從合成的rna轉錄物制備雙rna病毒的方法

專利名稱：從合成的rna轉錄物制備雙rna病毒的方法
背景技術：
感染性囊病病毒(IBDV)，一個雙RNA病毒家族的成員，是小雞中高免疫抑制疾病的成因劑(Kibenge，F.S.B.等人，病毒遺傳雜志，69，1757-1775(1988))。感染性囊病(IBD)或傳染性粘液囊病的特征是破壞法氏囊中的淋巴濾泡。在3-6周齡的完全敏感的雞群中，該臨床疾病引起嚴重的免疫抑制，導致由于妨礙生長，飼料的效率降低和死亡等引起的損失。小于3周齡的敏感雞群沒有顯示該疾病外在的臨床癥狀，但具有明顯的感染特征，囊受到損害。
與該疾病的癥狀相關的病毒稱為感染性囊病病毒(IBDV)。IBDV是對國家和世界家禽業有主要經濟重要性影響的致病原。它通過破壞法氏囊中的產生抗體的B細胞的前體，在小雞中引起嚴重的免疫缺陷。免疫抑制引起對其它疾病的敏感性增加，并干擾抗新城雞瘟病、馬立克氏病和感染性支氣管炎病毒的有效接種。
已知的IBDV血清型有兩種。血清型I病毒是雞的致病原，而血清型II病毒感染雞和火雞。火雞的感染的臨床意義目前還是未知。
IBDV屬于稱為雙RNA病毒的病毒組類，該組類包括其它雙區段RNA病毒，如感染性胰壞死病毒(魚)，tellina病毒和蠔病毒(雙殼類軟體動物)和果蠅X病毒(果蠅)。這些病毒都含有高分子量(MW)的雙鏈RNA基因組。
IBDV病毒粒子的外殼由幾個結構蛋白質組成。已經報道了9個之多的結構蛋白質，但有證據表明它們中的一些可能有前體—產物的關系(Kibenge，F.S.B.等人，病毒遺傳雜志，69，1757-1775(1988))。病毒蛋白質(VP)的命名和分子量表示如下。病毒蛋白 分子量VP1 90千道爾頓VP2 41千道爾頓VP3 32千道爾頓VP4 28千道爾頓VP5 17千道爾頓鑒定了IBDV的基因組中雙鏈RNA的兩區段。IBDV基因組由在核苷酸堿基對2827(區段B)到3261(區段A)之間變化的雙鏈(ds)RNA的兩個區段組成(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995))。較大的區段A編碼聚蛋白，這種蛋白質通過自我蛋白水解形成成熟的病毒蛋白質VP2、VP3和VP4(Hudson，P.J.等人，核酸研究，14，5001-5012(1986))。VP2和VP3是病毒粒子的主要結構蛋白。VP2是IBDV的主要的宿主保護性免疫原，含有導致誘導中和抗體的抗原區(Azad，等人，病毒學，161，145-152(1987))。在聚蛋白基因前面和與之部分重迭的第二個開放讀碼框架(ORF)，編碼存在于IBDV感染的細胞中的功能未知的蛋白質(VP5)(Mundt，E.等人，病毒遺傳雜志，76，437-443(1995))。較小的區段B編碼VP1，VP1是具有聚合酶和加帽酶活性的90千道爾頓多功能蛋白質(Spies，U.等人，病毒研究，8，127-140(1987)；Spies，U.，等人，病毒遺傳雜志，71，977-981(1990))。
已經證明VP2蛋白質是IBDV的主要的宿主保護性免疫原，含有導致誘導中和抗體的抗原區。已經證明含有中和位點的區域是高度構型依賴的。已經有人認為VP3蛋白質是特異于基團的抗原，因為抗來自血清型I和II病毒的抗原的單克隆抗體能夠識別該抗原。VP4蛋白質似乎是病毒編碼的蛋白酶，參與加工VP2、VP3和VP4蛋白質的前體聚蛋白的加工。
雖然已經公開了各種IBDV毒株的基因組區段A和B的核苷酸序列，只是在最近才確定了兩區段的完全的5’和3’非編碼序列。IBDV區段A和B的5’非編碼區含有32個核苷酸的共有序列，而兩區段的3’非編碼末端序列是不相關的，但在相同血清型的IBDV毒株中是保守的(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995))。正如在其它含有dsRNA的病毒如哺乳動物和植物呼腸病毒和輪狀病毒中所證明的，這些末端可能含有在包裝和調節IBDV基因表達中很重要的序列(Anzola，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，8301-8305(1987)；Zou，S.等人，病毒學，186，377-388(1992)；Gorziglia，M.I.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，5784-5788(1992))。
在最近幾年，利用依賴DNA的RNA聚合酶產生的轉錄物已經從克隆的cDNA產生出許多感染性動物RNA病毒(Boyer，J.C.，等人，病毒學，198，415-426(1994))。例如，脊髓灰質炎病毒，正鏈RNA病毒，流感病毒，區段化的負鏈RNA病毒，狂犬病毒，非區段化的負鏈RNA病毒；所有這些是從它們各自的基因組的克隆cDNA得到的(van derWerf，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，2330-2334(1986)，Enaml，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3802-3805(1990)；Schnell，M.J.等人，EMBO雜志，13，4195-4205(1994))。對于呼腸病毒，發現當與來自不同血清型的輔助病毒互補時，用SSRNA、dsRNA和體外翻譯的呼腸病毒產物聯合轉染細胞產生感染性呼腸病毒(Roner，M.R.，等人，病毒學，179，845-852(1990))。但是，至今，沒有報道只來自合成RNA的區段化的dsRNA基因組感染性病毒。
發明概要本發明涉及感染性囊病病毒(IBDV)，它與小雞的傳染性粘液囊病相關。更具體地說，本發明涉及利用起源于克隆的cDNA的合成轉錄物制備感染性囊病病毒(IBDV)的系統。本發明將有助于病毒基因表達的調節和病理的研究和設計產生新的活和失活的疫苗。本發明的詳細說明在開發IBDV的反遺傳系統的嘗試中，分別構建了三個含有血清型I毒株D78或血清型II毒株23/82的區段A和血清型I毒株P2的區段B的獨立的全長cDNA克隆。利用T7 RNA聚合酶通過線性質粒的體外轉錄反應產生區段A和B的合成的RNA。通過轉染非洲綠猴腎細胞評估未用DNase或RNase處理或已處理的這些區段的轉錄物的感染性病毒的生產。
