專利名稱：一種發酵生產β－胡蘿卜素的方法
技術領域：
本發明是用孢子接種在氣升式發酵罐中發酵培養絲狀真菌制備β-胡蘿卜素的工藝。β-胡蘿卜素是維生素類藥物，它是維生素A的前體，在人體內通過氧化酶的作用游離出二分子維生素A，起維生素A的作用。它對日光照射原卟啉所產生的過氧化基有清除作用，因此在醫藥和食品業有廣泛的用途。
在此發明以前發酵制備β-胡蘿卜素多采用搖瓶菌絲的進種子罐方法培養種子，即菌種通過斜面培養或搖瓶培養成菌絲后再接入種子罐繁殖產生大量菌絲作發酵用種，此種子制備工藝操作步驟多，周期長，增加雜菌污染的機會。另外，在本發明以前種子培養的發酵采用帶有機械攪拌裝置的通用式發酵罐。機械攪拌易將絲狀真菌的菌絲打斷，造成菌絲損傷，生物量減少，使發酵β-胡蘿卜素的產量降低，而且發酵要求通風量高，能耗大，成本高。
本發明的目的在于提供一種工藝簡單，發酵β胡蘿卜素產量高，制造成本低的發酵生產β-胡蘿卜素的方法。
本發明通過下列方案實現。
該方法包括a、一級種培養；b、二級種培養；c、發酵；其中二級種培養及發酵工序所采用的生物反應器均為氣升式發酵罐，該氣升式發酵罐的結構為內循環式或外循環式。一級種培養工序中、將保藏的能代謝產生β-胡蘿卜素的斜面菌種或砂土管保藏的菌種孢子接入PDA培養基上，在溫度24-30℃條件下培養48-72小時，待大量長出孢子后用無菌生理鹽水洗脫孢子成懸浮液，懸浮液中含孢子的量應為7-9×105個/毫升。PDA培養基是馬鈴薯、葡萄糖與瓊脂培養基或馬鈴薯、葡萄糖培養基，培養孢子的器皿可以用玻璃三角燒瓶或茄子瓶及培養皿。產生β-胡蘿卜素的菌種是一種絲狀真菌，Blakeslea frispora，分“+”、“-”兩種菌株，保藏于江蘇省微生物研究所菌種保藏處，菌號為9203(正株)，9204(負株)。在二級種培養工序中，新鮮孢子懸浮中的孢子在種子罐內萌發繁殖成大量菌絲體作為發酵用種子，孢子懸浮液中孢子的含量為7-9×105個/毫升。二級種培養和發酵工序采用氣升式發酵罐，罐體的高徑比為10∶1-20∶1，罐體與循環管的直徑比為1∶0.3-1∶0.5，壓縮空氣從裝置在培養液循環管中的噴嘴高速噴入培養液中呈氣液混合狀態，造成培養液重度降低，并獲得高速氣流的動力而沿循環管上升進入罐體，產生持續不斷的循環。在二級種培養工序中，培養基為葡萄糖1-2％，淀粉2-4％，玉米漿3-7％，磷酸二氫鉀0.1-0.3％，硫酸鎂0.01-0.05％，鹽酸硫胺素0.001-0.003，PH6.0-6.5，培養溫度24-30℃，通風量1∶0.8-1∶1.5，培養時間24-48小時。在發酵工藝中，培養基為淀粉2-4％；粕餅粉3-5％；植物油3-5％；玉米漿3-5％；磷酸氫二鉀0.1-0.3％；硫酸鎂0.01-0.05％；鹽酸硫胺素0.001-0.003％，PH7.0-8.0，培養溫度24-30℃，通風量1∶1.0-1∶20，罐壓0.04-0.08MPa，培養時間90-120小時。
本發明的優點是1、由于利有氣升式發酵罐，因而避免了原來使用普通發酵罐時，因攪拌葉造成較大的剪切力，使菌絲體受傷，生物量下降，從而降低β-胡蘿卜素的產量的問題，具體實驗結果如表一。
表一
2、普通發酵罐通過提高通風量來滿足發酵過程耗氧量高的問題。因而能耗大，氧的利用率也低。而采用氣升式發酵罐發酵就能解決這一問題。實驗結果見表二。
表二
3、本發明用孢子懸浮液代替搖瓶種子作為一級種種子接種子罐的工藝，可以縮短罐種子培養時間，提高種子的活力，使β-胡蘿卜素產量大大提高。實驗數據見表三。
