專利名稱：多基因轉染的細胞株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生命科學領域，特別是一種多基因轉染的細胞株及其構建方法。
基因治療是近年興起的一種生物高技術治療方案，被認為是治愈惡性腫瘤最有希望的方案之一，世界各國均投入相當大的科研力量及科研基金進行研究。盡管基因治療已在動物體內取得較大成功，但目前對腫瘤治療103個臨床方案中，其效果并不理想，主要原因是目前的基因治療多采用單基因治療方案，而單基因治療存在以下問題(1)單基因治療若采用直接抑制腫瘤生長或殺死腫瘤細胞的基因，則要求基因轉染的載體系統能高效且特異性地將基因轉染腫瘤細胞，而目前的基因轉染系統不可能達到上述要求，具最高轉染率的腺病毒載體也只能部分轉染腫瘤細胞，因此難以起明顯臨床療效；(2)單基因治療若采用免疫基因治療，即加強腫瘤細胞的免疫原性或機體免疫效應細胞的反應性，雖可避免上述載體系統的局限性，但在免疫基因治療的設計思路方面，或是著眼于腫瘤免疫原性缺陷，或是僅考慮增強免疫效應細胞(如T細胞)的反應性，這種方案在動物實驗中取得很大成功，而在臨床試驗中并不理想，其原因是人體腫瘤在病毒或化學致癌物作用下，經過癌變到腫瘤演進多階段的過程，不僅在腫瘤抗原性方面發生復雜變化，同時在機體免疫反應機制方面也產生缺陷，因此單用一種基因難以起明顯療效。近年來有研究表明，對惡性腫瘤的治療，多基因協同配合明顯優于單基因治療，如細胞凋亡基因HSV-TK和共刺激因子B7聯合優于單個基因的治療。因此研制高效多基因轉染技術至關重要。但目前的多基因轉染技術仍有很多技術缺陷，通常采用逆轉錄病毒載體、腺病毒載體及皰疹病毒載體三種方法(1)采用逆轉錄病毒載體，由于細胞只能單次被逆轉錄病毒顆粒轉染，因此只能在載體方面進行改建。目前逆轉錄病毒載體通常采用進入核糖體結合位點(IRES)，這種方法可轉染兩個目的基因及一個篩選基因，因此單用逆轉錄病毒載體最多只能轉染三個基因(其中包括一個篩選基因)(2)應用腺病毒載體，可采用多種腺病毒載體混合注射，但三個以上腺病毒載體混合注射可導致明顯的免疫反應，而使基因無法表達(3)應用皰疹病毒載體，皰疹病毒載體是目前較為常用的多基因表達載體，目前該載體可克隆多個基因，但由于該載體存在著明顯毒性以及強烈的抗原性，此載體尚存在很多問題，因此目前未見臨床應用的報告。總而言之，高效多基因轉染技術目前仍存在很多問題，故至今未見有4個或4個以上基因轉染的細胞株。
本發明的目的在于提供一種多基因轉染的細胞株及其構建方法。
本發明的目的通過如下技術方案達到建立一種多基因轉染技術，即應用多基因真核表達載體及逆轉錄病毒載體先后按常規轉染方法轉染同一逆轉錄病毒載體包裝細胞株(如PA317)，使該細胞株包含有多種基因，其既能表達真核表達載體攜帶的基因，又能分泌高滴度逆轉錄病毒顆粒。若將該細胞株接種于機體局部，則可利用該細胞株分泌真核表達載體攜帶基因的高水平表達產物，使該局部形成高濃度；同時該細胞株分泌的高滴度逆轉錄病毒顆粒，可轉染機體細胞，使機體細胞表達逆轉錄病毒顆粒攜帶的基因，從而達到多基因協同作用的目的。這種方法可以使足夠多的基因轉染同一細胞株。
例一、按常規(見分子生物學常用實驗方法，1996年2月人民軍醫出版社出版，下同)構建真核表達載體PED攜帶含P35及P40兩個基因片段的白介素12(IL-12)基因，然后應用磷酸鈣沉淀法(參見分子克隆第二版，1992年10月科學出版社出版)將其轉染逆轉錄病毒載體包裝細胞株PA317。載體PED中含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，應用氨甲喋呤(MTX)篩選，其濃度從0.05μM漸增至10.0μM，隔兩周增加一次濃度，每次MTX的用量約為前次的兩倍，具體視細胞生長情況而定，約需篩選三個月時間。