專利名稱：標記基因可從其上選擇性地去除的用于將基因導入植物的載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用遺傳工程方法將所需基因導入植物得到轉基因植物的新載體。
背景技術：
利用遺傳工程對微生物和培養細胞的轉化目前已被應用于生產用作藥品和諸如此類的生理活性物質，因此對工業有巨大的貢獻。在植物育種領域，工業化應用遺傳工程落后的原因是植物的生命周期比微生物等的生命周期長得多。但是，由于這一技術能使所需基因直接導入用于育種的植物，它比需要重復雜交的經典育種方法具有下面的優點(a)能夠只導入一個需要改進的特征；(b)能夠導入除了植物以外的其它物種的特征(如微生物等)；和(c)能夠大大縮短育種周期。所以，人們已經廣泛深入地研究了植物育種的遺傳工程方法。
具體地說，轉基因植物的生產需要下面三個步驟(1)將所需基因導入植物細胞(包括將它導入染色體、核酸等)；(2)選擇只由其中已經導入所需基因的細胞組成的植物組織；和(3)從選擇的植物組織再生植株。另外，其中在選擇已經導入所需基因的組織時，通常使用可選擇的標記基因。也就是說，通常把可選擇標記基因與所需基因一起導入植物細胞，通過在導入細胞以及起源于這些細胞的組織中表達可選擇標記基因顯示的可鑒定的特征作為所需基因導入的指標。結果是，在至今通過遺傳工程方法轉化的植物的所有情況中，除了所需因外，也導入和表達了可選擇標記基因。
但是，對于用作可選擇標記的產物，只有幾個基因對人體的安全性已經證實。因此，甚至是利用可選擇標記基因導入了有用的特性生產的西紅柿或土豆，只要表達了可選擇標記基因，當將它們作為可食產品提供時將要承擔許多障礙，包括顧客中莫名其妙的不安。
另外，在選擇導入基因的組織后，甚至對研究植物育種的研究人員來說，可選擇標記基因的表達將引起相當大的障礙，那是因為已經通過可選擇標記基因產生的轉基因植物再次導入另一個基因時，該基因的導入就不能利用同一可選擇標記基因來進行了。換句話說，因為可選擇標記基因已經存在于植物中，則它總會在植物中表達，而不管新的所需基因是否與可選擇標記基因一起導入植物中。所以，這樣的可選擇標記基因不能再用作新的所需基因導入的指標。結果是，在某些植物中重復基因轉移的次數自然地受到用于植物中的不同可選擇標記基因的數目的限制。但是，至今可得的可選擇標記基因的種類不是很多。另外，并不是所有可選擇標記基因在目標植物中都可使用。
為了解決上述問題從而有效地生產完全不受可選擇標記基因影響的導入了基因的組織或植物，本發明人已經開發了新的載體以用于將所需基因導入植物細胞(日本專利申請號H07-313432)。這一載體含有所需基因、作為可選擇標記基因的形態學異常誘導基因和可去除的DNA元件。由于所處位置，其中形態學異常誘導基因能完整地與可去除的DNA元件一起起作用，而所需基因則不與可去除的DNA元件一起完整地起作用。當利用這一載體將所需基因導入植物中時，可選擇標記基因是可以從它存在和發揮功能的DNA中去除的。在可選擇標記基因通過培養轉基因細胞表達后，以一定比例失去功能，由導入了該基因的植物細胞衍生的組織的形態學變化可以檢測可選擇標記基因的表達和其功能的丟失。也就是說，由這一可選擇標記基因在其中表達的細胞所衍生的組織顯示了某種不正常的形態，而且，當通過去除可選擇標記基因而失去其功能的細胞(即只導入了所需基因的細胞)從其后的組織產生時，從得到的細胞再生了具有正常形態的組織。因此，利用這一載體，通過簡單地重復培養導入基因的細胞和通過肉眼選擇培養得到的組織就可以生產含有只導入有所需基因的細胞的植物組織以及隨后的植物個體。
但是，甚至在本發明人開發的這一載體中可選擇標記基因的去除也是不能自由控制的。因此，如果可去除的DNA元件的能力較強的話，可選擇標記基因將可被非常快地去除。例如，在與所需基因一起導入植物細胞后，可選擇標記基因在它表達之前可被立即去除。在這種情況下，可以得到只導入有所需基因的細胞構成的組織；但是，未發生有基因導入的組織的導入了可選擇標記基因的形態學變化，結果是未篩選到這樣的組織。
另外，如果可選擇標記基因的去除是可以自由控制的，只導入了所需基因的細胞的產生和起源于這樣的細胞的植物組織的產生是可同時發生或適當控制的，所以，利用這一載體在實踐中生產轉基因植物是非常方便的。
因此，本發明的一個目的是提供用于在植物中導入基因的載體，它含有可選擇標記基因，其中在它表達后，通過從DNA如染色體等中去除可選擇標記基因就可以選擇性地去除與所需基因一起導入植物細胞的可選擇標記基因的功能，可選擇標記基因存在于該DNA中并在其中起作用，通過由導入基因的植物細胞衍生的組織的形態學變化可以檢測可選擇標記基因的功能的表達和丟失。
本發明的公開通過利用形態學異常誘導基因作為可選擇標記基因，同時將可去除DNA元件置于可誘導啟動子的控制下構建載體可以完成本發明的目的，其中對形態學異常誘導基因的定位使它不與可去除DNA元件完整地起作用，其中所需基因的定位使它不與可去除DNA元件一起完整地起作用。
下面將詳細地討論本發明。
