專利名稱：HBV聚合酶,起源于HBV聚合酶的RNaseH,其制備過程和在篩選抗病毒劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有組氨酸末端的乙型肝炎病毒(下面稱為HBV)的聚合酶，起源于HBV聚合酶的RNase H酶，和它們的制備過程。
更具體地說，本發明涉及重組HBV聚合酶，它的具有酶活性的RNase H區，在大腸桿菌中產生該酶的表達載體，和制備HBV聚合酶和RNase H酶的過程，這兩種酶可以容易地純化，因為它們具有組氨酸末端。
本發明涉及使用HBV聚合酶和RNase H酶篩選抗病毒試劑。
HBV是肝炎病毒中的主要病毒，在世界范圍內感染了超過3億人口。HBV引起急性或慢性肝炎，導致肝硬變或肝癌(Tiollais和Buenda，美國科學，264:48-54,1991；Blumberg,B.S.,研究，F.V.Chisari，編輯，紐約，Mason出版，1984)。由于HBV的分子特征和它與肝病的密切關系，對HBV已經進行了各種研究。
HBV是DNA病毒，是肝炎病毒家族的成員，具有由核蛋白殼和核心組成的球狀結構。HBV基因組是部分雙鏈DNA，只有3.2kb大小，不是環狀。詳細地說，HBV基因組是由四個交迭的基因組成的，它們是聚合酶(P)基因，表面蛋白質(HBsAg；S,pre-S1,pre-S2)基因，核心蛋白質(HBcAg；pre-C,C)基因和X蛋白質(HBx)基因。在這些基因之間，X蛋白質基因編碼調節蛋白質，其它基因編碼HBV的結構蛋白質。聚合酶基因在總基因組中占有80％，編碼由845個氨基酸組成的94KD大小的蛋白質。
HBV通過下面所述的過程感染肝細胞。肝細胞的特異受體識別病毒顆粒表面的表面蛋白，并與它們結合，以便將病毒粒子拉進肝細胞。然后，HBV聚合酶合成部分雙鏈DNA的單鏈部分，以得到完整的HBV基因組。利用細胞RNA聚合酶轉錄3.2kb大小的HBV基因組，產生約3.5kb的前基因組mRNA，核心蛋白質(c)mRNA，表面蛋白質mRNA和X蛋白質mRNA。從這些mRNA可以翻譯病毒蛋白質。特異地，HBV聚合酶利用它的逆轉錄酶活性合成RNA中間產物，以便提供DNA基因組的模板，產生含有前基因組mRNA，核心蛋白質和諸如此類的復制體結構，這個過程稱為包殼化過程。HBV基因組可以容易地包殼，因為含有連續的谷氨酸殘基的聚合酶的3’末端與核酸有親和力。上面在復制子中的RNA中間產物的作用是負DNA鏈合成的模板，然后通過依賴于DNA的DNA聚合酶(DDDP)活性，將全長的負鏈作為正鏈DNA合成的模板，以便最后產生整個前基因組mRNA。通過重復上面的過程，產生了200-300個拷貝以上的基因組DNA的集合上面提到的病毒蛋白質因而得到表達(Tiollais和Buenda，美國科學，264:48-54,1991；Ganem,D.和Varmus,H.E.，生物化學年評，56:651-693,1987)。
有趣的是，利用RNA中間產物和逆轉錄，HBV復制了它的基因組，即使它是DNA病毒。已知逆病毒利用逆轉錄復制它的基因組。特別是，有人報道逆病毒的聚合酶是多功能酶，它顯示出依賴DNA的DNA聚合酶活性，逆轉錄酶活性，和RNase H活性。顯然，HBV聚合酶含有一系列病毒基因組復制必須的功能。也就是下面的功能(Ⅰ)蛋白質引物，(ⅱ)依賴RNA的DNA聚合酶(RT)，(ⅲ)依賴DNA的DNA聚合酶(DDDP),(ⅳ)包括在一個多肽中的RNase H活性。Kaplan等人首次報道了HBV聚合酶的逆轉錄酶活性，并且已經探索闡明了HBV復制的機制。
如上文所述，逆轉錄酶通常具有一個活性的RNase H區，它識別RNA/DNA復合物，有選擇性地只水解RNA鏈。RNase H活性對逆轉錄是必需的，因為只有在RNase H活性水解了RNA中間產物后逆轉錄酶才能連續地復制DNA。雖然最近知道RNase H酶是逆轉錄酶的一個區域，RNase H酶首次是在小牛胸腺中由Hausen和Stein發現的，并且存在于各種原核生物和真核生物中(Stein,Hans和Hausen,P.科學，166:393-395,1969)。
一般地說，活化的HBV聚合酶的RNase H區域定位于它的C末端。據報道該聚合酶的氨基酸序列和核苷酸序列與莫洛尼氏小鼠白血病病毒的聚合酶非常相似。另外，已知HBV聚合酶的活化RNase H區合成推斷可能起源于前基因組RNA的正鏈引物。具體地說，這是對病毒增殖必需的RNase H酶中的保守序列進行誘變鑒定的。另外，RNase H區起的作用是合成負鏈DNA以及正鏈DNA，并進行RNA包裝，這是通過突變鴨子HBV聚合酶的RNaseH區鑒定的。但最近有報道鴨子HBV聚合酶不能識別人HBV前基因組RNA內的結合區∈。
所以，除了利用鴨子HBV聚合酶間接研究外，應該直接研究人HBV聚合酶和它的RNase H區，目的是闡明人HBV和它的聚合酶的機制。到目前為止已對疫苗開發和肝癌進程中轉錄的調節所必需的表面蛋白和X蛋白進行了深入的研究。雖然HBV聚合酶能用于開發抗病毒試劑，但很少有人使用HBV聚合酶。因為HBV聚合酶難于從病毒顆粒分離，并難于得到足夠的量，特別是活性形式(Radziwill,G.等人，病毒學，163:123-132,1988)。目前，為了開發肝炎的新的治療劑，曾將用HBV感染的細胞系用于篩選抗病毒試劑。但是，仍然沒有開發出有效的治療劑，因為利用細胞系的篩選方法比利用HBV聚合酶或它的RNase H酶的篩選方法需要更長時間，耗費更多。
