專利名稱：雙水相萃取法提取紅霉素的方法
技術領域：
本發明涉及抗生素的提取方法，尤其涉及雙水相萃取法(ATPE)提取紅霉素的方法雙水相就是當兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽類溶于同一溶液，由于聚合物溶液間或聚合物與無機鹽溶液間具有不相容性，使得當聚合物或無機鹽的濃度達到一定值以上時，就會分成互不相溶的兩相系統，由于其共同溶劑是水，就稱此系統為雙水相系統。一般認為憎水性差異是產生相分離的主要推動力。由于聚合物分子的空間位阻作用，相互間無法滲透，具有強烈的相分離傾向，混合時濃度達到一定時，就不能形成單相溶液。常見的用于生物物質分離的聚合物/聚合物系統，有聚乙二醇(PEG)葡聚糖，聚合物/無機鹽系統有PEG/磷酸鹽，PEG/硫酸銨等。過去應用價格高昂的葡聚糖大大限制了ATPE技術的工業規模化的進程。
在相當長的時間內，總以為雙水相萃取法(ATPE)只能用于生物大分子的分離，并認為生物小分子物質在雙水相系統(ATPS)中應趨于均勻分配。然而，自九十年代以來，國際上的研究結果和我們實驗室的工作表明，用ATPE技術提取生物小分子，如氨基酸等也可取得較理想的效果。將ATPE技術提取生物小分子是一個嶄新的、有著應用前景的領域，在一定程度上代表了ATPE技術的一種新發展趨勢。
自五十年代發現紅霉素以來，經過幾十年的發展，紅霉素的生產已經走上了規模化的道路。目前主要的分離工藝有溶媒萃取法、離子交換法及大孔樹脂吸附法等。國內普遍采用的為溶媒萃取法，溶媒萃取法又有溶媒反復萃取、溶媒萃取結合中間鹽沉淀以及薄膜濃縮結合溶媒萃取三條途徑。以上工藝中，以乳酸鹽沉淀法得到的成品質量最好，收率也較高，國內平均率在72％左右，國外在80％左右。
在實際生產中，以上的提取工藝中都有一定的局限性。
用溶媒萃取和乳酸鹽中間鹽轉移法存在以下問題；1.成本高，溶媒消耗量大，約為8Kg/十億單位。大孔樹脂吸附法的溶媒消耗有所降低，但仍需3～4Kg/十億單位。由于國內工藝成本高，難以與國際市場上同類產品競爭，1990年開始有相當數量的紅霉素進口，沖擊了國內市場。
2.醋酸丁酯不僅價格貴，而且易燃、易爆，車間要求嚴格，勞保費用高。同時溶媒回收耗能大，廢液處理量大。
3.由于發酵液中蛋白質含量高，萃取過程易發生乳化現象，因此需要高速離心萃取機，投資大、設備的運行、維修保養要求高、操作能耗大。
離子交換法由于發酵液中存在大量無機鹽離子而影響吸附率，并且樹脂在每次吸附后都需用酸堿處理，使之活化。
大孔樹脂吸附法中洗脫劑一般為醋酸丁酯，由于其與水互不相溶，不利于吸附操作和吸附劑的再生。
上述幾種提取方法中，有一個共同的程序是，都必須對發酵液進行預處理，以除去蛋白質、菌絲體等雜質，減少后續操作的乳化現象。預處理步驟分為加鹽、調pH和板框過濾等。對板框過濾，需選用適合的有機絮凝劑，過濾時要加助濾劑，并且板框過濾操作勞動強度大，周期長。這些步驟既費時、又費力、占用場地也較大，是整個工藝中較為薄弱的環節之一。
本發明的目的是提供一種方法簡單、易于掌握、不受環境影響、見效快的雙水相萃取法提取紅霉素的方法。
為了達到上述目的本發明采取下列措施，它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發酵液，發酵液濃度為3000～10000u/ml，加入環氧乙烷一環氧丙烷無規共聚物130～190ml，K2HPO4·3H2O晶體300～420g，攪拌至溶解，室溫下靜置0.1～24小時以上至分相徹底，紅霉素進入上相中；b.醋酸丁酯萃取取上相250～370ml，加入31～310ml醋酸丁酯，用5～15％的NaOH調節pH為9.0～11.0，系統升溫至20～50℃，靜止3～27小時分相或離心分相，紅霉素進入上相中；c.成鹽取酯相155ml，加入總體積0.8％～4％的NaCl于30～60℃水浴攪拌30分鐘，降至室溫，靜置1.5～4.5小時，吸去水層，過濾除不溶性雜質；在攪拌下，緩緩加入20％的乳酸稀釋液(預先將乳酸稀釋在醋酸丁酯中)，加入量按乳酸(100％計算)∶紅霉素(總單位)＝1∶(4～6)w/w計算，加完時pH應為5～7，繼續攪拌20分鐘以上過濾，待完全濾完后，再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1～3次，在35～55℃溫度下干燥4～12小時，得紅霉素乳酸鹽；d.將計量的蒸餾水，丙酮混合，攪拌下加入紅霉素乳酸鹽，其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)＝1∶(30～50)∶(3～5)，過濾后，濾液用5～15％Na2CO3溶液，調節pH至9～11攪拌10～50分鐘，升溫至40～70℃趁熱抽濾，得紅霉素堿濕品；濕品于30～60℃，500～750MMHg，真空干燥12～36小時，得成品。