本發明人已經證明源于相應于區段化的dsRNA動物病毒的整個基因組的克隆DNA的合成轉錄物能夠產生復制病毒。在利用起源于含有dsRNA基因組的病毒(IBDV)的克隆cDNA的合成的正意義RNA轉染細胞后回收感染性病毒，完成了產生RNA病毒的反感染系統的探索。許多研究者已經從克隆的cDNA產生動物感染性RNA病毒(Boyer，J.C.，等人，病毒學，198，415-426(1994))。Van der Werf等人是第一個利用T7 RNA聚合酶在克隆的cDNA模板上產生的合成RNA生產脊髓灰質炎病毒，一種正鏈RNA病毒(van der Werf，S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，2330-2334(1986))。后來，從它們各自的基因組的克隆cDNA，Enami等人獲得了流感病毒，一種區段化的負鏈RNA病毒(Enami，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3802-3805(1990))；和Schnell等人制得了狂犬病毒，一種非區段化的負鏈RNA病毒(Schnell，M.J.等人，EMBO雜志，13，4195-4205(1994))。通過合成的ssRNA、dsRNA、體外翻譯的呼腸病毒產物轉染細胞，Roner等人開發了區段化的dsRNA呼腸病毒的感染性系統，并與不同血清型的輔助病毒互補(Roner，M.R.等人，病毒學，179，845-852(1990))。通過噬菌斑測試，將得到的病毒與輔助病毒區別開來。但是，在這一系統中，使用輔助病毒是必要的。相反，現在敘述的IBDV反遺傳系統不需要輔助病毒或其它病毒蛋白。利用兩區段的正意義RNA轉染細胞足以產生感染性病毒(IBDV)。在區段A的3’末端分別轉錄的另外一個或四個核苷酸的結局沒有確定。但是，這并不阻止病毒dsRNA的復制。不同的研究者觀察到正鏈RNA病毒有同樣的效果(Boyer，J.C.，等人，病毒學，198，415-426(1994))。
用兩個區段的正意義RNA轉染同一細胞對于成功地恢復IBDV是必要的。通過細胞的翻譯機制將兩個區段的轉染RNA翻譯。假定區段A的聚蛋白加工成VP2、VP3和VP4蛋白質，它們形成病毒的外殼。白區段B翻譯出蛋白質VP1可能起依賴于RNA的RNA聚合酶的作用，從兩個區段的合成正鏈轉錄負鏈，反應產物形成dsRNA。最近，Dobos報道了感染性胰壞死病毒(IPNV)，雙RNA病毒家族中的一個原型病毒，通過依賴于病毒粒子RNA的RNA聚合酶在體外的轉錄是由VP1引導的，然后通過不對稱、半保守、鏈替代機制進行加工，在病毒基因組的復制過程中只合成正鏈(Dobos，P.，病毒學，208，10-25(1995))。本發明系統顯示負鏈的合成在正鏈的合成之前。得到的轉錄負鏈RNA是否用作為正鏈轉錄的模板仍然是進一步研究的主題。
為了證明轉染細胞的上清液中含有的感染性IBDV確實起源于合成的轉錄物，生產了含有血清型II毒株的區段A和血清型I毒株的區段B的人工嵌合體。序列分析證實了這一基因組聯合。該結果同樣表明Mundt和Muller描述的終端序列基元可能導致病毒基因組的復制，分類和包裝(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995))。血清型特異性終端序列的存在顯然不阻止在血清型I區段B的依賴RNA的RNA聚合酶VP1的作用下，適當復制血清型II A區段。產生重組病毒的能力將大大幫助分析血清型特異的和血清型共同的終端序列的準確功能。
感染性IBDV的回收證實只有兩區段的正鏈RNA才足以啟動dsRNA的復制。所以，該結果與呼腸病毒和輪狀病毒復制的一般特征一致，其中正鏈RNA的作用是作為合成子代負鏈的模板以便產生dsRNA(Schonberg，M.，等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，Patton，J.T.，病毒研究，6，217-233(1986)；Chen，D.，等人，病毒學雜志，68，7030-7039(1994))。但是，Spies等人和Dobos建議的半保守、鏈替代機制不能排除在外(Spies，U.等人，病毒研究，8，127-140(1987)；Dobos，P.，病毒學，208，10-25(1995))。IBDV反遺傳系統的開發將大大簡化將來基因表達和病理的研究，和輔助產生新的活和失活IBDV疫苗的設計。
如本申請書所用，如用于核酸的術語“合成的”指這是人制造的核酸，與天然存在的核酸不同。對于制造方法，該術語的含義沒有限制，可以是化學或生物的，只要制造方法包括人的干預即可。
術語“cDNA”是指含有區段A和B和區段A和B的5’和3’非編碼區的任何cDNA。
術語“感染性”如用于病毒，表明病毒具有再生能力。該病毒可以是致病原或非致病原，并且仍然是感染性的。
本發明提供了利用合成RNA轉錄物產生感染性囊病病毒的系統。這一系統可以用于病毒基因表達的調節和病理的研究和產生新的活和失活IBDV疫苗的設計。
本發明提供含有至少一個拷貝的本發明的cDNA的重組載體。重組載體也可以含有其它必需序列，如本領域已知的表達控制序列、標記、擴增基因、信號序列、啟動子和諸如此類。為了這一目的的有用載體是質粒，病毒如桿狀病毒、皰疹病毒(HVT)和痘病毒，例如，家禽痘病毒和諸如此類。
本文還提供了利用本發明的重組載體轉化的宿主細胞或利用本發明的合成RNA轉染的宿主細胞。宿主細胞可以是原核或真核宿主細胞。適當的例子有大腸桿菌、昆蟲細胞系如Sf-9、雞胚成纖維細胞(CEF)、雞胚腎細胞(CEK)、非洲綠猴腎細胞Vero和諸如此類。
同樣是本發明的一部分的是含有家禽保護量的重組產生的病毒或病毒一部分的IBDV家禽疫苗，其中病毒是失活或經修飾的，以致它不再具有毒力。
通過化學或物理方法可以失活病毒。例如用酶、甲醛、β-丙酸內酯、環乙亞胺、或其衍生物、有機溶劑(如鹵代烴)和/或去垢劑處理病毒可以達到化學失活。如果需要，在病毒已經失活后，可以中和失活的物質。通過將病毒進行如UV光照射、X-放射、或γ輻射可以進行物理失活。
通過已知方法包括在生產感染性病毒之前或之后進行連續傳代、缺失核酸序列和位點特異誘變，可以將病毒減毒以產生保留足夠的抗原性但毒力減弱的病毒。
用于家禽接種的生理可接受載體是本領域已知的，不需要在本文進一步敘述。除了對家禽是生理可接受的，該載體必須不干擾疫苗引發的免疫應答和/或不干擾它的多肽產物的表達。
其它添加劑如助劑和穩定劑等也可以本領域已知的量包含在疫苗中。優選地，助劑如氫氧化鋁、磷酸鋁、植物和動物油和諸如此類可以足以增強對IBDV的免疫應答的量與疫苗一起給藥。加入疫苗的助劑的量將根據助劑的特性而變化，通常范圍在IBDV重量的約0.1到約100倍，優選地為IBDV重量的約1到約10倍。
本發明的疫苗也可以含有各種穩定劑。任何適當的穩定劑都可以利用，包括碳水化合物如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精或葡萄糖；蛋白質如白蛋白或酪蛋白；和緩沖液如堿性金屬磷酸鹽和諸如此類。當通過冷凍制備干燥疫苗制劑時穩定劑是特別有利的。
