臭氧誘導的植物基因表達的制作方法

專利名稱：臭氧誘導的植物基因表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的DNA序列，產生含有新DNA序列的新植物的方法，所述DNA序列的編碼序列經臭氧誘導后被表達。本發明還涉及所述新植物，和DNA序列在植物和植物細胞中產生臭氧-反應性基因表達的用途。另外，本發明還涉及新的啟動子，通過除去其臭氧反應能力可增加其特異性。
在過去的一百年里，較強的工業活動使得北半球陸地上方較低的對流層中臭氧的濃度持續增加(Volz和Kley(1988)，自然，332,240-242)。與此同時，歐洲和北美的臭氧值也達到100nL/L至200nL/L的周期性高峰，(Krupa等，(1995)，環境污染，87,119-126)。
空氣污染物臭氧的植物毒性已被完善地檢測和報道，例見Heagle(1989),Annu.Rev.Phytopathol,27,397-423；Heath(1994):Alscher,Wellburn(編)“植物對大氣環境的反應”,p121-145,Chapman& Hall，倫敦。通常，這種臭氧影響的結果是減少凈光合作用，增加早衰，從而會導致植物生長的衰弱和收獲產量的降低。
盡管臭氧利用擴散作用由開放的氣孔侵入植物細胞，但不論環境中的臭氧濃度如何，葉細胞間空間內的臭氧濃度幾乎為零(Laisk等，(1989)，植物生理學，90,1163-1167)。通常假定臭氧與細胞壁和質膜的成分快速反應，并轉變為活性氧類，如過氧化物-陰離子，羥基基團和過氧化氫，通過使用電子自旋共振光譜在經臭氧處理的植物材料中可檢測到所述的活性氧類(Mehlhorn等，(1990),Physiologia Plantarum,79,377-383)。所謂的“氧化性爆發”，即相對大量的活性氧類的快速發展因改變了植物膜的通透性，滅活了對氧化還原作用敏感的蛋白質和增加了脂質的過氧化而導致對正常細胞功能的顯著干擾。
對經臭氧處理的植物所進行的最新試驗顯示出非特異性防御酶生物合成的增加，所述防御酶的功能是保護活細胞使之抵抗因氧化應力造成的損害(Kangasjarvi等，(1994)，植物細胞和環境，17,783-794)。但迄今為止仍不了解負責臭氧-誘導的基因激活，并將質外體形成的相關信息傳遞至細胞核心的信號-轉導鏈，即活性氧類。最近討論的結果是由氧化應力引起的多種因素可能是信號聯系，所述因素在植物的防御反應中一般能起一定的作用，所述因素如胞質溶膠中鈣濃度的增加(Price等，(1994)，植物細胞，6,1301-1310)，水楊酸(Klessig和Malamy(1994)，植物分子生物學，26,1439-1458)和植物激素茉莉酸(Farmer(1994)，植物分子生物學，26,1423-1437)和乙烯(Ecker(1995)，科學，268,667-674)的形成。
對通入臭氧的煙草植物的試驗表明臭氧可導致多種疾病抗性基因，即一些PR-(致病-相關)蛋白表達的增加(Ernst等，(1992)，植物分子生物學，20,673-682；Ernst等，(1996)，植物生理學雜志，148,215-221；Eckey-Kaltenbach等，(1994)，植物生理學，104,67-74)。這些結果表明由臭氧引起的氧化應力可按與病原體攻擊類似的方式影響植物防御基因的表達和調節。目前能利用的有關順式調節元件和轉錄因子的信息非常有限，作為對多種環境影響的反應，所述調節元件和轉錄因子可能在控制非特異性防御基因的基因表達方面起一部分作用(Lee等，(1994)，歐洲生物化學雜志，226,109-114)。然而，根據目前的研究結果，可假定編碼PR-蛋白的基因存在分離的或至少僅部分重疊方式的信號轉導(Somssich(1994):Nover(編)“植物啟動子和轉錄因子”，p163-179,Springer Publishing House，柏林；Dolferus等，(1994)，植物生理學，105,1075-1087)。
至于參與植物抗毒素合成的1,2-二苯乙烯合酶(STS)的活性，已知在成年植物中環境應力因素可誘導該活性，所述因素如病原體攻擊(Langcake(1981),Physiol.Plant Pathol,18,213-226)，紫外線(Fritzemeier和Kindl(1981),Planta,151,48-52)和臭氧(Rosemann等，(1991)，植物生理學，97,1280-1286)。與之形成對照的是在胚中觀察到組成型表達模式(Sparvoli等，(1994)，植物分子生物學，24,743-755)。
1,2-二苯乙烯合酶催化由1分子p-香豆酰基-CoA或肉桂酰-CoA和3單位丙二酰基-CoA合成1,2-二苯乙烯，如白藜蘆醇或赤松素。白藜蘆醇和赤松素具有植物抗毒素特性和抗真菌活性，并與其它衍生自苯基丙烷代謝的1,2-二苯乙烯聯合，作為植物抗毒素在抵抗病原體的防御中行使重要的功能(Hart(1981),Annu.Rev.Phytopathol,19,437-458)。
STS基因被發現于一些不相關的植物種中，如花生(Schroder等，(1988)，歐洲生物化學雜志，172,161-169)，葡萄樹(Hain等，(1993)，自然，361,153-156)和松樹(Fliegmann等，(1992)，植物分子生物學，18,489-503)，并構建在較大的基因家族中，其含有6個或更多個基因(Lanz等，(1990),Planta,181,169-175；Wiese等，(1994)，植物分子生物學，26,667-677)。