如本文所用，形態學異常誘導基因是誘導組織的形態學異常分化如矮小、頂端優勢的破壞、色素的變化、冠狀蟲癭的形成、有絨毛的根、波紋狀葉子等的形成。據報道，各種形態學異常誘導基因如細胞分裂素合成基因(如ipt(異戊烯基轉移酶)基因(A.C.Smigocki,L.D.Owens,Proc,Natl.Acad.Sc.USA,85:5131,1988)),iaaM(色氨酸單加氧酶)基因(H.J.Klee等人，Genes &Development,1:86,1987)，基因5(H.Koerber等人，EMBO雜志，10:3983,1991)，基因6b(P.J.J.Hooyaas等人，Plant Mol.Biol.,11:791,1988),rol基因如rolA到D(F.F.White等人，細菌學雜志(J.Bacteriol),164:33,1985)等等，存在于在各種植物中誘導腫瘤或畸胎瘤(即形成不定枝或不定根)的土壤桿菌屬等的細茵中。另外，據報道還有薩氏假單胞茵中的iaaL(吲哚乙酸賴氨酸合成酶)基因和各種植物中的同源盒基因，光敏色素基因等等。
任何這些基因可以用于本發明。其中，在本發明中誘導頂端優勢的破壞的ipt基因和誘導從絨毛根再生的植物的絨毛根、矮小、波紋狀葉子等的rol基因是優選的可選擇標記基因，因為在各種形態學異常誘導基因中它們誘導可鑒定的形態學異常。
另外，可以設計這些可選擇標記基因的組合，以使得在特定的其中導入了可選擇標記基因的植物中再分化出特異結構如不定莖和不定根等等。在本發明中，根據生產轉基因植物的條件，例如待導入基因的植物的種類，可以使用形態學異常誘導基因的組合。
本文所用的可去除DNA元件是指可以從該DNA元件在其中存在和起作用的DNA中去除的DNA序列元件。在植物中，已知存在于染色體中的轉座子就是這種元件。轉座子的結構、活性和行為已經差不多完全被鑒定了。轉座子要起作用，基本上需要兩個成分，從轉座子中存在的基因表達的酶，它催化轉座子本身的切除和轉座(轉座酶)，以及存在于轉座子終端區的DNA結合序列，轉座酶在此基礎上起作用。通過這些元件，轉座子從它存在的染色體中被切除，然后通常轉座到該DNA的新位置。但是，該轉座子同時以一定的比例丟失而不轉座。本發明就利用了轉座子的這種轉座錯誤。
轉座子可以是兩種類型中的一種，自發轉座子或非自發轉座子。自發轉座子保留了兩個元件，轉座酶和DNA結合序列。在自發轉座子中，轉座酶表達并結合到DNA結合序列上起作用，從而從染色體中自發切除轉座子。非自發轉座子保留了終端DNA結合序列，轉座酶與該序列結合起作用。在非自發轉座子中，轉座酶基因突變以致轉座酶不表達，所以轉座子不能從染色體中自發切除。但是，當將轉座酶用于來自自發轉座子或來自獨立的轉座酶基因的非自發轉座子時，非自發轉座子與自發轉座子的行為相似。
因此，在本發明中可以使用自發和非自發的轉座子。例如，通過在其中插入形態學異常誘導基因和從自發轉座子得到或合成的轉座酶基因后就可以使用非自發轉座子。
自發轉座子的例子包括從玉米中分離的Ac和Spm(A.Gierl和H.Saedler,植物分子生物學(Plant Mol.Biol),19:39,1992)。通過用限制性內切酶Sau3A消化玉米染色體wx-m7座位可以得到Ac(U.Behrens等人，Mol.Gen.Genet.,194:346,1984)。在植物轉座子中這一轉座子是分析得最多的。事實上，已經確定了該DNA序列(M.Mueller-Neumann等人，Mol.Gen.Genet.198:19,1984)。同時，非自發轉座子的例子包括通過分別刪除Ac和Spm的內部區得到的Ds和dSpm(H.-P.Doring和P.Starlinger,Ann.Rev.Genet.,20:175,1986)和那些從玉米以外的許多植物中分離的那些，這些植物例如金魚草和空心菜等等(例如，Y.Inagaki等人，植物細胞(Plant Cell),6:375,1994)。當將這些轉座子導入外源植物的染色體中時，同時從染色體中切除了這些轉座子并轉座(例如，B.Baker等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA,83:4844,1986)。
另一個不存在于植物中的可去除的DNA元件，是起源于位點特異重組系統的元件。位點特異重組系統包括兩個元件，具有特異性DNA序列的重組位點(相應于本發明的可去除DNA元件)和與DNA序列特異結合并且如果存在兩個或更多序列時催化這些DNA序列之間的重組的酶(重組酶)。當兩個DNA序列以同一方向位于同一DNA分子的給定間隔中時，可從DNA分子如質粒和染色體等中切除這些DNA序列支持的區域。當兩個DNA序列以相反的方向定位于同一DNA分子上時，將這些DNA序列支持的區域進行顛倒。本發明利用了前面的切除過程。通過位點特異的重組系統，同源重組的結果是重組位點內發生切除和倒位，這與利用轉座子的機制不同。已知重組基因不一定與重組位點存在于同一DNA分子上。重組酶基因只需要存在于同一細胞中并表達以便去除或顛倒兩個DNA序列支持的區域(N.L.Craig,Annu.Rev.Genet.,22:77,1988)。