細胞培養按常規進行，培養液為15％胎牛血清(GIBCO公司)+RPMI1640/DMEM，置3 7℃5％CO2培養箱培養。然后按通常的極度稀釋法進行單克隆化，應用ELISA法分別檢測其活性，可得到高水平分泌白介素12的PA317細胞株，命名為PA317-IL-12。按常規構建逆轉錄病毒多基因載體GCPXSN攜帶白介素2(IL-2)基因及共刺激因子B7得重組逆轉錄病毒多基因載體GCXPNSN IL-2 and B7。將該載體轉染PA317-IL-12細胞株，其轉染方法為磷酸鈣沉淀法，因該逆轉錄病毒載體攜帶新霉素耐藥基因(neo)，故應用含氨基甙類抗生素G418的培養基進行篩選，G418濃度為1000μg/ml，培養四周，所用培養基及培養條件同上，然后應用小鼠成纖維細胞NIH3T3按常規篩選出可分泌高滴度病毒顆粒的細胞株，命名為PA317-IL-12，IL-2and B7，它既能分泌高水平白介素12，又能分泌攜帶IL-2基因及共刺激因子B7的逆轉錄病毒顆粒。若將該細胞株直接注射在腫瘤部位，其可產生高濃度白介素12，其分泌的攜帶IL-2及B7的逆轉錄病毒顆粒可轉染腫瘤細胞，使腫瘤細胞表達共刺激因子B7及白介素2，T細胞受到腫瘤抗原及共刺激因子刺激，在IL-12及IL-2作用下，大量T細胞被激活并增殖，對腫瘤細胞產生強大攻擊作用，因而能殺滅腫瘤細胞。在該細胞株中，由于含IL-12基因的2個基因片段，加上IL-2、B7，共有4個目的基因，再加上兩個篩選基因DFHR及neo，因此共轉染6個基因片段。
例二、按常規構建真核表達載體PEG攜帶IL-12基因即PEG-IL-12，構建真核表達載體PMT攜帶IL-2基因即PMT-IL-2；應用逆轉錄病毒多基因載體GCPXSN攜帶凋亡基因HSV-TK及B7基因，得重組逆轉錄病毒載體GCPXSN-HSV-TK and B7。其中PEG篩選標記基因為DHFR，篩選藥物為MTX，篩選方法同例一PMT篩選標記基因為hygr，篩選藥物為潮霉素(hyg)，其濃度為300μg/ml，培養條件為15％胎牛血清+RPMI1640/DMEM，置37℃5％CO2培養箱，共培養3周，而逆轉錄病毒載體篩選標記基因為neo，篩選藥物為G418，篩選方法同例一。先將PEG-IL-12及PMT-IL-2混合，應用磷酸鈣沉淀法將其共轉染PA317，再用MTX及hyg進行共篩選，具體篩選方法為在培養基(15％胎牛血清+RPMI1640/DMEM)中，同時加入hyg和MTX，至37℃5％CO2培養箱中按細胞培養常規培養。hyg的濃度為300μg/ml，篩選3周后停加，MTX的濃度從0.05μM漸增至10.0μM，每兩周增加一次濃度，用量約為前次的2倍，具體視細胞生長情況而定，約培養3個月。篩選到的細胞株命名為PA317-IL-12，IL-2，然后將重組逆轉錄病毒載體GCPXSN-HSV-TK and B7轉染該細胞株，應用G418篩選，G418濃度為1000μM/ml，共篩選四周(方法同前)，所得到的細胞株命名為PA317-IL-12，IL-2，HSV-TK and B7。該細胞株既能高水平地分泌IL-12和IL-2、又能高滴度地分泌攜帶HSV-TK及B7的病毒顆粒。若將該細胞株局部注射腫瘤部位，可使腫瘤局部產生高濃度的白介素2及白介素12，其分泌的病毒顆粒可轉染腫瘤細胞，使腫瘤細胞表達HSV-TK及共刺激因子B7。該細胞株含有目的基因片段5個，篩選標記基因3個，共轉染8個基因片段。本發明具有如下有益效果1.利用多基因轉染的細胞株含有的逆轉錄病毒載體具有較高的轉染率及真核表達載體具有較高表達水平的特點，可根據不同情況，構建含相應目的基因的多基因細胞株，以殺滅腫瘤細胞。
2.本發明可將4個或4個以上基因片段先后轉染到同一細胞中，為腫瘤的多基因治療開辟了新的途徑。
