專利名稱：甲醇畢赤酵母營養突變體的制備的制作方法
背景技術：
甲基營養型酵母是那些能夠利用甲醇作為唯一碳源和能量源的酵母。具有甲醇利用所必需的生化途徑的酵母物種可分成四個屬漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬以及球擬酵母屬。這些酵母屬多少有點是基于細胞形態學和生長特點而人工合成的，并且不反映密切的遺傳關系(Billon-Grand,Mycotaxon 35:201-204,1989；Kurtzman,Mycologia 84:72-76,1992)。此外。并非這些屬中的所有物種都能夠利用甲醇作為碳源和能量源。這一分類的結果是在一屬的單個物種之間的生理和代謝方面有極大的差異。
甲基營養型酵母是在重組蛋白質產生系統中利用的具有吸引力的候選者。一些甲基營養型酵母已經顯示出在基本確定成分培養基上能快速生長至高生物量的特征。甲基營養型酵母的某些基因在誘導或者脫阻抑條件下得到嚴格調節和高度表達，這表明這些基因的啟動子對于產生商業價值的多肽來說是有用的。參見，例如，Faber等，酵母，11:1331,1995；Romanos等，酵母，8:423,1992；以及Cregg等，生物/技術，11:905,1993。
在重組產生系統中用作為宿主的甲基營養型酵母的發展是緩慢的，其部分原因是由于缺乏合適的材料(例如啟動子、選擇性標記以及突變體宿主細胞)和方法(如轉化技術)。大多數高度發展的甲基營養型宿主系統利用巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母(Faber等，Curr.Genet.25:305-310,1994；Cregg等，同上；Romanos等，同上；美國專利號4,855,242；美國專利號4,857,467；美國專利號4,879,231以及美國專利號4,929,555)。
本領域仍然需要轉化甲基營養型酵母的其它物種的方法，以及需要利用所轉化的細胞來產生具有經濟重要性的多肽，包括工業酶和藥物蛋白質。本發明提供了在這些過程中有用的組合物和方法以及其它的相關優點。
發明概要本發明提供了制備具有營養缺陷型突變的甲醇畢赤酵母細胞的方法。該方法包含步驟(a)暴露甲醇畢赤酵母細胞于誘變條件下；(b)在豐富培養基中培養得自步驟(a)的細胞，從而使得突變在至少一部分細胞中得到建立和復制；(c)在缺乏可同化的氮的培養基中培養得自步驟(b)的細胞，從而耗盡細胞的氮儲備；(d)在確定成分培養基中培養得自步驟(c)的細胞，以選擇營養基因缺損的細胞，其中的培養基包含無機氮源和足以殺死生長甲醇畢赤酵母細胞的量的制霉菌素；(e)在豐富培養基中培養得自步驟(d)的選擇的細胞。在本發明的一個實施方案中，得自步驟(d)的選擇的細胞被復制鋪板到確定成分培養基上，并培養其以確認營養缺陷型突變的存在。在另一個實施方案中，所選擇的細胞屬于腺嘌呤的營養缺陷型。在相關實施方案中，所選擇的細胞缺乏磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶。在附加的實施方案中，誘變條件包含暴露于紫外光中或者暴露于化學誘變劑中。在進一步的實施方案中，無機氮源包括銨離子。
一旦參考下列詳細描述和附圖，本發明的這些和其它方面將變得明顯。
附圖簡要描述
圖1說明電場強度和脈沖持續時間對甲醇畢赤酵母的電穿孔效率的影響。
圖2是在質粒pCZR140和甲醇畢赤酵母基因組DNA之間的重組過程的示意圖。
圖3是質粒pCZR137和甲醇畢赤酵母基因組DNA之間的重組過程的示意圖。
發明詳細描述在更詳細地闡明本發明之前，先定義在本文中使用的某些術語是有用的″DNA構建體″是一個單鏈或雙鏈DNA分子，該DNA分子通過人工干擾得到修飾，從而包含在并不天然存在的排列中結合和并列的DNA片段。
″早期對數期生長″是在培養中的細胞生長期，其時的細胞濃度為2×106個細胞/ml至8×106個細胞/ml。
″異源DNA″指的是一個DNA分子或者一群DNA分子，這些DNA分子并不天然存在于給定的宿主細胞中。與特定宿主細胞異源的DNA分子可以包含得自該宿主細胞物種的DNA，只要宿主DNA與非宿主DNA結合。例如，一般認為可操作地連接到宿主DNA節段(包含轉錄啟動子)上的DNA分子(包含編碼多肽的非宿主DNA節段)是異源DNA分子。
″高級真核″生物體是多細胞真核生物體。該術語包括植物和動物。
″整合轉化體″是異源DNA已經引入其中的細胞，其中的異源DNA已整合到該細胞的基因組DNA中。
″線型DNA″意指具有自由5′和3′末端的DNA分子，該DNA分子是非環狀DNA分子。線型DNA可以由閉合環狀DNA分子(如質粒)通過酶促消化或者物理破裂制得。
術語″可操作地連接的″意指DNA節段得到排列，以便它們一致實現其預期的目的，例如轉錄以啟動子開始并且通過編碼節段進行到終止子。
術語″啟動子″以它的領域識別含義用于本文，該含義指的是包含DNA序列(提供RNA聚合酶的結合和轉錄的起始)的一部分基因。一般但不總是在基因的5′非編碼區中發現啟動子序列。啟動子之內的序列元件(在轉錄的起始中起作用)經常以共有核苷酸序列為特征。這些啟動子元件包括RNA聚合酶結合位點；TATA序列；CAAT序列；分化特異性元件(DSEs；McGehee等，分子內分泌學，7:551-560,1993)；環狀AMP效應元件(CREs)；血清效應元件(SREs；Treisman，癌生物學研討會，1:47-58,1990)；糖皮質激素效應元件(GREs)；以及其它轉錄因子的結合位點，如CRE/ATF(O’Reilly等，生物化學雜志，267:19938-19943,1992),AP2(Ye等，生物化學雜志，269:25728-25734,1994),SP1.cAMP效應元件結合蛋白(CREB；Loeken，基因表達，3:253-264,1993)和八聚體因子。概括地說，參見Watson等編輯，基因的分子生物學，第4版，Benjamin/Cummings出版股份有限公司，Menlo公園，CA,1987；以及Lemaigre和Rousseau，生物化學雜志，303:1-14,1994。
″阻抑碳源″是可代謝的含碳化合物，當不受限制時，該化合物阻抑其它碳源分解代謝所需要的基因在生物體中的表達。″有限″指的是碳源不能利用或者可以以使其立即被消耗的這樣一種速率利用，因此在生物體環境中的碳源的普遍濃度從有效性上說為零。可以用于本發明中的阻抑碳源包括己糖和乙醇。葡萄糖是特別優選的。
″豐富″培養基是那些基于營養物的復雜源的培養基，典型地為細胞或者組織提取物或者蛋白質水解產物。豐富培養基在組成方面批與批之間有所改變，這是由于在營養源的組成方面的變化所致。
如上所述，本發明提供了制備具有營養缺陷型突變的甲醇畢赤酵母細胞的方法。可以用同源DNA(來源于宿主物種的DNA)和異源DNA來轉化甲醇畢赤酵母的營養缺陷型突變體，并且所產生的轉化體可以用于大量的不同生物應用中。本發明的突變細胞尤其能很好地適合于用異源DNA的轉化，其中轉化的細胞可以用來產生多肽和蛋白質，包括高級生物體(包括人類)的多肽和蛋白質。可以用其它DNA分子(包括DNA文庫和合成DNA分子)轉化營養缺陷型甲醇畢赤酵母細胞。因此本發明提供了這樣一種宿主細胞，該宿主細胞可以用來表達基因多樣化的文庫，從而產生對于新的生物活性篩選出的產品，該宿主細胞可以在基因工程中用作為化合物文庫篩選的靶，還可以得到基因修飾，從而提高它們在其它方法中的利用。
用異源DNA轉化的細胞一般具有一個突變，該突變可以為在異源DNA分子上的基因(″選擇性標記″)所互補。這一選擇性標記使所轉化的細胞得以在一定條件下生長，該條件即其中的未轉化細胞不能成倍增加(″選擇性的條件″)。選擇的一般原則是本領域所熟知的。通常利用的選擇性標記是編碼合成氨基酸或者核苷酸所要求的酶的基因。在這些基因中有突變的細胞(營養陷型突變體)在缺乏特異性氨基酸或者核苷酸的培養基中不能生長，除非突變為選擇性標記所互補。這樣的″選擇性″培養基的利用確保在宿主細胞之內的異源DNA的穩定維持。用于甲醇畢赤酵母中的這一類型的優選的選擇性標記是甲醇畢赤酵母ADE2基因，該基因編碼磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC4.1.1.21)。當ADE2基因轉化到ade2宿主細胞中時，該基因使細胞在缺少腺嘌呤的情況下得以生長。代表性甲醇畢赤酵母ADE2基因序列的編碼鏈顯示在SEQ ID NO:1中。所說明的序列包括5′-非編碼序列的1006個核苷酸和3′-非編碼序列的442個核苷酸，它們在核苷酸1007-1009都具有起始ATG密碼子。在本發明的優選實施方案中，包含核苷酸407-2851的DNA節段用作為選擇性標記，雖然也能利用更長或更短的節段(只要編碼部分可操作地連接到啟動子和終止子序列上)。本領域技術人員將認識到本文提供的這一序列與其它序列表示各自基因的單一等位基因，并且期望等位變異存在。任何功能性ADE2等位基因都可以用于本發明中。可以用于本發明中的其它營養性標記包括甲醇畢赤酵母ADE1、HIS3以及LEU2基因，這些基因允許在分別缺少腺嘌呤、組氨酸和亮氨酸的情況下進行選擇。異源基因(如得自其它真菌的基因)也可以用作為選擇性標記。對于大規模的工業方法(其中需要最大限度地減少對甲醇的利用)來說，優選的是利用其中兩個甲醇利用基因(AUG1和AUG2)缺失的宿主細胞。對于分泌的蛋白質的產生來說，缺乏液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主細胞是優選的。可以用已知方法(如定點誘變)制備基因缺損的突變體。可以基于與它們的對應物釀酒酵母的同源性來克隆甲醇畢赤酵母基因。基于這樣的同源性給出本文所揭示的ADE2基因的定義。
甲醇畢赤酵母菌株可得自美國典型培養物保藏中心(Rockville,MD)和其它儲存處，并且可以在本發明中用作為原材料。為了制備甲醇畢赤酵母的營養缺陷型突變體，首先使細胞暴露于誘變條件(即造成細胞的遺傳突變的環境條件)下。用于誘變細胞的方法是本領域所熟知的，其包括化學處理、暴露于紫外線下、暴露于X光下以及逆轉錄病毒插入誘變。化學誘變劑包括甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍、2-甲氧基-6-氯-9-[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨基]吖啶·2HCl、5-溴尿嘧啶、吖啶以及黃曲霉毒素。參見Lawrence，酶學方法，194:273-281,1991。獲得的誘變細胞的比例是誘變劑(細胞暴露于其中)的強度或用量的函數。低水平的誘變劑產生小比例的突變細胞。高水平的誘變劑產生大比例的突變細胞，但是也殺死大量細胞。因此有必要平衡誘變作用與致死作用，以便獲得合理數量的突變細胞。按照經驗，一般通過使細胞暴露于不同條件下從而建立一條致死曲線，來實現平衡。一般地使細胞暴露于誘變條件并培養一天，其后按照標準測定方法來檢驗它們的生存力。在本發明中，優選的是利用導致20-50％死亡率的誘變水平，雖然本領域技術人員認識到這一值可以根據需要來調整，例如如果與很大數量的細胞一起處理時。
