用主要是從激活大量T淋巴細胞的早期表達基因開始的。這些基因包括干擾素調節因子-1、PRL-受體、鳥氨酸脫羧酶、c-myc、nud等。研究發現，nudC、RnudC和DnudC在結構和功能上都高度保守，nudC調節著細胞內物質小泡轉運及細胞核運動。細胞內物質的小泡轉運對于細胞內蛋白分泌與運輸，細胞的分化生長起著重要的作用。nudC在生物體內與動力蛋白及動力蛋白激活蛋白復合物相互作用，從而使得細胞核與微管系統偶聯，產生正常的細胞核運動(MolecularEndocrinology，1995，9(3)，312-318)nudC基因在各種不同的細胞類型與種群中都廣泛存在，如在纖維細胞和神經細胞中。nudC最早是從構巢曲霉中發現的一個基因。它是由Osmani A.H.等人于1990年從構巢曲霉cDNA文庫中克隆得到的一個基因(J Cell Biol.1990，111543-551)，它與以后在大鼠及果蠅中分別發現的基因RnudC和DnudC具有較高的同源性并具有相似的功能。DnudC是于1997年由Cunniff J.等人從果蠅中克隆的(Mech De 1997，66(1-2)55-68)。其后不久，Shelli M等人從大鼠中分離得到了RnudC基因(Exp.Cell.Res 1998，238，23-32)。研究發現，這些基因不僅在結構上高度保守，而且在功能上也高度保守。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼人的一種與大鼠RnudC同源的蛋白，本發明的與大鼠RnudC同源的人基因被命名為HnudC。
本發明的另一個目的是提供一種新的蛋白，該蛋白被命名為HnudC蛋白。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人HnudC蛋白的方法。
本發明還提供了這種人HnudC核苷酸序列和蛋白的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中43-1038位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的HnudC蛋白多肽，它包括具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有HnudC蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成HnudC蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成HnudC蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HnudC蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HnudC蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為1091個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于43-1038位核苷酸。
在本發明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“HnudC蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中43-1038位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框43-1038位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中43-1038位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人HnudC相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語“HnudC蛋白多肽”指具有HnudC蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術語還包括具有與HnudC相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括HnudC蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與HnudC DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗HnudC多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含HnudC多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括HnudC多肽的可溶性片段。通常，該片段具有HnudC多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供HnudC蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然HnudC多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
本發明還包括HnudC多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內HnudC的表達。
本發明還包括一種可用作探針的核苷酸分子，該分子通常具有HnudC核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HnudC的核酸分子。
本發明還包括檢測HnudC核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于HnudC多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對HnudC DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人HnudC基因產物或片段。較佳地，指那些能與HnudC基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制HnudC蛋白的分子，也包括那些并不影響HnudC蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的HnudC基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的HnudC基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達HnudC或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷HnudC功能的抗體以及不影響HnudC功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用HnudC基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與HnudC基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人HnudC核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明的一個實施例中，人HnudC的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGAC-3′和反向引物A25′-AAGTTGGGTGGTTGCAGCTCAGC-3′，進行PCR，獲得1100bp(A1/A2)的目的片段。測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
nudC、nudA、nudF、RnudC和DnudC被認為與細胞器定位、細胞內物質小泡轉運及細胞核的運動有關。細胞內物質小泡轉運及細胞核運動是真核生物中普遍存在的現象。細胞內物質小泡轉運對于細胞內蛋白分泌，細胞的分化生長起著重要的作用。而在淋巴細胞中，細胞核的正確地運動與定位可能在淋巴細胞的增殖、活化及衰亡過程中起著關鍵的作用。本發明的HnudC與大鼠的RnudC高度同源，同時與nudC、DnudC的同源性也較高，因而我們認為它是RnudC在人中的一個同源基因，并且與RnudC(以及nudC、DnudC)有著相似的生物學功能，這些功能包括細胞器定位、物質小泡轉運及細胞核的運動等方面。
在附圖中，

圖1為本發明的人HnudC與大鼠RnudC的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標出。
圖2為本發明的人HnudC蛋白與大鼠RnudC蛋白的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1HnudC的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGAC-3′(SEQ ID NO1)正向引物，寡核苷酸A25′-AAGTTGGGTGGTTGCAGCTCAGC-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。A1、A2引物對的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘；電泳檢測得到的PCR片斷，以A1、A2為引物對擴增出的目的片段長約1100bp。