最近，為了闡明HBV，如上所述已經研究了HBV聚合酶和它的RNase H區。特別是已經嘗試了利用重組DNA技術大量生產上面的酶的研究。本發明的發明人已經通過從大腸桿菌轉化體表達，生產了重組HBV聚合酶，并且測量了該酶的酶活性，遞交了專利申請(韓國專利申請94-3918)。在大腸桿菌中重組HBV聚合酶以含有麥芽糖結合蛋白(MBP)的融合蛋白的形式產生，并且能夠容易地通過MBP親和柱色譜層析純化。但是，大量地得到活化的HBV聚合酶是困難的，因為聚合酶可以在C末端降解并且純度是低的。
通過重組DNA技術在蛋白質中插入組氨酸末端可以大量得到外源蛋白質。編碼組氨酸末端的核苷酸序列被插入在基因的5’末端或3’末端，組氨酸末端防止了重組蛋白質的降解，可以制備穩定的酶。另外，利用組氨酸末尾親和柱作為金屬螯合親和柱可以容易地純化高度活化的重組蛋白。
為了開發有效的治療試劑，通過本發明的方法已經生產了HBV聚合酶和它的RNase H酶。本發明人構建了含有HBV聚合酶基因的表達載體，該基因含有編碼重組蛋白質的C末端的組氨酸末尾，本發明人同時構建了含有起源于HBV聚合酶基因的3’末端的RNase H區基因的表達載體。另外，利用該表達載體在大腸桿菌中已經大量地以融合蛋白質的形式生產出了HBV聚合酶和它的RNase H區，并利用直鏈淀粉柱和組氨酸末尾親和柱將它們容易地純化了。所以可以制備沒有降解的高度活化和穩定的HBV聚合酶和它的RNase H酶。另外，本發明人已經開發了新的篩選抗病毒試劑的方法，其中利用了本發明的HBV聚合酶和它的RNase H區。
發明概要本發明的目的是提供一種含有組氨酸末尾的HBV聚合酶，起源于HBV聚合酶的RNase H酶和它們的制備方法。
具體地說，本發明提供了含有HBV聚合酶基因的表達載體和在大腸桿菌中制備HBV聚合酶的方法。
另外，本發明提供了含有起源于人HBV聚合酶基因的RNase H基因的表達載體和在大腸桿菌中制備RNase H酶的方法。
以及，本發明的目的是提供HBV聚合酶和RNase H酶在篩選抗病毒試劑中的用途。
具體地說，本發明提供了篩選HBV聚合酶和RNase H酶的抑制劑的方法。
附圖的簡要說明
圖1描述了構建產生含有組氨酸末尾的HBV聚合酶的表達載體pMPH的方案。
圖2描述了已經通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從大腸桿菌NM522/pMPH轉化體生產和純化的HBV聚合酶。
道1通過直鏈淀粉柱初步純化HBV聚合酶道2然后通過組氨酸末端親和柱純化HBV聚合酶圖3描述了構建產生起源于HBV聚合酶的RNase H酶的表達載體pMPRL的方案。
圖4描述了構建產生起源于人HBV聚合酶的活化的具有組氨酸末尾的RNase H酶的表達載體pMRH的方案。
圖5描述了已經通過SDS-PAGE從大腸桿菌NM522/pMRH產生和純化的RNase H酶。
道1標準分子量標記(分子量分別是97,68,43和29千道爾頓)；道2大腸桿菌轉化體的粗提取物道3通過直鏈淀粉柱初步純化的RNase H酶道4然后通過組氨酸末尾親和柱純化的RNase H酶圖6描述了已經通過Western影印分析從大腸桿菌NM522/pMRH轉化體生產和純化的RNase H酶。
A利用抗麥芽糖結合蛋白的結果B利用抗組氨酸末尾(MRGSHIS)的抗體的結果每道如上面的圖5中說明。
圖7描述了用于測試本發明的RNase H活性中的RNA/DNA復合物。
圖8表示了比較下面的樣品的RNase H的活性的結果，(ⅰ)麥芽糖結合蛋白，(ⅱ)培養的大腸桿菌轉化體的粗提取物，(ⅲ)利用表達載體pMPRL表達和直鏈淀粉柱純化的RNase H,(ⅳ)利用表達載體pMRH表達和直鏈淀粉柱，組氨酸親和柱純化的RNase H,(ⅴ)莫洛尼氏白血病病毒的逆轉錄酶。
圖9表示根據RNase H酶的量增強的RNase H活性。
圖10表示根據RNase H酶的反應期而增強的RNase H的活性。
圖11表示根據反應溫度而變化的RNase H活性。
圖12表示根據反應溶液的pH而變化的RNase H活性。
圖13表示根據氯化鉀的濃度而變化的RNase H的活性。
圖14表示根據鎂離子的濃度而變化的RNase H的活性。
圖15表示根據錳離子的濃度而變化的RNase H的活性。
優選實施方案的詳細說明本發明提供了含有組氨酸末尾的HBV聚合酶，它是通過在HBV聚合酶基因的末端插入組氨酸末尾的核苷酸序列制備的。
因為含有組氨酸末尾的HBV聚合酶是穩定的，并且容易純化，可較適當地測量它的逆轉錄酶活性等。通過利用位點特異插入誘變和其它，可以將含有組氨酸末尾的核苷酸序列插入HBV聚合酶基因的5’末端和3’末端。
特定地，本發明利用已經建立的病毒載體(韓國專利申請94-3918)，它產生與麥芽糖結合蛋白(MBP)融合的HBV聚合酶。6個組氨酸殘基的核苷酸序列被插入在HBV聚合酶基因的3’末端。特別是因為該組氨酸密碼子連續地插入在終止密碼之前，HBV聚合酶基因的開放讀碼框架(ORF)準確地定位了。組氨酸末尾可以插入在聚合酶的C末端，但保留了酶活性。結果是，構建了表達載體pMPH，這可以產生與麥芽糖結合蛋白和組氨酸末尾融合的HBV聚合酶(參見圖1)。
為了表達重組聚合酶，利用表達載體pMPH轉化微生物，以便制備轉化子。上面提到的微生物包括適于表達重組蛋白的所有種類的大腸桿菌。