然后在豐富培養基中培養誘變的細胞，從而使在至少一部分細胞群體中的突變得以建立和復制。這一步驟使細胞(其中的基因組已經改變)得以復制突變，并且將該突變傳遞給它們的子代，由此在群體中建立突變。
然后將細胞轉移至缺乏可同化的氮的培養基中，以便耗盡細胞氮儲備。其中″缺乏可同化的氮″意指培養基缺乏足以支持細胞生長的氮量。細胞氮儲備的耗竭一般需要大約12至24小時的溫育，在普通條件下用16小時就足以耗盡細胞氮儲備。在氮儲備耗竭之后，在確定成分培養基中培養該細胞，該培養基包含無機氮源和一定量(足以殺死生長甲醇畢赤酵母細胞)的抗真菌抗生素。優選的抗生素是制霉菌素(米可定)。優選的無機氮源是那些包含銨離子的物質，如硫酸銨。一般地，培養基含有10-200mM銨，優選為大約60mM銨。所包含的制霉菌素的濃度為0.1-100mg/L，優選為0.5-20mg/L，更優選為2mg/L(10個單位/L)。利用制霉菌素的處理進行十分鐘至六個小時，優選為大約1小時。本領域技術人員將認識到易于根據經驗確定殺死原養細胞所需的實際抗生素濃度和暴露時間，并且需要進行一定的調整以便補償在各批抗生素之間的比活性方面的變異。通過耗盡細胞氮儲備以及然后在確定成分培養基(包含無機氮源和抗生素)中培養細胞，具有氨基酸或者核苷酸生物合成作用的營養缺陷的細胞仍然存活，這是因為它們不能在確定成分培養基中生長。生長細胞為抗生素所殺死。在抗生素處理之后，將細胞轉移至豐富培養基中。
通過測定所處理的細胞的營養需求量來確認和鑒定營養缺陷型突變。通常將復制鋪板用于這一測定。將細胞平板接種在豐富培養基和缺乏特定營養物的培養基上。在特定平板上不生長的細胞是缺少營養物的營養缺陷型細胞。互補分析可以用于進一步鑒定。
異源DNA可以由幾種已知方法之任一種引入甲醇畢赤酵母細胞中，這些方法包括鋰轉化(Hiep等，酵母，9:1189-1197,1993；Tarutina和Tolstorukov，關于酵母的第15屆國際專門研討會摘要，Riea(USSR),1991,137；Ito等，細菌學雜志，153:163,1983；Bogdanova等，酵母，11:343,1995)，原生質球轉化(Beggs，自然，275:104,1978；Hinnen等，美國國家科學院院報，75:1929,1978；Cregg等，分子細胞生物學，5:3376,1985)，凍融聚乙二醇轉化(畢赤酵母屬表達試劑盒指導手冊，Invitrogen Corp.,San Diego,CA，目錄號K1710-01)或者電穿孔法，后一種方法是優選的。電穿孔法是這樣一種方法，其利用瞬時透化細胞膜的脈沖電場，使大分子(如DNA)得以進入細胞。已有文獻報道了與哺乳動物的(例如Neumann等，EMBO J.1:841-845,1982)和真菌的(例如Meilhoc等，生物/技術，8:223-227,1990)宿主細胞一起利用的電穿孔法。然而，對于DNA轉移進入細胞的真正機理并不充分了解。對于甲醇畢赤酵母的轉化，人們已發現當細胞暴露于指數衰減的脈沖電場(具有2.5至4.5kV/cm的電場強度和1至40毫秒的時間常數(τ))中時，電穿孔法是極為有效的。時間常數τ被定義為初始的峰值電壓V0降至V0/e值時所需的時間。可以按照脈沖電路的總電阻與電容的乘積來計算時間常數，即τ=R×C。典型地，可以由用戶預置或者選擇電阻以及電容，這取決于所選擇的電穿孔法設備。在任何情況下，按照制造廠商提供的上述電場強度和衰減參數的說明書來配置設備。電穿孔法設備由供應商(例如BioRad實驗室，Hercules,CA)提供。
一般將用于轉化甲醇畢赤酵母的DNA分子制備成雙鏈的環狀質粒，優選地，該質粒在轉化之前被線性化。對于多肽或者蛋白質產生，除以上描述的選擇性標記外，DNA分子還包括表達盒，其包含轉錄啟動子、編碼感興趣的多肽或者蛋白質的DNA節段(如cDNA)以及轉錄終止子。將這些元件可操作地連接在一起，從而提供感興趣的DNA節段的轉錄。優選的是，啟動子與終止子是甲醇畢赤酵母基因的啟動子與終止子。有用的啟動子包括那些來源于組成型和甲醇誘導型啟動子的啟動子。啟動子序列一般地包含在基因的編碼序列上游的1.5kb之內，經常在1kb或者更少的范圍之內。一般來說，由于存在調節元件，調節啟動子比組成型啟動子大。包括正和負調節元件的甲醇誘導型啟動子可以伸展超過起始ATG上游的1kb。由功能識別啟動子，并可以按照已知方法克隆啟動子。
特別優選的甲基誘導型啟動子是甲醇畢赤酵母醇利用基因的啟動子。這樣的基因AUG1的代表性編碼鏈序列顯示在SEQ ID NO:2中。在SEQ ID NO:2中，起始ATG密碼子位于核苷酸1355-1357。SEQ ID NO:2的核苷酸1-23是非AUG1多接頭序列。特別優選的是利用包含SEQ IDNO:2的核苷酸24-1354的節段作為啟動子，雖然附加的上游序列也可以包括在內。甲醇畢赤酵母含有第二個醇利用基因AUG2，該基因的啟動子可以用于本發明中。一個AUG2克隆的部分DNA序列顯示在SEQ ID NO:9中。用于本發明中的AUG2啟動子節段一般包含SEQ ID NO:9的核苷酸91-169，雖然不希望3′末端上的小截斷片段不存在啟動子功能。其它的有用啟動子包括那些二羥基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過氧化氫酶(CAT)基因的啟動子。來源于其它物種的編碼這些酶的基因已有文獻報道，它們的序列是可獲得的(例如，Janowicz等，核酸研究，13:2043,1985；Hollenberg和Janowicz,EPO出版物0 299 108；Didion和Roggenkamp,FEBS Lett.303:113,1992)。通過利用已知序列作為探針，或者通過對比已知序列，基于序列對比來設計引物以及由聚合酶鏈反應(PCR)擴增甲醇畢赤酵母DNA，可以克隆編碼這些蛋白質的基因。
組成型啟動子是那些沒有被環境條件活化或者滅活的啟動子；它們在轉錄方面總是具有活性的。用于本發明中的優選的組成型啟動子包括那些得自甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶以及甲醇畢赤酵母的磷酸甘油酸激酶基因的啟動子。通過在具有對應基因方面的突變的宿主細胞(如釀酒酵母細胞)中的互補作用，可以克隆這些基因。這一類型的突變體是本領域所熟知的。參見，例如，Kawasaki和Fraenkel，生物化學生物物理學研究通訊，108:1107-1112,1982；McKnight等，細胞，46:143-147,1986；Aguilera和Zimmermann，分子基因遺傳學，202:83-89,1986。
DNA分子還包含使鑒定、選擇和轉化體維持得以實現的選擇性標記。DNA分子還可以含有附加的元件，這樣的復制起點和選擇性標記使在交替宿主(例如大腸桿菌)中的DNA的擴增和維持得以實現。為了有利于DNA整合到宿主染色體中，優選的是DNA分子具有側連在宿主DNA序列的兩端的整個表達節段，包含啟動子-感興趣基因-終止子以及選擇性標記。通過在表達節段的下游末端上包含3′未翻譯DNA序列以及依賴于在5′末端上的啟動子序列，可以便利地實現這一目的。當利用線型DNA時，表達節段將側連切割位點，從而使分子得以線性化和使表達節段得以與其它序列(例如細菌復制起點和選擇性標記)分離。優選的這樣的切割位點是那些為不經常在DNA序列中切割的限制性內切酶所識別的切割位點，如那些識別8-堿基靶序列的切割位點(如NotⅠ)。
可以在甲醇畢赤酵母中產生的蛋白質包括工業和藥物上感興趣的蛋白質。這樣的蛋白質包括得自植物和動物(尤其是如哺乳動物的脊椎動物)的高級真核蛋白質，雖然某些來源于微生物的蛋白質也具有很高的價值。可以利用本發明方法制備的蛋白質包括酶(如脂酶、纖維素酶和蛋白酶)；酶抑制劑(包括蛋白酶抑制劑)；生長因子(如血小板衍生的生長因子、成纖維細胞生長因子和表皮生長因子)；細胞因子(如促紅細胞生成素和血小板生成素)以及激素(如胰島素、leptin和胰高血糖素)。
為了產生多肽，在大約25-35℃溫度下，在包含充分碳源、氮源以及痕量營養物質的培養基中培養甲醇畢赤酵母細胞。由常規手段(如搖動小瓶或者噴射發酵罐)用充分通氣來提供液體培養物。優選的培養基是YEPD(表1)。可以通過在新鮮培養基中稀釋使細胞傳代，或者細胞可以在冷凍之下在平板上短期存儲。對于長期存儲，細胞優選在-70℃下保持在50％甘油溶液中。
表1YEPD2％D-葡萄糖
2％BactTM蛋白胨(Difco實驗室，底特律，MI)1％BactoTM酵母提取物(Difco實驗室)0.004％腺嘌呤0.006％L-亮氨酸ADE D0.056％-Ade-Trp-Thr粉0.67％無氨基酸的酵母氮基質2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液ADE DS0.056％-Ade-Trp-Thr粉0.67％無氨基酸的酵母氮基質2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液18.22％D-山梨糖醇LEU D0.052％-Leu-Trp-Thr粉0.67％無氨基酸的酵母氮基質2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液HIS D0.052％-His-Trp-Thr粉0.67％無氨基酸的酵母氮基質2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液URA D0.056％-Ura-Trp-Thr粉0.67％無氨基酸的酵母氮基質2％D-葡萄糖