權利要求
1.一種多基因轉染的細胞株，其特征在于含有多基因的真核表達載體和逆轉錄病毒載體，因而既能表達真核表達載體攜帶的基因，又能分泌逆轉錄病毒顆粒。
2.按權利要求1所述的多基因轉染的細胞株，其特征在于所述的真核表達載體為PED，其攜帶含P35及P40兩個基因片段的IL-12基因，所述的逆轉錄病毒載體為GCPXSN，其攜帶IL-2基因及共刺激因子B7基因，所用的逆轉錄病毒載體包裝細胞株是PA317。
3.按權利要求1所述的多基因轉染的細胞株，其特征在于所述的真核表達載體之一為PEG，其攜帶含P35及P40兩個片段的IL-12基因，另一真核表達載體為PMT，攜帶IL-2基因，所述的逆轉錄病毒載體為GCPXSN，攜帶HSV-TK及B7基因，所用的逆轉錄病毒載體包裝細胞株是PA317。
4.一種多基因轉染細胞株的構建方法，其特征在于應用多基因真核表達載體及逆轉錄病毒載體先后轉染同一逆轉錄病毒載體包裝細胞株。
5.按權利要求4所述的多基因轉染細胞株的構建方法，其特征在于(1)按常規構建真核表達載體PED攜帶含P35及P40兩個基因片段的IL-12基因即PED-IL-12，再將其轉染逆轉錄病毒載體包裝細胞株PA317，然后用氨甲喋呤(MTX)進行篩選，用15％胎牛血清+RPMI1640/DMEM作培養基，加MTX置37℃5％CO2培養箱培養，MTX濃度從0.05μM漸增至10.0μM，每兩周增加一次濃度，每次MTX的用量約為前次的2倍，具體視細胞生長情況而定，約需篩選三個月，再按極度稀釋法進行單克隆化，應用ELISA法分別檢測其活性，得到高水平分泌白介素12的PA317細胞株，命名為PA317-IL-12(2)按常規構建攜帶IL-2及共刺激因子B7的逆轉錄病毒載體GCPXSN-IL-2and B7，再將其轉染PA317-IL-12細胞株，用含G418的培養基進行篩選，G418的濃度為1000μg/ml，培養基為15％胎牛血清+RPMI1640/DMEM，置37℃5％CO2箱中培養四周，然后應用小鼠成纖維細胞NIH3T3篩選出能分泌高滴度病毒顆粒的細胞株，命名為PA317-IL-12，IL-2and B7。
6.按權利要求4所述的多基因轉染細胞株的構建方法，其特征在于(1)按常規構建真核表達載體PEG攜帶含P35及P40的IL-12基因，命名為PEG-IL-12PMT攜帶IL-2基因，命名為PMT-IL-2；逆轉錄病毒多基因載體GCPXSN攜帶HSV-TK及B7基因，命名為GCPXSN-HSV-TK and B7，用氨甲喋呤(MTX)作為篩選藥物分別篩選PEG-IL-12和GCPXSN-HSV-TK and B7，用潮霉素hyg作篩選藥物篩選PMT-IL-2(2)將PEG-IL-12及PMT-IL-2共轉染PA317，應用MTX及hyg進行共篩選，得到的細胞株命名為PA317-IL-12，IL-2，然后將重組逆轉錄病毒多基因載體GCPXSN-HSV-TK and B7轉染該細胞株，得PA317-IL-12，IL-2，HSV-TK and B7細胞株。
全文摘要
本發明是將目的基因分別構建于真核表達載體和逆轉錄病毒載體中,如將白介素12基因、白介素2基因構建于真核表達載體，得到重組真核表達載體，而將細胞凋亡基因ＨＳＶ－ＴＫ等構建于逆轉錄病毒載體，得到重組逆轉錄病毒載體。然后將它們先后轉染同一逆轉錄病毒載體包裝細胞株，從而得到多基因轉染的細胞株。利用其真核表達載體具有較高的基因表達水平、逆轉錄病毒顆粒對腫瘤細胞具有較高的轉染率的特性，有望將其注射于腫瘤部位直接殺滅腫瘤細胞。
文檔編號C12N15/79GK1186121SQ9811066
公開日1998年7月1日 申請日期1998年2月23日 優先權日1998年2月23日
發明者錢其軍, 吳孟超, 曹慧芳, 崔貞福 申請人:上海東方肝膽外科醫院