目前，在例如噬茵體、細菌(例如大腸桿茵)和酵母等的微生物中已經鑒定了位點特異的重組系統。其例子包括Cre/lox系統、pSRl系統、FLP系統、cer系統和fim系統(例如，N.L.Craig,Annu.Rev.Genet.,22:77,1988)。當從利用衍生于P1噬茵體的Cre/lox系統的微生物中分離的位點特異的重組系統(國際公開號WO93/01283)被導入與衍生這一系統的有機體不同的有機體(包括植物)中時，其行為與原始有機體中一樣。同時根據本發明可以使用酵母(zygosaccharomyces rouxii)的位點特異重組系統(pSRl系統(H.Matsuzaki等人，細菌學雜志，172:610,1990))。這一pSRl系統也可以在更高等的植物中保持其固有功能(H.Onouchi等人，Nucleic Acid Res.,19:6373,1991)。
根據本發明，將這一可去除的DNA元件置于可誘導啟動子的控制下。
亦即，可誘導啟動子存在于范圍從原核生物有機體(例如細菌等)到真核生物有機體(例如酵母、真菌、高等植物和哺乳動物等)之間的所有有機體中的結構基因的上游，這些元件可單獨地或相互協調來控制某一基因或基因組的表達。例如，有時它們對應于各個個體的分化和生長時期或偶爾依賴于熱、光、金屬和諸如此類的環境因子來進行基因表達的開和關。根據本發明，利用具有如此功能的可誘導啟動子，在其下游的可去除的DNA元件控制表達或可移動性。
目前已知的這種可誘導啟動子的例子包括那些化學物質應答的啟動子，如谷胱苷肽-S-轉移酶Ⅰ系統基因啟動子(未審
公開日本專利申請號H05-268965)、谷胱苷肽-S-轉移酶Ⅱ系統(GST-Ⅱ)基因啟動子(國際公開號WO93/01294)、Tet阻遏物融合類型花椰菜花葉病毒35S啟動子(C.Gatz等人，Mol.Gen.Genet.,227:229,1991)、Lac操縱子/阻遏物系統啟動子(R.J.Wilde等人，EMBO雜志，11:1251,1992)、alcR/alcA系統啟動子(國際公開號WO94/03619)、糖皮質激素系統啟動子(Takushi Aoyama，蛋白質、核酸和酶(Protein,Nucleic acid and Enzyme),41:2559,1996)等,那些熱應答啟動子，如hsp80啟動子(未審
公開日本專利申請號H05-276951)等和那些光應答啟動子，如核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因(rbcS)啟動子(R.Fluhr等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2358,1986)、果糖-1,6-二磷酸酶基因啟動子(PCT國際公開的日本再公開專利申請號H07-501921)、捕光葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子(未審
公開日本專利申請號H05-89)等。
在這些啟動子中，在高等植物中的rbcS啟動子作為可誘導啟動子已經得到最深入的研究并且Chua等人對其有更詳細的分析(例如，參見Matsuoka,Plant Cell Technology Supplement,3:552,1991)。由于這一原因，在本發明的實施例1中利用這一啟動子，但是這一因子的調節對應于光的基因表達的機制還沒有確立。另一方面那些應答化學物質的啟動子，通常包括GST-Ⅱ基因啟動子，其通過化學物質的量可以相對自由地控制基因表達的誘導，因此在實際使用中，與不得不通過控制熱或光的來控制基因表達的熱-或光應答啟動子相比，他們是具有優勢的。
在本發明中，可以將形態學異常誘導基因插入到某一個位置上，在這一位置上該基因與可去除的DNA元件一起切除。例如，當將轉座子用作可去除DNA元件時，形態學異常誘導基因可以插入到不影響轉座子的切除的位置上，該位置在轉座子基因啟動子區的上游但在轉座酶結合的終端區的下游。當使用pSRl系統時，可以將形態學異常誘導基因插入到不抑制重組酶表達的重組位置支持的區域中的任何位置上。
可以將本發明的載體用于任何通過遺傳工程方法能將基因導入其中的植物。根據本發明，所需基因可以是賦予農業上優良特征的任何基因和允許進行基因表達機制等的研究的任何基因，雖然農業上優良的特征并非必需。
關于所需基因的啟動子和終止子，只要他們在植物中有功能，對其使用沒有任何限制。啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒的35S啟動子(J.T.Odell等人，自然(倫敦)，313:810,1985)、胭脂堿合成酶的啟動子(W.H.R.Langridge等人，Plant Cell Rep.4:355,1985)等。終止子的例子包括胭脂堿合成酶的多聚腺苷酸化信號(A.Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.,1:561,1982)、章魚堿合成酶的多聚腺苷酸化信號(J.Gielen等人，EMBO J.,3:835,1984)等等。
另外，如果序列已知，通過克隆cDNA或基因組DNA，或通過化學合成可以得到本發明的基因，即DNA。
