專利名稱：木薯葉脈花葉病毒啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于產生轉基因植物的組合物和方法。具體地說，本發明涉及植物病毒(CsVMV)啟動子序列和含CsVMV啟動子序列的表達盒。本發明也涉及含有可操作性連接到異源DNA序列的CsVMV啟動子序列的載體及轉基因植物。另外，本發明涉及采用含CsVMV啟動子序列的載體產生轉基因植物的方法。
背景技術：
分離的植物病毒啟動子可用于植物基因工程，以產生具有所需要表型特征的轉基因植物。為了產生這類轉基因植物，將分離的啟動子插入到載體并與異源DNA序列操作性連接。然后以多種方式，用含與異源DNA序列融合的分離啟動子的DNA構建物轉化植物細胞。這種轉化的結果是，與異源DNA可操作連接的啟動子插入到轉化植物細胞的基因組。此外，在轉化植物細胞中，異源DNA表達的調節受該啟動子的控制。
根據偶聯到分離啟動子的異源序列的性質，有多種不同的用于在轉基因植物中產生需要表型的方法。例如，在植物或植物的特定組織中表達通常不表達的新基因可以賦予表型改變。另一方面，導入轉基因植物的有義或反義構建物的表達可以引起內源植物基因表達的抑制。這種表達抑制可以依次產生需要的表型變化。
需要多種不同的用于植物基因工程的啟動子。這些啟動子有幾種類型。組成型啟動子為普遍使用類型啟動子。組成型啟動子為能夠在正常發育的整個過程中、在植物所有組織中表達操作連接的DNA序列的啟動子。與組成型啟動子相反，組織特異型啟動子為能夠在某些植物組織中選擇性表達異源DNA序列的啟動子。啟動子也可以是誘導型的，例如應用外源誘導劑誘導。組織型、誘導型和組織特異型啟動子用于植物基因工程，且在該領域具有許多不同潛在的應用價值。
組成型植物啟動子可以通過分離組成性表達的植物操縱子的調節區而獲得。除了從植物基因獲得啟動子外，也有用于在植物組織組成性表達新序列的細菌和病毒啟動子。得自細菌的這類啟動子的實例包括章魚堿合酶(ocs)啟動子、胭脂堿合酶(nos)啟動子和其它得自天然Ti質粒的啟動子(參見Herrera-Estrella等，Nature,303:209-213,1983)。花椰菜花葉病毒的35S和19S啟動子是普遍使用的病毒啟動子實例(參見Odel等，Nature,313:810-812,1985)。
與組成型啟動子相反，組織特異性啟動子一般是從在特定植物組織選擇性表達的植物基因的調節啟動子區分離獲得的。這些啟動子可以與異源DNA序列融合并用來轉化植物細胞，以產生在特定組織選擇性表達異源DNA的轉基因植物。例如，得自果實特異性乙烯調節基因E4和E8，以及得自果實特異性的聚半乳糖醛酸酶基因的啟動子區已經用來指導異源DNA序列在轉基因番茄植物中的果實特異性的表達。(參見Cordes等，Plant Cell,1；1025-1034,1989；Deikman等，EMJO J,7；3315-3320,1988；和Della Penna等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:6420-6424,1986)。
已經描述了幾種不同植物病毒的各方面特征，包括基因組克隆、分子特征記述及序列分析、以及啟動子描述，所述植物病毒包括花椰菜花葉病毒(CaMV),Hull，載于“病毒分類學(Virus Taxonomy)”,Murphy等編輯，Wein,New York,Springer-Verlag，第189-192頁，1995；鴨跖草黃斑點病毒(ComYMV),Medberry等，Nuc.Acid Res,18:5505-5513,1990；東格魯水稻桿菌狀病毒(RTBV),Hay等，Nuc.Acids Res,19:2615-2621,1991；甘蔗桿菌狀病毒(ScBV),Bouhida等，J.Gen.Virol,74:15-22,1993；大豆褪綠斑點病毒(SbCMV),Hasegawa等，Nuc.Acids Res,17:9993-10013,1989；玄參花葉病毒(FMV),Richins等，Nuc.Acids Res,15:8451-8466,1987；香石竹蝕環斑病毒(CERV),Hull等，EMBO J,5:3083-3090,1986；花生褪綠條斑病毒(PCSV),Reddy等，Phytopathol.,83:129-133,1993；草莓嵌脈病毒(SVBV)，基因庫登記號X97304；和可可樹腫枝病毒(CSSV)，基因庫登記號L14546。
Calvert等(J.Gen.Virol.,76:1271-1276,1995)描述了木薯葉脈花葉病毒(以前稱為CVMV，現在稱為CsVMV)，且也作為基因庫登記號U59751和U20341公開了序列資料。另外，最近Verdaguer等(Plant Mol.Biol.,31:1129-1139,1996)描述了CsVMV啟動子。
希望發現新組成型啟動子和新組織特異型啟動子用來控制工程操作到轉基因植物的不同核酸序列的表達。植物基因工程有許多有價值的潛在用途。為了實現這些潛在用途，可望有多種具有不同特性和在不同植物種中均有效的植物啟動子。
發明概述現在已經克隆并分子特征鑒定了得自CsVMV的啟動子，該啟動子可以作為異源基因表達啟動子用于各種轉基因植物細胞類型。該CsVMV啟動子和本文所述衍生啟動子提供各種各樣的優點和利益。
表明所述啟動子在單子葉植物種和雙子葉植物種中均有活性，因此可容易地用于各種栽培作物。盡管本文所述的衍生啟動子一般是組成型的，但是它們包括能夠以組織特異性方式調節表達的啟動子，所以可用于以組織特異性方式控制異源基因的表達。
因此在一個實施方案中，本發明設想一種分離核酸分子，它包含能夠在植物細胞中起始轉錄的操作連接異源核酸序列的啟動子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO 3(pA)中所示的木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的18個連續核苷酸的同一性至少為80％。
推薦的核酸分子包括選自CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、PΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的核酸序列。
也設想了一種包含操作連接到異源核酸序列的本發明啟動子序列的載體。也描述了包含操作連接到異源核酸序列的啟動子的嵌合基因。
本發明還設想了一種包含操作連接到異源核酸序列的本發明啟動子核苷酸序列的轉基因植物。
本發明也描述了在植物細胞表達異源核酸序列的方法，包括a)用本發明的載體轉化植物細胞，以及b)在異源核酸在植物細胞表達的條件下培養植物細胞。
基于本文說明書，其它優點和好處對于本領域技術人員而言是淺顯明白的。
附圖簡述在形成本發明一部分的附圖中
圖1圖解說明CsVMV病毒基因組中的CsVMV啟動子的結構和含有實施例1所述的或者CVP1或CVP2 CsVMV啟動子片段的uidA融合基因的構建。啟動子片段的位置用數字標記在CsVMV基因組DNA中。用AluI限制位點分離CVP1片段，而CVP2片段采用所述引物通過PCR擴增獲得，CVP2在5’末端多75個核苷酸，而在3’末端多52個核苷酸。CVP2的3’末端剛好是病毒基因組的第一個ATG密碼子的上游。也指明了轉錄起始位點(“Tsp”，右向箭頭)和共有tRNA結合位點(“tRNAmet”)的位置。示意圖未按比例畫出。
圖2圖釋確定如實施例2中所述的CsVMV啟動子的轉錄起始位點。按所述方法進行引物延伸反應，用兩種退火溫度(30℃和40℃)獲得的延伸反應產物和用同一種標記引物進行的CVP1-uidA基因構建物(A、C、G和D道)的參比測序反應產物在7M尿素、7.5％聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。顯示了正鏈DNA序列(凝膠上顯示的序列的互補序列)，核苷酸(nt.)7604號的箭頭指出轉錄起始位點(A*)。數字對應于CsVMV基因組的核苷酸序列標號，Calvert等，J Gen Virol,76:1271-1276,1995。
圖3圖釋也在SEQ ID NO 3顯示的CsVMV啟動子區域的核苷酸序列，包括在實施例2中所述的CVP1和CVP2啟動子片段。采用不同于基因組序列編號系統的以轉錄為基礎的編號系統，轉錄起始位點稱為+1。框注了共有TATA框(類as1序列)(Lam等，Proc.Natl.Acad of Sci USA,86:7890-7894,1989)和與ComYMV啟動子同源的區(Medberry等，PlantJ,6129-626,1993)。AluⅠ位點(箭頭)指示CVP1啟動子的3’和5’末端。下劃線的是類似于先前特征鑒定的植物啟動子中順式元件的序列基元(指示了類似于rbcS啟動子的框I元件(Donald等，EMBO J,9:1717-1726,1990)、MNF1結合位點(Yanagisawa等，Plant Mol Biol,19:545-553,1992)、SV40核心增強子(Ondek等，EMBO J,6:1017-1025,1987)的基元。
圖4圖示CsVMV基因組結構與實施例2中所述的花椰菜花葉病毒和badnaviruses病毒基因組的比較。所有圖譜均從基因間隔區的起始位點開始。編碼類似推定功能的多個或一個ORF區段用垂直線連接。數字“1”指示DNA復制起點。
:MP活性位點；◆:RT活性位點；《:TAV活性中心；]:RNA結合位點；◇:PR活性位點；
:RNA酶H共有序列。
圖5圖釋在實施例7a)所述的煙草和木薯原生質體中的CsVMV啟動子的表達。通過電穿孔將嵌合uidA基因構建物與表達熒光素酶的質粒共導入木薯(點狀條帶)和煙草(交叉影線條帶)原生質體中。啟動子活性以同一蛋白質提取物的GUS活性和LUC活性的比率表示。GUS活性測定結果為每單位發射光每小時pmol 4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-D-葡糖苷酸。條帶代表四次獨立實驗的平均值+/-標準差。用不同原生質體制品進行每一次實驗。pe35GN是一種構建物，該構建物中“強化的”35S啟動子(Kay等，Science,236:1299-1302,1987)控制uidA基因的轉錄。pGN100是含無啟動子的uidA基因的對照質粒。
圖6A-6J圖示如實施例7b)所述的在含有CsVMV啟動子uidA嵌合基因的轉基因煙草和水稻植株中GUS表達的組織化學定位。在用X-Gluc染色后通過深靛藍染料沉積顯示GUS活性。A煙草葉切片；B顯示中脈維管組織的煙草葉切片祥圖(×10)；C穿過煙草葉片的橫向切片(×30)；D煙草莖橫截面切片中的維管組織(×30)；E煙草根(×10)；F穿過煙草子房的橫向切片(×10)；G水稻葉橫截面切片(×50)；H稻葉鞘的橫截面切片(×50)；I軸向剖開并隨后染色以顯示GUS活性的水稻花(×10)；J:GUS在自體外小植株的木薯莖上的瞬時表達。bs維管束鞘；cy綠色組織；ep外生韌皮部；ip內生韌皮部；mx后生木質部；p韌皮部；ph髓；pm柵欄葉肉；pp韌皮薄壁組織；py薄壁組織；rt根尖；sc厚壁組織；sm葉肉；x木質部；cp木薄壁組織。
圖7A和7B圖示如實施例7b)所述的煙草(A)和水稻(B)轉基因植物品系的不同器官組織中CsVMV/uidA嵌合基因表達的GUS活性的量分布。具體的GUS活性表示為每分鐘每毫克蛋白pmol的4-甲基傘形酮(4MU)。檢測在含有嵌合基因中的或者CVP1(實心點)或者CVP2(空心點)的轉基因煙草或水稻品系的不同器官組織的GUS活性，所述器官組織是3-5cm長的幼葉(Y)、長10cm或10cm以上的成熟葉(M)、莖(S)、根(R)和葉鞘外植體(ST)。用于蛋白提取的樣品取自生長在溫室的成熟(5-7周齡)R1轉基因煙草植株。所用的水稻植株是生長在溫室的R0轉化體(2月齡)。每一點代表單個獨立轉基因系。實驗的品系數標示在圖中。實心箭頭指示不同器官和每一構建物的GUS活性的平均水平。對數刻度用來容納不同品系間的大變異。
圖8簡略圖示按實施例9所述制備的不同嵌合CsVMV啟動子/uidA基因融合表達構建物。含有不同所述構建物和5’末端終點和構建物內部缺失的不同質粒的名稱表示在圖的左側。內部缺失用符號“Δ”表示。pA含有圖3中圖示的全長的CsVMV啟動子。所有5’末端缺失的啟動子均在其5’末端具有BamHⅠ位點。內部缺失通過BanHⅠ連接5’末端截短的啟動子和3’末端缺失的啟動子片段產生。
圖9A-9I圖示實施例10b)所述的含有CsVMV啟動子/uidA嵌合基因缺失構建物的轉基因煙草植株中GUS表達的組織化學定位。所有圖(除了圖H和I)均是5周齡轉基因煙草植株的展開的嫩葉的橫截面切片。a)pB；b)pD；c)pE；d)pΔC；e)pΔD1；f)pΔDEl；g)pΔDE2；h)得自攜帶pB構建物(右)或pD構建物(左)的10天齡轉基因的葉子；I)自含有pC構建物(頂部)或pD構建物(底部)的轉基因煙草植株的根。m葉肉；v葉脈；py薄壁組織；RT根尖。
圖10圖示如實施例10c)所述的在轉基因煙草葉中由CsVMV啟動子/uidA嵌合基因缺失構建物表達的GUS酶活性。蛋白從5周齡轉基因植物的展開的嫩葉收集的葉片中提取。對于每一種構建物。檢測6-10種獨立的轉基因系的GUS活性。數據如圖7中所述方法表示。每一種植物的結果用空心點標示。每一種不同的啟動子構建物分別標示。其中的平均GUS水平用垂直箭頭標示。對數刻度用來容納轉基因系間的大變異。
圖11圖示如實施例10e)所述在BY-2(交叉陰影條帶)和葉肉(斜條紋條帶)原生質體中的CsVMV啟動子/uidA嵌合基因構建物的瞬時GUS表達。從BY-2細胞懸液或煙草葉制備的電穿孔的原生質體在培養24小時后用于分析GUS活性。所標示的不同啟動子構建物與作內標準品的熒光素酶質粒進行共轉染。將GUS表達水平相對于熒光術酶表達歸一化，并表示為相對于采用全長啟動子活性的GUS表達的百分率，其中設定構建物pA為100％值。每一條帶各自代表四次獨立實驗的平均值，并也標明+/-標準誤。
圖12圖示說明如實施例11中所述的CsVMV啟動子的功能圖譜。數字用圖3的轉錄起始位點記數系統指示相對位置和特征。垂直箭頭指示組織特異性功能，同時通過箭頭的相對大小指示對該功能相對重要的結構域。圖頂部的箭頭代表實施例11中討論的協同相互作用。鑒別出基元asl、GAGA和GTAA，它們并在啟動子調節功能中起作重要的作用。本發明的詳細說明A．定義本文所用的術語“核酸”是指或者DNA或者RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”指從5’末端到3’末端閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈多聚體。它包括自我復制型質粒、感染性DNA或RNA多聚體和非功能性DNA或RNA。在本文所用的多核苷酸符號標示中除非特別的說明，否則，單鏈多核苷酸序列的左手末端是5’末端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向是指5’端方向。
術語“啟動子”指翻譯起始密碼子的DNA上游區，它參與識別和結合RNA多聚酶和起始轉錄的其它蛋白質。“植物啟動子”是能夠在植物細胞起始轉錄的啟動子。本文所用的術語“CsVMV植物啟動子”或“CsVMV啟動子”指得自CsVMV基因組的啟動子區的啟動子，并如本文進一步定義的。
本文所用的術語“組成型啟動子或組成型植物啟動子”指能夠在正常發育過程中在植物的所有組織或幾乎所有組織中表達操作性連接的DNA序列的植物啟動子。本文所用的術語“誘導型啟動子”或“誘導型植物啟動子”指能夠對內源或外源刺激反應、在特定時間或特定組織中選擇性表達操作性連接的DNA序列的植物啟動子。
本文所用的術語“組織特異性啟動子”指能夠在特定組織中選擇性表達操作性連接的DNA序列。這意味著操作性連接的DNA序列的表達在一種或幾種植物組織中較在該植物其它組織中的表達更高。例如，存在于構建物pΔDE1的CsVMV啟動子是在根尖組織中選擇性表達操作性連接的異源DNA序列的組織特異性啟動子。
本文所用的術語“操作性的或可操作連接的”指將啟動子相對于異源核酸序列在5’末端連接，使得該啟動子介導連接DNA序列的轉錄。當然，該啟動子序列也含有轉錄起始密碼子和翻譯起始密碼子間的轉錄序列。
詞組“表達盒”指能夠在與所述序列相容的宿主中指導核酸序列或結構基因表達的核苷酸序列。這種盒至少包括啟動子和轉錄終止信號。如本文所述，也可以采用在有效的表達中必需或有輔助作用的其它因子。
術語“載體”是指表達系統，即基于核酸的穿梭載體、用于核酸傳遞的核酸分子和自主自我復制型環狀DNA(例如質粒、粘粒、噬菌體等等)。當重組微生物或細胞培養物描述為“表達載體”的宿主時，這包括染色體外的環狀DNA(例如線粒體DNA或葉綠體)、已經摻入到宿主染色體的DNA或以上二者。當載體由宿主細胞保持時，所述載體可以或者作為摻入在宿主的基因組中的自主結構在有絲分裂期間由所述細胞穩定復制，或者保持在宿主的核或胞質中。
術語“質粒”指能夠在細胞中復制的自主環狀DNA分子，包括表達和非表達兩種類型。當重組的微生物或細胞培養物描述為“表達載體”的宿主時，這包括染色體外的環狀DNA分子和已經摻入到宿主染色體的DNA。當質粒由宿主細胞保持時，該質粒或者作為自主結構在有絲分裂中由該細胞穩定復制，或者摻入到宿主的基因組中。