表三
實例11、一級種培養PDA培養基配制如下150克去皮馬鈴薯切成碎塊，置于100毫升水中煮沸30分鐘，經紗布過濾，濾液中加入20克葡萄糖，20克瓊脂，加火定容至1000ml，PH自然，裝入1000毫升的三角燒瓶中，每瓶裝80毫升培養基，120℃滅菌20分鐘。
將保藏于江蘇省微生物研究所菌種保藏處，菌號為9203(正株)、9204(負株)的BLakeslea frispora“+”、“-”菌株砂土管孢子分別接種至4只三角瓶中，每個菌株各接兩只。26℃培養48小時，待培養基表面生長大量黑色孢子后，每只三角瓶中加入無菌生理鹽水200ml，將孢子洗脫成每毫升中含有7×105個孢子的孢子懸浮液。
2、二級種培養，種子培養基按以下配方制備淀粉2％；葡萄糖2％；玉米漿5％；硫酸鎂0.01％；磷酸二氫鉀0.1％；鹽酸硫胺素0.001％，用氫氧化鈉溶液調整至PH6.2。
種子罐為容積6立升的內循環氣升式玻璃發酵罐2只，每只裝種子培養基2升。培養基經120℃滅菌30分鐘。分別接入培養基量1％的上述“+”、“-”菌珠的孢子懸浮液，26℃培養32小時，風量1∶1，罐壓0.05MPa。
3、發酵發酵培養基的配方為淀粉4％；棉籽餅粉4％；玉米漿3％豆油3％；磷酸二氫鉀0.1％；硫酸鎂0.01％，鹽酸硫胺素0.001％，用氫氧化鈉溶液調PH至8.0。
發酵罐為容積30毫升的外循環氣升式玻璃發酵罐，高徑比15∶1，循環管與罐直徑比為0.4∶1，裝發酵培養基18立升，120℃滅菌40分鐘，將培養好的“+”、“-”兩菌株的種子全部接入發酵培養基中，接種量為20％，“+”、“-”菌株各10％，發酵溫度27℃±1℃，通風量1∶2，罐壓0.08MPa。發酵48小時流加入β-紫羅蘭酮0.1％，發酵90小時，得β-胡蘿卜素含量1751.24毫克/立升的發酵液。將發酵液離心收集菌體，烘干，粉碎得干菌粉606.2克，每克干菌粉含β-胡蘿卜素52.0毫克。干菌粉用工業已烷提取，提取液經減壓濃縮后，加無水乙醇低溫結晶，結晶用少量無水乙醇洗滌，并真空干燥得β-胡蘿卜素晶體19.3g，晶體純度為95.6％。
實例21、一級種培養除不加瓊脂外，PDA培養基和培養條件同實例1，3000毫升的三角瓶，每瓶裝培養基150毫升。前述“+”、“-”兩個菌株各接8瓶，每毫升中含有9×105個孢子。
2、二級種培養，種子培養基同實例1，種子罐采用300立升外循環氣升式不銹鋼罐兩只。罐的高徑比為20∶1，循環管與罐的直徑比為0.36∶1，兩只罐各裝培養基240立升，滅菌后分別接入培養基量0.5％的“+”、“-”菌珠孢子懸浮液，27℃培養30小時、通風量1∶0.8。
3、發酵發酵培養基除3％豆油改成3％棉籽油，棉籽餅粉改為大豆餅粉外，其余同實例1，發酵罐為容積3000立升的外循環氣升式不銹鋼制發酵罐，罐體高徑比為20∶1，循環管與罐的直徑比為0.44∶1，罐內裝培養基2000立升，120℃滅菌1小時，冷卻后將培養好的“+”、“-”兩菌株一起接入培養基內。發酵溫度27°±1℃。通風量1∶1.4。罐壓0.05MPa。發酵48小時，流加β-紫羅蘭酮0.1％，發酵114小時結束，發酵液中β-胡蘿卜素產量為1328毫克/立升。經提取后制得β-胡蘿卜素含量8％的油狀產品29.5公斤。
權利要求