疫苗可以通過任何適當的已知接種家禽的方法給藥，包括經鼻的、眼的、通過注射、在飲用中、在飼料中、通過接觸等諸如此類。優選地，將疫苗通過大量給藥技術給藥，如將疫苗放入飲用水中，或通過噴灑動物所處的環境。當通過注射給藥時，優選地將疫苗經皮給藥。如本文所用的非腸道給藥指通過靜脈內、皮下、肌肉內或腹膜內注射給藥。
將本發明的疫苗在孵化之前或之后對家禽給藥以便在任何時候防止IBD。優選地，疫苗是在出生的時間之前，和動物約6周齡之后給藥。家禽定義包括，但不限于雞、公雞、母雞、焙烤小雞、繁殖的雞、生蛋的雞、火雞和鴨。
疫苗可以在無菌包裝中以單位形式或以其它量提供。優選地，將它冷凍儲藏，在低于-20℃，更優選地，在低于-70℃儲藏。在使用之前解凍，然后可以立即再冷凍。對于家禽給藥，可以將重組生產的病毒懸浮于載體中，量為104到107pfu/毫升，更優選地，在載體如鹽溶液中為105到106pfu/毫升。失活的疫苗可以含有懸浮于載體中的104到107pfu/毫升的抗原等價物。如本領域已知，其它載體也可以利用。藥學可接受載體的例子是稀釋劑和本領域已知的惰性藥學載體。優選地，載體或稀釋劑是與大量給藥技術給藥疫苗相容的。但是，載體或稀釋劑也可以與其它給藥方法如注射、滴眼、滴鼻等諸如此類相容。
本發明也可以用于產生與IBDV物質聯合的疫苗。IBDV物質可以與新城雞瘟病病毒感染性支氣管炎病毒、呼腸病毒、腺病毒和/或馬立克氏病毒的抗原物質聯合。
本發明前面的實施方案將進一步在下面的實施例中闡述。但是，本發明不限于這些實施例。對本領域技術人員而言，不離開本發明的范圍的變化將是顯然的。
附圖的簡要描述

圖1是用于合成含有T7 RNA聚合酶的IBDV正意義ssRNA的cDNA構建體的圖解說明。構建體pUC19FLAD78含有IBDV毒株D78的區段A的cDNA，重組質粒pUC18FLA23含有IBDV毒株23/82的區段A的全長cDNA。IBDV的區段A編碼聚蛋白質(VP2-VP4-VP3)和最近鑒定的VP5蛋白質。質粒pUC18FLBP2含有毒株P2的區段B的cDNA，它編碼依賴于RNA的RNA聚合酶(VP1)。病毒特異性序列下面劃線，T7啟動子序列是斜體。鑒定了限制位點并用黑體表示。用垂直的箭頭表示線性質粒的切割位點。用水平箭頭表示轉錄方向。
圖2顯示用于轉染非洲綠猴腎細胞株細胞的轉錄反應產物的瓊脂糖凝膠分析。在體外利用T7 RNA聚合酶和線性質粒pUC19FLAD78轉錄的合成RNA(泳道2，4和6)，含有IBDV毒株D78的區段A的cDNA；pUC18FLBP2(泳道1，3和5)含有毒株P2的區段B的cDNA。在轉錄后，反應混合物利用DNase(泳道1和2)，RNase(泳道3和4)處理或仍然未處理(泳道5和6)。在1％的瓊脂糖凝膠上分析2微升反應產物。將HindIII/EcoR I消化的λDNA用作分子量標記(泳道M)。
圖3顯示了來自嵌合體IBDV毒株23A/P2B的區段A和B的克隆的RT-PCR片斷的核苷酸序列(黑體)分別與血清型II毒株23/82和血清型I毒株P2的區段A和B的已知序列的比較。相同的核苷酸以冒號表示。
圖4顯示了pUC18FLA23的DNA序列。
圖5顯示了pUC19FLAD78的DNA序列。
圖6顯示了pUC18FLBP2的DNA序列。
實施例病毒和細胞 將兩個IBDV血清型I毒株(來自德國的減毒P2毒株和疫苗毒株D78(intervet international))和一個血清型II毒株(apathogenic23/82毒株)在雞胚細胞(CEC)中繁殖并純化(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995)；Vakharia，V.N.等人，病毒研究，31，265-273(1994))。在用5％胎牛血清(FCS)補充的M199培養基中生長非洲綠猴腎細胞并用于轉染實驗。在非洲綠猴腎細胞中進行進一步繁殖恢復的病毒和免疫熒光研究(Mundt，E.等人，病毒遺傳雜志，76，437-443(1995))。對于噬菌斑測試，制備和使用了第二代CEC的單層(Muller，H.，等人，病毒研究，4，297-309(1986))。
構建IBDV基因組的全長cDNA克隆 單獨制備了全長IBDV區段A和B的cDNA克隆。利用標準克隆程序和各種方法制備了含有毒株D78的RNA區段A的整個編碼區的cDNA克隆(Vakharia，V.N.，等人，病毒研究，31，265-273(1994))。將D78末端序列與最近公開的其它IBDV毒株的末端序列比較(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995))，觀察到D78 cDNA克隆在5’和3’末端分別缺乏保守的起始的17和最后10個核苷酸。所以，為了構建區段A的全長cDNA的克隆，合成了兩個引物對(A5’-D78，A5-IPD78和A3’-IPD78)，并用于PCR擴增(表1)。根據供應商的方案(新英格蘭生物實驗室)，利用“Deep Vent聚合酶”(高保真，耐熱DNA聚合酶)擴增該DNA區段。將擴增的片斷克隆到pCRII載體(Invitrogen公司)的EcoR I位點，以便分別得到質粒pCRD78A5’和pCRD78A3’。利用EcoR I和Sal I消化各個質粒，將得到的片斷連接到EcoR I消化的pUC19上以便得到質粒pUC19FLAD78(SEQ ID NO27和29)，該質粒含有編碼所有結構蛋白(VP2，VP4和VP3，SEQ ID NO30)以及非結構VP5蛋白(SEQ ID NO28)的區段A的全長cDNA拷貝(圖1)。
將兩個引物對(A5’-23，A5IP23和A3’-23，A3-IP23；參見表1)用于毒株23/82的病毒基因組dsRNA的逆轉錄(RT)，該逆轉錄利用了“SuperScript RT II”(RNA指導的DNA聚合酶，其RNase H的活性減弱，GIBCO/BRL)。通過酚/氯仿提取和乙醇沉淀純化RT反應產物。為了得到引物對A5’-23、A5-IP23，和A3’-23、A3-IP23，分別連接的兩個cDNA片斷，通過PCR，利用“Deep Vent聚合酶”擴增RT反應產物。根據供應商的方案進行RT和PCR。將得到的PCR片斷末端平齊化，并連接進入Sma I切割的pUC18載體以便得到pUC23A5’和pUC23A3’。將質粒pUC23A3’中含有的區段A的3’末端連接進入Hind III-BstB I切割的質粒pUC23A5’以便建立毒株23/82的區段A的全長cDNA。將得到的質粒命名為pUC18FLA23(SEQ ID NO31和33)(圖1)，它編碼結構蛋白VP2、VP3和VP4(SEQ ID NO32)和非結構蛋白質VP5(SEQ ID NO34)。