本文所用的“異源序列”、“異源DNA序列”或“異源核酸序列”是來源于外源(或種)序列，或者假如是同一來源，則是由原形式修飾后的序列。因此，操作連接到啟動子的外源DNA編碼序列源自不同于衍生啟動子的序列或者，假如是與啟動子是同一來源，外源DNA編碼序列是由其原始形式修飾后的序列。可以對異源DNA序列進行修飾，例如用限制酶處理該DNA，以產生能夠操作連接到所述啟動子的DNA片段。用諸如定點誘變的技術可以進行修飾。
詞組“選擇性雜交到”是指當靶序列存在于制備物中或總細胞DNA或RNA時，僅在特定靶DNA或RNA序列的核酸探針上雜交、形成雙鏈體或結合。“互補的”或“靶”核酸序列指那些選擇性雜交到核酸探針的核酸序列。適當的退火條件取決于例如探針的長度、溫度、堿基組成和錯配數及其探針上的位置，且通常必須根據實驗確定。為了討論核酸探針的設計和退火條件，參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(第二版)，第1-3卷，冷泉港實驗室，(1989)；或者CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等，編輯，Green Publishingand Wiley-Interscience，紐約(1987)。
詞組“編碼的…核酸序列”指編碼用于表達特定蛋白、肽、或核酸的核酸。所述核酸序列包括轉錄成RNA的DNA鏈序列和翻譯成蛋白質的RNA序列。所述核酸序列包括全長的核酸序列及得自全長序列的非全長序列。另外不用說，該序列包括天然序列或可以導入以在特定宿主細胞種提供密碼子優先的序列的簡并密碼子。
術語“分離的”當指核酸序列或分子時是指這樣的主題核酸，它們不含有天然存在的相鄰相應物序列，例如在CsVMV基因組的環境下的CsVMV啟動子，而是從CsVMV基因組的其它部分操作分離或與異源序列重組的。
詞組“大致純的”當指核酸時，是指主題核酸是從其生物學來源純化的且是已獲得的組合物中的主要分子類型，相對于諸如蛋白質、糖、脂類等之類的其它物質，主題核酸優選為至少50％純度，更優選的是至少為90％純度的核酸。
術語“植物”包括完整植物、植物器官(例如葉、莖、根等等)、種子和植物細胞及其子代。可用于本發明方法的植物類別一般與可用于轉化技術的高等植物一樣廣泛，包括單子葉的(單子葉植物)和雙子葉的(雙子葉植物)植物。它包括不同倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體的植物。
術語“轉基因植物”指通過基因工程技術產生的植物。例如，用含有操作連接到異源DNA序列的CsVMV啟動子的載體轉化的植物細胞可以用來產生具有改變表型特征的轉基因植物。
下列術語用來描述兩種或兩種以上核酸或多核苷酸之間的序列關系“參比序列”、“比較窗口”、“序列同一性”、“序列相同的百分率”和“大致相同”。“參比序列”是定義用作序列比較的基準的序列；參比序列可以是較大序列的子序列(subset)，例如為在諸如核酸序列的序列表中給出的全長基因序列的區段，或者可以包含完整的基因序列。
可以進行用于對齊比較窗口的最佳序列對齊，方法有Smith等(Adv.Appl.Math.,2:482,1981)的局部同源性算法、Needleman等(J.Mol.Biol.,48:443,1970)的同源性對比算法、Pearson等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),85:2444,1988)的相似性檢索或這些算法的計算機實現(Wisconsin Genetics軟件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)。本文描述了其它方法。
用于核酸序列和用在本文的術語“大致相同”或“大致序列相同”表示多核苷酸序列的特性，其中與至少有20個核苷酸位置的比較窗口、通常至少有25-50個核苷酸的參比序列比較，所述多核苷酸包含的序列至少有85％的序列相同，優選至少有90-95％的序列相同，更優選至少有99％的序列相同；其中的序列相同的百分率的測算是通過比較參比序列和可能含有缺失或增加的多核苷酸，所述缺失或增加總計為在比較窗口范圍內的參比序列的20％或更少。參比序列可以是較大序列的子序列，例如為本文公開的CsVMV啟動子區域的區段。
B．木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子本發明提供CsVMV啟動子和含有操作連接到異源核酸序列的CsVMV啟動子的DNA構建物。CsVMV啟動子是一種啟動子核苷酸序列，當它存在于能夠支持轉錄的轉錄媒介(例如在植物細胞、植物或本文所述的類似環境中)中時能夠啟動異源核酸序列的轉錄。所述啟動子啟動操作性連接到該啟動子的異源核酸的轉錄。
用在本文的“CsVMV啟動子”包括本文鑒定的野生型CsVMV啟動子、其片段(例如本文所述的CVP1和CVP2片段)、其衍生體(例如本文所述的缺失構建物)，所有這些序列的共同特征是含有得自本文所述和在SEQ ID NO 3中顯示的全長CsVMV啟動子序列的核苷酸序列推薦的CsVMV啟動子是至少有80％核苷酸與在SEQ ID NO 3中顯示的CsVMV啟動子的18個連續核苷酸相同的核苷酸序列。優選的是，所述同一性至少是90％，更優選為至少98％。優選的是同一性存在于20個連續的核苷酸中，更優選的是存在于25個連續的核苷酸中。同一性百分率是測定與特定長度的靶核酸序列比較，非間斷的線性(即連續的)核苷酸序列中相同的核苷酸的數目。
本文所用的核苷酸序列的“同一性”是指在兩種各自獨立的序列中所比較的核苷酸殘基是相同的。因此，100％同一性是指，例如在比較兩種不同分子的25個連續核苷酸時，所有25對所比較的核苷酸的殘基是相同的。
轉錄媒介可以是植物生物技術領域熟知的許多環境中任何一種，因此不必受限制。然而，典型的和推薦的媒介包括用含有主題啟動子的核酸轉化的植物細胞，例如培養的植物細胞、植物原生質體、或其它的植物組織培養物構型(configuration)、未分化的植物細胞、諸如在培養的小植株中的分化植物細胞、轉基因植物、成熟的植物和類似的媒介。正如本領域眾所周知的，也包括包含由純化蛋白、底物、和支持轉錄所需要的成分組成的再組成表達媒介的體外生化表達系統。
本發明的啟動子可以采用的形式有分離的核酸、嵌合基因、表達盒和本文所定義的類似重組DNA(rDNA)形式。
分離的核酸分子包括含有上述CsVMV啟動子的啟動子核苷酸序列。
嵌合基因是含有兩種不同核苷酸序列的融合物，其中主題啟動子核苷酸序列操作性連接到異源核酸序列，這樣在合適的轉錄媒介中所述異源核酸在所述主題啟動子的控制下進行轉錄。用于嵌合基因的典型異源核酸序列可以是編碼有用基因產物的任何核酸序列。本文還要進一步描述有用的基因產物和異源核酸序列。
本文所述的各種啟動子特別有用，它在其中將起始轉錄的植物和植物組織類型的范圍內提供控制。例如，對于許多植物類型、單子葉植物和雙子葉植物、包括植物的大多數組織的表達而言，本文所述的是組成型的啟動子；有一些描述的啟動子優先地限制轉錄到某些植物組織。
推薦的啟動子核苷酸序列包括衍生自SED ID NO 3中所示的CsVMV啟動子的核苷酸序列。本文中的“衍生自”是指主題啟動子或者通過CsVMV啟動子的缺失、斷裂或置換來機械操作制得；或者通過分析該序列，然后設計和合成一序列，該衍生物保留本文鑒定的CsVMV啟動子的重要的、功能性特征，從而制得所述主題啟動子。
優選的是，啟動子核苷酸序列是本文所述序列中的一種，即是存在于命名為CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、pΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的構建物中的啟動子序列中的任何一種。這些推薦啟動子核苷酸序列在本文的序列表中分別以SED ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16顯示。
CsVMV啟動子在產生轉基因植物中是有用的。作為含有操作連接到CsVMV啟動子的異源DNA序列的DNA構建物轉化植物細胞的結果，在轉基因植物中產生所需要的表型。因此，DNA構建物可以在許多用于各種植物細胞的種種表達載體中任何一種中包含表達盒。
本領域技術人員已知的許多方法可用來制備或分離CsVMV啟動子。例如可以從基因組的CsVMV DNA片段分離CsVMV啟動子。
CsVMV啟動子序列也可以通過用其序列得自本文所述CsVMV啟動子DNA序列的寡聚核苷酸序列篩選植物DNA文庫而分離。采用SEQ ID NO3的CsVMV啟動子序列，本文所述的各種克隆方法學也可以用來分離CsVMV啟動子。本領域技術人員已知的其它方法也可以用來分離含有CsVMV啟動子的植物DNA片段。關于分離與已知順序DNA分子相關的DNA的其它技術的介紹，參見Sambrook等。
為制備cDNA文庫，從表達待克隆的靶表達基因的組織中分離mRNA。例如可以利用植物果實的果皮組織。從mRNA制備cDNA，然后，合成第二條互補DNA鏈。隨后，將該雙鏈DNA分子連接到重組載體中。該載體轉染到重組宿主中進行繁殖、篩選和克隆。制備和篩選cDNA文庫的方法是眾所周知的。參見Gubler等，Gene,25:263-269,1983和Sambrook等。
為了基因組文庫，通常從植物組織中提取所述DNA，然后或者機械剪切或者酶消化以產生大約15-20kb的片段。之后通過梯度離心，將所述片段與從不需要的大小片段分離，并構建到λ噬菌體載體中。按Sambrook等所述的方法，體外包裝這些載體和噬菌體。通過按Benton等，Science,196:180-182,1997一般描述的噬菌斑雜交法分析重組噬菌體。按由Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),72:3961-3965,1975所述的方法進行克隆性雜交。例如載DNA印跡上，在或者cDNA或者基因組文庫中，通過其與核苷酸探針雜交的能力可以鑒定目的DNA，這些DNA區用本領域技術人員熟悉的標準方法分離。參見Sambrook等。
諸如聚合酶鏈反應(PCR)技術之類的核酸擴增技術，可以用來從mRNA、cDNA和基因組文庫或cDNA文庫擴增核酸序列。在PCR技術中，合成與待擴增DNA區的兩個3’末端邊緣互補的寡核苷酸引物，然后用這兩個引物進行聚合酶鏈反應。參見PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications(Inns等編輯)，Academic Press,San Diego(1990)。可以選擇引物來擴增含有所需要的啟動子的完整區。也可以用PCR來擴增所需要的這些區的較小DNA片段。
PCR和有關擴增技術可以以多種方式用來分離含有CsVMV啟動子的DNA分子。例如，PCR可以用在許多方案中以分離含有CsVMV啟動子的核酸。在這些方案中，由分析本文所列的DNA序列，產生用于擴增含有CsVMV啟動子的DNA的合適引物和探針。
通過Beaucage等(Tetrahedron Lett.,22(20):1859-1862,1981)所述的固相亞磷酰胺三酯法(phosphoramidite triester)，按照Needham-VanDevanter等，Nucl.Acads Res.,12:6159-6168,1984中所述，采用自動合成儀，可以化學合成用于所述公開方法中的寡核苷酸。寡核苷酸的純化是通過或者天然聚丙烯酰胺凝膠電泳或者如Pearson等(J.Chrom.,255:137-149,1983)所述的陰離子交換HPLC進行。可以采用Maxam等(Meth.Enzymol.,65:499-560,1980)的化學降解法確認合成寡核苷酸的序列。
可以產生具有本文所示不同特性的不同形式的CsVMV啟動子。可以用本領域技術人員已知的多種方法構建CsVMV啟動子。例如通過作圖分析CsVMV啟動子中的限制酶位點，然后用該構建圖譜確定合適的限制酶切割以切去所述序列的子序列，來構建啟動子。然后可以將較短的限制片段插入到合適的載體。本文說明了控制操作連接的異源DNA序列表達的特定啟動子的構建。其它形式的啟動子也可以用類似方式制備。
衍生型啟動子可以顯示出表達操作連接的異源DNA序列。這可以首先通過制備具有操作連接到報道基因的替代型啟動子的載體來完成。然后用所示載體轉化植物細胞，再由該轉化植物細胞產生轉基因植物。之后測定在該啟動子控制下所述基因的表達。參見本文關于證實用替代型CsVMV啟動子表達的異源DNA序列的實施例。
另一方面，在本文所述啟動子的順序基礎上，用多種方法可以合成包含本發明啟動子的核酸分子。正如本文所述，用產生寡核苷酸的化學合成法可以完成合成。另外，通過合成一系列的寡核苷酸可以制備核酸分子，所述寡核苷酸順序對應于所述啟動子的不同部分，可以通過其連接結合形成較大的核酸分子。
C．用于表達異源蛋白的載體本文所述的不同形式CsVMV啟動子可以用于表達盒、載體和其它DNA構建物。
本發明的載體是包含根據本發明的啟動子核苷酸序列的核酸分子，所述啟動子操作性連接到異源核酸序列。通常，該載體能夠表達作為嵌合基因的操作性連接的啟動子和異源核酸序列。適合用于表達嵌合基因的載體一般是大家熟知的，并且不必受限制。
用于本文載體中的嵌合基因是操作性連接到異源核酸序列的本發明啟動子核苷酸序列的融合物。各種異源核酸序列中的任何一種均可用于能夠改變植物表型的嵌合基因，可包括植物、動物或其它生物的蛋白或核酸。代表性蛋白包括農業上用于提高植物產量、抗病性、利用改良營養物質能力的有用蛋白質，以及類似蛋白。
例如，可以使用操作連接到基因的所述CsVMV啟動子，所述基因有除草劑抗性基因、真菌病抗性基因、(例如殼多糖酶和葡聚糖酶)、細菌性疾病抗性基因(例如殺菌肽)和寄生蟲抗性基因(例如B.Thuringiensis毒素)。另外的例子包括病毒外殼蛋白，諸如CsVMV的外殼蛋白或非洲木薯花葉病毒復制酶。
也可以使用操作連接到以下基因的CsVMV啟動子，例如成熟基因或降解基因(例如Acc氧化酶、Acc合酶、聚半乳糖醛酸酶、八氫番茄紅素合酶)；顏色基因；甜味物質基因以及類似基因。
可以以多種方式構建含有CsVMV啟動子的表達盒。這些技術是本領域技術人員熟悉，在上述的Sambrook等中有全面的描述。例如，諸如定點誘變之類的各種方法可以用來在異源基因片段的起始密碼子處導入限制位點。然后將異源DNA序列連接到CsVMV啟動子，使得該啟動子調節異源序列的表達。然后將由操作連接到異源DNA序列的CsVMV啟動子組成的DNA構建物插入到各種載體。這類載體包括在植物細胞轉化中有用的表達載體。可以通過應用本領域技術人員熟知的重組DNA技術，構建在植物細胞轉化中有用的許多其它的這類載體。
用于在原生質體或植物組織中表達的代表性載體包括pUC18/19或pUC118/119(GIBCO BRL,Inc.,MD)；pBluescriprt SK(+/-)和pBluescript KS(+/-)(Stratagene,La Jolla,CA)；pR7Blue T-載體(NOVAGEN,Inc.WI)；pGEM-3Z/4Z(PROMEGA Inc.,Msdison,WI)和諸如本文所述的類似的載體。
用于用根癌農桿菌介導的植物轉化的表達的典型載體，包括pBin19(Clontech Inc.),Frisch等，Plant Mol.Biol.,27:405-409,1995,pCAMBIA 1200和pCAMBIA 1201(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture,Canberra，澳大利亞)；pGA482,An等，EMBO J.,4:277-284,1985；pCGN1547(CalgeneInd.)McBride等，Plant Mol.Biol.,14:269-276,1990和本文所述的類似載體。
用于基因的核酸操作的技術，諸如亞克隆主題啟動子或異源核酸序列到表達載體中、標記探針、DNA雜交等等全面描述在Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版)，第1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989中，該手冊通過引用結合到本文中。此操作在本文中稱為“Sambrook等”。
D．轉基因植物本發明也設想在本文所述的嵌合基因構建物中含有本發明啟動子的轉基因植物。在主題啟動子控制下表達的異源核酸序列的表達，引起所述植物具有改變的表現型。因此所述轉基因植物含有作為該植物的一部分的本文所定義的表達盒，該表達盒已通過用本發明的載體轉化植物而導入。
因為本發明的啟動子能夠在廣泛的植物種類中(包括單子葉植物和雙子葉植物)發揮作用，所以轉基因植物可以是含有主題啟動子、并且能夠表達含有該啟動子的嵌合基因中的所述異源核酸序列的任何類型的植物。典型植物種和屬還將進一步描述。
轉化各種各樣的植物種類的技術是眾所周知的且描述于科技文獻中。參見例如Weising等，Ann.Rev.Genet.,22:421-477,1988。如本文所述，組成型或誘導型CsVMV啟動子在合適的載體中操作連接到所需要的異源DNA序列。含有融合到異源DNA的CsVMV啟動子的載體通常含有賦予植物細胞可選擇表型的標記基因。例如該標記可以編碼殺生物劑抗性、特別是抗生素抗性(諸如抗卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草劑抗性，諸如抗氯磺隆或草銨膦。這些選擇性標記基因在產生轉基因植物的方案中是有用的。