1.一種發酵生產β-胡蘿卜素的方法，包括a、一級種培養；b、二級種培養；c、發酵；其特征是二級種培養及發酵工序所采用的生物反應器均為氣升式發酵罐，該氣升式發酵罐的結構為內循環式或外循環式。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是在一級種培養工序中，將保藏的能代謝產生β-胡蘿卜素的斜面菌種或砂土管保藏的菌種孢子接入PDA培養基上，在溫度24-30℃條件下培養48-72小時，待大量長出孢子后用無菌生理鹽水洗脫孢子成懸浮液，懸浮液中含孢子的量應為7-9×105個/毫升。
3.根據權利要求1、2所述的方法，其特征是PDA培養基是馬鈴薯、葡萄糖與瓊脂培養基或馬鈴薯、葡萄糖培養基，培養孢子的器皿可以用玻璃三角燒瓶或茄子瓶及培養皿。
4.根據權利要求1、2所述的方法，其特征是產生β-胡蘿卜素的菌種是一種絲狀真菌，Blakeslea frispora，分“+”、“-”兩種菌株，保藏于江蘇省微生物研究所菌種保藏處，菌號為9203(正株)、9204(負株)。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是在二級種培養工序中，新鮮孢子懸浮液中的孢子在種子罐內萌發繁殖成大量菌絲體作為發酵用種子，孢子懸浮液中孢子的含量為7-9×105個毫升。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是二級種培養和發酵工序采用氣升式發酵罐，罐體的高徑比為10∶1-20∶1，罐體與循環管的直徑比為1∶0.3-1∶0.5，壓縮空氣從裝置在培養液循環管中的噴嘴高速噴入培養液中呈氣液混合狀態，造成培養液重度降低，并獲得高速氣流的動力而沿循環管上升進入罐體，產生持續不斷的循環。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是在二級種培養工序中，培養基為葡萄糖1-2％，淀粉2-4％，玉米漿3-7％，磷酸二氫鉀0.1-0.3％，硫酸鎂0.01-0.05％，鹽酸硫胺素0.001-0.003，PH6.0-6.5.培養溫度24-30℃，通風量1∶0.8-1∶1.5，培養時間24-48小時。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是在發酵工藝中，培養基為淀粉2-4％；粕餅粉3-5％；植物油3-5％；玉米漿3-5％；磷酸氫二鉀0.1-0.3％；硫酸鎂0.01-0.05％；鹽酸硫胺素0.001-0.003％，PH7.0-8.0，培養溫度24-30℃，通風量1∶1.0-1∶20，罐壓0.04-0.0 8MPa，培養時間90-120小時。
全文摘要
本發明屬于一種用孢子接種在氣升式發酵罐中培養絲狀真菌發酵制備β－胡蘿卜素的工藝。該工藝包括一級種培養、二級種培養及發酵等工序,其特點是將能代謝產生β－胡蘿卜素的微生物菌種在一定條件下培養形成大量孢子,以氣升式發酵罐作為培養種子和發酵的生物反應器,在該種類型的罐中,孢子培養繁殖成大量菌絲,并作為種子接入發酵培養基中,發酵產生β－胡蘿卜素。
文檔編號C12P23/00GK1193048SQ98111199
公開日1998年9月16日 申請日期1998年3月23日 優先權日1998年3月23日
發明者姜文候, 單志萍, 孟妤, 孫冬梅, 陳濤, 陳宗勝, 馬國華, 朱湘民, 童驍, 宋冬林 申請人:江蘇省微生物研究所, 中國科學院武漢病毒研究所