通過感染植物的病毒或細菌可以間接在植物細胞中導入本發明的載體(I.Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205,1991)。病毒的例子包括花椰菜花葉病毒、雙粒病毒組、煙草花葉病毒、菠蘿花葉病毒(bromomosaic virus)等。細菌的例子包括根癌土壤桿菌(下文中稱為根癌土壤桿菌)和發根土壤桿菌等。已知通常用土壤桿菌屬的細菌感染雙子葉植物。最近，也已經有通過用他們感染單子葉植物，在這些植物中導入基因的報道(例如，國際公開號WO94/00977)。
通過物理和化學方法如微注射、電穿孔、聚乙二醇方法、融合方法和高速彈道滲透等可以在植物細胞中直接導入本發明的載體(I.Potrykus、Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205,1991)。由于它們對土壤桿菌的感染有抗性，通常利用土壤桿菌屬的間接導入方法不能用于許多單子葉植物和雙子葉植物，而上面提到的直接導入方法對這些植物是有效的。
在本發明中，表達形態學異常誘導基因使細胞生理異常。生理異常包括在植物細胞中植物生長激素的生產，結果是使含有形態學異常誘導基因的細胞的增殖和分化混亂后誘導出各種形態學異常。例如，頂端優勢破壞形成的紊亂的莖的聚集(極端多莖的表現型)和絨毛根等性狀可以起源于導入了形態學異常誘導基因的細胞。這一表現型是通過上面提到的細胞的不正常增殖和分化形成的。所以，這一形態學異常組織只由含有這一基因的細胞組成。因此，如果利用這一基因作為可選擇標記基因與所需基因一起構建載體導入植物細胞中，培養該細胞，然后只通過肉眼篩選起源于植物細胞的形態學異常組織就可以選擇只由導入了可選擇標記基因和所需基因的細胞組成的組織。
另外，根據本發明可將形態學異常誘導基因摻入到一個特定位置上，在該位置上它與可誘導啟動子控制下的可去除DNA元件完整地起作用。當利用具有這種構建的載體把基因導入植物中時，根據所用的可誘導啟動子的情況對轉基因后的植物細胞可人工施加適當的刺激，例如熱、光和化學物質等可表達可去除的DNA元件，隨著可去除DNA元件以一定的比例從其導入和發生作用的DNA分子上的除去，作為可選擇標記基因的形態學異常誘導基因也失去了其功能，同時不與該(形態學誘導)基因完整起作用的所需基因仍然保留于同一DNA分子上并保持了其功能。因此，也就是說，保留了那些其中僅導入了所需基因的細胞。
而且，由于該可選擇標記基因的功能的丟失，即形異學異常誘導基因的功能的丟失是可以與導入該基因時所用的同樣的方式通過肉眼檢測到其形態學變化的，僅由其中可選擇標記基因的功能已丟失的細胞組成的組織，即僅由其中所需基因已導入的細胞組成的組織可以被明確而容易地選擇出來。也就是說，為了獲得只由這種細胞組成的組織，先培養導入了基因的細胞，并通過肉眼選擇表現出形態學異常的組織，然后分離選擇出的組織，這種形態學異常例如由形態學異常誘導基因的表達引起的多莖表現型和絨毛根等。接著，如果根據分離組織培養過程中使用的可誘導啟動子選擇性地給予適當的刺激，這時可從表現出形態學異常的組織中獲得的表現出形態學正常的組織，同樣也可以用內眼選擇。
附圖的簡要說明
圖1顯示在pNPI206構建方案中直到制備pNPI201的步驟。
圖2顯示在pNPI206構建方案中制備pNPI201到pNPI203的步驟。
圖3顯示在pNPI206構建方案中制備pNPI203到pNPI204的步驟。
圖4顯示在pNPI206構建方案中制備pNPI204到pNPI206的步驟。
圖5是pNPI206結構中T-DNA區的限制酶圖譜。
圖6顯示了pNPI125構建方案。
圖7顯示了pNPI128的構建方案。
圖8顯示了在pNPI123構建方案中直到制備pIPT2的步驟。
圖9顯示了在pNPI123構建方案中制備pIPT2到pIPT3的步驟。
圖10顯示了在pNPI123構建方案中制備pIPT3到pNPI4的步驟。
圖11顯示了在pNPI123構建方案中制備pIPT4到pNPI123的步驟。
圖12顯示了在pNPI303構建方案中制備pNPI200和pGlE7到pNPI301的步驟。
圖13顯示在pNPI303構建方案中制備pNPI123和pNPI128到pIPT8的步驟。
圖14顯示了在pNPI303構建方案中制備pNPI301和pIPT8到pNPI302的步驟。
圖15顯示了在pNPI303構建方案中制備pNPI302到pNPI303的步驟。
實施本發明的最佳方式[實施例]在下面的實施例中，根據分子克隆，第二版(Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社，紐約，1989)的指導，或通過制造商的另外說明進行實驗。
實施例11．構建載體從日本專利申請號H07-313432敘述的質粒pNPI125中利用限制性內切酶XbaⅠ和EcoRⅠ切下酵母位點特異性重組系統(pSR1系統)的重組酶基因(下文中稱為“R基因”)和與其連接的胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號，并將它們插入到pHSG398(從Takara Shuzo有限公司購買)的XbaⅠ-EcoRⅠ限制性內切酶位點之間得到質粒pNPI200。