含有連接到異源DNA的CsVMV啟動子的DNA構建物可以通過多種常規的技術導入到所需要的植物宿主的基因組中。例如，用諸如電穿孔和微量注射植物細胞原生質體之類的技術，可以將所述DNA構建物直接導入到植物細胞的DNA中。或者，采用諸如DNA微粒轟擊的生物發射(biolistic)法，將所述DNA構建物直接導入植物組織中。另外，所述DNA構建物可以與合適的T-DNA側翼區域結合并導入常用的根癌農桿菌宿主載體中。當根癌農桿菌感染植物細胞時，該菌宿主的毒力作用指引所述構建物和鄰近的標記基因插入到該植物細胞DNA。
微量注射技術是本領域眾所周知的，并在科技、專利文獻中有很好的描述。用聚乙二醇沉淀導入DNA構建物描述在Paszkowski等，EMBOJ.,3:2717-2722,1984。電穿孔技術描述在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824,1985。生物發射轉化技術描述在Klein等，Narure 327:70-73,1987。所有引用文獻的全部公開內容均通過引用結合到本文中。
變化包括通過或者在小珠或小顆粒的基質中或者在其表面上具有核酸的小顆粒的高速生物發射穿透(Klein等，Nature,327:70-73,1987)。盡管通常只需要單一導入新核酸片段，但是本方法特別提供多份導入。
根癌農桿菌介導的轉化技術詳細描述于科學文獻中。參見例如Horsch等，Science,23:496-498,1984，和Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:4803,1983。參見本文關于證實用含有CsVMV啟動子的載體通過根癌農桿菌轉化植物細胞的實施例。
更具體地講，用所述區段轉化的根癌農桿菌感染植物細胞、外植體、分生組織或種子。在本領域已知的合適條件下，將轉化植物細胞生長形成苗枝、根，及進一步發育成植株。例如通過根癌農桿菌的Ti質粒，所述核酸區可以導入到合適的植物細胞中。在用根癌農桿菌感染時，將所述Ti質粒傳遞到植物細胞，并穩定地整合到植物基因組(Horsch等，Science,233:496-498,1984；Fraley等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A,80:4803,1983。
Ti質粒含有產生轉化細胞必需的兩個區。其中命名為轉移DNA(TDNA)的一個區段誘導腫瘤形成。另一個叫做毒力區，是所述T DNA導入植物所必需的。轉移到植物基因組的轉移DNA區可以通過插入外源核酸序列增加其大小，而不影響其轉移能力。通過去除引起腫瘤的基因使得它們不在進行干擾，之后修飾Ti質粒可以用作轉移本發明的基因構建物到合適植物細胞的載體，這樣的質粒為“無能(disable)Ti質粒”。
根據本發明，可以被農桿菌轉化的所有植物細胞和由轉化細胞再生的完整植物也可以bz轉化，從而產生含有所述轉移外源核酸序列的轉化完整植物。
用農桿菌轉化植物細胞有多種方法，包括(1)農桿菌與培養分離的原生質體共培養；(2)細胞或組織與農桿菌共培養；(3)用農桿菌轉化種子、頂端(apices)或分生組織。
方法(1)要求允許培養原生質體和由培養原生質體再生植物的確立的培養系統。
方法(2)要求(a)所述植物細胞或組織可由農桿菌轉化，和(b)所述轉化細胞或組織可以誘導再生成完整植物。
方法(3)要求微繁殖。
在該雙元系統(binary system)中，為了感染，需要兩種質粒含有T-DNA的質粒和vir質粒。可以使用為數眾多的含有質粒的T-DNA中的任何一種，唯一的要求是該質粒對于所述兩種質粒的每一種都能獨立選擇。
在所述植物細胞或植物轉化后，那些由所述Ti質粒轉化使得所需要的DNA區段整合的植物細胞或植物可以通過合適的表型標記選擇。這些表型標記包括但不限于抗生素抗性、除草劑抗性或肉眼可視變化。其它表型標記是本領域眾所周知的并可用于本發明。
在轉化任何植物包括單子葉植物和雙子葉植物時，本發明包括利用要求保護的啟動子。雙子葉植物的轉化描述于上述文獻中。采用各種技術轉化單子葉植物是已知的，所述技術包括電穿孔(例如Shimamoto等，Nature,338:274-276,1992彈道沖擊(ballistics)(例如歐洲專利申請270,356)；和農桿菌(例如Bytebier等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,84:5345-5349,1987)。
采用任何一種上述轉化技術產生的轉化植物細胞可以培養再生成具有所需要轉化表型的完整植物。這類再生技術取決于組織培養生長培養基中某些植物激素的操作，通常取決于已經與所述核苷酸序列一起導入的殺生物劑和/或除草劑標記基因。由培養的原生質體再生植物描述于Evans等，植物細胞培養手冊，第124-176頁，MacMillanPublishing Company，紐約，1983；和結合、植物再生、植物原生質體，第21-73頁，CRC Press,Boca Raton,1985。從植物愈合組織、外植體、器官或這些的某一部分也可以獲得再生。這類再生技術由Klee等(Ann.Rev.Plant Phys.,38:467-486,1987)進行了全面描述。
可用于本發明中產生轉基因植物的其它方法描述于美國專利5,188,642；5,202,422；5,463,175和5,639,947號中，其說明書通過引用結合到本文中。
技術人員會知道，在含有所述CsVMV啟動子的表達盒穩定地摻入在轉基因植物中并證實是可操作的之后，該表達金可以通過有性雜交導入其它植物。根據待雜交的物種，可以使用眾多標準育種技術中的任何一種。
本發明的方法和組合物在廣泛種類的植物中具有用途，所述植物包括以下屬的種草莓屬、蓮屬、苜蓿屬、驢喜豆屬、三葉草屬、葫蘆巴屬、豇豆屬、巖薔薇屬、亞麻屬、Geranium、木薯屬、胡蘿卜屬、擬南芥屬、蕓苔屬、蘿卜屬、歐白芥屬、顛茄屬、辣椒屬、莨菪屬、番茄屬、煙草屬、茄屬、矮牽牛屬、毛地黃屬、Majorana、Ciohorium、向日葵屬、萵苣屬、雀麥屬、天門冬屬、金魚草屬、Herecocallis、龍面花屬、天竺葵屬、黍屬、狼尾草屬、毛莨屬(Ranuncultis)、千里光屬、蛾蝶花屬、香瓜屬、Browaalia、大豆屬、毒麥屬、玉米屬、小麥屬、高粱屬、曼陀羅屬、菊屬、石竹屬、大丁草屬、大戟草屬、番薯屬、西番蓮屬、仙客來屬、蘋果屬、櫻桃屬、薔薇屬、懸鉤子屬、楊屬、檀香屬、蔥屬、百合屬、水仙屬、Ananas、花生屬、菜豆屬和豌豆屬；而更具體地說，包括油料作物，例如canola(蕓苔屬種)、棉花(棉屬種)、花生(花生屬種)、向日葵(向日葵屬種)、棕櫚(油棕屬種)、亞麻(亞麻屬種)、紅花(紅花屬種)、椰子(椰子屬種)和大豆(大豆屬種)，谷類作物，例如小麥(小麥屬種)、玉米(玉米屬種)、高粱(高粱屬種)、大麥(大麥屬種)、黑麥(黑麥屬種)、燕麥(Averia種)和水稻(稻屬種)；果實作物例如香蕉((芭蕉屬種)、柑桔(柑桔屬種)、漿果(例如草莓(草莓屬種)或懸鉤子(懸鉤子屬種)、芒果(芒果屬種)、甜瓜(香瓜屬種)、梨(梨屬種)、黃瓜(黃瓜屬種)、和杏、桃、櫻桃、李和洋李(櫻桃屬種)，蔬菜作物，例如豌豆(豌豆屬種)、菜豆(野豌豆屬種)、嫩莖花椰菜和相關的十字花科植物(蕓苔屬種)、菠菜(菠菜屬種)、洋蔥(蔥屬種)、芹菜(Apiurti種)、胡蘿卜(胡蘿卜屬種)、蘆筍(天門冬屬種)、和洋薊(向日葵屬種)，番茄(Lycopersiconesculenium)，胡椒(Capsicum annuum)；其它觀賞作物，例如郁金香(郁金香屬種)、金魚草(金魚草屬種)、鳶尾(鳶尾屬種)、蘭花(蘭屬和卡特來蘭屬種)、天竺葵屬植物；飲料作物，例如咖啡(咖啡數種)和茶(山茶屬種)；草本作物，例如薄荷(薄荷數種)、百里香屬植物(百里香屬種)、半至菜(牛至屬種)、秋葵、咖啡、馬鈴薯、塊莖作物、野芋。
E．在植物中表達異源核酸的方法含有本發明CsVMV啟動子的DNA構建物、嵌合基因和表達盒可以用來轉化植物細胞，并產生具有所需要表型特征的轉基因植物。有眾多不同的方法供人們利用，以在轉基因植物產生所需要的表型。例如，通過采用本文所述方法，人們可以操作性連接新的基因到CsVMV啟動子并轉化植物細胞。由轉化植物細胞可以產生轉基因植物，使得所述新基因產物在所有組織中或只在轉基因植物的某些組織中產生。在本文中，術語“新基因”是指在植物中正常不存在或者，假如存在，則在特定的植物細胞組織中通常不能表達的基因。所述新基因的表達可導致產生賦予轉基因植物改變表型的蛋白。
因此，本發明設想了在植物細胞中表達異源核酸序列的方法，包括a)用含有操作連接到異源核酸序列的根據本發明啟動子核苷酸序列的載體轉化所述植物細胞；和b)在所述異源核酸序列在該植物細胞中表達的條件下培養所述植物細胞。
轉化植物細胞的方法可以廣泛變化并且是不需要如此不限制的。在本文中是描述典型的轉化方法。
用于表達的方法包括多種目的，諸如提供在表達和轉錄該核酸序列時賦予需要的表型的異源蛋白，提供可作為反義分子發揮作用的表達核酸，提供能夠調節基因表達或加工核酸的表達核酸的目的；以及在轉基因植物中的類似目的。
因此，含有操作連接到異源DNA序列的CsVMV啟動子的DNA構建物可用于許多技術方法中，以抑制外源植物基因的表達，例如有義和反義抑制。在反義技術學中，克隆來自所需要的植物基因的核酸區段，并將其操作地連接到CsVMV啟動子，使得合成RNA的反義鏈。然后，該構建物轉化到植物中，并產生RNA的反義鏈。在植物細胞中，已經表明反義RNA抑制基因表達，參見例如Sheehy等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:8805-8809,1988，和Hiatt等，美國專利4,801,340號，這些文獻通過引用結合到本文中。
在反義抑制中待導入的核酸區段一般至少與待阻遏的一個或多個內源基因的一部分、一種或多種功能大致相同，但是不必一致。可設計本發明的載體，使得所述抑制作用施加到表現出與靶基因同源或大致同源的家族基因中的其它蛋白上。基因的區段可(1)直接用來抑制不同植物種中的同源基因的表達，或(2)用作獲得可以用來抑制所述基因的相應序列的工具。
所述導入序列也不需要是相對于或者原初轉錄產物或者完全加工mRNA的全長。一般來說，較高同源性可以用來補償較短序列的使用。此外，該導入序列不需要具有相同內含子或外顯子模式，而非編碼區段的同源性將同樣有效。通常，應該應用大約30或40個核苷酸到大約2,000個核苷酸之間的序列，盡管優選至少大約100個核苷酸的序列，更優選至少大約200個核苷酸的序列，而特別優選至少大約500個核苷酸的序列。
也已經報告催化RNA分子或核酶具有作為抑制內源植物基因表達工具的用途。設計核酶是可能的，所設計的核酶與事實上任何靶RNA均特異性配對，并且在特定位置切割磷酸二酯主鏈，因此功能性使該靶RNA失活。在進行這種切割時，核酶本身無變化，因此能夠再循環并切割其它分子，從而使得它成為真正的酶。這時在反義RNA中包含核酶序列時賦予切割RNA的活性，由此提高該構建物的活性。
已經鑒定了許多類型的核酶。一類核酶衍生自多種小環狀RNA，所述環狀RNA能夠自我切割并在植物中復制。所述RNA或者獨立復制(類病毒RNA)或者與輔助病毒一起復制(衛星RNA)。實例包括自鱷梨白斑病類病毒的RNA和自煙草環斑病毒的衛星RNA、紫花苜宿短暫條紋病毒、絨樣煙草斑點病病毒、茄斑點病毒和地三葉斑點病毒。靶RNA特異性核酶的設計和應用描述于Haseloff等，Nature,334:585-591,1988。
優選的抑制方法是有義抑制。已經表明導入以有義方向配置的核酸是有效的方法，通過該方法阻斷靶基因的轉錄。關于應用該方法調節內源基因的表達的實例，參見Napoli等，The Plant Cell,2:279-289,1990和美國專利5,034,323號。有義抑制是用于成熟過程控制(例如Acc氧化酶或Acc合酶)、甜度控制(例如ADPG焦磷酸化酶)或顏色修飾(例如苯基苯乙烯酮合酶)的優選方法；參見美國專利5,034,323號。
一般而言，在有義抑制中發生所述導入序列的轉錄。當所述導入序列本身不含編碼序列，而只含有內含子或與存在于內源序列原始轉錄物的序列同源的非翻譯序列時，也發生該效應。所述導入序列一般與計劃抑制的內源序列大致相同。該最小同一性通常高于約65％，但是更高的同源性可用于對所述內源序列的表達發揮更有效的抑制。優選高于大約80％的大致更高的同一性，雖然大約95％到絕對同一性是最優選的。該效應可以用于顯示同源或大致同源的類似基因家族中的其它蛋白。基因區段可(1)直接用來抑制不同植物種中同源基因的表達，或(2)用作獲得可以用來抑制所述基因的相應序列的工具。
在有義抑制中，需要低于絕對同一性的導入序列也不需要相對于或者原始轉錄產物或者完全加工的mRNA是全長。在短于全長序列中的更高的同一性補償更長的較低同一性的序列。而且，所述導入序列不需要具有相同的內含子或外顯子模式，而同一性的非編碼區段可以同樣有效的。優選具有至少50個堿基對大小的序列，而更優選更長的序列；參見美國專利5,034,323號。
根據異源序列的性質，可以用多種方法檢測到連接到CsVMV啟動子的異源DNA序列的表達。例如人們可以檢測所需要的表型。根據所導入的表型性狀，用多種方法可以測定所需要的表型，該表型在CsVMV啟動子控制下產生自異源DNA序列的成功表達。例如通過用除草劑處理可以檢測到除草劑抗性。
異源DNA的表達也可以通過測定特定RNA轉錄產物而檢測到。例如可以用RNA酶保護或RNA印跡法進行此過程。假如異源DNA序列編碼一種新蛋白，例如通過該蛋白的功能或眾多的免疫檢測技術可以檢測該蛋白產物。例如可以在酶檢測中檢測具有酶活性的新的蛋白產物。實施例提供以下實施例是為了說明而不是限制本發明。1．木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的分離基本上按照Sambrook等的所述方法(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Clod Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989)，實施分子技術。
核苷酸數目是指由Calvert等(J Gen Virol,76:1271-1276,1995)報告的以及以基因庫登記U59751和U20341號公布的木薯葉脈花葉病毒基因組核酸序列。基因庫(GeneBank)是美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,MD)下屬的國立生物技術情報中心(National Center for Biotechnolgy Information)的國立醫學圖書館提供的核酸序列數據庫。原始CsVMV全長基因組克隆由R.Shepherd博士(University of Kentucky)提供。通過連接在質粒pCKIZ(Anza,O.,Replication and mapping of caulimoviruses,博士論文，University of California,Dayid,USA,1982)的BglⅡ位點中的唯一的BglⅡ位點處切割的所述全長CsVMV病毒基因組DNA，構建該克隆。用方便的限制位點分離六個重疊片段，每一種片段在質粒pUC119中克隆。通過采用染料標記的引物進行Taq介導的延伸，用Applied Biosystems 373A型測序儀進行自動測序。必要時，進行PCR反應，并進行該PCR產物的直接測序。采用自動測序儀制造商提供的SeqEd軟件編譯序列資料。
將直接產生自基因組克隆的限制片段克隆到pUC119質粒。采用這些亞克隆，分離含有共有TATA框基元的兩種病毒DNA片段(圖1)。命名為CVP1的片段包含CsVMV核苷酸7235-7632，而且可通過AluⅠ酶消化獲得。用PCR擴增分離含CsVMV核苷酸7160-7675且命名為CVP2的較長的片段。用于該PCR反應的兩種寡核苷酸是引物15’ACCGGTACCAGAAGGTAATTATCCAAGATGT3’(SEQ ID NO 18)(得自核苷酸7160-7183并在其5’末端添加上一個KpnⅠ限制位點的CsVMV序列)和引物25’CGGAATTCAAACTTACAAATTTCTCTGAAG3’(SED ID NO 19)(與核苷酸7652-7675互補并在5’末端添加上一個EcoRⅠ限制位點的CsVMV序列)。該擴增反應含有每種引物25pmol、每種dNTP 200μM、含待擴增序列的質粒DNA 100ng、Pfu聚合酶2.5U和合適的緩沖液(Stratagene)。在94℃進行首次變性5分鐘，之后該反應混合物在94℃變性1分鐘，再在60℃退火1分鐘，及在72℃延長1分鐘，重復上述每一過程15個循環。在72℃進行最后延長5分鐘。隨后用雙脫氧核苷酸鏈終止序列分析(Sequenase-USB)證實所擴增產物的序列準確性。
嵌合質粒pILTAB:CVP1和pILTAB:CVP2(圖1)用來研究啟動子活性并按下述方法制備。如圖1所示，將CVP1和CVP2啟動子片段分別連接到pGN100的SmaⅠ和EcoRⅠ/KpnⅠ位點中，pGN100是含有連接到胭脂堿合酶的3’多腺苷酸化信號(nos 3’)的uidA編碼序列的pUC119衍生質粒。