0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液URA DS0.056％-Ura-Trp-Thr粉0.67％無氨基酸的酵母氮基質2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液18.22％D-山梨糖醇-Leu-Trp-Thr粉通過結合以下物質所制得的粉狀物4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g組氨酸、6.0g異亮氨酸、4.0g賴氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)-His-Trp-Thr粉通過結合以下物質所制得的粉狀物4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、6.0g異亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g賴氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)-Ura-Trp-Thr粉通過結合以下物質所制得的粉狀物4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g組氨酸、6.0g異亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g賴氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)-Ade-Trp-Thr粉通過結合以下物質所制得的粉狀物3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g組氨酸、6.0g異亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g賴氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)200X色氨酸、蘇氨酸溶液3.0％L-蘇氨酸、0.8％在H2O中的L-色氨酸對于平板，加入1.8％BactoTM瓊脂(Difco實驗室)優選在早期的對數期生長中的細胞上進行甲醇畢赤酵母的電穿孔法。在固體培養基(優選為固體YEPD)上將細胞劃線培養為單一菌落。在30℃下生長大約2天之后，利用得自新鮮平板的單一菌落來接種所需量的豐富培養基(如YEPD)而使細胞密度達到大約5-10×105細胞/ml。在大約25-35℃(優選為30℃)下通過劇烈搖動來培養細胞，直到它們處于早期對數期。然后通過如3000×g的2-3分鐘離心來收獲細胞，并再懸浮該細胞。通過還原細胞壁中的二硫鍵、在離子溶液(適合電穿孔法條件)中平衡它們以及冷卻它們，使細胞處于電感受態(electrocompetent)。典型地，通過在pH6-8緩沖液(包含還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)或者β-巰基乙醇(BME))中培養它們，使細胞處于電感受態，以還原細胞壁蛋白質而有利于爾后的對DNA的攝取。就這一點來說，優選的培養緩沖液是pH7.5的、包含25mM DTT的50mM磷酸鉀緩沖劑的新鮮溶液。在大約30℃下在這一緩沖液(典型地是利用原培養量的五分之一)中培養細胞大約5-30分鐘，優選為大約15分鐘。然后收獲細胞并在合適的電穿孔緩沖液(其利用時是經過用冰預冷的)中洗滌該細胞。基于這一考慮，合適的緩沖液包括包含弱緩沖劑、二價陽離子(如Mg++、Ca++)和滲透穩定劑(例如食糖)的pH6-8溶液。在洗滌之后，將細胞再懸浮于小量的緩沖液中，其時間為達到電感受態的時間，并且該細胞可以被直接利用或者等分和存儲在凍結(優選為-70℃)下。優選的電穿孔緩沖液是STM(270mM蔗糖、10mM Tris、pH7.5、1mM MgCl2)。在優選的方案中，使細胞接受兩次洗滌，首先用原培養量的用冰預冷的緩沖液，然后用一半原培養量。在第二次洗滌之后，收獲并再懸浮細胞，典型地是利用大約3-5ml緩沖液(對于200ml原培養量)。
利用少量電感受態細胞(典型地為大約100μl)和至多十分之一量的線型DNA分子，實施電穿孔法。例如，使0.1ml的在緩沖液中的細胞懸浮液(其離子強度不超過50mM)與0.1-10μg的DNA(體積≤10μl)混合。將這一混合液放置在用冰預冷的電穿孔小池中，并且使之受于呈指數衰減的脈沖電場，電場強度為2.5至4.5kV/cm，優選為大約3.75kV/cm，時間常數為1至40毫秒，優選為10-30毫秒，更優選為15-25毫秒，最優選為大約20毫秒。為了達到所需脈沖參數，所利用的實際設備設置由所利用的設備決定。當利用具有2mm電穿孔小池的BioRad(Hercules,CA)Gene PulserTM電穿孔儀時，電阻設為600歐姆或者更大，優選為″無窮大″電阻值，而電容則設為25μF，以便獲得所需電場特征。在脈沖之后，將細胞稀釋大約10X而成為1ml YEPD肉湯，并在30℃下將其溫育一小時。
然后收獲細胞并將其平板接種在選擇性培養基上。在優選的實施方案中，用少量(等于稀釋量的電穿孔細胞)的1X酵母氮基質(6.7g/L無氨基酸的酵母氮基質，Difco實驗室，底特律，MI)一次性洗滌細胞，并且將其平板接種在基本選擇性培養基上。可以將具有ade2突變的細胞(已經用ADE2選擇性標記轉化過)平板接種在缺乏腺嘌呤的基本培養基(如ADE D(表1)或者ADE DS(表1))上。用典型的方法，可以將細胞的250μl等分平板接種在4個單獨ADE D或者ADE DS平板上，以便選擇Ade+細胞。
甲醇畢赤酵母識別某些極少存在的序列，即所謂的作為DNA復制起點的自主復制序列(ARS)，這些序列可以偶然地發生于用來轉化的DNA分子中，使轉化DNA得以保持在染色體外。然而。整合轉化體一般優選用于蛋白質產生系統中。在包含山梨糖醇作為碳源的選擇性培養基上，整合轉化體具有超過ARS轉化體的極強生長優勢，由此提供了用于從所轉化的細胞群體中選擇整合轉化體的方法。已經發現ARS序列存在于ADE2基因中，并且也有可能存在于甲醇畢赤酵母的AUG1基因中。用ADE2基因轉化的甲醇畢赤酵母的ade2宿主細胞因此可以通過至少兩種不同的方式成為Ade+。在ADE2基因中的ARS可以使轉化DNA的不穩定染色體外維持得以存在(Hiep等，酵母，9:1189-1197,1993)。這樣的轉化體的菌落的特征為緩慢的生長速率和粉紅顏色(由于所謂的Ade-子代的大量產生所致)。轉化DNA也可以整合入宿主基因組中，產生快速生長的、白色的以及不能產生可檢測量Ade-子代的穩定轉化體。ADE D平板使所轉化的細胞得以最迅速地生長，并且不穩定和穩定轉化體也以大致相同的速率生長。在30℃下在ADE D平板上溫育3-5天之后，穩定轉化體菌落是白色的，并且大致是不穩定的粉紅色轉化體的大小的兩倍。ADE DS平板對于穩定轉化體更是選擇性的，該轉化體在5-7天之后形成大(≈5mm)菌落，而不穩定(ARS保持)菌落則小得多(≈1mm)。因此更具選擇性的ADEDS培養基優選鑒定和選擇穩定轉化體。對于一些應用，如從遺傳多樣性文庫中篩選遺傳因子的稀有組合，有時需要篩選大量的不穩定轉化體，人們已觀察到不穩定轉化體的數量超過穩定轉化體的數量大約100倍。在這樣的情況中，本領域技術人員將認識到平板接種在較少選擇性培養基(如ADE D)上轉化體細胞的用途。
整合轉化體優選用于蛋白質產生方法中。可以增殖這樣的細胞而無需連續選擇性的壓力，這是因為DNA很少從基因組中失去。可以由Southern印跡分析確認DNA整合到宿主染色體中。簡言之，用限制性核酸內切酶消化轉化的和未轉化的宿主DNA，電泳分離之，將其印跡到支持膜上，以及用適當的宿主DNA節段探測之。在未轉化的和轉化的細胞中觀測到的片段模式的不同預示有整合轉化。可以選擇限制酶和探針以便在基因組片段中確定轉化DNA節段(如啟動子、終止子、異源DNA以及選擇性標記序列)。
異源蛋白質表達水平的不同產生于這樣一些因子，如整合位點和表達盒的拷貝數以及各個分離物之間的啟動子活性方面的不同。因此在選擇產生菌株之前根據不同表達水平篩選一些分離物是有利的。有各種合適的篩選方法可供使用。例如，使轉化體菌落生長在用結合蛋白質的膜(例如硝酸纖維素)覆蓋的平板上。通過分泌或者其后的裂解以及與膜的結合，可以使蛋白質從細胞中釋放出來。然后可以利用已知方法(包括免疫測定)分析結合的蛋白質。通過在液體培養基中適當地培養細胞以及適當地分析條件培養基或者細胞溶胞產物，可以獲得更精確的表達水平分析。從培養基和溶胞產物中濃縮和純化蛋白質的方法部分地由感興趣的蛋白質決定。這樣的方法易于由技術人員選擇和實踐。
對于小規模的蛋白質生產(例如平板或者搖瓶生產)來說，在存在甲醇以及缺乏干擾量的其它碳源(例如葡萄糖)的情況下，使攜帶包含甲醇調節的啟動子(如AUG1啟動子)的表達盒的甲醇畢赤酵母轉化體生長。對于小規模的實驗(包括表達水平的初步篩選)，可以使轉化體在固體培養基上在30℃下生長，該固體培養基包含，例如20g/L Bacto瓊脂(Difco)、6.7g/L無氨基酸(Difco)的酵母氮基質、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素以及0.56g/L-Ade-Thr-Trp粉。因為甲醇是易揮發的碳源，所以它在長時間溫育時容易損失。通過在倒置平板的蓋子上放置50％的甲醇水溶液，可以連續不斷地供給甲醇，由此蒸發傳輸將甲醇轉移到生長細胞上。總的來說，每100mm平板利用不到1mL的甲醇。利用生長在搖瓶中的培養物可以進行稍大規模的實驗。用一典型方法，在如上所述的基本甲醇平板上在30℃下培養細胞兩天，然后，將菌落用來接種少量的基本甲醇培養基(6.7g/L無氨基酸的酵母氮基質、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素)，其細胞密度為大約1×106個細胞/ml。使細胞在30℃下生長。生長在甲醇上的的細胞有高的需氧量，并需要在培養期間進行劇烈搖動。每日補充甲醇(典型地為每天1/100量的50％甲醇)。
對于生產規模培養，用搖瓶制備高產量克隆的新鮮培養物。然后，所產生的培養物用來在發酵罐中接種培養基。典型地，通過劇烈振蕩，在YEPD(在30℃下生長1-2天)中的500ml培養物用來接種5升發酵罐。在pH5.0下在28℃下使細胞生長在合適的培養基(包含鹽、葡萄糖、生物素和痕量元素以及＞30％的溶解氧)中。在消耗了(以耗氧量減少作為指示)初填充的葡萄糖之后，將葡萄糖/甲醇進料傳送到容器中以便引起感興趣的蛋白質的產生。因為在限制碳條件下實現大規模的發酵，所以葡萄糖在進料中的存在并不阻抑甲醇誘導型啟動子。在葡萄糖限制條件下與甲醇結合起來的葡萄糖的利用產生快速生長、碳向生物量的有效轉化和生理生長狀態的迅速改變，而仍然提供甲醇誘導型基因啟動子的充分誘導。在典型發酵過程中，可獲得的細胞密度為每升大約80至大約400克的潮濕細胞糊狀物。″潮濕細胞糊狀物″指的是通過從發酵罐收獲細胞(典型地通過培養物的離心)獲得的細胞團塊。
本發明由下列非限制性實施例進一步說明。實施例實施例1通過UV暴露來誘變甲醇畢赤酵母細胞(來源于美國典型培養物保藏中心的CBS6515菌株，Rockville,MD)。通過以大約200-250個細胞/平板將細胞接種在幾個平板上，首先產生致死曲線。然后，利用懸掛在離平板表面25cm處的G8T5殺菌燈(Sylvania)，將平板暴露于UV輻射下，持續時間如表2所示。然后保護平板以免可見光源照射并在30℃下溫育兩天。