另一方面，利用限制性內切酶KpnⅠ消化含有核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因啟動子(rbcS-3B)的質粒(從名古屋大學的Mamoru Sugita博士處得到)，利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)消化，以將所得的粘性末端形成平末端。然后，在得到的平末端之間插入5’-磷酸SalⅠ接頭得到質粒pRBCS，利用限制性內切酶SalⅠ從pRBCS切下rbcS-3B，并將它插入pNPI200的SalⅠ限制性內切酶位點間得到質粒pNPI201。
同時，rbcS-3B是來源于西紅柿(蕃茄VFNTLA 1221)的光應答的啟動子。除了這一啟動子，西紅柿有五個其它類似于rbcS的可誘導啟動子啟動子(rbcS-1、-2、-3、-3A和-3C)，Sugita等人已經分析了它們的表達方式(M.Sugita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7104,1987)。
然后，利用限制性內切酶PstⅠ和BamHⅠ消化質粒pNPI201，利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)，通過消化將所得的粘性末端變成平末端，然后連接，得到質粒pNPI202。利用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ，從質粒pNPI202中切下含有rbcS-3B、R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號的片段并將它們插入到pUC119(從Takara Shuzo有限公司購買)的EcoRⅠ-HindⅢ限制性內切酶位點之間以得到質粒pNPI203，再次利用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ從質粒pNPI203中切出含rbcS-3B、R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號的片段并將它們插入日本專利申請號H07-313432所述的質粒pNPI128的EcoRⅠ-HindⅢ限制性內切酶位點之間，得到質粒pNPI204。
然后，在所得的質粒pNPI204的HindⅢ限制性內切酶位點中插入含有花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)和與其連接的ipt基因的片斷，它們是利用限制性內切酶HindⅢ從也是日本專利申請號H07-313432中敘述的質粒pNPI123中切下的，如此得到了質粒pNPI205。
利用限制性內切酶PstⅠ從質粒pNPI205切下與CaMV35S啟動子連接的ipt基因、R基因和與RbcS-3B連接的胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號和位于其兩末端的酵母位點特異性重組系統的重組序列Rs，將它們插入用于把基因轉入到植物中(購自TOYOBO有限公司)的載體質粒pBI121(從TOYOBO有限公司購買)上的SseⅠ限制性內切酶位點。這樣就得到了所需的稱為質粒pNPI206的載體。當利用含有這一質粒的根癌土壤桿茵感染植物時，在這種情況下，植物染色體中整合了存在于質粒RB位點和LB位點之間的T-DNA區及從nptⅡ基因(新霉素磷酸化酶基因)到GUS基因(β-半乳糖苷酶基因)的約12.5kb的區域。
同時，在大腸桿茵JM109菌株中導入質粒pNPI206，得到的菌株以大腸桿菌JM109(pNPI206)用于國際保藏[國際貿易和工業部，工業科學和技局，國家生物科學和人技術研究所(Higashi1-1-3,Tsukuba-shi,Ibaraki，日本，305)國際登記號FERM BP-5518，根據布達佩斯條約原始保藏于1996年4月24日)。
圖1到4顯示了pNPI206的構建方案，圖5顯示了它的T-DNA區域的限制性酶切圖譜。同時，圖6顯示了pNPI125的構建方案，圖7顯示了pNPI128的構建方案，圖8到11顯示了pNPI123的構建方案。在這些附圖中，“35S-P”代表花椰菜花葉病毒35S啟動子，“NOS-P”代表了胭脂堿合成酶啟動子，“T”代表了胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號，“圓圈T”代表了ipt基因本身的多聚腺苷酸化信號，“半著色點網三角”代表重組序列Rs與其序列方向。如圖5所示，這一質粒在其T-DNA區域含有作為可選擇標記基因的ipt基因和作為所需基因的模型的nptⅡ基因和GUS基因，T-DNA區域也就是整合進植物染色體中的區域。這一ipt基因是致病原根癌土壤桿茵具有的腫瘤誘導基因中的一個，將它導入植物細胞后可誘導植物激素即細胞分裂素的過度生產，并導致細胞朝著形成極端多莖的方向分化。同時，賦予卡那霉素抗性的nptⅡ基因和通過代謝特異底物在含有該基因的細胞中生產藍色色素的GUS基因是通常用于分析植物中基因表達的基因。