本發明的優點①分相迅速在實驗中觀察到，采用ATPE處理發酵液，約30分鐘即可分相，且無乳化層，處理時間較傳統預處理時間短，縮短了整個工藝周期。
②過程集成雙水相萃取既達到了預處理的目的，又濃縮了料液。表現為，大量的蛋白質、菌絲體在下相(鹽相)中沉淀下來，紅霉素進入上相，上相體積較發酵液大為減少，濃縮倍數達到了4以上，充分體現了雙水相技術適用于生物產品粗分離的特點。
同時，下相經過離心分離后，得到蛋白質等副產品，可直接作為飼料，而傳統預處理中，由下使用了ZnSO4，沉淀下來的蛋白質用作飼料會產生Zn2+中毒現象，需進一步處理。
③節省溶媒采用薄膜濃縮工藝，將預處理過的發酵液濃縮到原體積的1/2.5-1/3后，再用醋酸丁酯萃取，醋酸丁酯用量比溶媒法節省30％，本法的濃縮倍數達到了4以上，因此有理由相信，此工藝也可大大節省溶媒用量。
④方法簡單，易于掌握，不受環境影響，見效快。
下面結合實施例作詳細說明雙水相萃取法提取紅霉素的方法的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發酵液，發酵液濃度為3500～8500u/ml，加入環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物155～170ml，K2HPO4·3H2O晶體340～380g，攪拌至溶解，室溫下靜置0.5～6小時以上至分相徹底，紅霉素進入上相中；b.醋酸丁酯萃取取上相290～330ml，加入62～93ml醋酸丁酯，用8～12％的NaOH調節pH為9.5～10.5，系統升溫至30～35℃，靜止8～16小時分相或離心分相，紅霉素進入上相中；c.成鹽取酯相155ml，加入總體積0.8％～4％的NaCl于40～50℃水浴攪拌30分鐘，降至室溫，靜置1.5～4.5小時，吸去水層，過濾除不溶性雜質；在攪拌下，緩緩加入20％的乳酸稀釋液(預先將乳酸稀釋在醋酸丁酯中)，加入量按乳酸(100％計算)∶紅霉素(總單位)＝1∶(4.8～5.2)w/w計算，加完時pH應為5.5～6.5，繼續攪拌20分鐘以上過濾，待完全濾完后，再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1～3次，在40～50℃溫度下干燥5～7小時，得紅霉素乳酸鹽；
d.將計量的蒸餾水，丙酮混合，攪拌下加入紅霉素乳酸鹽，其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)＝1∶(35～45)∶(3.5～4.5)，過濾后，濾液用8～12％Na2CO3溶液，調節pH至9.5～10.5攪拌25～35分鐘，升溫至50～60℃趁熱抽濾，得紅霉素堿濕品；濕品于40～50℃，670～730MMHg，真空干燥20～28小時，得成品。環氧乙烷-環氧丙烷無規其聚物的分子量為1000～8000。
本發明的基礎在于發現紅霉素在EOPO/K2HO4系統中分配的極大不對稱性表1給出了紅霉素在EOPO(1∶1)(4200)/K2HPO4ATPS的分配數據。紅霉素是強憎水性物質，根據相似相溶原則，紅霉素對EOPO具有某種親和性，使紅霉素能較易溶解在富含EOPO的上相中。而紅霉素發酵液中的雜質，如還原糖分配在下相，幾乎不影響紅霉素的分配和回收；雜蛋白的分配系數在2-5左右，紅霉素對雜蛋白的分離因子約在10以上。紅霉素的萃取率在77.82-96.17％之間，得率在64.40-87.63％之間。