通過KpnⅠ/HindⅢ消化，從pILTAB:CVP1和pILTAB:CVP2切下含CsVMV啟動子uidA融合基因的盒，并將其亞克隆在pBIN19雙元載體(Clontech)中的KpnⅠ/HindⅢ位點，所述雙元載體用于農桿菌介導的植物轉化。質粒pe35GN含有增強的35S啟動子(Kay等，Science,236:1299-1302,1987)和連接到nos 3’末端的uidA編碼序列。質粒pDO432含有得自石楠Photinus pyralis并受35S啟動子控制的熒光素酶編碼序列，OW等，Science,234:856-859,1986。用于瞬時分析實驗的質粒pILTAB:CVP1、pILTAB:CVP2和pe35GN的大小均為大約5.5kb。2．關于CsVMV啟動子的轉錄起始位點采用從轉基因煙草植株回收的總RNA，通過引物延伸分析確定CsVMV啟動子的轉錄起始位點，按實施例4所述制備的的轉基因煙草植株包含CVP1:uidA融合基因。
按改變很少的Prescitt和Martin(Plant Mol Biol.Reporter,4:219-224,1987)所述方法，從轉基因煙草植株的嫩葉提取總RNA。用含有序列5’-CGCGATCCAGACTGAATGCCCACAGGCCGTCGAG-3’(SEQ ID NO20)的34個堿基對長的寡核苷酸進行引物延伸，所述序列與uisA基因中的ATG起始密碼子下游的34個核苷酸區互補。采用6U T4多核苷酸激酶(USB)和7μCi[γ-32P]ATP(3000μCi/mmol,10μCi/μl)進行5’末端標記所述寡核苷酸(20pmol)。標記反應之后，用Nuctrap Push柱(Stratagene)純化該引物。0.1pmol的標記引物與50μg得自轉基因植物的總RNA混合。根據Sambrook等(Molecular cloning:Alaboratory manul,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989)所述方法進行該實驗，只是在30℃或40℃退火12小時，且用20U的AMV逆轉錄酶(Gibco-BRL)讓該擴增反應在42℃繼續進行1小時。在含7M尿素的7.5％聚丙烯酰胺凝膠上分離所述延伸產物。用相同標記引物進行的序列反應物在同一凝膠的相鄰泳道中進行電泳。
檢測單一的主要延伸產物，且將其作圖到位于推定的TATA框下游35個核苷酸的腺嘌呤殘基(nt.7604)(圖2)。與報道的關于其它植物副逆轉錄病毒啟動子的轉錄起始位置(Guilley等，Cell,30:763-773,1982；Hay等，Nucl Acids Res,19:2615-2612,1991；Medberry等，Nucl Acids Res,18:5505-5513,1990；和Sanfaon,H.,Virology,198:39-49,1994)比較，本文報道的在nt.7604的轉錄起始位點代表所述CsVMV轉錄的5’末端。通過比較得自TATA框的CsVMV啟動子的序列與具有花椰菜花葉病毒啟動子FMV34和CaMV35S的序列的轉錄起始位點(Gardner等，Nucl Acids Res,9:2871-2887,1981.17；和Richins等，Nucl Acids Res,15:8451-8466,1987)，我們得出結論在該區中的這三個啟動子彼此間是密切相關的。相反，與得自badnaviruses(ComYMV和RTBV)的啟動子的同源性較低。
CsVMV基因組的啟動子區的核苷酸順序標示在圖3中，并得到Calvert等(J Gen Virol,76:1271-1276,1995)報道的結果的證實。圖3中所示的編號系統是基于轉錄起始位點，其中+1對應的是本文報告的轉錄起始位點，為采用基因組順序編號的nt.7604。因此，CVP1包括從-368位到+20位的387個核苷酸，而CVP2包括從-443位到+72位的514個核苷酸的片段(圖3)。
所述CsVVMV啟動子序列與副逆轉錄病毒啟動子序列即35S CaMV(Gardner等，Nucl Aacids Res,9:287l-2887,1981)、34S FMV(Richins等，Nucl Aacids Res,15:8451-8466,1987)、RTBV(Qu等，Virology,185:354-364,1991)和ComYMV(Medberry等，NuclAacids Res,18:5505-5513,1990)啟動子的比較顯示，存在上述的保守TATA框和17個核苷酸的基元AGACGTAAGCACTGACG(從-203位到-219位)(SEQ ID NO 21)，所述基元與35S CaMV、FMV和ComYMV啟動子中發現的轉錄增強子as1高度同源。也鑒定了一個22個核苷酸的序列CTTATCACAAAGGAATCTTATC(從-90位到-111位)(SEQ ID NO 22)，該序列存在于ComYMV啟動子，但不存在于RTBV或花椰菜花葉病毒啟動子中。這種有限的同源性表示，我們已經分離出一種不同的植物副逆轉錄病毒啟動子。
另外，病毒分類學領域的新進展已經了解了花椰菜花葉病毒CaMV和木薯葉脈花椰菜病毒(CsVMV)之間的差異，并達到已經將CsVMV歸于新屬的程度。具體來說，病毒分類學國際委員會(ICTV)已經在1997年5月開會，并采用病毒命名的變化，使得CsVMV歸于“木薯花葉病毒(cassemovirus)”屬，而CaMV歸于花椰菜花葉病毒屬。
所述變化的基礎總結于圖4中，該示說明眾多相關病毒的基因組結構的比較。詳細地說，注意到兩種主要蛋白(外殼蛋白和移動蛋白)的順序在基因組上相對于CaMV是相反的，而且被加工成聚合蛋白的這兩種蛋白由一個ORF編碼，而CaMV上的這兩種蛋白由命名為ORF1和ORF4的兩個獨立的ORF編碼，且許多ORF的實際核苷酸序列與CaMV顯著不同。
用Macintosh(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的DNASTAAR軟件包的程序分析病毒序列。采用下述每種病毒株的公開號(括號內)從GeneBank獲得所述公布序列CaMV Strasbourg株(J02048)、CERV(X04658)、FMV(X06166)、SVBV(X97304)、PCSV(U13988)、SbCMV(X15828)、RTBV(M65026)、ComYMV(X52938)、CSSV(L14546)、ScBV(M89923)。
關于CaMV和CsVMV之間的同源程度，注意到所述啟動子序列之間有大約23％的同源性，而CaMV與FMV啟動子顯示大約47％的同源性。同樣地，通過ORF1的起始端到ORF5的末端之間的區域的序列對比，CsVMV和CaMV之間有35％的同源性，相比之下CaMV與FMV有56％的同源性。3．原生質體的分離、轉化及培養基本按Kikkawa等(J.Gen.Virol.,63:457-467,1982)所述，從BY-2(煙草，cv.Bright Yellow)細胞懸浮培養物分離煙草原生質體，并用DNA轉染。
從木薯(Manihot esculenta L.cv TMS60444)胚性細胞懸浮培養物制備木薯原生質體，Taylor等，Proceedings of the SecondInternational Scientific Meeting of the Cassava BiotechnologyNetwork-CBNⅡ,Bogor，印度尼西亞，第229-240頁，1995。收集50ml10天齡的培養物(培養液每2天更換一次)用于原生質體的分離。在酶消化之前，將細胞懸浮在30ml含有0.55M甘露醇、3.2g/L Schenk和Hinderbrandt鹽(Sigma)、1×Murashige和Skoog維生素(Sigma)、20mM CaCl2,pH5.8的培養液(培養液A)中。讓細胞沉降，并用補加2％纖維素酶Onozuka RS和0.1％果膠溶酶(Pectolyase)Y23的培養液A組成的酶消化液替代培養液A。在27℃避光進行消化3.5h。在處理的第一個小時輕輕攪動細胞。所述溫育混合物順序通過100μm和70μm的濾網過濾。原生質體在培養液A中通過100×g離心10分鐘洗滌3次。用血細胞計數器估計原生質體數。
純化的原生質體在含5mM Mes、130mM NaCl、10mM CaCl2、0.45M甘露醇，pH5.8的電穿孔緩沖液中再懸浮為終密度106細胞/ml。將200μl的含本文制備的每一種質粒30μg的電穿孔緩沖液加到0.4cm光程比色杯中的800μl的原生質體懸液中。用基因脈沖發生儀(GenePulse Instrument)(Biorad)以500μF的電容施以300V脈沖，以進行DNA攝取。電穿孔后，所述原生質體在冰中溫育30分鐘，之后在添加2％蔗糖和5×10-5M Pichloran的培養液A中以105細胞/ml的密度再懸浮。在27℃避光溫育24小時后，通過離心(10分鐘，100×g)收集原生質體，并再懸浮在pH7.7 GUS提取緩沖液中，Jefferson等，EMBO J,6:3901-3907,1987。4．用農桿菌的植物轉化將存在于pBIN19質粒并按實施例所述制備的基因構建物通過電穿孔導入到根癌農桿菌菌株LAB4404,Singh等，Focus,15:84-87,1993。根據Horsch等(Plant Molecular Biology Mannul，第A5/1-A5/9頁.Kluwer academic publishers,Dordrecht,1988)所述方法，用修飾的農桿菌來感染煙草cv Xanthi NN葉圓盤。將再生的卡那霉素抗性植物轉移到土壤并在溫室中生長。產生了7種含所述CVP1構建物的獨立轉基因系和8種含所述CVP2構建物的轉基因系。讓溫室生長的植物自花受精，并收集R1種子。R1種子在含卡那霉素的Murashige和Skoog(MS)培養基(Murashige等，Physiol Plant,15:473-497,1962)上萌發，且幼苗生長在溫室中。5．用粒子轟擊的植物轉化從木薯小植株(栽培品種Mcol 1505)切下葉和莖，所述小植株體外生長在含MS鹽和維生素、蔗糖20g/L、CuSO42μM、Phytagel 3g/L,pH5.7的培養基上。將外植體切片，隨后將該組織段在含固化培養基的9cm的培養皿中排列。用氦驅動粒子傳遞系統(PDS1000/He-BioRad)進行微粒子轟擊。基本上按照使用說明書(BioRad)制備金粒子(平均直徑為1.6μm)和包被DNA的粒子。將靶平板置于從底部計起的第三層(level)的槍室中，同時組裝的大載體/終止屏置于第五層。每一平板用大約1μg質粒DNA以1100PSI的壓力槍擊2次，所述質粒DNA按實施例中所述制備。轟擊之后，將無菌水加到平板中，以防止材料干燥。在組織化學GUS檢測之前，外植體于25℃避光培養2天。
通過如Li等(Plant Cell Reports,12:250-255,1993)所述的粒子轟擊，用與pMON410(Monsanto Co.)結合的pILTAB:CVP2，獲得7個轉基因水稻品系(Oryza sativa L.Taipei309)；pMON410攜帶潮霉素抗性基因。6．熒光素酶和萄萄糖醛酸糖苷酶分析以檢測CsVMV啟動子活性在pH7.7的GUS提取緩沖液中，通過渦流攪拌2分鐘裂解轉染的原生質體。在微型離心機中于4℃離心(5000×g,5min)澄清提取物。回收上清液用于MUG和LUC檢測。采用4-甲基-傘形基-β-D-葡萄糖醛酸(MUG-Sigma)，通過Jefferson等(EMBO J,6:3901-3907,1987)的方法測定GUS活性，并將50μl的提取物以pmol甲基傘形酮(MU)每小時定量。在50μl的相同蛋白提取物中，采用熒光素酶檢測(AnalyticalLuminescence Laboratory,San Diego,CA)，應用發光計(Monolight2010)測定LUC活性。用uidA基因加熒光素酶質粒共轉染細胞，允許我們實驗之間的GUS活性的變異歸一化，Leckie等，BioTechniques,17:54-57,1994。所述歸一化數據表示為pmol甲基傘形酮(MU)每小時每單位發射光。
轉基因植物組織在pH8的GUS緩沖液中研磨，并按Jefferson等(EMBO J,6:3901-3907,1987)所述測定GUS活性。所述酶活性(pmol/min)是指按Bradford,M.(Anal.Biochem,72:248-254,1976)所述的染料結合法測定的mg蛋白。
基本上按照Jefferson等(EMBO J,6:3901-3907,1987)所述進行GUS活性的組織化學分析。取自原代轉化體或R1子代的葉及莖的小片段在含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷酸(X-gluc)、100mM pH7磷酸鈉緩沖液，pH7.2、2mM亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀以及0.1％Triton-100的反應緩沖液中，于37℃溫育4-8小時。根和花器官在無氰化物鹽而含0.1％巰基乙醇的相同培養液中培養，以減少組織褐變。取手工切片在70％的乙醇中洗凈。在Zeiss顯微鏡下觀察染色切片。7．用CsVMV啟動子表達外源基因a．在煙草和木薯原生質體中的表達在瞬時分析實驗中用得自細胞懸浮培養物的煙草和木薯原生質體測試啟動子片段CVP1和CVP2。在該實驗中，我們采用質粒pILTAB:CVP1和pILTAB:CVP2。含受增強35S啟動子(e35S)(Kay等，Science,236:1299-1302),1987)控制的uidA序列的質粒pe35GN用作陽性對照。每一種質粒與含受CaMV 35S啟動子(Ow等，Science,234:856-859,1986)控制的熒光素酶基因的質粒共轉染到原生質體中。在每一轉染實驗后測定GUS/LUC的比率。進行了4次獨立的轉染實驗，獲得類似結果并總結在圖5中。在煙草原生質體中，對于CVP1啟動子，GUS/LUC比率為0.58，或者，由e35S啟動子(1.32)測定的表達水平為大約50％。然而，當使用所述CVP2片段時，該比率為1.3，或者活性高于CVP12倍。這兩個片段間的差別表明，CVP1缺乏一個或多個用于高水平表達的重要元件。CVP2和e35S啟動子產生類似的GUS活性，表明所述CsVMV啟動子在煙草原生質體中是強啟動子。在木薯原生質體中類似研究獲得的結果與煙草結果相似，表明所述CsVMV啟動子在這些細胞中也是非常有效的。
b．在煙草和水稻植株中的表達如本文所述，獲得了7個含CVVP1啟動子-uidA基因融合物的轉化煙草品系和8個含CVP2啟動子的轉化煙草品系。由原代轉化體(由轉基因愈傷組織再生的植物)的PCR分析證實存在全長的基因盒。
采用原代轉化體及其R1子代的各種器官的新鮮組織手工切片進行GUS積聚的詳細組織化學分析。盡管染色強度在不同轉化體中有不同，但是含有或者所述CVP1或者CVP2片段的所有煙草植株基本上具有相同的基因模式。在葉子中，在中脈和側二級脈的韌皮部組織中觀察到強GUS活性(圖6A和6B)。盡管中脈的薄壁組織細胞不含可檢測的GUS活性(圖6A和6B)，只是除緊靠表皮下的綠色組織細胞外(圖6C)，但鄰近木質部分子的薄壁組織細胞也發生藍色染色圖案。盡管在表皮中的保衛細胞和毛狀體、尤其是腺頂端細胞出現強染色，但在葉片的柵欄層和葉肉細胞顯示非常強的染色(圖6A和6C)。非特異化表皮細胞幾乎不積聚染色劑或無染色劑。莖的橫截面切片顯示韌皮細胞強染色，包括位于中髓組織的內生韌皮束和位于木質部外部的韌皮細胞(圖6D)。在木質部薄壁組織細胞中也可見到較弱的表達。在髓細胞或莖的皮質薄壁組織細胞中檢測不到GUS染色(圖6D)。與X-Gluc溫肓的根組織顯示染藍色的維管柱(圖6E)；由于該組織易碎的特性未取其橫截面切片。根尖是根部區域染色最深的(圖6E)。在花中，子房的基部顯示強藍色染色。花組織的維管分子在雄蕊、子房內的花柱和胎座(圖6F)以及在萼片和花瓣中顯示強染色。花粉粒也顯示藍色。R1幼苗與所述R0親代轉化體一樣產生相同染色總體模式，只是子葉葉肉中的GUS活性較成熟葉小一些。
在含CVP2:uidA基因的7個獨立轉化的水稻品系中以類似的方式進行檢測GUS活性的組織化學分析。所述CVP2啟動子uidA基因的一般模式在水稻和煙草中非常相似，盡管這些植物的解剖學有差異。與X-Gluc底物溫育的葉子橫向切片在維管束和葉肉細胞中產生強染色(圖6G)。盡管后生木質部管狀分子和較大的篩管分子似乎無任何藍色沉積物，但是小韌皮部薄壁組織細胞和木薄壁組織細胞顯示強染色。維管束鞘細胞、泡狀細胞和厚壁組織纖維也無染色。在葉表皮中保衛細胞和葉毛細胞顯示染色。葉鞘組織的橫截面切片(圖6H)中顯示的GUS活性模式與在葉中觀察到的模式類似。正如在煙草植株觀察到的一樣，在薄壁組織細胞中檢測不到GUS活性(圖6H)。根只在其維管柱和根尖被染上色。水稻花組織基本上與煙草花具有相同模式的GUS活性(圖6I)。
在按所述實施例中所述的方法制備的煙草和水稻轉化體中，采用4-甲基-傘形基-β-D-葡萄糖苷酸(MUG)熒光檢測法(Jefferson等，EEMBO J,6:3901-3907,1987)，定量測定由不同器官制備的提取物中的GUS活性。所測試的器官包括嫩葉、成熟葉、莖和根。這些檢測的結果顯示在圖7，且證實所述CssVMV啟動子在水稻和煙草的所有器官中均是有活性的。該CsVMV啟動子在葉中的活性高于其它器官，而在根中的表達水平最低。在含CVP2啟動子的煙草植株中的GUS活性不表現出明顯強于含CVP1啟動子的植株。由于所述轉基因表達的變化、所述MUG檢測的相對易變性和導致蛋白在植物組織中積聚的GUS的高度穩定性，在轉基因植物中，在原生質體測定的CVP1和CVP2之間的啟動子活性的兩倍差異可能檢測不到。