具體地說，利用表達載體pMPH轉化大腸桿菌NM522菌株，并且將轉化體于1996年7月19日保藏于在韓國微生物培養物中心，漢城，韓國(登記號KCCM-10084)。
本發明提供了大量制備重組HBV聚合酶的方法。誘導含有該表達載體的大腸桿菌轉化體表達重組蛋白質，并裂解得到粗提取物，然后，將HBV聚合酶利用組氨酸末端親和柱層析和其它層析的方法純化。
準確地說，因為含有表達載體pMPH的大腸桿菌轉化體產生了與N末端的MBP融合的重組HBV聚合酶，利用直鏈淀粉樹脂柱純化了融合蛋白質形式的HBV聚合酶。利用蛋白酶因子Xa等處理分離MBP才能得到具有組氨酸末端的聚合酶。
另外，將金屬螯合親和柱作為組氨酸末尾親和柱可以高度地，方便地純化組氨酸為末端的HBV聚合酶。在純化過程中組氨酸末端保持了重組HBV聚合酶的酶活性，因為它防止了蛋白質降解，并且簡化了HBV聚合酶的純化過程。
本發明提供了起源于HBV聚合酶的RNase H酶。
因為人HBV聚合酶在N末端含有具有酶活性的RNase H區，通過在表達載體中插入HBV聚合酶基因的3’末端，并誘導大腸桿菌轉化體制備本發明的RNase H區。
本發明提供了產生與MBP融合的RNase H酶的表達載體，以便制備起源于HBV聚合酶的RNase H酶。
準確地說，進行聚合酶鏈式反應(PCR)可以得到HBV聚合酶的RNase H亞區基因，該反應利用了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3作為引物(參見序列表)和已建立的表達載體pMPLX作為模板。表達載體pMPLX可以生產形式為與MBP融合的HBV聚合酶(韓國專利申請94-3918)。已經將上面得到的RNase H酶基因插入質粒載體pMAL-c2構建表達載體pMPRL(參見圖3)。
具體地說，利用表達載體pMRH轉化了大腸桿菌NM522菌株，在韓國微生物培養物中心，漢城，韓國，在1996年11月29日已經保藏了該轉化體(登記號KCCM-10092)。
另外，本發明提供了表達載體，該載體產生與MBP和組氨酸末端融合的RNase H酶，目的是制備起源于HBV聚合酶的RNase H酶。
準確地說，從表達載體pMPH得到含有組氨酸末端的核苷酸序列的HBV聚合酶的基因片斷，并插入表達載體pMPRL以便構建表達載體pMRH(參見圖4)。
具體地說，利用表達載體pMPH轉化大腸桿菌NM522菌株，將該轉化體于1996年11月11日保藏于漢城，韓國，微生物培養物中心(登記號KCCM-10091)。
本發明提供了制備起源于HBV聚合酶的RNase H酶的方法，其中利用了表達載體和如上所述的轉化體。
準確地說，為了純化HBV聚合酶的RNase H區，在含有表達載體的大腸桿菌轉化體中誘導該蛋白質表達，并裂解得到粗提取物，然后利用直鏈淀粉樹脂和含有麥芽糖的緩沖液純化融合蛋白形式的RNase H酶。組氨酸為末端的RNase H酶通過蛋白酶因子Xa等的處理分離MBP才能得到。通過如上所述同樣的過程，進行組氨酸末端親和柱層析高度純化組氨酸為末端的RNaseH酶。
利用SDS-PAGE和Western印跡已經確定了上面純化的RNase H酶和HBV聚合酶的分子量和純度。結果本發明的HBV聚合酶和RNase H酶被鑒定為沒有降解的完整的形式(參見圖2，圖5，和圖6)。
已經檢測了在本發明的HBV聚合酶中的逆轉錄酶活性。結果是，含有MBP和組氨酸末尾的重組聚合酶已經顯示了比沒有組氨酸末尾的聚合酶更高的逆轉錄酶活性。詳細地說，依賴于DNA的DNA聚合酶(DDDP)和依賴于RNA的DNA聚合酶(RDDP)的活性在組氨酸為末端的形式中比完整形式中高19倍(參見表1)。
準確地說，為了研究由RNase H活性的RNA降解，可以將RNA/DNA復合物用作酶反應的底物。選擇起源于質粒pBS的質粒pBS-oligo作為制備RNA/DNA復合物的DNA模板，在T7啟動子下游102個核苷酸處的限制性位點SmaⅠ內消化，然后利用T7 RNA聚合酶，放射性核苷酸和其它進行體外翻譯。利用QIAquick核苷酸除去試劑盒得到102個核苷酸的RNA，加入QIAGEN和合成的SEQ ID NO:4的DNA低聚核苷酸(43-mer)以便制備圖7顯示的RNA/DNA復合物(參見序列表)。
為了測量RNase H酶活性，將放射性活性的RNA/DNA復合物與RNase H酶反應，利用閃爍雞尾酒和諸如此類測量反應混合物中的放射性活性。在這時，利用了作為對照樣品的麥芽糖結合蛋白，粗提取物部分，作為比較樣品的商業可得莫洛尼氏小鼠白血病病毒的逆轉錄酶和其它。結果是，本發明的RNase H酶比莫洛尼氏小鼠白血病病毒的逆轉錄酶更加活化，高約90％的活性(參見圖8)。
為了檢測RNase H區的酶特性，利用適當的緩沖液和放射性活化RNA/DNA復合物，在各種反應條件下測量RNase H活性。
結果是，根據酶量RNase H區的酶活性增加(參見圖9)，并化了約3小時的反應時期顯示出來(參見圖10)。優選地，酶反應的溫度范圍是32-42℃(參見圖11)，pH范圍是較寬的，如7.5-8.8(參見圖12)。優選地，酶反應的反應混合物應該含有20-100毫摩爾范圍的KCl濃度(參見圖13)，4-8毫摩爾范圍的鎂濃度(參見圖14)，和4-12毫摩爾范圍的錳濃度(參見圖15)。
更優選地，RNase H的酶反應的最適溫度是37℃，最適pH是7.9，最適NaCl濃度是40毫摩爾，鎂離子是4毫摩爾和錳離子是8毫摩爾。
本發明提供了HBV聚合酶和起源于HBV聚合酶的RNase H酶在篩選抗病毒試劑中的用途。