為了得到P2毒株的區段B的cDNA克隆，根據公開的序列設計兩個引物對(B5’-P2，B5-IPP2和B3’-P2，B3-IPP2)，用于RT-PCR擴增(參見表1)。利用基因組dsRNA作為模板，根據供應商的方案合成和擴增cDNA片斷(Perkin-Elmer Cetus)。將擴增的片斷末端平齊化，連接進入Sma I切割的pBS載體(Stratagene)以便得到克隆pBSP2B5’和pBSP2B3’。為了構建區段B的全長克隆，首先在pUC18載體的EcoRI和Pst I位點之間亞克隆質粒pBSP2B5’的5’末端片斷以便得到pUCP2B5’。然后，將質粒pBSP2B3’的3’末端片斷插入在質粒pUCP2B5’的唯一的Bgl II和Pst I位點以便得到全長的質粒pUC18FLBP2(SEQ ID NO25)，該質粒編碼VP1蛋白質(SEQ IDNO26)(圖1)。利用“序列酶”DNA測序系統(美國生化)可以對質粒pUC18FLBP2、pUC18FLA23和pUC19FLAD78完全測序，利用“DNASIS”(Pharmacia)或“PC/Gene”(Intelligenetics)軟件分析序列數據。利用T7 RNA聚合酶(Promega)體外轉錄和體外翻譯偶聯網織紅細胞裂解液系統以測試全長構建體的完整性。
合成RNA的轉錄和轉染 分別利用BsrG I、Nsi I和Pst I酶消化質粒pUC19FLAD78、pUC18FLA23和pUC18FLBP2，并用作T7 RNA聚合酶(Promega)體外翻譯的模板。簡要地說，將限制酶切割測試調節到0.5％SDS，并與蛋白酶K(0.5毫克/毫升)在37℃，溫育1小時。在乙醇沉淀后，回收線性DNA模板(約3微克)，并分別加入轉錄反應混合物(50微升)，轉錄混合物含有40毫摩爾濃度Tris-HCl(pH7.9)、10毫摩爾濃度的NaCl、6毫摩爾濃度的MgCl2、2毫摩爾濃度的亞精胺、各0.5毫摩爾濃度的ATP、CTP和UTP、0.1毫摩爾濃度GTP、0.25毫摩爾濃度的帽子類似物[m7G(5’)PPP(5’)G]、120單位“RNasin”(核糖核酸酶抑制劑)和150單位T7 RNA聚合酶(Promega)，在37℃溫育1小時。通過酚/氯仿提取和乙醇沉淀純化合成的RNA轉錄物。作為對照，利用DNase或RNase(Promega)在純化步驟之前處理轉錄產物。
在60毫米培養皿中將非洲綠猴腎細胞株系生長至80％匯合，并且用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌一次。將3毫升的“OPTI-MEM I”(該培養基是含有HEPES緩沖液、碳酸氫鈉、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、微量元素、生長因子和酚紅的還原血清培養基；從GIBCO/BRL獲得)加入到該單層，在二氧化碳培養箱，于37℃將細胞培養1小時。同時，將0.15毫升的“OPTI-MEM I”與1.25微克的“脂質轉染”試劑(N-(1-(2，3-二油酰氧)丙基)-N，N，N-三甲基銨氯和二油酰磷脂酰乙醇胺，GIBCO/BRL)-起在室溫下的聚苯乙烯試管中保溫45分鐘。將懸浮于0.15毫升的焦碳酸二乙酯處理的水中的合成的RNA轉錄物的兩個區段加入到OPTI-MEM脂質轉染劑混合物，緩慢混合，置于冰上保溫5分鐘。在從60毫米的培養皿的單層去除“OPTI-MEM”并且用新鮮的1.5毫升的“OPTI-MEM”替代之后，將含有核酸的混合物逐滴加入到非洲綠猴腎細胞株系細胞并且緩慢渦動。在37℃保溫2小時之后，用含有5％FCS(沒有浸洗細胞)的M199培養基(氯化鈣(無水)、9水硝酸鐵、氯化鉀、硫酸鎂(無水)、氯化鈉、一水磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、L-丙氨酸、L-鹽酸精氨酸、L-天冬氨酸、一水鹽酸L-半胱氨酸、2鹽酸L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、一水鹽酸L-組氨酸、L-羥基脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、鹽酸L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、2水L-酪氨酸2鈉、L-纈氨酸、α維生素E磷酸2鈉、抗壞血酸、生物素、維生素D2、D-泛酸鈣、綠化膽堿、葉酸、I-肌醇、3水二甲萘醌亞硫酸氫鈉、煙酸、煙酰胺、對—氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素、乙酸維生素A、硫酸腺嘌呤、腺苷酸、ATP、Na2、膽固醇、2-脫氧-D-核糖、D-葡萄糖、谷胱甘肽、鹽酸鳥嘌呤、次黃嘌呤鈉、酚紅鈉、核糖、乙酸鈉(無水)、胸腺嘧啶、吐溫80、尿嘧啶和黃嘌呤鈉；從Mediatech公司獲得)替換混合物，以所需的時間間隔進一步在37℃將細胞保溫。產生的IBDV的鑒定用從由pUC18FLA23和pUC18FLP2B轉錄物轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞過濾(0.2微米)得的上清液感染CEC。感染后16小時，分離整個細胞的核酸(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995))。根據公開的序列設計引物，將RT-PCR片段擴增，克隆和測序(Mundt，E.等人，病毒學，209，10-18(1995))。通過利用“DNASIS”軟件分析序列數據。免疫熒光測定用從感染的非洲綠猴腎細胞系細胞獲得的上清液(在冰凍和凍融之后)感染在蓋玻片上生長到80％匯合的非洲綠猴腎細胞系細胞，在37℃保溫2天。然后洗滌細胞，用丙酮固定并且多克隆兔抗-IBDV血清處理，洗滌之后將細胞用熒光素標記的山羊抗兔抗體(Kirkegaard&Perry實驗室)處理并用熒光顯微鏡檢查。噬菌斑測試在60毫米培養皿中生長的次代CEC的單層用來自于轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞的上清液接種。在感染1小時之后，用PBS將細胞洗滌一次和用含有10％磷酸胰蛋白胨肉湯、2％FCS、0.112％碳酸氫鈉、103單位的青霉素、103微克/毫升的鏈霉素、0.25微克/毫升的兩性霉素、0.005％中性紅、0.0015％酚紅的0.8％純凈瓊脂(Difco)覆蓋。將細胞在37℃保溫2-3天直到能夠觀察到噬菌斑并且計數(Muller，H.等人，病毒研究，4，297-309(1986))。IBDV基因組的全長cDNA克隆的構建為了研制用于dsRNA病毒IBDV的反遺傳系統，構建兩個獨立的cDNA克隆，它們含有毒株D78的區段A和毒株P2的區段B(附圖1)。