2.PCR產物的測序將PCR擴增產物分別與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QLAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1091bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于43-1038位核苷酸。
根據得到的全長cDNA序列推導出HnudC的氨基酸序列，共331個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較和結構分析用HnudC的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數據庫中用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現它們與大鼠RnudC基因及其編碼蛋白具有極高同源性，在核酸水平上的同一性(identity，又稱為相同性)都達到了84％，蛋白水平上的同一性達到95％、相似性達到了97％。所以，可以確定HnudC是RnudC在人中的同系物。
特別是實驗證明DnudC、nudC和RnudC的開放閱讀框中都含有一個潛在的核定位信號區域，這一區域為酸性區域，有著保守的氨基酸序列，本發明的HnudC蛋白也含有這一保守的氨基酸序列，具體為SEQ ID NO.4的67-75位氨基酸，即LQNFLLHGT。
另外，DnudC、nudC和RnudC這些蛋白的C末端94個氨基酸的相似性和同源性都很高，RnudC與nudC相應區域的同源度達68％(Shelli M.A.等人，MolecularEndocrinology，9(3)312-8，1995)。這一區域在進化上都是高度保守的，本發明HnudC蛋白的這一區域，具體為SEQ ID NO.4的237-330位氨基酸，即序列AVFLWNMDKYTMIRKLEGHHHDVVACDFSPDGALLATASYDTRVYIWDPHNGDILMEFGHLFPPPTPIFAGGANDRWVRSVSFSHDGLHVASL，而且，就這一保守區域而言，本發明HnudC與RnudC僅相差2個氨基酸，而且其中一個氨基酸是相似氨基酸替換(圖2)。如此高的保守性進一步暗示，這些基因可能構成一個家族。并且根據結構決定功能，結構相似功能相似的原理，本發明的HnudC應具有與這些基因相同或相似的功能。
nudC是生物體內依賴于PRL(催乳素，一種多肽激素)的T淋巴細胞因子早期表達的基因。DnudC、nudC和RnudC與生物體內的細胞器定位、小泡物質轉運、蛋白分泌及細胞核運動等作用有關。
眾所周知，細胞內小泡轉運及核運動在細胞分化、生長及衰亡的過程中起著重要的作用。因此本發明的HnudC在生物體內起著重要作用。
細胞核的運動主要依賴于微管系統(MTs)。有實驗表明，在高等真核生物中，nudC可能是動力蛋白及動力蛋白激活蛋白復合物的組成部分，與正確的細胞器定位，如高爾基體的定位等有關。nudC與動力蛋白及動力蛋白激活蛋白作用，使T細胞中高爾基體正確定位，從而介導細胞核與微管系統偶聯，產生正常的核運動。而在淋巴細胞中，細胞核的正常運動及其定位對其活化、增殖及衰亡起著重要的作用。除此之外，從真核生物體內還分離得到了nudA、nudG、nudF等另三個nud基因，它們的蛋白產物，都與細胞核的運動有關。在nudC缺陷型菌株中，細胞核的運動將被明顯阻止。這說明nudC對于T細胞細胞核的正確運動與定位有著重要作用(Exp.Cell.Res.1998，238，23-32)，nudC很可能是PRL(催乳素)調節T細胞活性的關鍵中間調節物。這暗示，本發明的人HnudC在人體細胞細胞核的運動和定位中也發揮著類似的作用。
同時，RnudC還參與細胞內物質小泡轉運過程。小泡運輸是細胞內物質運輸的一種方法，nudC就是參與細胞膜組織產生的小泡與其他蛋白融合，并將這些蛋白運送到生物生長點，以促進這些組織的生長(Exp.Cell.Res.1998，238，23-32)。這暗示，本發明的人HnudC也可能參與物質小泡的轉運過程。
本發明的人HnudC除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人HnudC還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人HnudC的N端與大鼠或果蠅或構巢曲霉的HnudC的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人HnudC的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人HnudC核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人HnudC的表達水平或者抑制人HnudC的過度表達。由于人HnudC在細胞中具有重要的功能，因此該基因的缺失或異常表達會造成多種病癥。本發明的人HnudC核苷酸序列和多肽能用于這些相關疾病的治療。本發明的人HnudC蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人HnudC缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3HnudC在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼HnudC的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得HnudC cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為
5′-GAACGGATCCATGGGCGGAGAGCAGGAGG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的HnudC編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-GCAGGTCGACCTAGTTGAATTTAGCCTTG-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和HnudC的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHI、SalI消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證HnudC的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養基中，培養細胞至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞34小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HnudC。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫HnudC。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化后的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約40KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4HnudC在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼HnudC的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得HnudC cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-GAACGGATCCATGGGCGGAGAGCAGGAGG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的HnudC編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-GCAGCGGCCGCTAGTTGAATTTAGCCTTG-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有XmaIII限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和HnudC的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(fl ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用BamHI、XmaIII消化pcDNA3載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，用EcoRI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證HnudC的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是采用脂轉染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為40KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀HnudC基因翻譯產物的能力加以評估。