為了利用HBV聚合酶選擇在HBV的增殖時期起作用的HBV抑制劑，(a)將HBV聚合酶與同聚物模板，放射性核苷酸和抗病毒試劑反應，(b)使(a)步驟中的反應溶液吸附到陰離子吸附濾紙上，并干燥，(c)利用閃爍雞尾酒測量吸附濾紙的放射性活性和，(d)將(c)步驟的結果與比較樣品的比較，該比較樣品在反應混合物中不含有抗病毒試劑，并被用于計算HBV增殖的抑制效應。
然后，優選地將poly(dA)/oligo(dT)12 18用作DDDP活性的同聚物模板，將poly(rA)/oligo(dT)12 18用作RDDP活性的同聚物模板，優選使用DE-81陰離子吸附濾紙。
另外，為了利用起源于HBV聚合酶的RNase H酶篩選抗病毒試劑，首先，通過如下所述的過程制備酶底物，然后測量底物的放射性活性。
為了選擇利用HBV聚合酶的RNase H區在HBV的增殖時期起作用的HBV抑制劑(a)將RNase H酶與反應底物和抗病毒試劑反應，(b)加入乙酸銨終止(a)步驟的反應并加入乙醇沉淀和離心，(c)測量沉淀的上清液的放射性活性和，(d)將(c)步驟的結果與比較樣品的那些比較，該比較樣品在反應混合物中不含有抗病毒試劑，并用于計算HBV增殖的抑制效應。
如下面的實施例所示，說明了本發明的實踐和當前的優選實施方案。
但是，本領域的技術人員在考慮了本公開物的基礎上，在本發明的精神和范圍內可以作出一些修改和改進。實施例<實施例1>構建表達載體pMPH為了構建表達載體pMPH，通過位點特異的插入誘變，將6個組氨酸殘基的核苷酸序列插入已經確立的表達載體pMPLX(韓國專利申請94-3918)的HBV聚合酶基因的3’末端。
由表達載體pMPLX轉化大腸桿菌CJ236菌株(ung-,dut-)，培養直到OD600為0.3，然后用M13 K07輔助噬菌體感染。在1小時后，在生長培養基中加入卡那霉素，在培養過夜后，得到含有尿嘧啶的DNA。通過進行體外DNA聚合化構建含有6個組氨酸殘基，(His)6為末端的突變體表達載體，其中根據Kunkel的方法利用了含有SEQ ID NO:1(參見序列表)核苷酸序列的誘變引物和上面的單鏈DNA(Kunkel,T.A.，美國核酸科學進程，82:488,1985)。利用插入的限制酶EcoRⅠ位點和DNA序列分析選擇上面所述的突變體表達載體。
具體地說，制備了誘變引物使HBV聚合酶基因的開放讀碼框架中含有緊接終止密碼上游的6個組氨酸密碼。所以，將組氨酸末端插入而在HBV聚合酶基因中沒有任何序列變化。另外，將表達載體pMPLX中缺乏的EcoRⅠ位點(GAATTC)導入，緊接著終止密碼的下游，所以，可以容易地選擇突變體表達載體和轉化體。突變體表達載體可以含有恰當的開放讀碼框架和表達方向，這通過分析DNA序列可以檢測。
結果是，構建了本發明的表達載體pMPH，它可以產生重組蛋白，即與MBP和組氨酸末尾融合的HBV聚合酶(參見圖1)。<實施例2>HBV聚合酶的表達為了得到大量的HBV聚合酶，利用表達載體pMPH轉化了大腸桿菌NM522菌株，該菌株可以產生轉化體蛋白，即與MBP和組氨酸末端融合的HBV聚合酶。
在3毫升，2X YT培養基中接種如上所述的轉化體，培養16-20小時，將生長培養基稀釋1∶100，再次接種，進入400毫升的LB培養基。然后，在37℃，溫育生長培養基直到OD600達到0.5，在大腸桿菌培養基中加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再次在20-37℃培養6-18小時。<實施例3>純化HBV聚合酶為了純化HBV聚合酶，在4,000RPM離心實施例2中誘導表達的大腸桿菌培養物20分鐘。在5毫升緩沖液A(10毫摩爾Tris-Cl,pH7.4,200毫摩爾NaCl,1毫摩爾EDTA)中再懸浮細胞沉淀，并通過超聲波裂解20秒，5次。為了利用MBP分離HBV聚合酶，離心粗提取物，將上清液加載到直鏈淀粉樹脂柱(新英格蘭生物實驗室)，用緩沖液A,50倍上清液體積的體積洗滌該柱的樹脂。利用含有10毫摩爾麥芽糖的緩沖液A洗脫與MBP融合的HBV聚合酶。
另外，為了利用組氨酸末端高度純化HBV聚合酶，如上再次加載到Ni2+-NTA樹脂(QIAGEN)得到蛋白質部分。在加載蛋白質樣品通過柱后，利用含有10毫摩爾咪唑的10倍樹脂體積的緩沖液B(50毫摩爾NaHPO4,300毫摩爾NaCl,10％甘油，10毫摩爾咪唑，pH6.0)，洗滌柱，然后再用30倍樹脂體積的緩沖液B洗滌柱。利用10-200毫摩爾濃度梯度的咪唑洗脫和純化HBV聚合酶。<實施例4>鑒定HBV聚合酶的分子量和純度為了鑒定實施例3中得到的HBV聚合酶的分子量和純度，將純化的HBV聚合酶在SDS-PAGE上根據Laemmli的方法電泳，同時進行了Western影印，并根據Bradford的方法定量HBV聚合酶的量。
將可以結合組氨酸為末端的蛋白質的MRGSHis-Ag用于Western影印分析。以1∶2,000的比例稀釋的MRGSHis-Ag(QIAGEN)用作第一個抗原，和1∶16,000比例稀釋的兔抗小鼠IgG(Sigma)用作第二個抗原。
結果是，鑒定了含有組氨酸末尾的本發明的HBV聚合酶含有144KD大小的蛋白質，加載到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，該大小的蛋白質因為蛋白質的水解在已經純化的HBV聚合酶的情況中不能檢測到(參見圖2)。表達的蛋白質濃度是400微克/升，該濃度與已經純化的HBV聚合酶相同。<實施例5>鑒定HBV聚合酶的活性為了鑒定在上面的過程中純化的重組HBV聚合酶的活性，在含有底物的7.5％SDS-PAGE上電泳重組的HBV聚合酶(4.5％濃縮膠)。在電泳后，在復性緩沖液溶液(50毫摩爾Tris-Cl,pH7.4)中浸泡凝膠，并振搖在4℃，溫育24小時。