各個質粒或者編碼結構蛋白質的前體(VP2，VP4，VP3)和VP5或僅編碼VP1蛋白質(依賴于RNA的RNA聚合酶)。用Pst I消化質粒pUC18FLBP2并且由T7 RNA聚合酶體外轉錄以產生含有正確的5’-和3’-末端的RNA。基于用BsrG I消化和轉錄，質粒pUC19FLAD78產生含有正確的5’-末端但是在3’末端具有另外的4個核苷酸的RNA。在兔網狀細胞系統中將上述質粒的轉錄和轉譯偶合產生蛋白質產物，該產物是經正確地加工過的并且在SDS-聚丙烯酰胺凝膠和自動自顯影分離之后與標記物IBDV蛋白質一起共遷移(數據未顯示)。感染性病毒的轉錄，轉染和繁殖利用線性化的全長cDNA質粒作為模板，用T7 RNA聚合酶體外分別合成IBDV區段A和B的正意義轉錄物(參見附圖2)。雖然在中性凝膠上對于區段B(泳道1和5)觀察到兩個種類的RNA轉錄物，在變性凝膠上分離這些樣品僅產生一個特異于轉錄物的譜帶(數據未顯示)。為了顯示兩個區段的正意義RNA轉錄物需要制備感染性病毒，用不同的核酸酶保溫轉錄混合物，如附圖2所示。在用DNA酶(泳道1+2)、RNA酶(泳道3+4)處理轉錄產物之后或沒有處理(泳道5+6)之后回收的合成的RNA用于轉染非洲綠猴腎細胞株系細胞。作為模擬對照，僅使用脂質轉染試劑，在轉染之后5天，僅在用未處理的或DNA酶處理的轉錄產物轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞中觀察到細胞毒性作用(CPE)，但是在用RNA酶處理的轉錄混合物或模擬物轉染的對照沒有觀察到。另外，當僅用區段A或B的RNA轉染非洲綠猴腎細胞系細胞時(數據沒有顯示)，沒有檢測到CPE。這些結果證實在用IBDV的兩個區段的正意義ssRNA轉染非洲綠猴腎細胞系細胞之后確保IBDV的復制。為了驗證導致非洲綠猴腎細胞系細胞中CPE的因子的確是IBDV，將轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞冷凍—凍融，并且通過離心使上清液澄清，并且用于感染CEC或非洲綠猴腎細胞系細胞。用來自未處理或DNA酶處理的轉錄混合物感染的非洲綠猴腎細胞系細胞的上清液感染CEC，在接種一天后即表現出CPE(表2)。但是，用來自于RNA酶處理的轉錄混合物、未處理的區段A或B轉錄混合物感染的非洲綠猴腎細胞系細胞，和模擬物轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞的上清液感染CEC，甚至在5天之后也沒有檢測到CPE。類似地當用類似于上面描述的上清液感染蓋玻片上的非洲綠猴腎細胞系細胞并且在免疫熒光染色之后2天檢查，僅來自于未處理的或DNA酶處理的轉錄混合物轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞的上清液獲得陽性免疫熒光信號(表2)。轉染病毒的回收為了測定感染性病毒的回收的時間點，用區段A和B結合的RNA轉錄物轉染非洲綠猴腎細胞系細胞。在轉染之后4、8、16、24、36和48小時時，通過感染狀態和噬菌斑測試檢查上清液中轉染性病毒的存在，如表3所示。我們的結果表明，可以早至轉染之后36小時回收病毒。病毒效價是2.3×102pfu/毫升，表明在晚于轉染之后48小時獲得的樣品中效價有所下降。嵌合病毒的制備為了證明IBDV的兩個區段的正意義ssRNA足于恢復成感染性病毒，制備嵌合IBDV。通過Nsi I消化將含有血清型II毒株的區段A的全長序列的質粒pUC18FLA23線性化，利用T7 RNA聚合酶體外合成ssRNA。ssRNA轉錄物限定了正確的5’末端但是在3’末端含有一個額外的殘基(附圖1)。用血清型II毒株23/82的區段A的ssRNA和血清型I毒株P2的區段B的ssRNA轉染非洲綠猴腎細胞系細胞。轉染5天之后，當CPE顯示時，澄清上清液(在冷凍—凍融之后)并且用于感染CEC。在CEC中第二次傳代之后，通過RT-PCR分析病毒的基因組RNA并且對PCR產物進行測序。將區段A的引物設計為特異于僅擴增來自于血清型II毒株的區段A的序列。對于區段B的引物與兩種血清型的序列均結合。克隆該擴增的片段并且測序。獲得的區段A的序列顯示與血清型II毒株23/82的已知區段A序列良好地匹配，而區段B序列顯示與出版的血清型I毒株的區段B序列則完全同源(附圖3)。
表1 用于構建IBDV基因組區段A和B的全長cDNA克隆的寡聚核苷酸核苷酸序列方向 名稱 核苷酸編號
用于克隆的寡聚核苷酸引物的組成和定位。用斜體字標記T7啟動子序列，底下劃線的為病毒特異性序列，用黑體字標記限制性位點。用有意義(+)和反義(-)顯示了引物中的病毒特異性序列的定向。引物結合的位置(核苷酸編號)是根據出版的P2毒株(2)序列確定的。
表2 從區段A和B的合成的RNA制備感染性IBDV轉染的物質 CPE 免疫熒光測定<
用來自于轉錄反應的區段A和B的合成的RNA轉染非洲綠猴腎細胞系細胞，所述RNA未用或已用DNA酶或RNA酶處理。在5天之后，收集上清液，通過離心澄清，分析病毒的存在。根據接種1-2天之后胞毒作用(CPE)的出現在CEC中測定所回收病毒的感染性。用兔抗—IBDV血清，通過對感染的非洲綠猴腎細胞系細胞的免疫熒光染色測定回收的病毒的特異性。
表3 轉染后不同的時間回收的病毒轉染后的時間(小時) CPE 免疫熒光測定pfu/毫升<
如描述的，用區段A和B的合成的RNA轉染非洲綠猴腎細胞系細胞。在CEC中通過CPE和在非洲綠猴腎細胞系細胞中進行免疫熒光染色測定來分別檢測回收的病毒的感染性和特異性。在用來自于轉染的非洲綠猴腎細胞系細胞的上清液接種細胞之后，將次代CEC的單層用于噬菌斑測試。計算病毒的近似效價，以每升的噬菌斑形成單位表示(pfu/毫升)。
序列表(1)總的資料(i)申請人VAKHARIA，Vikram N.；MUNDT，Egbert(ii)發明創造名稱從合成的RNA轉錄物制備雙RNA病毒的方法(iii)序列數目34(iv)通信地址(A)聯系人NIKAIDO，MARMELSTEIN，MURRAY &amp; ORAM LLP(B)街道655，15大街，N.W.，Suite 330-G Street Lobby(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國家美國(F)郵編20005-5701(v)計算機可讀方式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件程序PatentIn Release #1.0，版本#1.30(vi)當前申請數據(A)申請號US(B)申請日期(C)分類(viii)代理人/代理信息(A)姓名KITTS，MonicaC.