c．在木薯植物外植體中的瞬時表達在木薯植物中，通過微粒轟擊得自體外生長材料的莖和葉外植體，測試圖1中所示的CVP2片段的啟動子活性。質粒pILTAB:CVP2和質粒pe35GN(作為陽性對照)用于該研究，并按實施例5中所述通過轟擊進行轉化。因此，用實施例6的組織化學方法分析小植株的組織表達。采用含有二者中任何一種啟動子的質粒發現，顯示GUS表達的染強藍色的斑點數大致相同。在表皮細胞、保衛細胞、葉肉細胞和沿小葉的葉脈發現染藍色的細胞。這些實驗提供在木薯的不同細胞類型中CVP2片段的啟動子活性的證據。8．實施例1-7的討論所述實施例描述了從新的特征鑒定的木薯葉脈花葉病毒的病毒基因組中分離啟動子，Calvert等，J Gen Virol,76:1271-1276,1995。采用從含pCsVMV-uidA基因的轉基因植物中分離的RNA，確定該啟動子的轉錄起始位點。本文結果表明，該CsVMV啟動子在煙草和木薯原生質體中相對較強，且其活性類似于用e35S啟動子獲得活性。在原生質體中所測試的2個啟動子片段中，其中較短片段CVP1的活性大約低于較長的CVP2片段兩倍。然而，兩個片段在轉基因的煙草和水稻植株中均產生相同的表達型。在原生質體中觀察到的表達水平的不同可能是由較長片段的5’區中的轉錄加強子或較長的不翻譯的前導序列引起的。
相比之下，注意到CaMV前導序列的前60個核苷酸(從+1到第一個ATG)刺激下游基因表達增加約2倍(Dowson等，Plant Mol Biol,23:97-109,1993；和F
tterer等，EMBO J,9:1697-1707,1990)。關于東格魯水稻桿菌狀病毒(RTBV)啟動子的非翻譯前導序列的類似效應已經報道，F
tterer等，EMBO J,9:1697-1707,1990。然而，CsVMV前導序列與CaMV前導序列或RTBV前導序列之間存在有限的序列同源性。轉基因植物的分析表明，與花椰菜花葉病毒啟動子的情況一樣，CsvMV啟動子在所有器官和各種類型細胞中都有活性。CsVMV啟動子在水稻和煙草植株的維管組織、葉子的葉肉細胞和根尖中強表達。然而，在煙草髓和皮質薄壁組織的非葉綠素細胞中無GUS活性。這可能表明CsVMV啟動子具有兩個主要活性域，即維管分子和綠色的含有葉綠體的細胞。然而我們不能排除這些觀察結果是由于染色檢測法的限制引起的可能性。與具有致密胞質的小細胞相比，幾乎沒有胞質的大細胞(例如薄壁組織細胞)可能看起來幾乎不含有或沒有染料。同樣，具有不同代謝活性的細胞可能染色強度不同。
本文的數據表明，CsVMV啟動子在原生質體和轉基因植物中的表達相對類似于35S啟動子。然而，CsMMV啟動子的核苷酸序列與花椰菜花葉病毒啟動子的同源性有限，這可能意味著該啟動子的調節機制不同。分析CsVMV啟動子序列表明存在幾種基元，所述基元類似于以前鑒定的與轉錄調節有關的順式元件。在CsVMV啟動子存在這類基元可以解釋轉基因植物中的表達型。在CsVMV啟動子的nt-203到nt-219中，鑒定了與CaMV 35S啟動子as1元件高度同源的16個堿基對的基元(Lam等，Proc Natl Acad of Sci USA,86:7890-7894,1989)。特征為TGACG同向重復的as1元件結合到AS1核因子(Fromm等，Plant Cell,1:977-984,1989)以及克隆的TGAl轉錄因子(Katagiri等，Mol CellBiol,12:4809-4816,1992)，且該元件指導根特異性基因表達(Benfey等，EMBO J,8:2195-2202,1989)。CsVMV啟動子在根中的表達類似于CaMV 35S(Benfey等，EMBO J,8:2195-2202,1989)和ComYMV啟動子(Medberry等，Plant Cell,4:185-192,1992)誘導的表達，這兩種啟動子均含有as1元件。雖然在花椰菜花葉病毒啟動子中，as1基元一般緊鄰TATA框(在35S CaMV啟動子中的n.t.-83到-63；在FMV啟動子中為-57到-73)，但是在CsVMV啟動子中as1基元位于位置-203到-219。然而，在ComYMV啟動子中，as1基元位于核苷酸-205到-227之間，且不是根活性必需的(Medberry等，Plant J,619-626,1993):提示在ComYMV啟動子在根部的表達調節中涉及另外的元件。必需另外的研究，以確定as1元件相對于TATA框序列的位置是否調節其在根基因表達中的作用。
在位置-90到-111鑒定了一個22個核苷酸的序列CTTATCACAAAGGAATCTTATC(SEQ ID NO 23)，該序列存在于ComYMV啟動子相同的相對位置(n.t.-78到n.t.-100)，但是在其它植物副逆轉錄病毒啟動子中無該序列。在ComYMV啟動子中該基元位于在維管組織表達所需要的區中，Medberry等，Plant J,619-626,1993。CsVMV啟動子也包括基元AAGATAAGG(n.t.-186到-194)，該基元包含存在于Rbcs基因啟動子中的框I共有序列GATAAG,Donald等，EMBO J,9:1717-1726,1990。另外，在位置-257到-263鑒定出的序列GTAGAAA與MNF1葉子特異性核因子的結合位點序列相同，序列GTAGAAA發現于PEPc基因啟動子以及35S啟動子中，Yanagisawa等，Plant Mol Biol,19:545-553,1992。這些基元可能參與在葉肉細胞CsVMV啟動子的強基因表達。核苷酸-170到-130(圖3)含有類似于所述SV40增強子核心序列GTGGAAAG的兩種基元，Ondek等，EMBO J,6:1017-10251987。9．CsVMV啟動子缺失構建物的制備通過進行性5’末端缺失和內部缺失，使CsVMV啟動子突變。
用于該研究的起始質粒是含有從位置+72延伸到-443的CsVMV啟動子片段的pILTAB:CVP2,Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996。由于在所述CsVMV啟動子片段中缺乏便利的限制位點，使用聚合酶鏈式反應(PCR)來產生一組5’末端和內部缺失。
通過PCR擴增直接獲得該啟動子的5’末端缺失。我們應用在該啟動子的3’末端雜交的共用反向引物P1’(表1)，該引物與CsVMV特異性引物P2、P3、P4、P5及P6成對(表1)，以產生具有野生型CsVMV啟動子序列各種缺失的命名為B、C、D、E及F的5種啟動子片段。
表1名稱 序列(5′to 3′) 位置 有義SIDP1GCTCTAGACCAGAAGGTAATTATCCAAG -443/-423 + 24P2TATGGATCCTATGTTCAAAAATGAAG-330/-312 + 25P3AAAGGATCCTGAAGACGTAAGCACTG-222/-206 + 26P4AGAGGATCCGGTCGGTGATTGTGAA -178-/163 + 27P5AAAGGATCCTTATCACAAAGGAATC -112/-95 + 28P6TATGGATCCGTGTCATTTTTGCCCTTG -63/-43+ 29P1′ CGGAATTCAAACTTACAAATTTCTCTAAG +72/+50- 30P2′ TAAGGATCCTTTCCGCCCTTACATT -116/-132 - 31P3′ CATGGATCCTCTATGTCTCTTTCAC -149/-168 - 32P4′ ACAGGATCCGACCTTATCTTCT-173/-187 - 33P5′ ACCGGATCCTCTTCTTTTCATTGTTC-182/-199 - 34P6′ TCAGGATCCTTTTCTTCGCCTGGT -228/-243- 35P7′ ATAGGATCCATATGTGCCGCATA -334/-348- 36表1說明用通過PCR擴增產生Cs VMV啟動子片段的寡核苷酸引物。“SID’是指SEQENCE ID NO。引物含有有義(+)或反向(-)CsVMV啟動子序列。注釋了圖3中顯示的相對于轉錄起始位點的引物坐標。與P2-P6結合的引物P1’用來產生5’末端缺失的CsVMV啟動子。同樣地，與P2’-P7’結合的P1用于3’末端缺失。雖然其它引物在5’末端具有一個BamHⅠ位點，但是P1和P1’在其5’末端分別含有XbaⅠ和EcoRⅠ位點。限制位點用粗體字母標示。
在商業賣主(Gibco BRL Life Technology,Inc.)的自動合成儀上，用亞磷酰胺化學合成法制備表1中的寡核苷酸引物。
產生的PCR擴增片段在位置+72具有共用3’末端，以及其5’末端分別在位置-330、-222、-178、112、-63(圖8)。也用引物P1和P1’(表1)再合成全長的啟動子片段(A片段)。用100ng pILTAB:CVP2、2.5UTaq DNA聚合酶(Gibco-BRL)和標準濃度的引物、MgCl2及dNTP進行PCR反應。進行20個循環(94℃,30s；56℃,30s；72℃,30s)的擴增，最后在72℃延伸5分鐘。所擴增的5種DNA片段中的每個用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，并連接到含有uidA基因編碼序列(編碼β-葡萄糖醛酸糖苷酶-GUS)的質粒的相同位點，所述uidA基因連接到胭脂堿合酶基因的3’端多腺苷酸化信號(圖8)。產生的質粒根據它們攜帶的啟動子缺失命名為pA、pB、pC、pD、pE、pF(圖8)。
以兩步法構建內部啟動子缺失。首先，按如上所述進行PCR反應，以產生一組3’端缺失的CsVMV啟動子。將在啟動子5’末端雜交的有義引物(P1，表1)與6種特定CsVMV反向引物(P2’-P7’，表1)中的一一配對，以產生在位置-443的共用5’末端以及從位置-116到-334跨度的3’末端點的6種截短啟動子。然后，通過把5’端缺失啟動子上游的不同3’末端截短啟動子克隆到先前獲得的質粒(pB到pF)中，從而工程制備內部缺失。相應地，包含核苷酸-443到-334的3’缺失啟動子片段用BamHⅠ和XbaⅠ消化，并連接到所述pC質粒中的相同位點。所產生的命名為pΔB的質粒包含從核苷酸-334到-222的內部缺失(圖8)。同樣地，將從核苷酸-443到-228的片段融合到D啟動子片段，產生質粒pΔC(圖8)。在-443具有共用5’末端、而3’末端位于位置-182、-173和-149的三種片段各自克隆到質粒pE中，分別產生質粒pΔD1、pΔD2和pΔD3(圖8)。將相同的三種片段克隆到pF中，產生質粒pΔDE1、pΔDE2和pΔDE3(圖8)。用同樣方法將含核苷酸-443到-116的片段克隆到質粒pF中，產生質粒pΔE(圖8)。所有啟動子序列均用二脫氧核苷酸序列分析證實。所述不同CsVMV啟動子-uidA融合基因用XbaⅠ和HindⅢ切下，且連接到用于農桿菌介導植物轉化的pBin19雙元載體的相同位點。10．CsVMV啟動子缺失構建物的表達分析a．用農桿菌轉化植物攜帶缺失啟動子構建物的pBin19衍生質粒通過電穿孔轉移到根癌農桿菌菌株LBA4404中。如前所述進行農桿菌介導的煙草cv XanthiNN的轉化，Horsch等，Plant molecular biology manul，第A5/1-A5/9.Kluwer academic publishers,1988。再生的卡那霉素抗性植物在溫室中生長成熟并允許自花受精。R1種子在含有100mg/l卡那霉素的Murashige and Skoog(MS)培養基(Murashig & Skoog,PhysiolPlant,15:473-497,1962)中萌發，之后轉移到溫室土壤中。對于每一種構建物產生10-20種獨立轉基因系。對于每一種啟動子構建物分析10種獨立R1系。
b．組織化學分析在嫩幼苗中的CsVMV表達為了分析所述缺失啟動子在發育早期的表達型，對質粒轉化10天齡的幼苗進行組織化學GUS分析。
收集植物頂部的展開嫩葉用于GUS分析。取新鮮組織切片，置于在含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷酸(X-gluc)、100mM pH7磷酸鈉緩沖液、2mM亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀以及0.1％Triton-100的反應緩中液中，于37℃溫育6-12小時。為了嫩R1幼苗的GUS組織化學分析，收集萌發后一周左右的完整小植株，并將其侵入在GUS緩沖液中，Jefferson等，Embo J,6:3901-7,1987。在幾分鐘的真空浸潤后，于37℃溫育過夜。樣品在70％乙醇中洗滌幾次清洗干凈。如Jefferson等(Embo J,6:3901-7,1987)所述，用底物4-甲基傘形酮-β-D葡萄糖苷酸(MUG)進行定量GUS分析。
在轉化的轉基因煙草植株中，用GUS活性的組織化學染色法分析不同啟動子構建物的表達型。用PCR和/或Southern分析，證實存在完整的啟動子uidA基因盒。在含有相同啟動子構建物的植物之間所觀察到的GUS表達型相似，僅有下面報告的幾個例外。在一些啟動子構建物之間可以清楚見到顯著且可重復的染色強度的不同。在本研究中測試的植物含有1-5個拷貝的uidA融合基因。拷貝數不影響用每種構建物所觀察到的特征性表達型。而且，在拷貝數與染色表觀強度之間未觀察到明顯的關系。啟動子之間的不同染色模式表明缺失對啟動子調節的影響。CsVMV啟動子在轉基因植物的所有器官表達。最高啟動子表達的區域位于維管分子、葉和根尖的葉肉細胞。相應地，分析這三種不同組織中GUS活性，所得結果總結于表2。
表2啟動子 葉肉 韌皮部 根尖-443pA+++-330pB+++-222pC+++-178pD (+) +--112pE+ (+/-) --63 pF+---334/-222 pΔB +++-228/-178 pΔC++ +-182/-112 pΔD1 ++ +-173/-112 pΔD2 ++ +-149/-112 pΔD3 ++ +-182/-63 pΔDE1 - (-)+-173/-63 pΔDE2 - (+/-) +-149/-63 pΔDE3 - (+/-) +-116/-63 pΔE++ +表明了表2中所示的各構建物d啟動子構建物名稱和缺失終點。評價所檢測到的GUS活性表達水平并以4個水平報告于表2中“+”與全長啟動子(即pA)無可見的區別；“+/-染色強度低于全長啟動子；“(-)”很少表達；“-”無可檢測的染色。
a)5’末端缺失在攜帶缺失到位置-222的啟動子構建物的轉基因植物中出現相同模式的GUS染色，并且與用全長啟動子(構建物pA，圖9A)所觀察到的染色強度范圍相同。該啟動子再缺失到位置-178(構建物pD)引起GUS表達型的重要變化(表2)。在大多數攜帶pD構建物的植物的葉子橫截面切片中，觀察到局限于維管分子的強染色(圖9B)。在柵欄葉肉細胞和葉肉細胞中未檢測到可檢測的GUS活性。然而10種中的3種植物品系在葉肉細胞中呈現淺染色。在用pD構建物轉化的所有植物中，根尖未顯示GUS染色(圖9I)，而具有所述全長啟動子的該組織強染色。由缺失到位置-112的啟動子構建物pE引起的GUS表達限于維管分子(表2，圖9C)。該表達的強度非常低，并需要長時間溫育來檢測藍色沉淀物。構建物pF不顯示任何可檢測的表達。本研究表明，器官特異性功能可能歸因于不同的啟動子區。盡管核苷酸-443到-222區看來不是啟動子活性必需的，但是-222到-178的區在葉肉細胞以及根尖中明顯地引起啟動子表達。雖然缺失到位置-178的啟動子包括維管表達所必需的所有元件，結果它在綠色組織中幾乎無活性。pE構建物顯示非常低的維管表達。用pD構建物觀察到的強維管表達可能是由或者該區中的強維管元件引起或者存在于該區中的非特異性激活劑引起，所述激活劑影響存在于該E啟動子中的維管元件。
b)內部缺失核苷酸-334到-222區的內部缺失(啟動子ΔB)不影向所述CsVMV啟動子的總體表達型(表2)。在用pΔC轉化的的植物葉肉組織中觀察到GUS表達顯著降低(表2，圖9D)。與由5’末端缺失獲得的數據一致，該結果表明-222到-178區含有控制綠色組織中啟動子表達的重要元件。然而，在測試的所有植物品系中觀察到葉肉細胞染色密度低，提示在該細胞類型的啟動子表達中也涉及次要作用的其它元件，推定所述元件位于包含核苷酸-443到-222的區中。另外，所述維管元件顯示強染色，提示該組織中的啟動子活性不受這種缺失的影響(圖9D)。pΔC構建物不抑制在根尖的表達。這提示，除了(-222/-178)區外，在該組織的啟動子表達中可能涉及位于(-443/-222)區的另一個元件。缺失自-182到-112的缺失(構建物pΔD1)對啟動子表達有顯著影響(表2)。實際上，構建物pΔD1顯示在維管分子中僅有弱染色的維管特異性表達分布型(圖9E)。另外，在根尖也觀察到GUS表達。該啟動子構建物含有涉及較早期定義的葉肉組織表達的結構域的大部分。在pΔD1缺失的情況下，該葉肉域不能激活所述綠色組織中的啟動子。此結果可能是由于缺失位于核苷酸-182與-112之間、且為所述葉肉域啟動子激活所需要的一個或多個的順式元件所致。構建物pΔE顯示類似于非缺失啟動子的組成型表達型(表2，圖9G)。用該構建物觀察到的強維管表達提示，對于維管組織中的強啟動子表達不需要較早提及存在于(-112/-63)區中的維管分子。因此，重要的維管功能可能歸因于(-178/-112)區。包括核苷酸-182到-63的內部缺失(pΔDE1)對啟動子活性有明顯的影響(表2)。所測試的10個獨立轉基因植物中，8個在葉子和莖中沒有任何可檢測的GUS活性。延長溫育后，在兩個植株中觀察到定位于韌皮部分子的非常淡的藍色點(圖9F)。相反，根尖顯示強染色以及根部的維管分子較弱的染色。這些結果一定程度上與上述數據一致。實際上，pΔDE1啟動子未含有維管表達的區(-178到-63)以及在葉肉組織表達所需要的區(-182到-112)。推測在根組織中檢測到GUS活性是因為存在在根尖表達中涉及的(-443/-182)區。