將通過除去SDS復性的凝膠與100毫升反應溶液(50毫摩爾Tris-Cl,pH7.4,5毫摩爾DTT,5毫摩爾MgCl2,0.01％NP-40,10毫摩爾dGTP,10毫摩爾dATP,10毫摩爾dCTP,20微居里32P-dTTP)混合，將反應混合物在37℃溫育16小時。然后，在如上所述的反應混合物中加入500毫升5％的TCA-1％Na4P2O7，在4℃洗滌凝膠20小時，將干燥的凝膠在X射線的膠片上曝光。
結果是，推測為HBV聚合酶的144KD的蛋白質與MBP和顯示逆轉錄酶活性的組氨酸末尾融合。另外，含有組氨酸末尾的HBV聚合酶的逆轉錄酶活性比沒有組氨酸末尾的HBV聚合酶更加有活性。<實施例6>測試HBV聚合酶活性為了測試如上所述的過程純化的HBV聚合酶的活性，將含有0.5微克純化的HBV聚合酶，標準聚合酶反應緩沖液，50納克同聚物模板，和2微居里的32P-d TTP(～3000居里/毫摩爾)的反應混合物在37℃溫育1小時。在DDDP活性的測試中，將poly(dA)/oligo(dT)12-18用作模板，在RDDP活性的測試中，將poly(rA)/oligo(dT)12-18用作模板。將這一反應混合物吸附于盤狀濾紙，洗滌盤狀濾紙，閃爍現象雞尾酒(5.5克/升PP0,0.15克/升P0P0P)混合，利用液體閃爍計數器測量32P-dTTP的放射性活性。
結果是，本發明的含有組氨酸末端的HBV聚合酶相對顯示了比已經純化的聚合酶的活性更高的DDDP和RDDP特異活性(cpm/微克)。特定地說，本發明的表達載體產生的重組HBV聚合酶的DDDP活性比已經純化的聚合酶高19倍，本發明的表達載體產生的重組HBV聚合酶的RDDP活性比已經純化的聚合酶高5.6倍(參見表1)。<表1>比較重組HBV聚合酶的酶活性<
lt;實施例7>構建表達載體pMPRL為了構建表達載體pMPRL，該載體產生起源于HBV聚合酶的RNase H酶，通過PCR擴增了編碼RNase H區(亞區)的HBV聚合酶基因的3’末端的基因部分。5’末端的引物含有SEQ ID NO:2的序列，3’末端的引物含有SEQ IDNO:3的序列(參見序列表)。表達載體pMPLX(韓國專利申請94-3918)用作DNA模板。已經擴增的DNA部分的大小鑒定為0.5kb。通過XmnⅠ限制酶位點切割上面大小的DNA部分，與質粒pMAL-c2連接。通過限制酶EcoRⅠ切割連接的產物，這樣，分離了對應于RNase H酶的DNA部分。將上面的DNA部分與利用EcoRⅠ限制酶切割的質粒pMAL-c2連接，最后構建7.2kb大小的表達載體pMPRL(參見圖3)。質粒pMAL-c2的MBP基因的開放讀碼框架和RNase H基因準確地連接，這通過連接的EcoRⅠ位點序列分析得到了鑒定。<實施例8>構建表達載體pMRH為了構建表達載體pMRH，它產生了起源于含有組氨酸末尾的HBV聚合酶的RNase H區，利用了表達載體pMPH，它產生含有組氨酸末尾的HBV聚合酶。通過限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割表達載體pMPH，所以得到了含有編碼組氨酸末尾的DNA序列的DNA部分。在通過限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割實施例7中構建產生RNase H酶的表達載體pMPRL，在上面的表達載體pMPRH中插入了編碼組氨酸末尾的DNA序列。結果是，構建了表達載體，它能產生重組蛋白，與MBP和C末端的組氨酸末端融合的RNase H區(參見圖4)。<實施例9>表達起源于人HBV聚合酶的RNase H區利用表達載體pMPRL和pMRH，在大腸桿菌中表達了起源于HBV聚合酶的RNase H區。分別利用表達載體pMRH和pMPRL轉化大腸桿菌NM522，在2X YT培養基中過夜培養轉化體。將這一生長培養基稀釋1∶100，接種進入富葡萄糖的培養基，溫育直到OD600達到0.5。在培養基中加入IPTG，它的最后濃度是0.5毫摩爾。將上面生長的培養基再次在23℃溫育12小時，并且表達RNase H區。
在3,000rpm離心上面培養的肉湯，用10毫升柱緩沖液(10毫摩爾Tris-HCl,pH7.4,200毫摩爾NaCl,1毫摩爾EDTA)洗滌細胞沉淀，再次離心并再懸浮。重復冷凍，熔化細胞4次，然后，通過超聲波處理裂解10秒3次。在13,000rpm,4℃離心上面的過程中制備的粗提取物，分離上清液。重復上面的過程3次，然后將上清液通過直鏈淀粉樹脂。利用50倍樹脂體積的柱緩沖液洗滌柱，利用含有10毫摩爾麥芽糖的緩沖液洗脫RNase H區。通過用蛋白酶因子Xa處理，將純化的重組蛋白質水解成MBP和RNase H區。
另外，從本發明的表達載體pMRH產生的RNase H區通過利用組氨酸為末端的親和柱得到純化，因為RNase H在C末端具有組氨酸末尾。利用超聲波處理緩沖液(50毫摩爾磷酸鈉，pH8.0,300毫摩爾氯化鈉)活化組氨酸末端親和柱中使用的樹脂(Ni-NTA,QIAGEN)，在直徑約為1厘米的玻璃管中裝載4-5毫升活化的樹脂。從上面的敘述得到的蛋白質樣品以0.1毫升/分鐘的流速通過樹脂，利用100-200倍蛋白質樣品的體積的洗滌緩沖液(50毫摩爾磷酸鈉，pH6.0,300毫摩爾氯化鈉，10％甘油)洗滌柱。利用濃度梯度為0.01-0.5摩爾的咪唑洗滌柱洗脫重組蛋白質。