(B)登記號36，105(C)案卷/卷宗號P8172-6002(ix)通訊信息(A)電話202/638-5000(B)傳真202/638-4810(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO1的序列描述GAATTCGGCT TTAATACGAC TCACTATAGG ATACGATCGG TCTGAC46(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO2的序列描述AATTGGATCC GTTCGCGGGT CCCCTGTACA AAGCCGAATT C 41(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO3的序列描述CGGCGAATTC ATGCATAGGG GACCCGCGAA CGGATC 36(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO4的序列描述GTCAGACCGA TCGTATCCTA TAGTGAGTCG TATTAGAATT CTCT 44(2)SEQ ID NO5的信息
(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO5的序列描述TTGCATGCCT GCAGGGGGCC CCCGCAGGCG AAG 33(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO6的序列描述TCGTATCCTA TAGTGAGTCG TATTAGAATT C31(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度120個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO7的序列描述GGAAGCCTGA GTGAGTTGAC TGACTACAGC TACAACGGGC TGATGTCAGC CACTGCGAAC60ATCAACGACA AGATCGGGAA CGTTCTAGTT GGAGAAGGGG TGACTGTTCT CAGTCTACCG 120(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度120個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形
(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO8的序列描述GGAAGCCTGA GTGAGTTGAC TGACTACAGC TACAACGGGC TGATGTCAGC CACTGCGAAC 60ATCAACGACA AGATCGGGAA CGTTCTAGTT GGAGAAGGGG TGACTGTTCT CAGTCTACC 119(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度120個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO9的序列描述GGAAGCCTGA GTGAACTGAC AGATGTTAGC TACAATGGGT TGATGTCTGC AACAGCCAAC60ATCAACGACA AAATTGGGAA CGTCCTAGTA GGGGAAGGGG TCACCGTCCT CAGCTTACCC 120(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度120個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO10的序列描述TTTTCAATAG TCCACAGGCG CGAACGAAGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG60CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CCAAAGTCTG GGTGCCACCT GAGGATCCGC 120(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度120個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA
(xi)SEQ ID NO11的序列描述TTTTCAACAG TCCACAGGCG CGAAGCACGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG60CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CTAAAGTTTG GGTGCCACCT GAGGATCCGC 120(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度120個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO12的序列描述TTTTCAACAG TCCACAGGCG CGAAGCACGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG60CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CTAAAGTTTG GGTGCCACCT GAGGATCCGC 120(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO13的序列描述TAATACGACT CACTATAGGA TACGATCGGT CTGACCCCGG GGGAGTCA 48(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO14的序列描述AGAGAATTCT AATACGACTC ACTATAGGAT ACGATCGGTC TGAC 44(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO15的序列描述TGTACAGGGG ACCCGCGAAC GGATCCAATT 30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO16的序列描述CGGCGAATTC ATGCATAGGG GACCCGCGAA CGGATC36(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO17的序列描述CGTCGACTAC GGGATTCTGG 20(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO18的序列描述CAGAGGCAGT ACTCCGTCTG 20(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO19的序列描述AGTCGACGGG ATTCTTGCTT 20(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO20的序列描述GAAGGTGTGC GAGAGGAC 18(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO21的序列描述AGAGAATTCT AATACGACTC ACTATAGGAT ACGATGGGTC TGAC 44(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO22的序列描述CGATCTGCTG CAGGGGGCCC CCGCAGGCGA AGG 33(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO23的序列描述CTTGAGACTC TTGTTCTCTA CTCC 24(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(xi)SEQ ID NO24的序列描述ATACAGCAAA GATCTCGGG 19(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度2827個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/KEYCDS(B)位置112..2745(xi)SEQ ID NO25的序列描述GGATACGATG GGTCTGACCC TCTGGGAGTC ACGAATTAAC GTGGCTACTA GGGGCGATAC 60CCGCCGCTGG CCGCCACGTT AGTGGCTCCT CTTCTTGATG ATTCTGCCAC C ATG AGT 117Met Ser1GAC ATT TTC AAC AGT CCA CAG GCG CGA AGC ACG ATC TCA GCA GCG TTC 165Asp Ile Phe Asn Ser Pro Gln Ala Arg Ser Thr Ile Ser Ala Ala Phe5 10 15GGC ATA AAG CCT ACT GCT GGA CAA GAC GTG GAA GAA CTC TTG ATC CCT 213Gly Ile Lys Pro Thr Ala Gly Gln Asp Val Glu Glu Leu Leu Ile Pro20 25 30AAA GTT TGG GTG CCA CCT GAG GAT CCG CTT GCC AGC CCT AGT CGA CTG 261Lys Val Trp Val Pro Pro Glu Asp Pro Leu Ala Ser Pro Ser Arg Leu35 40 45 50GCA AAG TTC CTC AGA GAG AAC GGC TAC AAA GTT TTG CAG CCA CGG TCT 309Ala Lys Phe Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Val Leu Gln Pro Arg Ser55 60 65CTG CCC GAG AAT GAG GAG TAT GAG ACC GAC CAA ATA CTC CCA GAC TTA 357Leu Pro Glu Asn Glu Glu Tyr Glu Thr Asp Gln Ile Leu Pro Asp Leu70 75 80GCA TGG ATG CGA CAG ATA GAA GGG GCT GTT TTA AAA CCC ACT CTA TCT 405Ala Trp Met Arg Gln Ile Glu Gly Ala Val Leu Lys Pro Thr Leu Ser85 90 95CTC CCT ATT GGA GAT CAG GAG TAC TTC CCA AAG TAC TAC CCA ACA CAT 453Leu Pro Ile Gly Asp Gln Glu Tyr Phe Pro Lys Tyr Tyr Pro Thr His100 105 110CGC CCT AGC AAG GAG AAG CCC AAT GCG TAC CCG CCA GAC ATC GCA CTA 501Arg Pro Ser Lys Glu Lys Pro Asn Ala Tyr Pro Pro Asp Ile Ala Leu115 120 125 130CTC AAG CAG ATG ATT TAC CTG TTT CTC CAG GTT CCA GAG GCC AAC GAG 549Leu Lys Gln Met Ile Tyr Leu Phe Leu Gln Val Pro Glu Ala Asn Glu135 140 145GGC CTA AAG GAT GAA GTA ACC CTC TTG ACC CAA AAC ATA AGG GAC AAG 597Gly Leu Lys Asp Glu Val Thr Leu Leu Thr Gln Asn Ile Arg Asp Lys150 155 160GCC TAT GGA AGT GGG ACC TAC ATG GGA CAA GCA AAT CGA CTT GTG GCC 645Ala Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Met Gly Gln Ala Asn Arg Leu Val Ala165 170 175ATG AAG GAG GTC GCC ACT GGA AGA AAC CCA AAC AAG GAT CCT CTA AAG 693Met Lys Glu Val Ala Thr Gly Arg Asn Pro Asn Lys Asp Pro Leu Lys180 185 190CTT GGG TAC ACT TTT GAG AGC ATC GCG CAG CTA CTT GAC ATC ACA CTA 741Leu Gly Tyr Thr Phe Glu Ser Ile Ala Gln Leu Leu Asp Ile Thr Leu195 200 205 210CCG GTA GGC CCA CCC GGT GAG GAT GAC AAG CCC TGG GTG CCA CTC ACA 789Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Asp Asp Lys Pro Trp Val Pro