表2可存活的細胞時間平板1平板2平均值0秒 225 229 2271秒 200 247 2232秒 176 185 1814秒 149 86 1188秒 207 1416秒 021然后利用2秒UV暴露進行大規模誘變，以提供大約20％的殺死。以大約104個細胞/平板將細胞平板接種在八個YEPD平板上，這些平板用尿嘧啶、腺嘌呤和亮氨酸(每種物質各為100mg/L)進行補充，補加這些物料以便給可能的缺乏有關營養物質的營養缺陷型生長補料。在UV暴露之后，用箔包裹這些平板，并在30℃下溫育一夜。第二天，將平板上的菌落(總共為大約105)再懸浮于水中，并用水洗滌一次。足以給出0.1-0.2OD600的一定量細胞懸浮液用來接種500ml基本肉湯(用無氨基酸或者無氨的酵母氮基質制得)，其中用1％葡萄糖和400μg/L生物素補料。將培養物放置在2.8L折流板式Bell瓶(baffled Bell flask)中，并且在30℃下劇烈振蕩一夜。第二天，細胞達到大約1.0-2.0OD600。使細胞成球狀，并將其再懸浮于500ml的以5g/L硫酸銨補料的基本肉湯中。將細胞懸浮液放置在2.8L折流板式Bell瓶中，并在30℃下劇烈振蕩6個小時。將50ml培養物放置在250ml瓶中而擱置在一邊作為對照，并且在其余部分的培養物中加入1mg制霉菌素(Sigma化學公司，St.Louis,MO)，以便選擇營養突變體(Snow，自然，211:206-207,1966)。通過振蕩附加的一小時來溫育培養物。然后由離心收獲對照細胞和制霉菌素處理過的細胞，并用水洗滌三次。再懸浮所洗滌的細胞從而在50％甘油中得到1.0OD600并凍結之。以菌落形成單位表示的制霉菌素處理過的細胞相對于對照細胞的滴定揭示制霉菌素富集使可存活細胞的數量減少了104倍。
將制霉菌素處理過的細胞的10-2稀釋液平板接種在15 YEPD平板上。將菌落復制鋪板于基本平板(2％瓊脂，1X YNB,2％葡萄糖，400μg/L生物素)上。營養缺陷型的頻率為大約2-4％。挑選大約180個營養缺陷型菌落至YEPD+Ade,Leu,Ura平板中，并將其復制鋪板于各種點滴(dropout)平板上。所有營養缺陷型都是Ade-。其中的30個在點滴平板上呈現出顯著的粉紅色(LEU D,HIS D等參見表1)。在30個粉紅色突變體中，選擇21個進行進一步的研究，余者對于在ADE D平板上的生長是滲漏的或者為野生型細胞所污染。
然后對Ade-突變體進行互補分析和表型檢驗。為了確定由突變體限定的基因座的數量，將所有21個突變體配對成單一粉紅色的Ade-檢驗菌株(菌株2#)。通過混合細胞懸浮液(OD600=1)以及把混合物的10μl等分試樣平板接種在YEPD平板上，來實現配對。然后將細胞復制到SPOR培養基(0.5％乙酸鈉，1％KCl,1％葡萄糖，1％瓊脂)上，并在30℃下溫育一夜。然后將細胞復制鋪板于ADE D平板上以評價表型。正如表3所示，一些突變體組合沒有給出Ade+菌落(可能限定與菌株#2中的相同的遺傳基因座)，而其它突變體組合則產生許多Ade+菌落(可能限定單獨的遺傳基因座)。因為當與#2配對時，突變體#3給出Ade+菌落，所以用突變體#3重復互補檢驗。如果該組突變體限定兩個遺傳基因座，那么當與#3配對時，所有突變體(當與菌株#2配對時，其沒有給出Ade+菌落)都應該給出Ade+菌落。雜交的結果顯示在表3中。
表3
正如表3所示，大多數突變體屬于兩組之一，這與有兩種腺嘌呤生物合成基因(當缺失時，其在有限腺嘌呤培養基上產生粉紅色菌落)的想法一致。三個菌落(#4、#12和#16)可以限定第三基因座或顯示出基因內互補。選擇來源于兩互補組之每一組的兩種具有強烈色素形成的突變體(#3和#10；#6和#11)進一步鑒定。附加的分析表明Ade-是存在于這些菌株中的唯一營養缺陷體。
用載體pRS426(一種包含2μ和釀酒酵母URA3序列的穿梭載體，其中的URA3序列使載體pRS426得以在釀酒酵母中增殖)構建甲醇畢赤酵母克隆庫。按照標準方法由菌株CBS6515制備基因組DNA。簡言之，在豐富培養基中培養細胞一夜，用酶解酶原生質球化，以及用SDS裂解。用乙醇從溶胞產物中沉淀DNA，并用苯酚/氯仿混合物提取之，然后用乙酸銨和乙醇沉淀。DNA制備物的凝膠電泳顯示出完整的高分子量DNA和可觀數量的RNA的存在。通過當該酶的一系列稀釋液存在時培養該DNA，用Sau 3A部分消化DNA。由電泳分析消化液的樣品，以便確定片段的大小分布。從凝膠上切割下在4和12kb之間遷移的DNA，并從凝膠切片上提取之。然后將大小分級的DNA連接到已用Bam HⅠ消化過和用堿性磷酸酶處理過的pRS426上。按照制造廠商推薦的方法，利用BioRad Gene PulserTM裝置，在大腸桿菌MC1061細胞中電穿孔反應混合物的等分試樣。
基因組文庫用來由電穿孔法(Becker和Guarente，酶學方法，194:182-187,1991)轉化釀酒酵母菌株HBY21A(ade2 ura3)。使細胞再懸浮于1.2M山梨糖醇中，并將六個300μl的等分試樣平板接種在ADE D、ADE DS、URA D以及URA DS平板(表1)上。在30℃下溫育平板4-5天。在ADE D或者ADE DS平板上沒有回收到任何Ade+菌落。將得自URA D和URA DS平板的菌落復制鋪板于ADE D平板上，可獲得兩個緊密相間的白色菌落。再劃線這些菌落，并確定其為Ura+和Ade+。將這兩種命名為Ade1和Ade6的菌株劃線在包含5FOA(5氟代乳清酸；Sikorski和Boeke，酶學方法，194:302-318)的培養基上。獲得復制鋪板時發現為Ade-的Ura-菌落。這些結果表明Ade+互補活性被基因連接到攜帶質粒的URA3標記上。得自酵母菌株Ade1和Ade6的質粒似乎與如下所描述的限制性酶切作圖一致。將這些基因組克隆分別命名為pADE1-1和pADE1-6。
將總DNA與HBY21A轉化體Ade1和Ade6分離，并將其用來轉化大腸桿菌菌株MC1061為AmpR。由Ade1的2個AmpR菌落和Ade6的3個AmpR菌落制備DNA。用PstⅠ、ScaⅠ和PstⅠ+ScaⅠ消化DNA，并由凝膠電泳分析之。所有五個分離物產生相同的限制圖譜。
由甲醇畢赤酵母P ADE2基因(也稱作為ADE1；Hiep等，酵母，9:1251-1258,1993)的公布序列設計PCR引物。引物9080(SEQ ID NO:3)設計為在ADE2 DNA(SEQ ID NO:I)的406-429堿基上引導，引物9079(SEQ ID NO:4)設計為在2852-2829堿基上引導。所包含的兩種引物不能在擴增序列兩端引入AvrⅡ和SpeⅠ位點。所產生的PCR片段大小的預測值為2450bp。
以五個推定的ADE2克隆作為模板利用質粒DNA進行PCR。100μl反應混合物包含1×Taq PCR緩沖液(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、10-100ng質粒DNA、0.25mM dNTPs、100pmol的每種引物以及1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)。PCR包括在94℃下進行30次30秒的循環、在50℃下進行30次60秒的循環、在72℃下進行30次120秒的循環。五個推定的ADE2基因組克隆之每一個都產生所需大小(2.4kb)的PCR產物。當用BglⅡ或者SalⅠ消化時，得自一個反應的DNA片段的限制性酶切圖給出所需大小的片段。
集中陽性PCR反應物并用SpeⅠ消化之。用SpeⅠ消化載體pRS426，并用牛小腸磷酸酶處理之。利用常規連接條件在10μl反應混合物中使4μl PCR片段與1μl載體DNA結合。由凝膠電泳分析所連接的DNA。分析SpeⅠ消化液以便確定攜帶在pRS426之內的ADE2基因的亞克隆的質粒。將正確的質粒命名為pCZR118。
因為已由PCR擴增了pCZR118中的ADE2基因，所以有可能的是，可以產生使基因的功能特性不能存在的突變。為了檢驗這樣的突變，將具有所需插入片段的亞克隆單獨地轉化到釀酒酵母菌株HBY21A中。使細胞處于電感受態，并按照標準方法轉化之。將轉化體平板接種在URA D和ADE D平板上。三個表型組得到鑒定。克隆1、2、11和12在ADED上產生許多健壯生長的轉化體。轉化頻率與Ura+轉化體的頻率相當。克隆6、8、10和14也給出向Ura+和Ade+的高效率的轉化，但是Ade+菌落比那些在第一組中的菌落稍小。克隆3產生許多Ura+菌落，但不產生Ade+菌落，這表明克隆3攜帶非功能性ade2突變。集中克隆1、2、11、和12。
為了確定甲醇畢赤酵母ade2互補組，用克隆的ADE基因轉化得自每個互補組的兩個代表性突變體(#3和#10；#6和#11)，該突變體，當其生長在限制腺嘌呤上時，基于深紅色素形成進行選擇。由離心(3000×g,3分鐘)收獲早期對數期細胞的200ml培養物，并將其再懸浮于20ml的新鮮KD緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5，包含25mM DTT)。在30℃下在這一緩沖液中溫育細胞15分鐘。然后收獲細胞，并將其再懸浮于200ml用冰預冷的STM(270mM蔗糖，10mM Tris,pH7.5,1mMMgCl2)中。收獲細胞，并將其再懸浮于100ml用冰預冷的STM中。再一次收獲細胞，并將其再懸浮于3-5ml用冰預冷的STM中。然后使來源于每種培養物的電感受態細胞的100μl的等分試樣與NotⅠ消化的pADE1-1 DNA混合。將細胞/DNA混合物放置在2mm電穿孔小池中，并利用設置為1000Ω電阻和25μF電容的BioRad Gene PulserTM使該混合物受于5kV/cm的脈沖電場中。在脈沖之后，通過加入1ml YEPD來稀釋細胞，并在30℃下溫育一小時。然后由和緩離心收獲細胞，并再懸浮于缺乏腺嘌呤的400μl基本選擇性培養基(ADE D)中。將再懸浮樣品分成200μl的等分試樣，并將其平板接種在ADE D和ADE DS平板上。在30℃下溫育平板4-5天。突變體#6和#11給出Ade+轉化體。當DNA被省略時，沒有觀察到任何Ade+轉化體，因此，兩個分離物似乎限定ade2互補組。ADE2序列顯示在SEQ ID NO:1中。實施例2實施例1中所揭示的甲醇畢赤酵母克隆庫用作為克隆醇利用基因(AUG1)的源。克隆庫作為獨立庫存儲，其中每個庫表示大約200-250個個體基因組克隆。來源于每個庫的0.1μl″小量制備″DNA在利用PCR引物(8784,SEQ ID NO:5；8787,SEQ ID NO:6)的聚合酶鏈反應中用作為模板，該PCR引物由在多形漢遜酵母、博伊丁假絲酵母和巴斯德畢赤酵母的醇氧化酶基因中的保守序列的排列來設計。擴增反應進行如下在94℃下30個30秒的循環，在50℃下30個30秒的循環，在72℃下30個60秒的循環；隨后在72℃下溫育7分鐘。一個庫(#5)給出大約600bp帶。這一PCR產物的DNA測序揭示它編碼這樣一種氨基酸序列，該氨基酸序列與為AOX1基因所編碼的巴斯德畢赤酵母醇氧化酶之間有大約70％的序列等同性，與為MOX1基因所編碼的多形漢遜酵母醇氧化酶之間有大約85％的序列等同性。克隆的AUG1基因的序列顯示在SEQ IDNO:2中。