結果是，從組氨酸末尾的親和柱在50毫摩爾咪唑時分離活化的RNase H區。進行SDS-PAGE和Western影印鑒定起源于人HBV聚合酶的純化RNaseH區(參見圖5和圖6)。<實施例10>制備RNase H酶的底物為了鑒定本發明的RNase H活性，利用T7RNA聚合酶進行體外轉錄制備了用作RNase H酶的底物的RNA/DNA復合物。用于制備流出轉錄物的模板是起源于質粒pBS的質粒pBS-oligo。利用質粒pBS-oligo轉化的大腸桿菌，大量培養轉化體以便利用堿性裂解方法得到大量質粒pBS-oligo。限制酶SmaⅠ位點定位于質粒pBS-oligo的T7啟動子的下游的102個核苷酸處。
利用限制酶SmaⅠ切割質粒pBS-oligo，在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳，從凝膠上洗脫，用于進行體外轉錄。利用反應混合物進行體外轉錄，反應混合物由下面物質組成30微升蒸餾水，20微升5X反應緩沖液(200毫摩爾Tris-HCl，片。5,30毫摩爾氯化鎂，10毫摩爾亞精胺，50毫摩爾氯化鎂)，10微升DTT,10微升含有2-5微克限制酶SmaⅠ消化的質粒pBS-oligo的溶液，5微升2.5毫摩爾ATP,5微升2.5毫摩爾GTP,5微升2.5毫摩爾UTP,5微升0.1毫摩爾CTP,3微升RNasin,5微升[32P]CTP50微居里，2微升T7RNA聚合酶。將總體積調整到100微升，將上面的反應混合物在37℃溫育1-2小時。然后，產生的RNA是102個核苷酸長，利用QIAquick核苷酸除去試劑盒(QIAGEN)分離出來，將其中的1-5微升在8摩爾脲-6％TBE凝膠上電泳，然后干燥凝膠，在X射線膠片上曝光48小時以上。顯影X射線膠片以便檢測放射性活性信號。
鑒定102個核苷酸RNA的放射性活性信號，將其與等摩爾的合成DNA低聚物(43-mer)混合，該低聚物具有SEQ ID NO:4的DNA序列，在70-80℃加熱3-10分鐘，然后冷卻至室溫。最后通過上面過程制備了具有放射性活性信號的RNA/DNA復合物，圖7顯示了RNA/DNA復合物的結構。<實施例11>鑒定RNase H活性利用實施例9中純化的RNase H酶和實施例10中制備的含有放射性信號的RNA/DNA復合物鑒定RNase H活性。為了鑒定本發明的RNase H活性，將本發明的1微克RNase H酶與40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9),4毫摩爾氯化鎂，40毫摩爾氯化鉀和RNA/DNA復合物混合，在37℃溫育上面的反應混合物3小時，然后在反應混合物中加入50毫摩爾EDTA終止反應。在小體積的反應溶液中加入同樣量的10％的冰冷的TCA。在4℃溫育上面的反應混合物1小時，在13,000rpm,4℃離心15分鐘。得到上清液，利用閃爍雞尾酒測量20微升上清液的放射性活化信號。
作為對照，在同樣條件下將與RNase H區融合的MBP反應，但沒有檢測到的放射性活化信號。另外，在同樣條件下相互比較下面蛋白質的RNase H活性，下面的蛋白質包括實施例9得到的粗提取物，莫洛尼氏小鼠白血病病毒的商業可得逆轉錄酶，在從表達載體pMPRL表達后從直鏈淀粉柱純化的RNase H酶，在從表達載體pMRH表達后，首先利用直鏈淀粉柱，然后利用組氨酸為末端的親和柱純化的RNase H酶。結果是，RNase H區的活性是商業可得的莫洛尼氏白血病病毒的逆轉錄酶中含有的RNase H的活性的90％(參見圖8)。<實施例12>根據RNase H酶的量變化的RNase H活性為了測量根據反應條件變化的RNase H活性，改變RNase H酶的反應條件，測量RNase H酶的活性。詳細地說，當酶量從0變化到1.6微克，將本發明的RNase H酶與下面物質混合40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9),4毫摩爾氯化鎂，40毫摩爾氯化鉀，30,000cpm RNA/DNA復合物，并將反應混合物在37℃溫育3小時。結果是，當酶量增加時，RNase H酶活性變得更高(參見圖9)。<實施例13>根據反應時期而變化的RNase H活性將1微克RNase H酶與下面物質混合40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9),4毫摩爾氯化鎂，40毫摩爾氯化鉀和30,000cpmRNA/DNA復合物，如實施例11所述將反應混合物在37℃溫育，測量顯示足夠的酶活性的反應時期。大約需要3小時活化RNase H酶(參見圖10)。<實施例14>根據反應溫度而變化的RNase H活性當溫度從0變化到52℃，將1微克RNase H酶與下面物質混合40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9),4毫摩爾氯化鎂，40毫摩爾氯化鉀，30,000cpmRNA/DNA復合物，將反應混合物如實施例11所述溫育3小時。