Leu Thr215 220 225AGA GTG CCG TCA CGG ATG TTG GTG CTG ACG GGA GAC GTA GAT GGC GAC 837Arg Val Pro Ser Arg Met Leu Val Leu Thr Gly Asp Val Asp Gly Asp230 235 240TTT GAG GTT GAA GAT TAC CTT CCC AAA ATC AAC CTC AAG TCA TCA AGT 885Phe Glu Val Glu Asp Tyr Leu Pro Lys Ile Asn Leu Lys Ser Ser Ser245 250 255GGA CTA CCA TAT GTA GGT CGC ACC AAA GGA GAG ACA ATT GGC GAG ATG 933Gly Leu Pro Tyr Val Gly Arg Thr Lys Gly Glu Thr Ile Gly Glu Met260 265 270ATA GCT ATC TCA AAC CAG TTT CTC AGA GAG CTA TCA ACA CTG TTG AAG 981Ile Ala Ile Ser Asn Gln Phe Leu Arg Glu Leu Ser Thr Leu Leu Lys275 280 285 290CAA GGT GCA GGG ACA AAG GGG TCA AAC AAG AAG AAG CTA CTC AGC ATG 1029Gln Gly Ala Gly Thr Lys Gly Ser Asn Lys Lys Lys Leu Leu Ser Met295 300 305TTA AGT GAC TAT TGG TAC TTA TCA TGC GGG CTT TTG TTT CCA AAG GCT 1077Leu Ser Asp Tyr Trp Tyr Leu Ser Cys Gly Leu Leu Phe Pro Lys Ala310 315 320GAA AGG TAC GAC AAA AGT ACA TGG CTC ACC AAG ACC CGG AAC ATA TGG 1125Glu Arg Tyr Asp Lys Ser Thr Trp Leu Thr Lys Thr Arg Asn Ile Trp325 330 335TCA GCT CCA TCC CCA ACA CAC CTC ATG ATC TCT ATG ATC ACC TGG CCC 1173Ser Ala Pro Ser Pro Thr His Leu Met Ile Ser Met Ile Thr Trp Pro340 345 350GTG ATG TCC AAC AGC CCA AAT AAC GTG TTG AAC ATT GAA GGG TGT CCA 1221Val Met Ser Asn Ser Pro Asn Asn Val Leu Asn Ile Glu Gly Cys Pro355 360 365 370TCA CTC TAC AAA TTC AAC CCG TTC AGA GGA GGG TTG AAC AGG ATC GTC 1269Ser Leu Tyr Lys Phe Asn Pro Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg Ile Val375 380 385GAG TGG ATA TTG GCC CCG GAA GAA CCC AAG GCT CTT GTA TAT GCG GAC 1317Glu Trp Ile Leu Ala Pro Glu Glu Pro Lys Ala Leu Val Tyr Ala Asp390 395 400AAC ATA TAC ATT GTC CAC TCA AAC ACG TGG TAC TCA ATT GAC CTA GAG 1365Asn Ile Tyr Ile Val His Ser Asn Thr Trp Tyr Ser Ile Asp Leu Glu405 410 415AAG GGT GAG GCA AAC TGC ACT CGC CAA CAC ATG CAA GCC GCA ATG TAC 1413Lys Gly Glu Ala Asn Cys Thr Arg Gln His Met Gln Ala Ala Met Tyr420 425 430TAC ATA CTC ACC AGA GGG TGG TCA GAC AAC GGC GAC CCA ATG TTC AAT 1461Tyr Ile Leu Thr Arg Gly Trp Ser Asp Asn Gly Asp Pro Met Phe Asn435 440 445 450CAA ACA TGG GCC ACC TTT GCC ATG AAC ATT GCC CCT GCT CTA GTG GTG 1509Gln Thr Trp Ala Thr Phe Ala Met Asn Ile Ala Pro Ala Leu Val Val455 460 465GAC TCA TCG TGC CTG ATA ATG AAC CTG CAA ATT AAG ACC TAT GGT CAA 1557Asp Ser Ser Cys Leu Ile Met Asn Leu Gln Ile Lys Thr Tyr Gly Gln470 475 480GGC AGC GGG AAT GCA GCC ACG TTC ATC AAC AAC CAC CTC TTG AGC ACA 1605Gly Ser Gly Asn Ala Ala Thr Phe Ile Asn Asn His Leu Leu Ser Thr485 490 495CTA GTG CTT GAC CAG TGG AAC CTG ATG AGA CAG CCC AGA CCA GAC AGC 1653Leu Val Leu Asp Gln Trp Asn Leu Met Arg Gln Pro Arg Pro Asp Ser500 505 510GAG GAG TTC AAA TCA ATT GAG GAC AAG CTA GGT ATC AAC TTT AAG ATT 1701Glu Glu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Lys Leu Gly Ile Asn Phe Lys Ile515 520 525 530GAG AGG TCC ATT GAT GAT ATC AGG GGC AAG CTG AGA CAG CTT GTC CTC 1749Glu Arg Ser Ile Asp Asp Ile 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(A)長度3261個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/KEYCDS(B)位置131..3166(xi)SEQ ID NO29的序列描述GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGGAGTC ACCCGGGGAC AGGCCGTCAA GGCCTTGTTC 60CAGGATGGGA CTCCTCCTTC TACAACGCTA TCATTGATGG TTAGTAGAGA TCAGACAAAC120GATCGCAGCG ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC CAA CAG ATT GTT CCG 169Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro150 155TTC ATA CGG AGC CTT CTG ATG CCA ACA ACC GGA CCG GCG TCC ATT CCG 217Phe Ile Arg Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro160 165 170GAC GAC ACC CTG GAG AAG CAC ACT CTC AGG TCA GAG ACC TCG ACC TAC 265Asp Asp Thr Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr175 180 185190AAT TTG ACT GTG GGG GAC ACA GGG TCA GGG CTA ATT GTC TTT TTC CCT 313Asn Leu Thr Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro195 200 205GGA TTC CCT GGC TCA ATT GTG GGT GCT CAC TAC ACA CTG CAG GGC AAT 361Gly Phe Pro Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn210 215 220GGG AAC TAC AAG TTC GAT CAG ATG CTC CTG ACT GCC CAG AAC CTA CCG 409Gly 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940ATT GTG ACC GAC ATG GCT AAC TTC GCC CTC AGC GAC CCA AAC GCG CAT 2569Ile Val Thr Asp Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His945 950 955AGG ATG AAA AAC TTC CTA GCA AAC GCA CCC CAG GCT GGA AGC AAG TCG 2617Arg Met Lys Asn Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser960 965 970CAG AGG GCC AAG TAT GGC ACG GCA GGC TAC GGA GTG GAG GCT CGA GGC 2665Gln Arg Ala Lys Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly975 980 985 990CCC ACA CCA GAA GAG GCA CAG AGG GAA AAA GAC ACA CGG ATC TCC AAG 2713Pro Thr Pro Glu Glu Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys995 10001005AAG ATG GAA ACA ATG GGC ATC TAC TTC GCG ACA CCG GAA TGG GTG GCT 2761Lys Met Glu Thr Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala101010151020CTC AAC GGG CAC CGA GGC CCA AGC CCC GGC CAA CTC AAG TAC TGG CAA 2809Leu Asn Gly His Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln102510301035AAC ACA AGA GAA ATA CCA GAG CCC AAT GAG GAC TAC CCA GAC TAT GTG 2857Asn Thr Arg Glu Ile Pro Glu Pro Asn Glu Asp Tyr Pro Asp Tyr 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TGGACACCAA TTCGGCCTTC TACCATCCCA AATTGGATCC GTTCGCGGGT 3259CCCCT 3264(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長度1013個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線形(ii)分子類型蛋白質(xi)SEQ ID NO34的序列描述Met Thr Asn Leu Met Asp His Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg1 5 10 15Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr35 40 45Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60Gly Ser Val Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Ser Gly Asn Tyr65 70 75 80Gln Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr100 105 110Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125Phe His Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Tyr Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val145 150 155 160Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Ser165 