c)(-178-112)啟動子域所述5’末端缺失的結果突出了(-182/-112)區對于所述CsVMV啟動子組成型表達的重要性。缺失pΔD1實際上抑制葉肉組織中的啟動子活性，同時也減少維管表達(圖9F)。結果是，我們制備了構建物ΔD2和pΔD3以便更詳細地研究該區(表)。從核苷酸-173到-112缺失的構建物pΔD2顯示類似于全長CsVMV啟動子的表達分布型(圖9G)。該結果提示，在(-182/-112)缺失的5’終點加上9個核苷酸可以恢復用構建物ΔD1改變的完全表達型。有趣的是，這9個核苷酸含一個GATA基元。在葉肉細胞觀察到最為顯著的不同，所述葉肉細胞當用ΔD1構建物轉化時不顯示任何藍色。因此，從-182到-173的區是葉肉表達所必需的。在構建物pΔD2和pΔD3之間未檢測到顯著差別。
相反，分別將序列-182/-173和-182/-149加到pΔDE1以產生pΔDE2和pΔDE3，并不會引起啟動子活性的恢復(表2)，只是根尖除外。在用pΔDE2和pΔDE3轉化的植物中，雖然在維管分子中的表達非常低，但是在葉肉細胞中未觀察到GUS染色(圖9E)。構建物pΔD2和pΔD3與構建物pΔDE2和pΔDE3的比較暗示對于總啟動子活性而言(-112/-63)區的重要作用。然而，如比較pΔDE3和pΔE時所提示的(表2，圖9E和9F)，加接(-149/-116)區可抑制該區缺失的明顯的作用。這些結果表明，從-222到-173的上游區不能單獨獲得完整組成表達型。存在功能上冗余且與上游區(-222到-173)結合的或者(-149/-116)區(通過pΔD3顯示)或者從-112到-63(通過pΔD2和pΔD3顯示)的區，對于所有組織中的CsVMV啟動子的最佳活性是必需的。
我們的結果表明(如比較pΔE和pΔDE3所顯示)，(-149/-116)區可能引起用所述截短啟動子D觀察到的強維管表達。
所述缺失啟動子構建物指導類似于在成熟植物觀察到的特異性表達型。在子葉的葉中，在成熟植物展開葉中賦予維管特異性表達型的構建物pD、pE、pΔD1，只在維管分子中表現出GUS染色模式(圖9H)。同樣地，在煙草植株的葉肉和維管組織具有活性的pB和pC構建物在幼苗中具有相同組成表達型(圖9H)。這些結果提示，在轉基因植物中用不同缺失觀察到的特異性表達型不受植物發育階段的影響。
c．在轉基因幼苗植株中的表達用熒光檢測法定量測定由葉組織制備的蛋白提取物中的GUS活性，Jefferson等，Embo J,6:3901-7,1987。從按實施例10.a)中所述制備的5周齡轉基因煙草植株展開嫩葉的葉脈間(interveinal)組織收集樣品。結果檢測到的酶活性水平主要反映葉肉組織中的所述啟動子表達。如圖10所示，攜帶相同啟動子構建物的不同轉基因系的GUS活性值最大變化17倍。轉基因表達的變異可能歸因于包括反映周圍染色質對基因表達影響的推定位置效應、拷貝數或基因沉默的因素的組合。這些數據證實了轉基因植物中GUS表達的組織化學定位數據。在攜帶啟動子構建物pΔD1、pΔDE1、pΔDE2和pΔDE3的植物的提取物中檢測到最低GUS活性水平。該結果與所述組織化學分析一致，因為這些缺失構建物在轉基因植物葉肉細胞中不表達報告基因，但是維管分子中顯示弱GUS染色。相應地，這些缺失的GUS活性水平低于用構建物pB和pC檢測到的水平大約20倍，所述pB和pC在轉基因植物中顯示強組成表達型。如構建物pD所示，假如缺失從-222到-178的序列，發現活性水平顯著下降。同樣，內部缺失從-222到-178的序列將用高表達構建物pB或pC檢測到的GUS活性水平降低5倍。這些結果突出了從核苷酸-228到-178的區對于綠色組織中的啟動子表達的作用。
用構建物pΔD2和pΔD3檢測到的平均活性水平高于pΔD1構建物。然而，pΔD3活性水平在較高范圍內，而構建物pΔD2產生中等水平的表達。應用組織化學檢測法檢測不到這一不同。構建物pΔD2在轉基因植物的葉肉細胞中表達，但是根據熒光檢測，GUS染色觀察過高估測該啟動子構建物的活性水平是可能的。結果熒光GUS檢測提示，包括核苷酸-173到-149的區對于綠色組織中的表達水平是重要的。正如用組織化學檢測觀察到的，缺失核苷酸-112到-63的區(構建物pΔDE3)消除用構建物pΔD3檢測到的高表達水平。然而，盡管缺失包含核苷酸-116到-63的區(構建物pΔE)，仍然檢測到高水平的GUS活性，提示從-149到-116的區對于高水平啟動子活性是有用的(如比較pΔDE3和pΔE時所示)。
d．原生質體的分離、轉化和培養基本按Watanabe等(FEBS Letters,219:65-69,1987)所述方法，從BY-2煙草懸浮細胞制備原生質體并用DNA轉染。從生長于生長室的5周齡植物的完全展開葉中分離煙草葉肉原生質。通過浸入5％chlorox液中5分鐘，然后用無菌水洗滌3次，從而使該葉子表面消毒。所述葉子在層流通風柜中干燥，并通過去皮去除下表皮。去皮的葉片在0.6M甘露醇中洗滌，然后轉移到含1.5％纖維素酶R10、0.3％離析酶R10和0.6M甘露醇，pH7.5的酶溶液中。在28℃進行消化12-16小時。消化混合物通過一層Miracloth過濾，隨后在醫用離心機以300rpm離心10分鐘。收集上清夜并用同所述同樣設定離心第二次。原生質體離心球團用20％蔗糖溶液再懸浮并轉移到50ml容積的容量瓶(volumetricflask)。所述容量瓶在J6B Beckman轉子中以100g離心7分鐘。用Pasteur移液管收集漂浮在所述蔗糖溶液表面的完整圓形原生質體，并用血細胞計數器計數。大約1×106原生質體用于各次電穿孔。
在600μl含0.55M甘露醇、5mM MES、70mM KCl、pH5.8的電穿孔緩沖液中再懸浮葉肉原生質體。30μg質粒DNA和用作內標準品的30μg 35S-熒光素酶構建物(Ow等，Science,234:856-859,1986)加到原生質體溶液中，且用BioRad基因脈沖發生器在200伏和250μF下進行該DNA轉移。在施加脈沖后，讓所述原生質體在冰中沉降1小時。原生質體在培養基中以105細胞/ml的密度培養，所述培養基含0.4M甘露醇、30％蔗糖、4.3g/l MS鹽、10mg/l鹽酸硫胺素、5mg/l煙酸、10mg/l鹽酸吡多醇、100mg/l肌醇、2mg/l甘氨酸、2mg/l NAA、0.5mg/l BAP,pH5.8。于25℃培養24小時后收集原生質體用于蛋白質提取。
如上所述，對原生質體蛋白提取物進行MUG和LUC檢測。結果以CsVMV啟動子構建物的GUS活性與內部對照的LUC活性之比表示。
e．CsVMV啟動子構建物在原生質體中的表達如實施例10中所述，用CsVMV啟動子構建物轉染由BY-2懸浮細胞以及煙草葉的葉肉細胞制備的原生質體。在電穿孔之后24小時時，如實施例6所述檢測相對于共轉染的熒光素酶質粒表達的內標準品的GUS瞬時表達。每個原生質體系統進行4次獨立轉染實驗。所獲得的結果總結于圖11。
在BY-2原生質體中，含有缺失到位置-222的CsVMV啟動子的構建物pC保留全長啟動子片段活性的88％。該啟動子進一步缺失到位置-178時，其啟動子活性迅速下降到只有完全活性的24％。盡管缺失延伸至位置-63時觀察到活性第二次下降，但構建物pD和pE幾乎具有相同的表達水平。具有12％的完整啟動子活性的構建物pF剛好高于背景水平。自核苷酸-228到-178的內部缺失(構建物pΔC)使總表達下降大于50％。令人驚奇的是，在轉基因植物中非常低表達的構建物pΔD1和pΔDE1提供高水平表達。該結果與我們在植物中觀察到的截然相反，可能反映了在兩個系統中所使用的細胞類型不同，即得自完整植物的分化細胞與得自細胞培養物的未分化細胞。為了闡明該問題，我們用葉子葉肉原生質體進行轉染實驗。自-443到-222的5’缺失(構建物pC)引起啟動子表達下降35％。構建物pD的GUS活性僅僅是全長啟動子活性的15％，而構建物pF的活性水平并不高于背景。就BY-2細胞而言，在葉肉原生質體中(-228/-178)內部缺失的作用是顯著的。實際上，當使用構建物pΔC時，GUS表達水平下降到28％。構建物pΔD1保持全長啟動子活性的57％，它大致與構建物pΔE的活性相同(未在BY-2細胞測試)。測得所述ΔDE1啟動子的活性為非缺失CsVMV啟動子水平的43％。
在兩種原生質體系統中，當通過或5’端缺失或內部缺失去除自-222到176的序列時，觀察到基因表達顯著下降。我們可以估計該區在原生質體中負責大約60％的啟動子表達。pD和pE的低活性在某種程度上與得自轉基因植物的組織化學數據一致，這些構建物在轉基因植物中表現出維管特異性表達型。
構建物pΔD1恒定產生全長啟動子GUS活性的50％以上。雖然該構建物與pΔE在植物中的表達水平非常不同，但是在葉子葉肉原生質體中它們的活性相同。同樣地，構建物pΔDE1產生與在轉基因植物獲得結果不一致地高水平表達。基于這些結果，我們得出結論，在原生質體中的控制CsVMV啟動子活性的調節機制不同于在植物中起作用的機制。(-222/-178)區在原生質體中起著關鍵作用，而自-178到-63的區看來在原生質體具有的作用較在植物中的作用小。11．實施例9-10討論進行本研究以確定CsVMV啟動子的功能結構。通過缺失分析該啟動子的調節區，確定在轉基因植物中負責啟動子表達的不同域。我們的結果表明，CsVMV啟動子的組成表達型是由不同組織特異性結構域引起的。而且，獲得最佳啟動子活性需要元件之間協同互作。如圖12所示，綜合得自轉基因植物的所有數據，以確定CsVMV啟動子的原始功能圖譜(first functional map)。自核苷酸-222到-173的區含有控制啟動子在綠色組織和根尖中表達的順式元件。正如已經描述的，Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996，該區含有在所述35S CaMV啟動子中鑒定的激活序列1(as1)的共有序列，Lam等，ProcNatl Acad Sci USA,86:7890-4,1989。在那種啟動子中，as1元件直接參與根尖表達，Fromm等，Plant Cell,1:977-84,1989，而as1元件與上游基元相互作用，以在其它組織提供啟動子活性(Benfey&Chua,Science,250:959-966,1989；Fang等，Plant Cell,1:141-50,1989；Benfey等，Embo Journal,9:1677-1684,1990a；和Benfey等，Embo Journal,9:1685-96,1990b)。Lam等，Proc Natl Acad SciUSA,86:7890-4,1989a，報道在35S啟動子中該元件的突變導致在根和莖中的啟動子活性下降80％，而在葉子中下降50％。將CsVMV啟動子截短到核苷酸-178也突出as1區在根尖的基因表達中的作用。指導限于根組織的GUS染色模式的構建物pΔDE1(缺失182/-63區)具有完整as1元件。表明as1元件與TGAla相互作用，TGAla是主要存在于根組織中得自煙草的bzip轉錄因子，Katagiri等，Nature,340:727-730,1989；和Neuhaus等，Plant Cell,6:827-834,1994。因此，用pΔDE1構建物觀察到的根表達型可能產生自TGAla和as1序列之間的相互作用。然而pΔDE1構建物以及pΔD1缺失(-182到-112)表明，在CsVMV啟動子中as1元件不能獨自激活綠色組織中的啟動子表達。另一方面，我們表明自-182到-173的區是指導葉肉細胞中的啟動子表達所必需的。有趣的是，該短區包含一個GATA基元。不能評價該GATA區獨立于as1元件的特殊作用。因此，可以想象兩種假說或者該GATA區獨自控制綠色組織中的啟動子表達，或者該GATA區和as1元件一起協同控制葉肉組織中的CsVMV啟動子活性。公開數據報道，在CaMY啟動子中的GATA基元命名為激活序列2(as2),Lam&Chua,Plant Cell,1:1147-56,1989，它也在葉子表達中涉及。而且受該GATA區控制的葉子表達依賴于位于35S啟動子的-90到-46區中的序列(它含有as1元件)。相同類型的相互作用可以控制綠色組織中的CsVMV啟動子表達。然而，在CsVMV啟動子中鑒定的GATA基元與CaMV啟動子的as2基元不同。我們發現與在東格魯水稻桿菌狀badnavirus啟動子中鑒定的GATA框(Yin&Beachy,PlantJ,7:969-980,1995)有強同源性，該GATA盒在激活該啟動子中也起重要的作用。我們也注意到，在CsVMV啟動子中的GATA基元類似于在幾種光和晝夜節律鐘調節的啟動子中發現的框Ⅰ共有序列(GTAAPu),Donald和Cashmore,The Embo Journal,9:1717-1726,1990；和Teakle及Key,Plant Molecular Biology,29:1253-1266,1995。
含有as1和GATA元件的構建物pΔDE2和pΔDE3在轉基因植物中表現出弱GUS表達型。該資料暗示，綠色組織中的啟動子激活需要一種或多種其它元件。我們觀察到自核苷酸-149到-112的區或區-112/-63能夠恢復葉肉細胞中的啟動子活性，該活性由于使用pΔDE2和pΔDE3構建物而喪失。這兩個區可能含有具有豐余功能的順式作用元件，所述元件對于綠色組織中的啟動子激活是必需的。如構建物pD或pE所示的，這些推定的順式元件位于不能指導葉肉細胞中的基因表達的啟動子區中。可能在GATA區和-149到-63的區之間協同或聯合作用機制占優勢，以允許在葉肉細胞中表達。然而，可以提出另一種解釋。我們注意到，當在GATA元件(-182到-173)和位置-63之間存在至少49個核苷酸時，該啟動子實際上是有活性的。GATA區和TATA框之間的距離可能引起所觀察到的結果。包括保持GATA區和TATA框之間的正確距離的中性接頭的構建物允許該問題得到闡明。盡管如此，在CaMV 35S啟動子中，as1和GATA基元位于位置-64和-105之間，與在CsVMV啟動子中的比較，它們非常靠近TATA框。因此，通過pΔDE2和pΔDE3內部缺失產生的GATA區和TATA框之間的較小距離應該不會妨礙as1和GATA順式元件的活性。另外，采用能夠指導維管分子中的高水平基因表達的構建物pD所獲得結果清楚提示，自-178到-63的區含有重要順式作用元件。用區-161到-56進行的體外結合檢測揭示與核蛋白的特異性相互作用，支持該假說。我們只檢測到一個滯留帶，通過用自核苷酸-141延伸到-99的43個核苷酸的片段的競爭，有效地破壞該帶的形成。因為自-149到-112和自-112到-63的兩個區在激活過程中起著有效作用，假如已經檢測到兩種滯留復合物，則它會與我們的體內數據更一致。由于在我們的核提取物中轉錄因子濃度低或對于結合位點的親合力較低，或者因為需要與其它因子協作結合，因此不能檢測到一個特異帶是可能的。-149/-99片段與核苷酸數據庫的序列比較分析沒有顯示任何強同源性。檢測該片段的核苷酸序列顯示存在位于位置-129到-113的GTAA重復。在各種功能性順式作用元件中已經發現了GTAA基元，所述順式作用元件例如玉米醇溶蛋白基因啟動子的胚乳盒(Maier等，The EmboJournal,6:17-22,1987；和Muller和Knudsen,Plant J,4:343-55,1993)、as1元件和OCS共有序列，Ellis等，Plant J,4:433-43,1993。擬南芥(Arabidopsis thaliania)EF-1a基因啟動子的tefl框(Curie等，Nucleic Acids Res,19:1305-1310,1991；Curie等，Plant Mol Biol,18:1083-1089,1992)和番茄也包含GTAA重復，且與CsVMV啟動子的GTAA框表現出相似性。已經報道位于EF-1a啟動子的-100區中的Tefl框參與循環細胞中的啟動子激活，Regad等，Mol GenGenet,248:703-711,1995。CsVMV啟動子中的GTAA重復的作用必須進一步確定。
包括核苷酸-178到-63的區指導維管分子中的CsVMV啟動子表達。該維管域含有兩個分別位于-149/-112區和-112/-63區中的獨立元件。正如較早期所述，Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996，后者包含特征為CTTATC重復的22個核苷酸序列，該核苷酸序列位于鴨跖草黃斑點badnayirus啟動子(ComYMV)的維管域中的相同對應位置(-78到-100),Medberry和Olszewski,Plant.J,3:619-26,1993。我們的結果提示，參與CsVMV啟動子的維管表達的該類元件可能是與上游葉肉區相互作用的一類元件。有趣的是，注意到CsVMV啟動子中維管元件直接位于TATA框的上游。該布置非常類似于關于RTBV和ComYMV啟動子的報道，Medberry和Olszewski,Plant J,3:619-26,1993；以及Yin和Beachy,Plant J,7:969-980,1995。在如Benfey等(Embo J,9:1685-96,1990b)所報道的CaMV啟動子中，所述維管元件位于從核苷酸-310到-209的B4亞域中。而且，在該啟動子中，在維管表達的調節中也涉及as1元件。缺失CsVMV中的as1區不會影響維管表達。調節CsVMV和CaMV啟動子中維管啟動子活性的機制不同是可能的。