結果是，鑒定了具有RNase H活性的溫度范圍是相當寬的范圍32-42℃(參見圖11)。<實施例15>隨著反應溶液的pH而變化的RNase H活性當pH從pH6.0變化到pH10.0時，將1微克RNase H酶與下面的物質混合40毫摩爾Tris-Cl,4毫摩爾氯化鎂，40毫摩爾氯化鉀，和30,000cpmRNA/DNA復合物混合，將反應混合物在37℃如實施例11所述溫育3小時。RNase H活性在pH范圍7.5-8.8具有最高的值(參見圖12)。<實施例16>根據氯化鉀的濃度而變化的RNase H活性當氯化鉀的濃度從0變化到400毫摩爾，將1微克RNase H酶與下面物質混合40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9),4毫摩爾氯化鎂和30,000rpmRNA/DNA復合物，將反應混合物在37℃如實施例11所述溫育3小時。當氯化鉀的濃度在20-100毫摩爾時RNase H的活性的值最高(參見圖13)。<實施例17>根據鎂離子的濃度而變化的RNase H活性當鎂離子(Mg2+)的濃度從0變化到50毫摩爾時，將1微克RNase H酶與下面物質混合40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9),40毫摩爾氯化鉀和30,000cpmRNA/DNA復合物，將反應混合物在37℃如實施例11所述溫育3小時。當鎂離子的濃度為4到8毫摩爾時RNase H活性的值最高(參見圖14)。<實施例18>根據錳離子的濃度而變化的RNase H活性當反應溶液的陽離子(Ⅱ)用錳離子(Mn2+)替代時，將1微克RNase H酶與下面物質混合40毫摩爾Tris-Cl(pH7.9)，40毫摩爾氯化鉀，和30,000cpmRNA/DNA復合物，將反應混合物在37℃如實施例11所述溫育3小時。當錳離子的濃度為4-12毫摩爾時，RNase H活性最高(參見圖15)。<實施例19>利用HBV聚合酶篩選HBV抗病毒試劑利用本發明的HBV聚合酶，為了篩選抗病毒試劑進行下面的反應。將50微升反應混合物在37℃溫育1小時，該反應混合物分別含有下面物質0.5微克純化的HBV聚合酶，50毫摩爾Tris-Cl,pH7.4,50毫摩爾氯化鉀，0.5毫摩爾氯化鎂，1毫摩爾DTT,0.01％NP-40,50納克同聚物模板(RDDP:poly(rA)/oligo(dT)12-18；DDDP:poly(dA)/oligo(dT)12-18)和2微居里[α-32P]TTP(3,000居里/毫摩爾)。然后，通過TCA沉淀反應溶液，吸附于DE-81陰離子吸附濾紙。用0.1摩爾磷酸緩沖液洗滌含有樣品的吸附濾紙，用紅外射線干燥已洗滌的濾紙。然后，在與閃爍雞尾酒混合后，通過測量放射性活性測試RNase H活性(cpm)。
為了利用上面的過程選擇抗病毒試劑，在上面的反應混合物中加入了10微升推測的抗病毒試劑，測量抗病毒活性，并與不含有抗病毒試劑的反應樣品的酶活性比較。<實施例20>利用RNase H酶篩選HBV抗病毒試劑利用本發明的RNase H酶，為了篩選抗病毒試劑通過下面的過程制備酶底物。
為了制備RNA轉錄物，利用大腸桿菌RNA聚合酶純化和轉錄M13噬菌體的單鏈DNA。將下面的反應混合物在37℃與1微升大腸桿菌RNA聚合酶溫育15小時4微升緩沖液溶液(200毫摩爾Tris-Cl,pH7.5,30毫摩爾氯化鎂，10毫摩爾亞精胺，和50毫摩爾氯化鈉)，2微升100毫摩爾DTT,1微升RNasin(Promega),1微升2.5毫摩爾ATP,1微升2.5毫摩爾GTP,1微升2.5毫摩爾UTP,0.6微升沒有RNase的蒸餾水，2.4微升0.1毫摩爾CTP,1微升M13mp19的單鏈DNA(約1微克/微升)和5微升[α-32P]CTP(10微居里/微升，Amersham)。將上面的反應混合物通過SephadexG-50柱，以便除去殘留的核酸。檢測通過上面的柱的反應溶液的體積，在上面的反應混合物中加入2×乙醇的體積，在-20℃沉淀1小時。通過離心和用70％的乙醇洗滌得到上面沉淀的RNA轉錄物。然后，在100微升10毫摩爾Tris-Cl,pH8.0中再懸浮RNA轉錄物，檢測1微升RNA轉錄物溶液中的放射性活性信號。
另外，將通過上面的過程得到了RNA轉錄物和M13mp19的單鏈DNA懸浮于緩沖液溶液(10毫摩爾Tris-Cl,pH8.0,1毫摩爾EDTA,80毫摩爾氯化鉀)中，將同樣的量在85℃加熱2分鐘，然后在室溫下冷卻上面的反應混合物。結果是，通過用乙醇沉淀得到RNA/DNA復合物，并在100微升TE緩沖液(pH8.0)中懸浮。
為了測量上面的RNase H活性，制備含有下面物質的反應混合物25微升2×緩沖液溶液(40毫摩爾Tris-Cl,pH8.0,20毫摩爾氯化鉀，2毫摩爾氯化鎂，4毫摩爾DTT)，5微升RNase H區，5微升酶底物(大約50,000cpm)和15微升蒸餾水，并將反應混合物在37℃溫育30分鐘。利用25微升7.5摩爾乙酸銨終止反應，并利用230微升乙醇沉淀。為了測量抗病毒活性，在上面的反應混合物中加入了5微升抗病毒試劑，測量抗病毒活性并與不含有抗病毒試劑的的反應樣品的RNase H的酶活性比較。
正如上面的敘述說明的，在大腸桿菌中可以大量生產高度活化的HBV聚合酶，因為本發明的HBV聚合酶由于它的組氨酸末尾是穩定的。利用組氨酸末端親和柱色譜層析可以容易地純化本發明的HBV聚合酶。準確地說，該HBV聚合酶顯示了高度特異的活性，如比已經純化的聚合酶高5-20倍的活性，因為通過開發MBP和組氨酸末端可以成倍地純化HBV聚合酶。在大腸桿菌中也可以大量地產生起源于HBV聚合酶的RNase H酶，并容易地純化。另外，在純化過程中高度地保留了RNase H活性。