另外，由于在酵母位點特異重組系統(pSR1系統)中的一對重組序列Rs之間的區域在質粒中以可去除的DNA元件起作用插入ipt基因的形式是夾在方向相同的Rs重組序列之間。但同時，R基因作為催化去除Rs之間的區域的酶的基因被連接到可誘導啟動子，也就是光應答啟動子rbcS-3B的下游，因此除非將它置于適當的光條件下通過調節啟動子可使該基因發生表達，或發生Rs之間的去除，否則將不會發生這些事件。
Ⅱ．在土壤桿菌中導入pNPI206在10毫升YEB液體培養基(含有5克/升牛肉提取物，1克/升酵母提取物，1克/升蛋白胨，5克/升蔗糖，和2毫摩爾/升MgSO4,pH7.2,22℃(下面使用22℃的pH，除非另外說明))中接種根癌土壤桿菌菌株LBA4404(購自CLONTECH CO.LTD)，在28℃培養直到OD630在0.4到0.6范圍內。然后，在4℃，6900×g離心培養物10分鐘，收集細胞。將細胞懸浮于20毫升10毫摩爾/升Tris-HCl(pH8.0)中，在4℃，6900×g再離心懸浮液10分鐘。隨后，將收集的細胞再懸浮于200微升的YEB液體培養基中，并將這一懸浮液用作導入質粒的細胞懸浮液。
將用于質粒導入的200微升細胞懸浮液與6微克上述步驟Ⅰ中得到的pNPI206在15毫升容量試管(Falcon制造)中混合，將試管浸入已在液氮中預冷30到40分鐘的乙醇中5分鐘冷卻混合物，將試管在29℃的水浴中放置25分鐘，在試管中加入750微升YEB液體培養基，然后于29℃在搖床上把細胞在試管中培養1小時從而將PNPI206導入土壤桿菌中。
Ⅲ．來自土壤桿茵的pNPI206在煙草中的導入、導入pNPI206的煙草細胞的培養和所得組織的形態學將在溫室中生長的煙草(煙草栽培種SRl)的成熟葉子在1v/v％的氯化鈉水溶液中浸泡滅菌，用無菌水洗滌三次。然后，去除葉子的中肋，以便形成約8平方毫米的葉盤。然后將所得葉盤在上述步驟Ⅱ中導入了pNPI206的根癌土壤桿菌菌株LBA4404的細胞懸浮液中浸泡約1分鐘，由此被感染(在YEB液體培養基中過夜培養后用OD630=0.25的無菌水稀釋懸浮液)。將感染葉盤置于無茵濾紙上以便去除任何額外的細胞懸浮液。然后將它置于無激素的MS瓊脂培養基上(T.Murashige和F.Skoog,Physiol.Plant.,15:473,1962(假如在其中加入了0.8w/v％的瓊脂))，該培養基含有50毫克/升的乙酰丁香酮，葉子的背面朝上，在暗處25℃，培養3天(下文中，植物組織的培養溫度是25℃，除非另外說明)。其次，當將這一葉子移植到只含有500毫克/升的羧芐青霉素的無激素MS瓊脂培養基中，在約7到10微摩爾/秒/米2量的光下培養，同時用含有同樣成分的培養基繼代培養，在感染后三個月得到了225個極端多莖表現型系，其中的126個系分成兩組，將各組在約7到10微摩爾/秒/米2或約70微摩爾/秒/米2量的光下，利用含有同樣成分的培養基繼續培養。
結果是，在約70微摩爾/秒/米2量的光下培養的系中，在感染約6個月后，從43個極端多莖表現型系中產生具有肉眼可見的正常表現型(下文中稱為“正常個體”)，而在約7到10微摩爾/秒/米2量的光下培養的這些系中，在同樣的時期后，只有12個極端多莖表現型系產生正常個體。
結果如表1所示。
表1在用pNPI206轉化的培養煙草組織中的正常個體的光條件和產生的比例
在L2條件下培養三個月，然后在L1或L2條件下培養三個月。
*1光條件L2；約7到10微摩爾/秒/米2量的光L1；約70微摩爾/秒/米2量的光*2(產生正常個體的系的數目/用于檢測光條件的極端多莖表現型系的數目)×100正如從上面的表中顯示的結果可以看出，當用本發明的載體pNPI206轉移的培養煙草組織在低光條件下培養，然后在高光條件下培養時，正常個體產生的比例差不多是低光條件下連續培養(所產生正常個體)的4倍。因此，這表明在利用pNPI206導入基因的組織中，用于調節可去除DNA元件的光應答啟動子rbcS-3B控制了用作可選擇標記基因的形態學異常誘導基因的行為，并且通過將導入基因組織的光條件從低光量轉換到高光量可以加速它的去除。
實施例21．構建載體用PstⅠ消化實施例1中得到的質粒pNPI200，利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)把所得的粘性末端消化變成平末端。利用限制性內切酶NdeⅠ從質粒pGlE7(購自Zeneca有限公司)中切下GST-Ⅱ27RD亞基基因(GST-Ⅱ-27)啟動子(PCT國際
公開日本國內再公開的專利申請號H06-511385，第7頁右下欄15到17行)，同時利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)將得到的粘性末端進行平齊化，隨后插入pNPI200的平末端之間以得到質粒pNPI300。其次，利用限制性內切酶EcoRⅠ從所得的pNPI300中切下含有GST-Ⅱ-27啟動子-R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號的片斷，并插入到pUC18(購自TakaraShuzo有限公司)的EcoRⅠ限制性內切酶位點內以得到質粒pNPI301。