170 175Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ala Gly Leu Asp Pro Lys180 185 190Leu Met Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205Thr Ala Ala Asp Glu Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Leu Ile Pro Ser Gly210 215 220Val Lys Thr Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Leu Thr Ser Phe225 230 235 240Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Ser Gln Val Thr Ile Gln Ser Ile245 250 255Glu Val Asp Val Thr Ile His Phe Ile Gly Phe Asp Gly Thr Asp Val260 265 270Ala Val Lys Ala Val Ala Thr Asp Phe Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asn275 280 285Asn Leu Val Pro Phe Asn Leu Val Val Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln290 295 300Pro Ile Thr Ser Met Lys Leu Glu Val Val Thr Tyr Lys Ile Gly Gly305 310 315 320Thr Ala Gly Asp Pro Ile Ser Trp Thr Val Ser Gly Thr Leu Ala Val325 330 335Thr Val His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu340 345 350Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Ala Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly355 360 365Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu370 375 380Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys385 390 395 400Leu Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro405 410 415Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp420 425 430Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile435 440 445Ile Arg Ala Ile Arg Lys Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe450 455 460Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val Asp Tyr465 470 475 480Leu Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ala Ala485 490 495Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln Leu Thr Leu500 505 510Ala Ala Asp Lys Gly Cys Glu Val Val Ala Asn Met Phe Gln Val Pro515 520 525Gln Asn Pro Ile Val Asp Gly Ile Leu Ala Ser Pro Gly Ile Leu Arg530 535 540Gly Ala His Asn Leu Asp Cys Val Leu Trp Glu Gly Ala Thr Leu Phe545 550 555 560Pro Val Val Ile Thr Thr Leu Glu Asp Glu Leu Thr Pro Lys Ala Leu565 570 575Asn Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp Leu Gln580 585 590Pro Pro Ser Gln Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser Gly His Arg595 600 605Val Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu Thr Gly Arg610 615 620Asp Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser Ile Met625 630 635 640Leu Ser Gln Asp Pro Ile Pro Pro Ile Ile Gly Asn Ser Gly Asn Leu645 650 655Ala Ile Ala Tyr Met Asp Val Phe Arg Pro Lys Val Pro Ile His Val660 665 670Ala Met Thr Gly Ala Leu Asn Ala Arg Gly Glu Ile Glu Ser Val Thr675 680 685Phe Arg Ser Thr Lys Leu Ala Thr Ala His Arg Leu Gly Met Lys Leu690 695 700Ala Gly Pro Gly Ala Tyr Asp Ile Asn Thr Gly Pro Asn Trp Ala Thr705 710 715 720Phe Val Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro725 730 735Tyr Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Thr Ala Gly Arg Gln Phe His740 745 750Leu Ala Leu Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Asp755 760 765Ala Val Arg Ala Met Asp Ala Ala Ala Asn Ala Asp Pro Leu Phe Arg770 775 780Ser Ala Leu Gln Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr785 790 795 800Asp Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Lys805 810 815Asn Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala820 825 830Lys Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro835 840 845Glu Glu Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu850 855 860Thr Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly865 870 875 880His Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg885 890 895Glu Ile Pro Glu Pro Asn Glu Asp Tyr Pro Asp Tyr Val His Ala Glu900 905 910Lys Ser Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser915 920 925Ile Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp930 935 940Glu Val Ala Arg Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln945 950 955 960Glu Gln Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg965 970 975Asn Pro Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro980 985 990Ser Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Val Ser995 10001005Asp Glu Asp Leu Glu1010
權利要求
1.用于制備活的雙RNA病毒的方法，包括下列步驟制備含有感染性囊病病毒基因組區段A和B的cDNA，將所述的cDNA轉錄以產生合成的RNA轉錄物，用所述的合成的RNA轉錄物轉染宿主細胞，在培養基中培養所述的宿主細胞，和從所述的培養基中分離活的感染性囊病病毒。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的雙RNA病毒是感染性囊病病毒。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的宿主細胞是非洲綠猴腎細胞系細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的cDNA的區段A和B是獨立制備的。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述的區段A存在于質粒pUC19FLAD78或pUC18FLA23上。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述的區段B存在于質粒pUC18FLBP2上。
7.活的感染性囊病病毒，其中所述的病毒是通過一種方法制備的，該方法包括步驟制備含有感染性囊病病毒基因組區段A和B的cDNA，將所述的cDNA轉錄以產生合成的RNA轉錄物，用所述的合成的RNA轉錄物轉染宿主細胞，在培養基中培養所述的宿主細胞，和從所述的培養基中分離活的感染性囊病病毒。
8.編碼感染性囊病病毒的蛋白質VP1、VP2、VP3、VP4和VP5的合成的RNA。
9.用權利要求8所述的合成的RNA轉染的宿主細胞。
10.含有感染性囊病病毒基因組的至少一部分的cDNA，所述的一部分選自由感染性囊病病毒區段A、區段B和區段A和B組成的組，其中所述的cDNA包括所述片段的5’和3’末端。
11.包含權利要求10所述的cDNA的重組載體。
12.根據權利要求11所述的載體，其中所述的載體是質粒。
13.根據權利要求12所述的載體，其中所述的質粒選自由pUC19FLAD78，pUC18FLA23和pUC19FLBP2組成的組。
14.用權利要求11所述的載體轉化的宿主細胞。
15.包含權利要求7所述的感染性囊病病毒的疫苗，其中所述的感染性囊病病毒在給藥之前是失活的或減毒的。
16.制備活的感染性囊病病毒疫苗的方法，該方法包括如下步驟制備含有感染性囊病病毒基因組區段A和B的全長cDNA，將所述的cDNA轉錄以產生合成的RNA轉錄物，純化所述的合成的RNA轉錄物，用所述的純化的RNA轉錄物轉染宿主細胞，在培養基中培養所述的宿主細胞，從所述的培養基中分離活的感染性囊病病毒，將所述活的感染性囊病病減毒以產生具有降低的毒性的病毒，和將所述活的感染性囊病病毒與藥物學可接受載體結合以產生活的感染性囊病病毒疫苗。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的活的感染性囊病病毒通過連續的傳代或位點特異性誘變來減毒的。
18.根據權利要求1所述的方法，其中所述的宿主細胞是家禽細胞。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述的家禽細胞是雞、火雞或鵪鶉細胞。
20.根據權利要求19的方法，其中所述的家禽細胞是雞胚成纖維細胞或雞胚腎細胞。
全文摘要
利用起源于克隆的DNA的合成轉錄物已經開發了制備活的雙RNA病毒如感染性的囊病病毒(IBDV),一種雙RNA病毒家族的形成區段的雙鏈(ds)RNA病毒的系統。構建了獨立的全長cDNA克隆,它們分別含有IBDV的RNAA和B區段的整個編碼和非編碼區。利用T7RNA聚合酶對線性化質粒體外轉錄產生兩個區段的合成RNA。利用合并的兩區段的正意義轉錄物轉染非洲綠猴腎細胞,在早至轉染后36小時產生感染性病毒。dsRNA病毒的反遺傳系統的開發將大大簡化病毒基因表達的調節和病理的研究和產生新的活和失活疫苗的設計。
文檔編號C12N7/00GK1229358SQ97197688
公開日1999年9月22日 申請日期1997年7月31日 優先權日1996年9月5日
發明者維克拉姆·N·瓦卡瑞爾, 埃格伯特·蒙特 申請人:馬里蘭大學-生物技術研究所