表3.1紅霉素純品在EOPO(1∶1)(4200)/K2HPO4雙水相系統中的分配序總組成 上相組成 下相組成 TLL相體積萃取 得率號 ％wt ％wt ％wt ％wt 上相 下相 相比 K G率％EOPO 鹽 EOPO 鹽 EOPO 鹽 ml ml ％1 13.50 6.00 30.56 1.71 1.03 9.11 30.44 4.00 5.30 0.75 4.65 3.49 77.82 64.402 14.52 7.00 33.00 1.48 0.53 11.12 33.87 4.00 5.20 0.77 6.56 0.51 83.46 66.763 15.49 7.99 40.37 1.08 0.28 12.53 41.69 4.00 5.20 0.77 10.30 7.93 88.85 76.734 16.51 8.99 43.41 0.86 0.21 14.45 45.29 3.60 5.60 0.64 39.10 25.05 96.17 87.63表中TLL=(Wt,1-Wb,1)2+(Wt,2-Wb,2)2]]>相比R＝Vt/Vb分配系數K＝Ct/Cb分配率G G＝K(Vt/Vb)萃取率 η＝mt/mt+mb＝RK/(1+RK)得率Yt＝mt/mtotal式中Vt，Vb-上相，下相的體積；Ct，Cb-紅霉素在上，下相中的濃度；Mt，Mb-紅霉素在上，下相中的質量；
Mtotal-系統中紅霉素的總量。
實施例雙水相萃取法提取紅霉素的方法的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發酵液，發酵液濃度為3921u/ml，加入環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物162ml，K2HPO4·3H2O晶體360g，攪拌至溶解，室溫下靜置2小時以上至分相徹底，紅霉素進入上相中；b.醋酸丁酯萃取取上相310ml，加入70ml醋酸丁酯，用10％的NaOH調節pH為10，系統升溫至32℃，靜止12小時分相或離心分相，紅霉素進入上相中；c.成鹽取酯相155ml，加入總體積0.8％～4％的NaCl于45℃水浴攪拌30分鐘，降至室溫，靜置1.5～4.5小時，吸去水層，過濾除不溶性雜質；在攪拌下，緩緩加入20％的乳酸稀釋液(預先將乳酸稀釋在醋酸丁酯中)，加入量按乳酸(100％計算)∶紅霉素(總單位)＝1∶5w/w計算，加完時pH應為6.0，繼續攪拌20分鐘以上過濾，待完全濾完后，再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1～3次，在45℃溫度下干燥6小時，得紅霉素乳酸鹽；d.將計量的蒸餾水，丙酮混合，攪拌下加入紅霉素乳酸鹽，其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)＝1∶40∶4，過濾后，濾液用10％Na2CO3溶液，調節PH至10.0，攪拌30分鐘，升溫至55℃趁熱抽濾，得紅霉素堿濕品；濕品于45℃，700MMHg，真空干燥24小時，得成品。生物效價920u/mg，總收率71.2％。
權利要求
1.一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法，其特征在于它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發酵液，發酵液濃度為3000～10000u/ml，加入環氧乙烷一環氧丙烷無規共聚物130～190ml，K2HPO4·3H2O晶體300～420g，攪拌至溶解，室溫下靜置0.1～24小時以上至分相徹底，紅霉素進入上相中；b.醋酸丁酯萃取取上相250～370ml，加入31～310ml醋酸丁酯，用5～15％的NaOH調節pH為9.0～11.0，系統升溫至20～50℃，靜止3～27小時分相或離心分相，紅霉素進入上相中；c.成鹽取酯相155ml，加入總體積0.8％～4％的NaCl于30～60℃水浴攪拌30分鐘，降至室溫，靜置1.5～4.5小時，吸去水層，過濾除不溶性雜質；在攪拌下，緩緩加入20％的乳酸稀釋液(預先將乳酸稀釋在醋酸丁酯中)，加入量按乳酸(100％計算)紅霉素(總單位)＝1∶(4～6)w/w計算，加完時pH應為5～7，繼續攪拌20分鐘以上過濾，待完全濾完后，再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1～3次，在35～55℃溫度下干燥4～12小時，得紅霉素乳酸鹽；d.將計量的蒸餾水，丙酮混合，攪拌下加入紅霉素乳酸鹽，其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)＝1∶(30～50)∶(3～5)，過濾后，濾液用5～15％Na2CO3溶液，調節pH至9～11攪拌10～50分鐘，升溫至40～70℃趁熱抽濾，得紅霉素堿濕品濕品于30～60℃，500～750MMHg，真空干燥12～36小時，得成品。