利用與初始擴增中所用的相同的引物由PCR分析#5庫的亞庫。進一步分解一個陽性亞庫以便確定陽性菌落。在平板上劃線這一陽性菌落，并由個體菌落制備DNA。在用ClaⅠ消化之后，三個菌落給出同一模式。
基因組克隆和PCR產物的限制性酶切圖揭示AUG1基因位于7.5kb基因組插入片段上，并且在PCR片段之內的位點可以在基因組插入片段之內得到獨一無二的確定。因為在PCR片段之內的基因的取向是已知的，因此后一條信息提供在基因組插入片段之內的AUG1基因的近似位置和轉錄方向。在這一區域之內的DNA測序揭示基因在氨基酸水平上與其它已知的醇氧化酶基因之間有十分高的序列相似性。實施例3用包含AUG1啟動子和終止子、人GAD65 DNA(Karlsen等，美國國家科學院院報，88:8337-8341,1991)以及ADE2選擇性標記的表達載體，基本上按照如上所述的過程，由電穿孔法轉化ade2突變的甲醇畢赤酵母細胞。使菌落在瓊脂基本甲醇平板(每100mm平板10至100個菌落)上形成膜片，該平板包含20g/L BactoTM瓊脂(Difco)、6.7g/L無氨基酸的酵母氮基質(Difco)、10g/L甲醇以及0.4μg/L生物素。用硝酸纖維素覆蓋瓊脂，并將平板倒置在包含1ml 50％甲醇(在水中)的蓋子上，并在30℃下溫育3至5天。然后將膜轉移至浸泡在0.2M NaOH、0.1％SDS、35mM二硫蘇糖醇中的濾器上以便裂解粘著細胞。在30分鐘之后，用蒸餾水從濾器沖洗下細胞碎片，并通過在0.1M乙酸中沖洗30分鐘來中和濾器。
然后分析濾器中的粘著蛋白質。通過在室溫下在TTBS-NFM(20mMTris pH7.4,0.1％Tween 20,160mM NaCl,5％的無脂牛奶粉)中漂洗30分鐘，封阻未占據的結合位點。然后將濾器轉移到包含GAD6單克隆抗體(Chang和Gottlieb,J.Neurosci,8:2123-2130,1988)的溶液中，該單克隆抗體在TTBS-NFM中的稀釋比率為1∶1000。在該抗體溶液中對濾器進行伴有至少一小時的和緩攪拌的溫育，然后用TTBS(20mM TrispH7.4,0.1％Tween 20,160mM NaCl)洗滌兩次，每次五分鐘。然后用與辣根過氧化物酶(1μg/ml TTBS-NFM)綴合的山羊抗小鼠抗體溫育濾器至少一小時，然后用TTBS洗滌濾器三次，每次5分鐘。然后使濾器暴露于市售的化學發光試劑(ECLTM；Amersham Inc.,Arlington Heigths,IL)下。在X光膠卷上檢測由陽性膜片產生的光線。
為了更精確地檢測GAD65表達的水平，在搖瓶培養物中培養候選克隆。按照如上所述的方法，使菌落在30℃下在基本甲醇平板上生長兩天。菌落用來接種20ml基本甲醇培養基(6.7g/L的無氨基酸的酵母氮基質、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素)，其細胞密度為1×106個細胞/毫升。在劇烈振蕩下使培養物在30℃下生長1-2天。每日在每種培養物中加入0.2ml的50％甲醇。由離心收獲細胞，并且將其懸浮于用冰預冷的裂解緩沖液(20mM Tris pH8.0,40mM NaCl,2mM PMSF,1mM EDTA,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，1μg/ml抑蛋白酶肽)中，其終體積為每g細胞糊狀物10ml裂解緩沖液。將2.5ml所產生的懸浮液加入至2.5ml的400-600微米的、用冰預冷的、酸洗滌過的玻璃珠(其置于15ml容器中)中，并劇烈攪拌混合物一分鐘，然后在冰上溫育1分鐘。重復這一過程直到細胞已經被攪拌了總共五分鐘。由離心(1000×g,5分鐘)除去大的碎片和未被打碎的細胞。然后將澄清的溶胞產物倒入一個干凈的容器中。用樣品緩沖液(5％SDS,8M尿素，100mM Tris pH6.8,10％甘油，2mM EDTA,0.01％溴酚藍)稀釋澄清的溶胞產物，并在4-20％丙烯酰胺梯度凝膠(Novex,San Diego,CA)上電泳。將蛋白質印跡到硝酸纖維素上，并用如上所述的GAD6抗體檢測之。
在高細胞密度發酵條件下，對在搖瓶培養中顯示出甲醇誘導的外源蛋白質的最高表達水平的克隆進行更深入的分析。首先在劇烈攪拌下在30℃下在0.5升YEPD肉湯中培養細胞1-2天，然后利用其來接種5升發酵裝置(例如BioFlowⅢ；New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,NJ)。首先通過加入57.8g(NH4)2SO4、68g KH2PO4、30.8g MgSO4·7H2O、8.6g CaSO4·2H2O、2.0g NaCl以及10ml消泡劑(PPG)，用礦物鹽來填裝發酵容器。加入H2O以形成2.5L體積，并將溶液高壓滅菌40分鐘。在冷卻之后，加入350ml的50％葡萄糖、250ml的10X痕量元素(表4)、25ml的200μg/ml生物素以及250ml細胞接種物。
表410 X痕量元素FeSO4·7H2O 100mM27.8g/LCuSO4·5H2O 2mM 0.5g/LZnCl28mM 1.09g/LMnSO4·H2O 8mM 1.35g/LCoCl2·6H2O 2mM 0.48g/LNa2MoO4·2H2O1mM 0.24g/LH3BO38mM 0.5g/LKI 0.5mm 0.08g/L生物素 5mg/L硫胺素 0.5g/L每升加入1-2毫升H2SO4以便使化合物形成溶液將發酵容器設置在28℃、pH5.0和＞30％溶氧量下運行。細胞將消耗初始的葡萄糖填裝物(這由消耗葡萄糖期間的需氧量急劇增加表明)，其后，在葡萄糖被耗盡之后耗氧量減少。在初始的葡萄糖填裝物用盡之后，將補加有NH4+和痕量元素的葡萄糖-甲醇進料輸送到容器中，其中0.2％(w/v)葡萄糖、0.2％(w/v)甲醇進料5個小時，其后為0.1％(w/v)葡萄糖、0.4％(w/v)甲醇進料25小時。以純甲醇計，利用12.5ml/hr的初始輸送速率和25ml/hr的最終速率通過容器的一個端口供給總共550克甲醇。利用包含175克葡萄糖、250ml 10X痕量元素以及99g(NH4)2SO4的700ml溶液，通過第二個端口供給葡萄糖。在這些條件下，葡萄糖和甲醇同時得到利用，并且伴隨一旦葡萄糖-甲醇進料開始，就誘導GAD65表達。按照如上所述的用于搖瓶培養的方法，分析得自發酵容器的細胞的GAD65表達。
以一定時間間隔從發酵容器移去細胞，并隨后對其進行分析。在利用葡萄糖的生長期間觀察到低GAD65表達。葡萄糖的耗盡導致GAD65蛋白質的低水平表達；在發酵培養物的進料期間通過加入MeOH可提高表達水平。甲醇的加入對由甲醇反應性AUG1啟動子驅動的人GAD65的表達有明顯的刺激作用。實施例4研究轉化條件以便確定最適于甲醇畢赤酵母的有效轉化的電場條件、DNA拓撲結構以及DNA濃度。所有實驗都利用甲醇畢赤酵母ade2菌株#11。按照如前所述方法制備感受態細胞。利用BioRad GenePulserTM實施電穿孔法。
三個電場參數影響電穿孔的轉化效率電容、電場強度和脈沖持續時間。電場強度由電脈沖的電壓決定，而脈沖持續時間則由儀器設置的電阻決定。在這一組實驗中，檢查了一組在各種電阻下的電場強度設置。在所有實驗中，都利用了儀器的最高電容設置(25μF)。在冰上使電感受態細胞的100μl等分試樣與10μl DNA混合，該DNA包含大約1μg的ADE2質粒pCZR133，該質粒已用限制酶NotⅠ線性化。將細胞和DNA轉移到2mm的電穿孔小池(BTX Corp.,San Diego,CA)中，并使之接受電場強度為0.5kV(2.5kV/cm)、0.75kV(3.75kV/cm)、1.0kV(5.0kV/cm)、1.25kV(6.25kV/cm)以及1.5kV(7.5kV/cm)的電脈沖。在各種脈沖持續時間下檢查這些場強條件。通過將儀器電阻改變為200歐姆、600歐姆或者″無窮大″歐姆值來調控脈沖持續時間。將脈沖過的細胞懸浮于YEPD中，并在30℃下溫育一小時，并收獲、再懸浮和平板接種之。進行三組獨立的實驗。在每一組中都發現相比于所檢驗的其它條件，在″無窮大″歐姆值的電阻下的0.75kV(3.75kV/cm)的電穿孔條件給出極高的轉化效率(參見圖1)。
在建立最適脈沖條件之后，研究DNA拓撲結構對轉化效率的影響。使電感受態細胞與1μg未切割的環狀pCZR133混合，或者與1μg NotⅠ消化的pCZR133混合。在三個單獨的實驗中，用環狀DNA回收平均大約25個轉化體，而線型DNA產生平均近1×104個轉化體。這些數據表明相比于環狀DNA，線型DNA以大得多的效率轉化甲醇畢赤酵母。
最后，研究DNA濃度和轉化效率之間的關系。使線型pCZR133 DNA的等分試樣(1ng、10ng、100ng和1μg，在10μl水中)與100μl電感受態細胞混合，并在3.75kV/cm和″無窮大″歐姆值下實施電穿孔法。轉化體的數量變化于大約10(1ng DNA)至104(1μg DNA)之間，并且發現該數量與DNA濃度成正比。實施例5通過比較來源于野生型細胞和穩定的白色轉化體菌落的DNA，檢測到轉化DNA整合進入甲醇畢赤酵母的基因組。鑒定出兩類整合轉化體。在第一類中，發現轉化DNA整合進入同源位點。在第二類中，發現轉化DNA取代內源性AUG1開放讀框。雖然不希望被理論所束縛，但一般認為第二類轉化體的出現是“置換型重組事件”(Rothstein，酶學方法，194:281-301,1991)，其中轉化DNA經由雙重組事件取代內源性DNA。