所以，可以利用本發明的HBV聚合酶和它的RNase H區，以便有效地選擇各種抗病毒試劑。可以利用本發明的篩選方法選擇的抗病毒試劑以便理解HBV復制的機制，并治療HBV感染引起的肝炎，肝硬化，和肝癌。序列表(1)總的資料(ⅲ)序列數4(2)SEQ ID NO:1的資料(Ⅰ)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GGAGACCACC GCATCACCAT CACCATCACT GAGAATTCAC GCCCATCAGG(2)SEQ ID NO:2的資料(Ⅰ)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CCCCGTTGCC CGGGAATTCC GAACAGGTCT CTGCC(2)SEQ ID NO:3的資料(Ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TCACGGTGGT CTCCATGC(2)SEQ ID NO:4的資料(Ⅰ)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:AATTGCGTGC GAGGCGATTG GTTTGGGGCC AGAGTGGGCC AGG
權利要求
1．含有組氨酸末端的HBV聚合酶。
2．根據權利要求1所述的HBV聚合酶，它與麥芽糖結合蛋白融合。
3．根據權利要求2所述的HBV聚合酶，在C末端含有組氨酸末端。
4．在大腸桿菌中產生權利要求1所述的HBV聚合酶的表達載體。
5．根據權利要求4所述的表達載體，它是表達載體pMPH。
6．利用權利要求4所述的表達載體轉化寄主細胞而制備的大腸桿菌轉化體。
7．根據權利要求6所述的大腸桿菌轉化體，它是利用表達載體pMPH(KCCM-10084)轉化寄主細胞而制備的。
8．制備根據權利要求1所述的HBV聚合酶的方法，包括如下步驟(a)培養權利要求6所述的大腸桿菌轉化體，(b)誘導HBV聚合酶的表達，(c)對大腸桿菌轉化體的粗提取物進行組氨酸末端親和柱色譜層析。
9．制備根據權利要求8所述的HBV聚合酶的方法，還含有如下步驟(a)進行直鏈淀粉親和柱色譜層析，(b)利用蛋白酶因子Xa處理。
10．起源于人HBV聚合酶的RNase H酶。
11．根據權利要求10所述的RNase H酶，它與麥芽糖結合蛋白融合。
12．根據權利要求11所述的RNase H酶，在C末端含有組氨酸末端。
13．根據權利要求10所述的RNase H酶，它在32-42℃，在pH范圍7.5-8.8，在含有20-100毫摩爾的氯化鉀，4-8毫摩爾的鎂離子或4-12毫摩爾的錳離子的反應溶液時是活化的。
14．產生權利要求11所述的RNase H酶的表述載體pMPRL。
15．利用權利要求14所述的表達載體pMPRL(KCCM-10092)轉化寄主細胞而制備的大腸桿菌轉化體。
16．生產權利要求12的RNase H酶的表達載體pMRH。
17．利用權利要求16所述的表達載體pMRH(KCCM-10091)轉化寄主細胞而制備的大腸桿菌轉化體。
18．制備權利要求10所述的RNase H酶的方法，包括如下步驟(a)在培養權利要求15或權利要求17所述的大腸桿菌轉化體后誘導RNase H酶的表達，(b)對粗提取物進行直鏈淀粉親和柱色譜層析，(c)用蛋白酶因子Xa處理。
19．根據權利要求18制備權利要求10的RNase H酶的方法，還包括另外一個步驟對權利要求17所述的大腸桿菌轉化體進行組氨酸末端的親和柱色譜層析。
20．權利要求1所述的HBV聚合酶在篩選人HBV的抗病毒劑中的應用。
21．權利要求10所述的RNase H酶在篩選RNase H酶的抑制劑和人HBV的抗病毒中的應用。
22．篩選抗病毒劑的方法，包括如下步驟(a)將權利要求1所述的HBV聚合酶與放射性核苷酸和抗病毒劑反應，(b)將反應溶液吸附于陰離子吸附濾紙，并干燥濾紙，(c)利用閃爍雞尾酒測量(b)步驟的吸附濾紙的放射性活性，(d)將(c)的結果與(a)中沒有抗病毒試劑反應的比較樣品的結果進行比較。
23．篩選抗病毒試劑的方法，包括如下的步驟(a)將權利要求10的RNase H酶與RNA/DNA復合物和抗病毒劑反應，(b)加入乙酸銨終止(a)步驟的反應，利用乙醇沉淀，并離心，(c)測量(b)步驟的上清液的放射性活性。(d)將(c)步驟的結果與(a)步驟中沒有抗病毒劑反應的比較樣品的結果進行比較。
全文摘要
本發明涉及含有組氨酸末端的乙型肝炎病毒聚合酶,衍生于HBV聚合酶的RNase H以及它們的制備方法。更具體地說,本發明涉及重組HBV聚合酶,它的具有酶活性的RNase H區域,在大腸桿菌中產生該酶的表達載體,以及制備HBV聚合酶和RNase H酶的方法,它們由于具有組氨酶末端而可容易地被純化。本發明涉及HBV聚合酶和RNase H酶的篩選抗病毒劑中的應用。
文檔編號C12P21/04GK1231695SQ97197345
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月9日 優先權日1996年8月16日
發明者尹晟俊, 金鐘宇, 許熔, 盧賢模, 鄭求興 申請人:同和藥品工業株式會社