在原生質體中，CsVMV啟動子活性看來基本上是受包含核苷酸-222到-178的區的控制，所述區包含as1共有序列。令人驚奇的是，觀察到得自該啟動子的表達與自-182到-63的序列無關。例如在BY-2原生質體中，我們表明pΔDE啟動子構建物保留80％以上的野生型啟動子活性。關于35S CaMV啟動子，也提及基于原生質體的瞬時檢測和轉基因植物之間的結果偏差，Fang等，Plant Cell,1:141-50,1989；和Lam,Results Probl Cell Differ,20:181-196,1994。Ow等(Proceedingof the National Academy of Science of the USA,84:4870-4874,1987)報道-90截短的35S CaMV啟動子在胡羅卜原生質體中的活性高于轉基因植物。同樣地，我們觀察到35S啟動子的-90衍生物在BY-2原生質體中產生強CAT活性(資料未展示)，然而報道用相同構建物在轉基因植物中未檢測到CAT轉錄，Fang等，Plant Cell,1:141-50,1989。原生質體處于高度應激生理狀態，Roest等，Acta BotanicaNeerlandica,42:1-25,1993。該應激狀態可能引起激活或失活與所述啟動子相互作用的各種反式作用因子。在這一方面，特別有關的是幾個關于as1元件對多種應激相關信號響應的報道，應激相關信號諸如植物生長素、水楊酸、茉莉酮酸甲酯，Liu和Lam,J Biol Chem,269:668-675,1994；Qin等，The Plant Cell,6:863-874,1994；Zhang和Singh,Proc Natl Acad Sci USA,91:2507-11,1994；和Xiang等，Plant Mol Biol,32:415-26,1996。
我們以前表明，在BY-2原生質體中，包含核苷酸-368到+20的CsVMV啟動子構建物的活性低于全長啟動子(-443到+72)2倍，Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996。本研究表明，5’末端截短該啟動子到位置-222不影響其活性水平。實際上，在BY2原生質體中，構建物pC保持80％以上的全長啟動子活性。因此，在較早期檢測到的啟動子表達中的差別最可能是由所述較長的前導片段引起的。通常已知非翻譯病毒前導序列影響信使穩定性或翻譯起始，Gallie和Walbot,Nucleic Acids Res,20:4631-4638,1992；和Dowson等，Plant Mol Biol,23:97-109,1993。最近，Chen等(J Virol,70:8411-8421,1996)報道RTBV前導序列對轉錄激活的直接作用。我們不能排除在CsVMV前導序列片段中存在這樣的順式作用序列的可能性。
所述CsVMV啟動子含有由不同域組成的模塊結構，所述不同域對組織特異性表達型顯示不同作用。而且，啟動子表達需要不同順式元件之間協同或聯合互作。這些結論使人想起用所述CaMV 35S啟動子所獲得的那些結論，Benfey和Chua,Science,250:959-966,1990。CaMV和CsVMV啟動子的組成表達型似乎是通過相同調節策略獲得的。as1和GATA順式元件的共同重要性強調了它們功能結構的相似性。然而，這兩種啟動子在其功能結構上不是完全同源的。在CsVMV啟動子中，從位置-63延伸到-149的區含有在植物中表達的必需元件。在CaMV啟動子中未鑒定出這些元件，可能表示在這兩種花椰菜花葉病毒啟動子所用的調節機制中存在某些分歧。
前面的書面說明是考慮用來說明本發明，而不是限制本發明。實際上，由前面描述來看，除了本文所說明和描述的外，本發明的各種修改對本領域技術人員來說是淺顯明白的，且這些修改在附加權利要求書范圍內。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE(B)街道10550 North Torrey Pines Road(C)城市La Jolla(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵政編碼92037(G)電話(619)784-2937(H)傳真(619)784-9399(ⅱ)發明名稱木薯葉脈花葉病毒啟動子及其應用(ⅲ)序列數36(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅴ)當前申請數據(A)申請號PCT/US 97/(B)提交日期1997年6月20日(ⅵ)在先申請數據(A)申請號US60/020,129(B)提交日期1996年6月20日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長度392個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1AGCTCAGCAA GAAGCAGATC AATATGCGGC ACATATGCAA CCTATGTTCA AAAATGAAGA 60ATGTACAGAT ACAAGATCCT ATACTGCCAG AATACGAAGA AGAATACGTA GAAATTGAAA 120AAGAAGAACC AGGCGAAGAA AAGAATCTTG AAGACGTAAG CACTGACGAC AACAATGAAA 180AGAAGAAGAT AAGGTCGGTG ATTGTGAAAG AGACATAGAG GACACATGTA AGGTGGAAAA 240TGTAAGGGCG GAAAGTAACC TTATCACAAA GGAATCTTAT CCCCCACTAC TTATCCTTTT 300ATATTTTTCC GTGTCATTTT TGCCCTTGAG TTTTCCTATA TAAGGAACCA AGTTCGGCAT 360TTGTGAAAAC AAGAAAAAAT TTGGTGTAAG CT392(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長度524個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2GGTACCAGAA GGTAATTATC CAAGATGTAG CATCAAGAAT CCAATGTTTA CGGGAAAAAC 60TATGGAAGTA TTATGTGAGC TCAGCAAGAA GCAGATCAAT ATGCGGCACA TATGCAACCT 120ATGTTCAAAA ATGAAGAATG TACAGATACA AGATCCTATA CTGCCAGAAT ACGAAGAAGA 180ATACGTAGAA ATTGAAAAAG AAGAACCAGG CGAAGAAAAG AATCTTGAAG ACGTAAGCAC 240TGACGACAAC AATGAAAAGA AGAAGATAAG GTCGGTGATT GTGAAAGAGA CATAGAGGAC 300ACATGTAAGG TGGAAAATGT AAGGGCGGAA AGTAACCTTA TCACAAAGGA ATCTTATCCC 360CCACTACTTA TCCTTTTATA TTTTTCCGTG TCATTTTTGC CCTTGAGTTT TCCTATATAA 420GGAACCAAGT TCGGCATTTG TGAAAACAAG AAAAAATTTG GTGTAAGCTA TTTTCTTTGA 480AGTACTGAGG ATACAAGTTC AGAGAAATTT GTAAGTTTGA ATTC 524(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長度526個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG 300ACACATGTAA GGTGGAAAAT GTAACGGCGG AAAGTAACCT TATCACAAAG GAATCTTATC 360CCCCACTACT TATCCTTTTA TATTTTTCCG TGTCATTTTT GCCCTTGAGT TTTCCTATAT 420AAGGAACCAA GTTCGGCATT TGTGAAAACA AGAAAAAATT TGGTGTAAGC TATTTTCTTT 480GAAGTACTGA GGATACAAGT TCAGAGAAAT TTGTAAGTTT GAATTC 526(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特征(A)長度411個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:4GGATCCTATG TTCAAAAATG AAGAATGTAC AGATACAAGA TCCTATACTG CCAGAATACG60AAGAAGAATA CGTAGAAATT GAAAAAGAAG AACCAGGCGA AGAAAAGAAT CTTGAAGACG 120TAAGCACTGA CGACAACAAT GAAAAGAAGA AGATAAGGTC GGTGATTGTG AAAGAGACAT 190AGAGGACACA TGTAAGGTGG AAAATGTAAG GGCGGAAAGT AACCTTATCA CAAAGGAATC 240TTATCCCCCA CTACTTATCC TTTTATATTT TTCCGTGTCA TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC 300TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA AAACAAGAAA AAATTTGGTG TAAGCTATTT 360TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA GAAATTTGTA AGTTTGAATT C411(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)順序特征(A)長度305個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:5GGATCCTGAA GACGTAAGCA CTGACGACAA CAATGAAAGG AAGAAGATAA GGTCGGTGAT60TGTGAAAGAG ACATAGAGGA CACATGTAAG GTGGAAAATG TAAGGAAAGT AAGTAACCTT 120ATCACAAAGG AATCTTATCC CCCACTACTT ATCCTTTTAT ATTTTTCCGT GTCATTTTTG 180CCCTTGAGTT TTCCTATATA AGGGAACCAA TTCGGCATTT GTGAAAACAA GAAAAAATTT 240GGTGTAAGCT ATTTTCTTTG AAGTACTGAG GATACAAGTT CAGAGAAATT TGTAAGTTTG 300AATTC 305(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)順序特征(A)長度261個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:6GGATCCGGTC GGTGATTGTG AAAGAGACAT AGAGGACACA TGTAAGGTGG AAAATGTAAG 60GGCGGAAAGT AACCTTATCA CAAAGGAATC TTATCCCCCA CTACTTATCC TTTTATATTT 120TTCCGTGTCA TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA 180AAACAAGAAA AAATTTGGTG TAAGCTATTT TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA 240GAAATTTGTA AGTTTGAATT C 261(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)順序特征(A)長度193個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:7GGATCCTTAT CACAAAGGAA TCTTATCCCC CACTACTTAT CCTTTTATAT TTTTCCGTGT 60CATTTTTGCC CTTGAGTTTT CCTATATAAG GAACCAAGTT CGGCATTTGT GAAAACAAGA 120AAAAATTTGG TGTAAGCTAT TTTCTTTGAA GTACTGAGGA TACAAGTTCA GAGAAATTTG 180TAAGTTTGAA TTC 193(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)順序特征(A)長度143個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:8GGATCCGTGT CATTTTTGCC CTTGAGTTTT CCTATATAAG GAACCAAGTT CGGCATTTGT60GAAAACAAGA AAAAATTTGG TGTAAGCTAT TTTCTTTGAA GTACTGAGGA TACAAGTTCA 120GAGAAATTTG TAAGTTTGAA TTC 143(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)順序特征(A)長度420個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:9TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGGATC 120CTGAAGACGT AAGCACTGAC GACAACAATG AAAAGAAGAA GATAAGGTCG GTGATTGTGA 180AAGAGACATA GAGGACACAT GTAAGGTGGA AAATGTAAGG GCGGAAAGTA ACCTTATCAC 240AAAGGAATCT TATCCCCCAC TACTTATCCT TTTATATTTT TCCGTGTCAT TTTTGCCCTT 300GAGTTTTCCT ATATAAGGAA CCAAGTTCGG CATTTGTGAA AACAAGAAAA AATTTGGTGT 360AAGCTATTTT CTTTGAAGTA CTGAGGATAC AAGTTCAGAG AAATTTGTAA GTTTGAATTC 420(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)順序特征(A)長度482個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:10TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGGATCCGGT CGGTGATTGT 240GAAAGAGACA TAGAGGACAC ATGTAAGGTG GAAATTGTAA GGGCGGAAAG TAACCTTATC 300ACAAAGGAAT CTTATCCCCC ACTACTTATC CTTTTATATT TTTCCGTGTC ATTTTTGCCC 360TTGAGTTTTC CTATATAAGG AACCAAGTTC GGCATTTGTG AAAACAAGAA AAAATTTGGT 420GTAAGCTATT TTCTTTGAAG TACTGAGGAT ACAAGTTCAG AGAAATTTGT AAGTTTGAAT 480TC 482(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)順序特征(A)長度458個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:11TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA 60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAGGATC CTTATCACAA AGGAATCTTA TCCCCCACTA 300CTTATCCTTT