2.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法，其特征在于它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發酵液，發酵液濃度為3500～8500u/ml，加入環氧乙烷一環氧丙烷無規共聚物155～170ml，K2HPO4·3H2O晶體340～380g，攪拌至溶解，室溫下靜置0.5～6小時以上至分相徹底，紅霉素進入上相中；b.醋酸丁酯萃取取上相290～330ml，加入62～93ml醋酸丁酯，用8～12％的NaOH調節pH為9.5～10.5，系統升溫至30～35℃，靜止8～16小時分相或離心分相，紅霉素進入上相中；c.成鹽取酯相155ml，加入總體積1.5％～2.5％的NaCl于40～50℃水浴攪拌30分鐘，降至室溫，靜置2.5～3.5小時，吸去水層，過濾除不溶性雜質；在攪拌下，緩緩加入20％的乳酸稀釋液(預先將乳酸稀釋在醋酸丁酯中)，加入量按乳酸(100％計算)∶紅霉素(總單位)＝1∶(4.8～5.2)w/w計算，加完時pH應為5.5～6.5，繼續攪拌20分鐘以上過濾，待完全濾完后，再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1～3次，在40～50℃溫度下干燥5～7小時，得紅霉素乳酸鹽；d.將計量的蒸餾水，丙酮混合，攪拌下加入紅霉素乳酸鹽，其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)＝1∶(35～45)∶(3.5～4.5)，過濾后，濾液用8～12％Na2CO3溶液，調節pH至9.5～10.5攪拌25～35分鐘，升溫至50～60℃趁熱抽濾，得紅霉素堿濕品；濕品于40～50℃，670～730MMHg，真空干燥20～28小時，得成品。
3.根據權利要求1或2所述的一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法，其特征在于它的步驟如下a.雙水相萃取取1500ml紅霉素發酵液，發酵液濃度為3921u/ml，加入環氧乙烷一環氧丙烷無規共聚物162ml，K2HPO4·3H2O晶體360g，攪拌至溶解，室溫下靜置2小時以上至分相徹底，紅霉素進入上相中；b.醋酸丁酯萃取取上相310ml，加入70ml醋酸丁酯，用10％的NaOH調節pH為10系統升溫至32℃，靜止12小時分相或離心分相，紅霉素進入上相中；c.成鹽取酯相155ml，加入總體積0.8％～4％的NaCl于45℃水浴攪拌30分鐘，降至室溫，靜置1.5～4.5小時，吸去水層，過濾除不溶性雜質；在攪拌下，緩緩加入20％的乳酸稀釋液(預先將乳酸稀釋在醋酸丁酯中)，加入量按乳酸(100％計算)∶紅霉素(總單位)＝1∶5w/w計算，加完時pH應為6.0，繼續攪拌20分鐘以上過濾，待完全濾完后，再用新鮮的醋酸丁酯洗滌1～3次，在45℃溫度下干燥6小時，得紅霉素乳酸鹽；d.將計量的蒸餾水，丙酮混合，攪拌下加入紅霉素乳酸鹽，其比例為乳酸鹽(W)∶蒸餾水(V)∶丙酮(V)＝1∶40∶4，過濾后，濾液用10％Na2CO3溶液，調節pH至10.0攪拌30分鐘，升溫至55℃趁熱抽濾，得紅霉素堿濕品；濕品于45℃，700MMHg，真空干燥24小時，得成品。
4.根據權利要求1或2所述的一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法，其特征在于所說的環氧乙烷一環氧丙烷無規共聚物的分子量為1000～8000。
全文摘要
本發明公開了一種雙水相萃取法提取紅霉素的方法。它是向紅霉素發酵液中加入一定量的環氧乙烷—環氧丙烷無規共聚物(EOPO)及K
文檔編號C12P19/62GK1195028SQ98104898
公開日1998年10月7日 申請日期1998年4月8日 優先權日1998年4月8日
發明者朱自強, 李勉, 王軼雄, 關怡新, 姚善涇 申請人:浙江大學