用AspⅠ消化過的pCZR140將甲醇畢赤酵母ade2菌株#11轉化成為Ade+,pCZR140即一種基于Bluescript(Stratagene克隆系統，La Jolla,CA)的載體，該載體包含甲醇畢赤酵母ADE2基因和AUG1的突變體，其中在啟動子和終止子區域之間的整個開放讀框都已被缺失(圖2)。由野生型細胞和在30℃下在YEPD平板上生長兩天的轉化體細胞制備基因組DNA。將大約100-200μl細胞懸浮于1ml H2O中，然后在微量離心機中離心30秒。回收細胞沉淀，并將其再懸浮于400μl SCE+DTT+酶解酶(1.2M山梨糖醇，10mM檸檬酸鈉，10mM EDTA,10mM DTT,1-2mg/ml酶解酶100T)中，并在37℃下溫育10-15分鐘。加入400μl的1％SDS，并混合溶液直到澄清。加入300μl的5M乙酸鉀(pH8.9)，混合溶液并在微量離心機中以全速離心五分鐘。將750μl上清液轉移到一新試管中，并用等體積苯酚/氯仿提取之。回收600μl所產生的上清液，并通過加入2倍體積的乙醇和在冷室中離心15分鐘來沉淀DNA。在65℃下，在50mlTE(10mM Tris pH8,1mM EDTA)+100μg/ml RNA酶中，將DNA沉淀再懸浮大約1小時。在37℃下，用在100μl反應量中的Eco RⅠ(5μl)消化10μl DNA樣品一夜。用乙醇沉淀DNA，由離心回收之，并將其再懸浮于7.5μl TE+2.5μl 5X加樣染料中。將全部10ml量施用于在0.5×TBE(10×TBE是108g/L Tris堿7-9,55g/L硼酸，8.3g/L EDTA二鈉)凝膠中的0.7％瓊脂糖的一條泳道上。在包含溴化乙錠的0.5×TBE中在100V下運行凝膠。給凝膠拍照，并在400mA、20mV下用30分鐘將DNA電泳轉移到正衍生的尼龍膜(NytranN+,Schleicher & Schuell,Keene,NH)上。然后用2×SSC沖洗該膜，該膜在變性溶液上印跡五分鐘，用2×SSC中和，然后在UV交聯劑(Stratalinker,Stratagene克隆系統)中根據其自動設置交聯阻尼。利用市售的試劑盒(ECLTM試劑盒，Amersham Corp.,Arlington Heigthts,IL)，使印跡雜交到PCR產生的AUG1啟動子探針上。結果表明轉化DNA改變AUG1啟動子DNA的結構，這與同源整合事件(圖2)一致。
在第二個實驗中，用NotⅠ消化過的pCZR137將甲醇畢赤酵母ade2菌株#11轉化成為Ade+,pCZR137即在AUG1啟動子和終止子之間包含人GAD65 cDNA的載體(圖3)。按照如上所述的方法，由野生型細胞和穩定的白色Ade+轉化體制備基因組DNA，并用EcoRⅠ消化之。由電泳分離出所消化的DNA，并且將其印跡到膜上。用由PCR產生的、與AUG1開放讀框或者AUG1啟動子對應的探針探測印跡。結果顯示在轉化體菌株中缺失AUG1開放讀框DNA，并且AUG1啟動子區域已經歷過顯著的重排。這些結果與轉化DNA和宿主基因組之間的雙重組事件(置換型)(圖3)一致。實施例6使甲醇畢赤酵母的AUG1菌株生長在高密度發酵條件下。通過加入57.8g(NH4)2SO4、46.6gKCl、30.8gMgSO4·7H2O、8.6gCaSO4·2H2O、2.0gNaCl以及10ml消泡劑(PPG)，用礦物鹽來填裝發酵容器。加入H2O以產生2.5L的體積，并將溶液高壓滅菌40分鐘。在冷卻之后，加入350ml的50％葡萄糖、250ml 10X痕量元素(表4)、210ml的30％磷酸鈉、25ml 200μg/ml生物素以及250ml細胞接種物。在三個階段向細胞分批進料葡萄糖或者葡萄糖/甲醇。在階段1，細胞接收0.4％/L/小時葡萄糖(w/v終發酵量)25小時，其中每1.5升利用750g葡萄糖、110g(NH4)2SO4以及278ml 10X痕量元素。然后給細胞以0.2％葡萄糖、0.2％甲醇/L/小時的過渡進料，歷時5小時。最后的葡萄糖補充性甲醇進料包含0.1％葡萄糖、0.4％甲醇/L/小時，歷時25小時。最后的生物量為大約300g/L細胞糊狀物。實施例7對于甲醇畢赤酵母aug1Δ菌株的發酵，發酵容器最初填裝有如實施例6中所述的礦物鹽、葡萄糖、磷酸鹽、痕量元素以及生物素。加入250ml細胞接種物。每1.2升利用600g葡萄糖、108g(NH4)2SO4以及273ml10X痕量元素，制備葡萄糖進料。在三個階段向細胞分批給料。在第一階段，細胞以0.4％/L/小時接收葡萄糖12-25小時。然后通過大丸劑加入重量百分比為1％的甲醇來誘導細胞，并通過用混合的0.2％葡萄糖/0.1％甲醇進料10小時來過渡到甲醇利用階段。在第三階段，輸送0.2％葡萄糖、0.2％甲醇的混合進料15小時。實施例8甲醇畢赤酵母細胞(其中的AUG1基因已為GAD65表達構建體的插入所破裂)仍然保持在甲醇上的生長能力，這表明存在一個第二醇氧化酶基因。由PCR鑒定第二個基因(命名為AUG2)。基因的5’編碼區的序列分析顯示所編碼的蛋白質的N-末端是類似于那些已知醇氧化酶基因的。
菌株MC GAD8(一種在基本甲醇肉湯上生長十分貧乏的轉化體)用作為克隆AUG2基因的源。由MC GAD8制備基因組DNA，并用特異于AUG1開放讀框(8784,SEQ ID NO:5；8787,SEQ ID NO:6)的有義和反義PCR引物擴增該基因組DNA。獲得在大小上與AUG1產物一致但在分析凝膠上顯示極低強度的產物。
用一組限制酶消化推定的AUG2 PCR產物。EcoRⅠ和PvuⅠ對其的部分消化以及幾個BglⅡ位點的存在表明DNA為少量的AUG1所污染。為了除去污染的AUG1 DNA，用EcoRⅠ切割PCR混合物并凝膠純化之。由于MC GAD8產物似乎沒有EcoRⅠ位點，因此它不受影響。再擴增所產生的凝膠純化的DNA，并由限制性消化對其進行再一次分析。DNA給出與AUG1 PCR產物不同的限制性酶切圖。
利用AUG1或者AUG2開放讀框PCR片段作為探針，對來源于MCGAD8和野生型細胞的基因組DNA進行Southern印跡分析。AUG2探針在嚴格性差的條件下與AUG1基因座雜交，在嚴格性差和強的條件下與第二個基因座雜交。AUG1探針在嚴格性差的條件下與兩個基因座都結合，但是在嚴格性強的條件下主要與AUG1基因座結合。這些數據表明得自MC GAD8的新PCR產物類似于但有別于AUG1。序列分析顯示出在AUG1和AUG2基因產物之間的83％等同性。
為了克隆AUG2基因組的基因座，由原AUG2 PCR片段設計PCR引物。引物9885(SEQ ID NO:7)和9883(SEQ ID NO:8)用來篩選甲醇畢赤酵母基因組文庫。然后用原MC GAD8 PCR產物探測陽性克隆庫。以大約5000個菌落/平板將細胞平板接種在10個平板上并生長一夜，然后用濾片(Hybond-N,Amersham Corp.,Arlington Heigthts,IL)覆蓋平板。使菌落變性，中和之，并對其進行UV交聯。用5X SSC從濾器上洗滌下細菌碎片，并再一次交聯濾器。在25ml雜交緩沖液中在42℃下成對雜交印跡1小時。然后在每對濾器中加入大約250ng的探針。在42℃下實施雜交4小時。然后在42℃下用500ml的0.1X SSC、6M尿素和0.4％SDS洗滌印跡10分鐘，共計四次。然后在室溫下用500ml的2X SSC中和印跡5分鐘，其中沖洗兩次。然后將印跡浸沒在100ml展開劑(ECL,Amersham Corp.)中。
挑選陽性菌落，并利用PCR引物9885(SEQ ID NO:7)和9883(SEQID NO:8)擴增該陽性菌落以確定它們的等同性。在平板上劃線陽性庫，并由PCR再篩選單一菌落。選擇一個菌落用于進一步分析(作限制性酶切圖和測序)。AUG2基因的部分序列顯示在SEQ ID NO:9中。正如SEQID NO:9所示，AUG2序列開始于HindⅢ位點上的核苷酸91。在這一位置上游的核苷酸是載體序列。編碼序列開始于核苷酸170。
AUG2基因的破裂對細胞在甲醇上的生長幾乎無影響。缺乏功能性AUG1和AUG2基因產物的細胞在甲醇上不能生長。爾后的分析顯示AUG1基因產物是在生長于發酵罐中的細胞中的唯一可檢測到的醇氧化酶。
按照以上所述，明顯的是雖然為了說明本發明本文描述了本發明的具體實施方案，但是可以對其進行各種修飾而不偏離本發明的精神與范圍。因此，除所附的權利要求書的限定外，本發明無其它限制。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人ZymoGenetics,Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattle,Washington 98102美利堅合眾國(ⅱ)發明名稱甲醇畢赤酵母營養突變體的制備(ⅲ)序列數9(ⅳ)通訊地址(A)收信人ZymoGenetics,Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州WA(E)國家美國(F)ZIP:98102(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,版本#1.25(ⅵ)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Parker,Gary E(B)登記號31-648(C)參考/證書號96-17(ⅸ)聯系信息
(A)電話206-442-6673(B)傳真206-442-6678(2)關于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3077個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假擬無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CAGCTGCTCT GCTCCTTGAT TCGTAATTAA TGTTATCCTT TTACTTTGAA CTCTTGTCGG 60TCCCCAACAG GGATTCCAAT CGGTGCTCAG CGGGATTTCC CATGAGGTTT TTGACAACTT120TATTGATGCT GCAAAAACTT TTTTAGCCGG GTTTAAGTAA CTGGGCAATA TTTCCAAAGG180CTGTGGGCGT TCCACACTCC TTGCTTTTCA TAATCTCTGT GTATTGTTTT ATTCGCATTT240TGATTCTCTT ATTACCAGTT ATGTAGAAAG ATCGGCAAAC AAAATATCAA CTTTTATCTT300GAACGCTGAC CCACGGTTTC AAATAACTAT CAGAACTCTA TAGCTATAGG GGAAGTTTAC360TGCTTGCTTA AAGCGGCTAA AAAGTGTTTG GCAAATTAAA AAAGCTGTGA CAAGTAGGAA420CTCCTGTAAA GGGCCGATTC GACTTCGAAA GAGCCTAAAA ACAGTGACTA TTGGTGACGG480AAAATTGCTA AAGGAGTACT AGGGCTGTAG TAATAAATAA TGGAACAGTG GTACAACAAT540AAAAGAATGA