TATATTTTTC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA GTTTTCCTAT ATAAGGAACC 360AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA GCTATTTTCT TTGAAGTACT 420GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC 458(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)順序特征(A)長度468個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:12TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGATC CTTATCACAA AGGAATCTTA 300TCCCCCACTA CTTATCCTTT TATATTTTTC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA GTTTTCCTAT 360ATAAGGAACC AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA GCTATTTTCT 420TTGAAGTACT GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC468(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)順序特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:13TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA 60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG 300ATCCTTATCA CAAAGGAATC TTATCCCCCA CTACTTATCC TTTTATATTT TTCCGTGTCA 360TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA AAACAAGAAA 420AAATTTGGTG TAAGCTATTT TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA GAAATTTGTA 480AGTTTGAATT C 491(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)順序特征(A)長度408個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:14TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAGGATC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA GTTTTCCTAT 300ATAAGGAACC AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA GCTATTTTCT 360TTGAAGTACT GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC408(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)順序特征(A)長度418個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:15TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGATC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA 300GTTTTCCTAT ATAAGGAACC AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA 360GCTATTTTCT TTGAAGTACT GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC 418(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)順序特征(A)長度441個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:16TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA 60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG 300ATCCGTGTCA TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA 360AAACAAGAAA AAATTTGGTG TAAGCTATTT TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA 420GAAATTTGTA AGTTTGAATT C441(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)順序特征(A)長度476個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:17TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA 180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG 300ACACATGTAA GGTGGAAAAT GTAAGGGCGG AAAGGATCCG TGTCATTTTT GCCCTTGAGT 360TTTCCTATAT AAGGAACCAA GTTCGGCATT TGTGAAAACA AGAAAAAATT TGGTGTAAGC 420TATTTTCTTT GAAGTACTGA GGATACAAGT TCAGAGAAAT TTGTAAGTTT GAATTC 476(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)順序特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:18ACCGGTACCA GAAGGTAATT ATCCAAGATG T31(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)順序特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:19CGGAATTCAA ACTTACAAAT TTCTCTGAAG 30(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)順序特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:20CGCGATCCAG ACTGAATGCC CACAGGCCGT CGAG 34(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)順序特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無
(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:21AGACGTAAGC ACTGACG17(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)順序特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:22CTTATCACAA AGGAATCTTA TC 22(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)順序特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:23CTTATCACAA AGGAATCTTA TC 22(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)順序特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:24GCTCTAGACC AGAAGGTAAT TATCCAAG28(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)順序特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:25TATGGATCCT ATGTTCAAAA ATGAAG 26(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)順序特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:26AAAGGATCCT GAAGACGTAA GCACTG 26(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)順序特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:27AGAGGATCCG GTCGGTGATT GTGAA 25(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)順序特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:28AAAGGATCCT TATCACAAAG GAATC 25(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)順序特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)順序描進SEQ ID NO:29TATGGATCCG TGTCATTTTT GCCCTTG 27(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)順序特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:30CGGAATTCAA ACTTACAAAT TTCTCTAAG 29(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)順序特征
(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:31TAAGGATCCT TTCCGCCCTT ACATT 25(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)順序特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:32CATGGATCCT CTATGTCTCT TTCAC 25(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)順序特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:33ACAGGATCCG ACCTTATCTT CT 22(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)順序特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:34ACCGGATCCT CTTCTTTTCA TTGTTC 26(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)順序特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:35TCAGGATCCT TTTCTTCGCC TGGT24(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)順序特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說無(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:36ATAGGATCCA TATGTGCCGC ATA 2權利要求
1．分離核酸分子，包含在植物細胞中能夠起始操作連接的異源核酸序列轉錄的啟動子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO3(pA)中所示木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的18個連續核苷酸的同一性至少為80％。
2．權利要求1的核酸分子，包含選自分別示于SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16中的CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、pΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的核酸序列。
3．權利要求1的核酸分子，其中所述植物細胞是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞。
4．權利要求1的核酸分子，其中所述轉錄在植物葉肉組織中起始。
5．權利要求1的核酸分子，其中所述轉錄在植物韌皮部組織中起始。
6．權利要求1的核酸分子，其中所述轉錄在植物根尖組織中起始。
7．權利要求1的核酸分子，其中所述分子具有選自CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、pΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的核苷酸序列。
8．載體，包含在植物細胞中能夠起始操作連接的異源核酸序列轉錄的啟動子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的18個連續核苷酸的同一性至少為80％，并且所述核苷酸序列操作連接到異源核酸序列。
9．權利要求8的載體，其中所述啟動子包含與按照權利要求1的核酸序列。
10．轉基因植物，包含在植物細胞中能夠起始轉錄操作連接的異源核酸序列的啟動子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的18個連續核苷酸的同一性至少為80％，并且所述核苷酸序列操作連接到異源核酸序列。
11．權利要求10的轉基因植物，其中所述啟動子包含按照權利要求1的核酸序列。
12．在植物細胞中表達異源核酸序列的方法，包括a)用包含啟動子核苷酸序列的載體轉化所述植物細胞，所述啟動子核苷酸序列在植物細胞中能夠起始轉錄操作連接的異源核酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的18個連續核苷酸的同一性至少為80％，并且所述核苷酸序列操作連接到異源核酸序列；和b)在所述異源核酸序列在所述植物細胞中表達的條件下培養所述植物細胞。
13．權利要求12的方法，其中所述啟動子包含按照權利要求1的核酸序列。
14．在植物細胞中表達異源核酸序列的嵌合基因，包含以5’端到3’端方向操作連接序列的a)啟動子核苷酸序列，它在植物細胞中能夠起始轉錄操作連接的異源核酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的18個連續核苷酸的同一性至少為80％；和b)相對于所述啟動子為異源的結構核酸序列。
15．權利要求14的嵌合基因，其中所述啟動子包含按照權利要求1的核酸序列。
全文摘要
本發明涉及用于產生轉基因植物的組合物和方法。具體地說,本發明涉及木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子序列和含CsVMV啟動子序列的表達盒。本發明描述了含有操作連接到異源DNA序列、得自CsVMV啟動子的啟動子的核酸分子、載體及轉基因植物,并描述了用于含這些啟動子的轉基因植物的產生方法。
文檔編號C12N5/10GK1228814SQ97197430
公開日1999年9月15日 申請日期1997年6月20日 優先權日1996年6月20日
發明者B·貝達格爾, A·德科希科, R·N·比奇, C·福凱 申請人:斯克里普斯研究學院