GST-Ⅱ是存在于玉米等中的酶，是有關除草劑解毒的GST的同工酶之一。同時，GST-Ⅱ-27啟動子控制了作為GST-Ⅱ亞基之一的27kD的亞基的基因表達，已知通過存在除草劑解毒劑如2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷或其類似物(PCT國際
公開日本再公開的專利申請號H06-511385)時誘導GST-Ⅱ-27的表達，這一啟動子可顯著增加GST-Ⅱ的活性從而提高玉米等對除草劑的抗性。
另一方面，利用限制性內切酶HindⅢ從質粒pNPI123中切下CaMV35S啟動子和與其連接的ipt基因，并插入到pNPI128的HindⅢ限制性內切酶位點中，得到質粒pIPT8。隨后，利用限制性內切酶EcoRⅠ從pNPI301中切下含有GST-Ⅱ-27啟動子、R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號的片斷并插入到所得的pIPT8的EcoRⅠ限制性內切酶位點中以獲得質粒pNPI302。
利用限制性內切酶SseⅠ從質粒pNPI302切下與CaMV35S啟動子連接的ipt基因、R基因和與GST-Ⅱ-27啟動子和定位于兩端的酵母位點特異重組系統的重組序列Rs連接的胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號，并將它們插入到用于在植物中導入基因的載體質粒pBI121的SseⅠ限制性內切酶位點中，就可以得到所需載體，將所得的所需載體命名為質粒pNPI303。即在這一質粒pNPI303中，用GST-Ⅱ-27啟動子而不是用pNPI206的tbcS-3B用于控制R基因。圖12到15顯示了pNPI303的構建方案。用于這些附圖中的符號與用于圖1到11的那些相同。
而且，同時在大腸桿菌JM109菌株中導入質粒pNPI303。并且將得到的大腸桿菌作為大腸桿菌JM109(pNPI303)用于國際保藏[國際貿易和工業部，工業科學和技術局，國家生物科學和人類技術研究所(Higashi 1-1-1,Tsukuba-shi,Ibaraki，日本，305)，國際登記號FERM BP-5927，于1997年4月23日根據布達佩斯條約原始保藏]。
Ⅱ．在煙草中導入pNPI303和導入有pNPI303的煙草的分析以與實施例1的步驟Ⅱ和Ⅲ所述相同的方式，將質粒pNPI303導入根癌土壤桿菌菌株LBA4404，用得到的根癌土壤桿菌菌株LBA4404感染煙草的葉盤，然后將這一感染的葉盤平放在含有50毫克/升的乙酰丁香酮的無激素MS瓊脂培養基上，在光下培養3天。其次，當將得到的被感染的葉子移植到只含有500毫克/升羧芐青霉素的無激素MS瓊脂培養基上，繼續培養，繼代培養同樣的時期時，得到了極端多莖的表現型，在培養2個月后得到30個極端莖表現型系，將它們分成4組，將每組放在含有500毫克/升羧芐青霉素的無激素MS瓊脂培養基上，在培養基中另外加入0、10、20或30毫克/升的2,2,5-三甲基-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷，以便檢測正常個體的產生比例。
表2顯示了在存在2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷時培養1個月后的結果。在這種情況下，為了證實用作實施例中所需基因的模型的GUS基因的表達，肉眼進行正常個體的檢測，并根據Jefferson等人的方法，進行GUS活性試驗。
表2用pNPI303轉化的培養煙草組織中正常個體的產生比例和2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷的濃度<
>存在2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷時培養后1個月*1產生正常個體的系的數目*2產生正常個體的莖的數目
*3在作為正常個體產生的莖中顯示GUS活性的個體數目如表2顯示的結果可以看出，當沒有加入2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷時沒有產生正常個體。另一方面，當它以10毫克/升的量加入時產生正常個體，當它以20毫克/升的量加入時產生比例進一步增加。結果是，同時發現在這種情況下，作為用于調節可去除DNA元件的化學物質應答啟動子的GST-Ⅱ-27啟動子可以正常地起作用，于是當通過pNPI303在植物組織中導入基因并將所得組織在存在適當化學物質進行培養時，它誘導可去除DNA元件的表達和加速它的去除，并且進一步將作為可選擇標記基因的形態學異常誘導基因去除。