CGCTGTATGT CGTAGCCTGC ACGAGTAGCT CAGTGGTAGA GCAGCAGATT600GCAAATCTGT TGGTCACCGG TTCGATCCGG TCTCGGGCTT CCTTTTTTGC TTTTTCGATA660TTTGCGGGTA GGAAGCAAGG TCTAGTTTTC GTCGTTTCGG ATGGTTTACG AAAGTATCAG720CCATGAGTGT TTCCCTCTGG CTACCTAATA TATTTATTGA TCGGTCTCTC ATGTGAATGT780TTCTTTCCAA GTTCGGCTTT CAGCTCGTAA ATGTGCAAGA AATATTTGAC TCCAGCGACC840TTTCAGAGTC AAATTAATTT TCGCTAACAA TTTGTGTTTT TCTGGAGAAA CCTAAAGATT900TAACTGATAA GTCGAATCAA CATCTTTAAA TCCTTTAGTT AAGATCTCTG CAGCGGCCAG960TATTAACCAA TAGCATATTC ACAGGCATCA CATCGGAACA TTCAGAATGG ACTCGCAAAC 1020TGTCGGGATT TTAGGTGGTG GCCAACTTGG TCGTATGATC GTTGAAGCTG CACACAGATT 1080GAATATCAAA ACTGTGATTC TCGAAAATGG AGACCAGGCT CCAGCAAAGC AAATCAACGC 1140TTTAGATGAC CATATTGACG GCTCATTCAA TGATCCAAAA GCAATTGCCG AATTGGCTGC 1200CAAGTGTGAT GTTTTAACCG TTGAGATTGA ACATGTTGAC ACTGATGCGT TGGTTGAAGT 1260TCAAAAGGCA ACTGGCATCA AAATCTTCCC ATCACCAGAA ACTATTTCAT TGATCAAAGA 1320TAAATACTTG CAAAAAGAGC ATTTGATTAA GAATGGCATT GCTGTTGCCG AATCTTGTAG 1380TGTTGAAAGT AGCGCAGCAT CTTTAGAAGA AGTTGGTGCC AAATACGGCT TCCCATACAT 1440GCTAAAATCT AGAACAATGG CCTATGACGG AAGAGGTAAT TTTGTTGTCA AAGACAAGTC 1500ATATATACCT GAAGCTTTGA AAGTTTTAGA TGACAGGCCG TTATACGCCG AGAAATGGGC 1560TCCATTTTCA AAGGAGTTAG CTGTTATGGT TGTGAGATCA ATCGATGGCC AAGTTTATTC 1620CTACCCAACT GTTGAAACCA TCCACCAAAA CAACATCTGT CACACTGTCT TTGCTCCAGC 1680TAGAGTTAAC GATACTGTCC AAAAGAAGGC CCAAATTTTG GCTGACAACG CTGTCAAATC 1740TTTCCCAGGT GCTGGTATCT TTGGTGTTGA AATGTTTTTA TTACAAAATG GTGACTTATT 1800AGTCAACGAA ATTGCCCCAA GACCTCACAA TTCTGGTCAC TATACCATCG ACGCTTGTGT 1860CACCTCGCAA TTTGAAGCTC ATGTTAGGGC CATTACTGGT CTACCCATGC CGAAGAACTT 1920CACTTGTTTG TCGACTCCAT CTACCCAAGC TATTATGTTG AACGTTTTAG GTGGCGATGA 1980GCAAAACGGT GAGTTCAAGA TGTGTAAAAG AGCACTAGAA ACTCCTCATG CTTCTGTTTA 2040CTTATACGGT AAGACTACAA GACCAGGCAG AAAAATGGGT CACATTAATA TAGTTTCTCA 2100ATCAATGACT GACTGTGAGC GTAGATTACA TTACATAGAA GGTACGACTA ACAGCATCCC 2160TCTCGAAGAA CAGTACACTA CAGATTCCAT TCCGGGCACT TCAAGCAAGC CATTAGTCGG 2220TGTCATCATG GGTTCCGATT CGGACCTACC AGTCATGTCT CTAGGTTGTA ATATATTGAA 2280GCAATTTAAC GTTCCATTTG AAGTCACTAT CGTTTCCGCT CATAGAACCC CACAAAGAAT 2340GGCCAAGTAT GCCATTGATG CTCCAAAGAG AGGGTTGAAG TGCATCATTG CTGGTGCTGG 2400TGGTGCCGCT CATTTACCGG GAATGGTTGC GGCGATGACG CCGCTGCCTG TTATTGGTGT 2460CCCTGTTAAA GGCTCTACTT TGGATGGTGT TGATTCACTA CACTCCATCG TTCAAATGCC 2520AAGAGGTATT CCTGTTGCTA CTGTGGCTAT TAACAATGCT ACTAACGCTG CCTTGCTAGC 2580TATCACAATC TTAGGTGCCG GCGATCCAAA TACTTGTCTG CAATGGAAGT TTATATGAAC 2640AATATGGAAA ATGAAGTTTT GGGCAAGGCT GAAAAATTGG AAAATGGTGG ATATGAAGAA 2700TACTTGAGTA CATACAAGAA GTAGAACCTT TTATATTTGA TATAGTACTT ACTCAAAGTC 2760TTAATTGTTC TAACTGTTAA TTTCTGCTTT GCATTTCTGA AAAGTTTAAG ACAAGAAATC 2820TTGAAATTTC TAGTTGCTCG TAAGAGGAAA CTTGCATTCA AATAACATTA ACAATAAATG 2880ACAATAATAT ATTATTTCAA CACTGCTATA TGGTAGTTTT ATAGGTTTGG TTAGGATTTG 2940AGATATTGCT AGCGCTTATC ATTATCCTTA ATTGTTCATC GACGCAAATC GACGCATTTC 3000CACAAAAATT TTCCGAACCT GTTTTTCACT TCTCCAGATC TTGGTTTAGT ATAGCTTTTG 3060ACACCTAATA CCTGCAG 3077(2)關于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3386個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假擬無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:GAATTCCTGC AGCCCGGGGG ATCGGGTAGT GGAATGCACG GTTATACCCA CTCCAAATAA 60AAGTGTAGTA GCCGGACTGA AAGGTTTTAG GAGTCTGTTT GTTTGTTCAT GTGCATCATT120CCCTAATCTG TTAACAGTCT CGGAGTATAC AAAAAAGTAA GTCAAATATC AAGGTGGCCG180GGGGCAGCAT CGAGACTCGA GATGGTACAT ACTTAAAAGC TGCCATATTG AGGAACTTCA240AAGTTTTATC TGTTTTTAGA ATTAAAAGAC GATTGTTGTA ACAAAACGTT GTGCCTACAT300AAACTCAAAT TAATGGAAAT AGCCTGTTTT GAAAAATACA CCTTCTTAAG TACTGACAAA360GTTTTGTTAA ATGACTATCG AACAAGCCAT GAAATAGCAC ATTTCTGCCA GTCACTTTTA420ACACTTTCCT GCTTGCTGGT TGACTCTCCT CATACAAACA CCCAAAAGGG AAACTTTCAG480TGTGGGGACA CTTGACATCT CACATGCACC CCAGATTAAT TTCCCCAGAC GATGCGGAGA540CAAGACAAAA CAACCCTTTG TCCTGCTCTT TTCTTTCTCA CACCGCGTGG GTGTGTGCGC600AGGCAGGCAG GCAGGCAGCG GGCTGCCTGC CATCTCTAAT CGCTGCTCCT CCCCCCTGGC660TTCAAATAAC AGCCTGCTGC TATCTGTGAC CAGATTGGGA CACCCCCCTC CCCTCCGAAT720GATCCATCAC CTTTTGTCGT ACTCCGACAA TGATCCTTCC CTGTCATCTT CTGGCAATCA780GCTCCTTCAA TAATTAAATC AAATAAGCAT AAATAGTAAA ATCGCATACA AACGTCATGA840AAAGTTTTAT CTCTATGGCC AACGGATAGT CTATCTGCTT AATTCCATCC ACTTTGGGAA900CCGCTCTCTC TTTACCCCAG ATTCTCAAAG CTAATATCTG CCCCTTGTCT ATTGTCCTTT960CTCCGTGTAC AAGCGGAGCT TTTGCCTCCC ATCCTCTTGC TTTGTTTCGG TTATTTTTTT 1020TTCTTTTGAA ACTCTTGGTC AAATCAAATC AAACAAAACC AAACCTTCTA TTCCATCAGA 1080TCAACCTTGT TCAACATTCT ATAAATCGAT ATAAATATAA CCTTATCCCT CCCTTGTTTT 1140TTACCAATTA ATCAATCTTC AAATTTCAAA TATTTTCTAC TTGCTTTATT ACTCAGTATT 1200AACATTTGTT TAAACCAACT ATAACTTTTA ACTGGCTTTA GAAGTTTTAT TTAACATCAG 1260TTTCAATTTA CATCTTTATT TATTAACGAA