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海新黃浦復旦基因工程有限公司(ii)發明名稱(iii)序列數目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1ACTAGAGTGC AGAGCTCCGG GAC 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AAGTTGGGTG GTTGCAGCTC AGC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長度1091bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGACGTGGATCGGAGCCGGCGCGATGGGCGGAGAGCAGGAG61 GAGGAGCGGTTCGACGGCATGTTGCTGGCCATGGCTCAGCAGCACGAGGGCGGCGTGCAG121 GAGCTTGTGAACACCTTCTTCAGCTTCCTTCGACGCAAAACAGACTTTTTCATTGGAGGA181 GAAGAAGGGATGGCAGAGAAGCTTATCACACAGACTTTCAGCCACCACAATCAGCTGGCA241 CAGAAGACCCGGCGGGAGAAGAGAGCCCGGCAGGAGGCCGAGCGGCGGGAGAAGGCGGAG301 CGGGCGGCCAGACTGGCCAAGGAAGCCAAGTCAGAGACCTCAGGGCCCCAGATCAAGGAG361 CTAACTGATGAAGAGGCAGAGAGGCTGCAGCTAGAGATTGACCAGAAAAAGGATGCAGAG421 AATCATGAGGCCCAGCTCAAGAACGGCAGCCTTGACTCCCCAGGGAAGCAGGATACTGAG481 GAAGATGAGGAGGAAGATGAGAAGGACAAAGGAAAACTGAAGCCCAACCTAGGCAACGGG541 GCAGACCTGCCCAATTACCGCTGGACCCAGACCCTGTCGGAGCTGGACCTGGCGGTCCCT601 TTCTGTGTGAACTTCCGGCTGAAAGGGAAGGACATGGTGGTGGACATCCAGCGGCGGCAC661 CTCCGGGTGGGGCTCAAGGGGCAGCCAGCGATCATTGATGGGGAGCTCTACAATGAAGTG721 AAGGTGGAGGAGAGCTCGTGGCTCATTGAGGACGGCAAGGTGGTGACTGTGCATCTGGAG781 AAGATCAATAAGATGGAGTGGTGGAGCCGCTTGGTGTCCAGTGACCCTGAGATCAACACC841 AAGAAGATTAACCCTGAGAATTCCAAGCTGTCAGACCTGGACAGTGAGACTCGCAGCATG901 GTGGAAAAGATGATGTATGACCAGCGACAGAAGTCCATGGGGCTGCCAACTTCAGACGAA961 CAGAAGAAACAGGAGATTCTGAAGAAGTTCATGGATCAACATCCGGAGATGGATTTTTCC1021 AAGGCTAAATTCAACTAGCCCCTGTTTTTTCCTCCCTGAACTCTTGGGGCTGAGCTGCAA1081 CCACCCAACTT(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度331個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Gly Gly Glu Gln Glu Glu Glu Arg Phe Asp Gly Met Leu Leu16 Ala Met Ala Gln Gln His Glu Gly Gly Val Gln Glu Leu Val Asn31 Thr Phe Phe Ser Phe Leu Arg Arg Lys Thr Asp Phe Phe Ile Gly46 Gly Glu Glu Gly Met Ala Glu Lys Leu Ile Thr Gln Thr Phe Ser61 His His Asn Gln Leu Ala Gln Lys Thr Arg Arg Glu Lys Arg Ala76 Arg Gln Glu Ala Glu Arg Arg Glu Lys Ala Glu Arg Ala Ala Arg91 Leu Ala Lys Glu Ala Lys Ser Glu Thr Ser Gly Pro Gln Ile Lys106 Glu Leu Thr Asp Glu Glu Ala Glu Arg Leu Gln Leu Glu Ile Asp121 Gln Lys Lys Asp Ala Glu Asn His Glu Ala Gln Leu Lys Asn Gly136 Ser Leu Asp Ser Pro Gly Lys Gln Asp Thr Glu Glu Asp Glu Glu151 Glu Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys Leu Lys Pro Asn Leu Gly Asn166 Gly Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Arg Trp Thr Gln Thr Leu Ser Glu181 Leu Asp Leu Ala Val Pro Phe Cys Val Ash Phe Arg Leu Lys Gly196 Lys Asp Met Val Val Asp Ile Gln Arg Arg His Leu Arg Val Gly211 Leu Lys Gly Gln Pro Ala Ile Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn Glu226 Val Lys Val Glu Glu Ser Ser Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val241 Val Thr Val His Leu Glu Lys Ile Asn Lys Met Glu Trp Trp Ser256 Arg Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Ile Asn Thr Lys Lys Ile Asn271 Pro Glu Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asp Ser Glu Thr Arg Ser286 Met Val Glu Lys Met Met Tyr Asp Gln Arg Gln Lys Ser Met Gly301 Leu Pro Thr Ser Asp Glu Gln Lys Lys Gln Glu Ile Leu Lys Lys316 Phe Met Asp Gln His Pro Glu Met Asp Phe Ser Lys Ala Lys Phe331 Asn(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GAACGGATCC ATGGGCGGAG AGCAGGAGG29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GCAGGTCGAC CTAGTTGAAT TTAGCCTTG29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GAACGGATCC ATGGGCGGAG AGCAGGAGG29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GCAGCGGCCG CTAGTTGAAT TTAGCCTTG29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ IDNO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中43-1038位的核苷酸序列。
4.一種分離的HnudC蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有HnudC蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成HnudC蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成HnudC蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HnudC蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HnudC蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位。
12.一種能與權利要求4所述的HnudC蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地,本發明提供了人HnudC的cDNA序列,該序列的編碼蛋白是大鼠RnrdC的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號C12N15/11GK1250097SQ9812092
公開日2000年4月12日 申請日期1998年10月5日 優先權日1998年10月5日
發明者余龍, 傅強, 屠強, 趙勇, 張宏來 申請人:上海新黃浦復旦基因工程有限公司