另一方面，在約一半作為正常個體產生的莖中證實了GUS活性的表達，也就是所需基因的存在和表達，在其余一半中檢測不到GUS活性。雖然其中的原因仍未清楚，但是，例如，如果通過相互連接，優選在煙草染色體中導入多個pNPI303的T-DNA區，在T-DNA區內的重組序列Rs之間不發生同源重組，而在互不相同的T-DNA區的重組序列之間發生，從而導致去除的區域夾在這樣的序列中間。結果是，不僅ipt基因而且GUS基因也可以包括在與可去除DNA元件一起去除的區域中，在這種情況下，與這一實施例的情況相同，從極端多莖表現型中將產生正常但沒有GUS活性的個體。
同時，將顯示GUS活性的正常個體之一以PCR進行DNA分析，在DNA水平證實了GUS基因的存在和作為可選擇標記基因的ipt基因與可去除DNA元件一起去除了。
工業應用性當利用本發明的載體把基因導入植物細胞中時，通過在基因導入后對細胞施加特定刺激，如熱、光和化學物質等可使得與所需基因一起導入的可選擇標記基因的功能在其存在和起功能的DNA上以一定的比率去除后被消除。因此，僅僅通過改變用于導入的所需基因的部分而不改變可選擇標記基和其它的結構就可以使該載體在特定植物中實現該基因的重復導入。于是，重復導入的進行就可以不受次數限制了。
另外，因為將形態學異常誘導基因用作可選擇標記基因，利用組織的形態學變化作為指標可以進行只由導入可選擇標記基因的細胞形成的組織(也就是只由導入所需基因的細胞形成的組織)的篩選，以及以在可選擇標記基因的功能消失后還能夠表達的方式單獨導入的所需基因的細胞形成的組織的篩選。結果是，可以確定地和容易地選擇只起源于在染色體等中僅導入了所需基因的細胞的組織，并且不存在選擇過程中減弱植物細胞的活性的問題，因為在培養基中不必要加入用于篩選的抗生素。因此，可以有效地進行基因的重復導入，不經過雜交步驟也可以得到由只這些細胞組成的轉基因個體，也就是消除了可選擇標記基因的影響及完全清除有關基因產物的憂慮的個體。
另外，根據本發明的載體，去除可選擇標記基因是可以人工控制的。結果，即使在可去除DNA元件具有非常優良的去除能力因而該可選擇的標記基因可快速被去除，同時當不能進行如此調控而要獲得僅由其中導入了所需基因的細胞組成的組織變得相當困難的情況下，其能力在本發明中仍然可被用作可去除的DNA元件。另一方面，由于利用本發明的載體可以有選擇地進行同步化地或有控制地產生這種細胞以及這些細胞組成的植物組織，可以非常方便地在實踐中來產生轉基因植株。例如，當ipt基因被用作形態學異常誘導基因即可選擇的標記基因時，在無植物激素條件下，它可誘導在其中導入了該基因的細胞的相當活躍的生長，并且引起不定牙等的分化。因此，在維持可選擇的標記基因的前期條件下通過持續培養可大量生產能產生當有必要時在任何時候都可在其中導入所需基團的細胞的組織。
權利要求
1．一種用于將所需基因與可選擇標記基因一起導入植物細胞的載體，其中可選擇標記基因在它存在和起作用的DNA中是可選擇地去除的，并且在表達后失去其功能，通過起源于導入了可選擇標記基因的植物細胞的組織中的形態學變化可以檢測可選擇標記基因的表達和其功能的丟失。
2．一種用于在植物中導入基因的載體，它包括所需基因、作為可選擇標記基因的形態學異常誘導基因以及置于可誘導啟動子控制下的可去除DNA元件，其中形態學異常誘導基因所處的位置使它與可去除DNA元件完整地起作用，而所需基因所處的位置使它不與可去除DNA元件一起完整地作用。
3．根據權利要求2所述的用于在植物中導入基因的載體，其中形態學異常誘導基因存在于可去除DNA元件內。
4．根據權利要求2或3所述的用于在植物中導入基因的載體，其中控制可去除DNA元件的可誘導啟動子是核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)的啟動子。
5．根據權利要求2或3所述的用于在植物中導入基因的載體，其中控制可去除DNA元件的可誘導啟動子是谷胱苷肽-S-轉移酶Ⅱ系統(GST-Ⅱ)基因的啟動子。
6．根據權利要求2、3、4或5所述的用于在植物中導入基因的載體，其中可去除DNA元件來自于位點特異重組系統。
7．根據權利要求2、3、4、5或6所述的用于在植物中導入基因的載體，其中形態學異常誘導基因從屬于土壤桿菌屬的細菌中得到。
8．根據權利要求2、3、4、5、6或7所述的用于在植物中導入基因的載體，其中形態學異常誘導基因是細胞分裂素合成基因。
9．根據權利要求8的用于在植物中導入基因的載體，其中細胞分裂素合成基因是存在于根癌土壤桿菌的T-DNA中的ipt基因，即異戊烯基轉移酶基因。
全文摘要
一個用于將基因轉入到植物中的載體,該載體在必要時可使在表達后從標記基因存在和發揮功能的染色體的DNA上切除與目的基因一起轉入到植物中的標記基因,因而也消除了其功能,以及在其中導入了基因的植物細胞所衍生的組織的形態變化的基礎上來檢測該標記基因的表達和消除。該載體的構建利用了一個作為標記基因的能誘導形態學異常及控制一個能與調控器一塊消失的DNA因子的基因。由于其所處位置,該形態學異常誘導基因能與該DNA因子一起起作用,而該目的基因并不處于這樣一個位置上故其不與該DNA因子一起作用。
文檔編號C12N15/82GK1225133SQ9719598
公開日1999年8月4日 申請日期1997年5月9日 優先權日1996年5月9日
發明者杉田耕一, 上杉干子, 松永悅子, 海老沼宏安 申請人:日本制紙株式會社 被以下專利引用 (1),