ATCTTTACGA ATTAACTCAA TCAAAACTTT 1320TACGAAAAAA AAATCTTACT ATTAATTTCT CAAAATGGCT ATTCCAGATG AATTTGATAT 1380TATTGTTGTC GGTGGTGGTT CCACCGGTTG TGCTCTTGCT GGTAGATTAG GTAACTTGGA 1440CGAAAACGTC ACAGTTGCTT TAATCGAAGG TGGTGAAAAC AACATCAACA ACCCATGGGT 1500TTACTTACCA GGTGTTTATC CAAGAAACAT GAGATTAGAC TCAAAGACTG CTACTTTTTA 1560CTCTTCAAGA CCATCACCAC ACTTGAACGG TAGAAGAGCT ATTGTTCCAT GTGCTAACAT 1620CTTGGGTGGT GGTTCTTCCA TCAACTTCTT GATGTACACC AGAGCCTCTG CCTCCGATTA 1680CGATGATTGG GAATCTGAAG GTTGGACTAC CGATGAATTA TTACCACTAA TGAAGAAGAT 1740TGAAACTTAT CAAAGACCAT GTAACAACAG AGAATTGCAC GGTTTCGATG GTCCAATTAA 1800GGTTTCATTT GGTAACTATA CTTATCCAAA CGGTCAAGAT TTCATTAGAG CTGCCGAATC 1860TCAAGGTATT CCATTTGTTG ATGATGCTGA AGATTTGAAA TGTTCCCACG GTGCTGAGCA 1920CTGGTTGAAG TGGATCAACA GAGACTTAGG TAGAAGATCC GATTCTGCTC ATGCTTACAT 1980TCACCCAACC ATGAGAAACA AGCAAAACTT GTTCTTGATT ACTTCCACCA AGTGTGAAAA 2040GATTATCATT GAAAACGGTG TTGCTACTGG TGTTAAGACT GTTCCAATGA AGCCAACTGG 2100TTCTCCAAAG ACCCAAGTTG CTAGAACTTT CAAGGCTAGA AAGCAAATTA TTGTTTCTTG 2160TGGTACTATC TCATCACCAT TAGTTTTGCA AAGATCTGGT ATCGGTTCCG CTCACAAGTT 2220GAGACAAGTT GGTATTAAAC CAATTGTTGA CTTACCAGGT GTTGGTATGA ACTTCCAAGA 2280TCACTACTGT TTCTTCACTC CATACCATGT CAAGCCAGAT ACTCCATCAT TCGATGACTT 2340TGTTAGAGGT GATAAAGCTG TTCAAAAATC TGCTTTCGAC CAATGGTATG CTAACAAGGA 2400TGGTCCATTA ACCACTAATG GTATTGAGGC AGGTGTTAAG ATTAGACCAA CTGAAGAAGA 2460ATTAGCCACT GCTGATGACG AATTCAGAGC TGCTTATGAT GACTACTTTG GTAACAAGCC 2520AGATAAGCCA TTAATGCACT ACTCTCTAAT TTCTGGTTTC TTTGGTGACC ACACCAAGAT 2580TCCAAACGGT AAGTACATGT GCATGTTCCA CTTCTTGGAA TATCCATTCT CCAGAGGTTT 2640CGTTCACGTT GTTTCTCCAA ACCCATACGA TGCTCCTGAC TTTGATCCAG GTTTCATGAA 2700CGATCCAAGA GATATGTGGC CAATGGTTTG GTCTTACAAG AAGTCCAGAG AAACTGCCAG 2760AAGAATGGAC TGTTTTGCCG GTGAAGTTAC TTCTCACCAC CCACACTACC CATACGACTC 2820ACCAGCCAGA GCTGCTGACA TGGACTTGGA AACTACTAAA GCTTATGCTG GTCCAGACCA 2880CTTTACTGCT AACTTGTACC ACGGTTCATG GACTGTTCCA ATTGAAAAGC CAACTCCAAA 2940GAACGCTGCT CACGTTACTT CTAACCAAGT TGAAAAACAT CGTGACATCG AATACACCAA 3000GGAGGATGAT GCTGCTATCG AAGATTACAT CAGAGAACAC ACTGAAACCA CATGGCATTG 3060TCTTGGTACT TGTTCAATGG CTCCAAGAGA AGGTTCTAAG GTTGTCCCAA CTGGTGGTGT 3120TGTTGACTCC AGATTAAACG TTTACGGTGT TGAAAAGTTG AAGGTTGCTG ATTTATCAAT 3180TTGCCCAGAT AATGTTGGTT GTAACACTTA CTCTACTGCT TTGTTAATCG GTGAAAAGGC 3240TTCTACCTTA GTTGCTGAAG ACTTGGGCTA CTCTGGTGAT GCTTTGAAGA TGACTGTTCC 3300AAACTTCAAA TTGGGTACTT ATGAAGAAGC TGGTCTAGCT AGATTCTAGG GCTGCCTGTT 3360TGGATATTTT TATAATTTTT GAGAGT3386(2)關于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TGATCACCTA GGACTAGTGA CAAGTAGGAA CTCCTGTA 38(2)關于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CAGCTGCCTA GGACTAGTTT CCTCTTACGA GCAACTAGA 39(2)關于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TGGTTGAAGT GGATCAA 17(2)關于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GTGTGGTCAC CGAAGAA 17(2)關于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅶ)直接來源(B)克隆ZC9885(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GTTGTTCCTT CCAAACCATT GAAC 24(2)關于SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線型(ⅶ)直接來源(B)克隆ZC9883(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:AAAGTAAGAA GCGTAGCCTA GTTG 24(2)關于SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度329個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GACCATGATT ACGCCAAGCG CGCAATTAAC CCTCACTAAA GGGAACAAAA GCTGGGTACC 60GGGCCCCCCC TCGAGGTCGA CGGTATCGAT AAGCTTTATT ATAACATTAA TATACTATTT120TATAACAGGA TTGAAAATTA TATTTATCTA TCTAAAACTA AAATTCAAAA TGGCTATTCC180TGAAGAATTC GATATCATTG TTGTCGGTGG TGGTTCTGCC GGCTGTCCTA CTGCTGGTAG240ATTGGCTAAC TTAGACCCAA ATTTAACTGT TGCTTTAATC GAAGCTGGTG AAAACAACAT300TAACAACCCA TGGGTCTACT TACCAGGCG 329
權利要求
1．一種制備具有營養缺陷型突變的甲醇畢赤酵母細胞的方法，該方法包含(a)暴露甲醇畢赤酵母細胞于誘變條件下；(b)在豐富培養基中培養得自步驟(a)的細胞，從而使得突變在至少一部分細胞中得到建立和復制；(c)在可同化的氮不足的培養基中培養得自步驟(b)的細胞，從而耗盡細胞的氮儲備；(d)在確定成分培養基中培養得自步驟(c)的細胞，以選擇營養基因缺損的細胞，其中的培養基包含無機氮源和足以殺死生長甲醇畢赤酵母細胞的量的制霉菌素；(e)在豐富培養基中培養得自步驟(d)的選擇的細胞。
2．按照權利要求1的方法，其中將得自步驟(e)的選擇的細胞復制鋪板于確定成分培養基中，并培養該細胞以確定營養缺陷型突變的存在。
3．按照權利要求1的方法，其中所選擇的細胞屬于腺嘌呤的營養缺陷型。
4．按照權利要求3的方法，其中所選擇的細胞缺乏磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶。
5．按照權利要求1的方法，其中的確定成分培養基包含2mg/L制霉菌素。
6．按照權利要求1的方法，其中的誘變條件包括暴露在紫外光線下。
7．按照權利要求1的方法，其中的誘變條件包括暴露在化學誘變劑下。
8．按照權利要求1的方法，其中的無機氮源包括銨離子。
9．按照權利要求8的方法，其中的無機氮源是硫酸銨。
全文摘要
本發明公開了制備具有營養缺陷型突變的甲醇畢赤酵母細胞的方法，該方法包含步驟(a)暴露甲醇畢赤酵母細胞于誘變條件下；(b)在豐富培養基中培養得自步驟(a)的細胞，從而使得突變在至少一部分細胞中得到建立和復制；(c)在可同化的氮不足的培養基中培養得自步驟(b)的細胞，從而耗盡細胞的氮儲備；(d)在確定成分培養基中培養得自步驟(c)的細胞，以選擇營養基因缺損的細胞，其中的培養基包含無機氮源和足以殺死生長甲醇畢赤酵母細胞的量的制霉菌素；(e)在豐富培養基中培養得自步驟(d)的選擇的細胞。
文檔編號C12N15/01GK1238806SQ97197503
公開日1999年12月15日 申請日期1997年7月14日 優先權日1996年7月17日
發明者C·K·雷蒙德 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司