對轉基因煙草細胞的實驗表明1,2-二苯乙烯合酶的表達主要在轉錄水平上被調節，在多個植物種的進化過程中，應力-誘導的信號轉導鏈被保留下來(Hain等，(1990)，植物分子生物學，15,325-335)。
已分離出花生(Arachis hypogaea)和葡萄樹(Vitis vinifera)的STS基因(Schroder等，(1988)，文獻同上或Hain等，(1993)，文獻同上)，并在轉基因植物中表達了STS基因(Hain等，(1990)，文獻同上或Hain等，(1993)，文獻同上)。
已知編碼1,2-二苯乙烯合酶的DNA序列，例見歐洲專利EP0309862，德國專利申請DE-A-4107396，歐洲專利申請0464461以及美國專利5.500.367。這些文獻描述了1,2-二苯乙烯合酶基因的分離及其生產轉基因植物的用途。所得轉基因植物對多種植物害蟲如真菌，細菌，昆蟲，病毒和線蟲表現出較強的抗性。含有STS基因的質粒已被保藏于德國微生物保藏中心(DSM),Mascheroder Weg 1B,D-38124,Braunschweig。還保藏了pVstⅠ質粒中的葡萄樹VstⅠ-基因，其保藏號為DSM6002(DE-A-4107396,EP-A-0464461，美國專利5.500.367)。
同時還描述了STS編碼序列用于產生雄性不育的植物和花顏色有所改變的植物的用途(德國專利申請DE-A-4440200)，但至今仍完全未弄清STS基因表達和臭氧誘導之間可能存在的關系。
同時，有多種跡象表明為了基于轉基因植物中STS基因的表達對疾病產生盡可能有效的抗性，如果植物中異源STS基因的表達(或異源STS基因)首先被進攻病原體刺激，即如果首先被植物和病原體的相互作用所刺激的話較為有利(Fischer和Hain(1994),Current Opinion in Bio-technology,5,125-130；Fischer(1994)“用于植保的1,2-二苯乙烯合酶基因之異源表達的最優化”，Hohenheim大學)。以下觀察結果特別贊同這一說法，即病原體-誘導的STS基因表達局限于感染部位，并且具有瞬時特性，這意味著STS的表達相對快地達到最高值，并在48小時之內重新降低(Hain等，(1993)，文獻同上)。對轉基因煙草植物進行的實驗中STS基因在花椰菜花葉病毒的組成型35S RNA啟動子的控制下表達，實驗結果表明真菌感染后，所述植物獲得的抗病性低于在病原體-誘導的同源STS啟動子控制下表達相同基因的植物所獲得的抗性(Fischer和Hain等，(1994)，文獻同上；Fischer(1994)，文獻同上)。無論如何，需要因插入STS基因而顯示出較強的抗病性的轉基因栽培植物中的STS表達只被(和直至)病原體的攻擊激活和控制，而不必另外(或以前曾)被不必要的環境應力因素如臭氧所激活和控制。
因此，植保生物技術研究的重要任務是在植物中實現更特殊的防御基因表達，為了以有效的和可控的方式使產生較強抗性植物的分子生物學策略具體化。重要的是除去不必要的，非特異性的環境刺激，如通過臭氧，紫外線，重金屬，極端溫度和其它非生物刺激誘導某些防御基因。
因此，本發明重要的目的是提供在臭氧誘導的抗性基因表達中直接起作用的新的DNA序列。
本發明的另一個目的是顯示除去臭氧誘導的可能性，即消除臭氧對基因表達不必要的刺激。
另外，本發明的重要目的是提供DNA序列，借助于該DNA序列，僅在植物與病原體接觸之后，而不必通過臭氧刺激可在轉基因植物中表達1,2-二苯乙烯合酶基因。
正如在本文開始時所述，可觀察到對植被也有顯著影響的臭氧影響的穩定增加。目前，對空氣中臭氧濃度的觀察和測定已構成化學，物理學，和生物學，環境學研究的焦點。用于這種研究的重要工具是所謂的生物監測器，借助于該工具易于定性和定量地測定臭氧影響及其后果，尤其是生物毒性效果。
因此，本發明的另一目的是提供可用于產生定向的臭氧可誘導的啟動子的DNA序列。借助于這種啟動子可使生物技術研究領域中眾所周知的所謂的報道基因被用作生物監測器，由簡單的酶促試驗即可證明所述報道基因的表達。
本發明的另一目的是提供一種系統，借助于該系統，可使某些基因在必要時，如臭氧影響較大的情況下能被“打開”，所述基因的表達產物能解毒細胞中的氧類。換句話說，通過提供負責臭氧-反應基因之調節的DNA序列，應該可以提供所述基因的臭氧-誘導的表達，所述基因如過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因。因此，本發明的目的是提供可用于產生臭氧誘導的，細胞“臭氧保護系統”的DNA序列。隨著下列描述的進行，本發明的其它目的將是顯而易見的。
通過獨立權利要求的主題，特別是根據本發明所提供的直接參與植物中臭氧誘導的基因表達的DNA序列可解決這些問題。
我們驚奇地發現某些植物核酸序列直接參與臭氧-反應性STS表達。而對轉基因的煙草胚和植物(在不同長度的5’缺失的葡萄樹VstⅠ啟動子的控制下表達大腸桿菌中常規的報道基因uidA，所述基因編碼β-葡糖醛酸酶)所作的實驗表明至少一些負責真菌誘導的順式元件(cis-element)位于含有堿基對-140至-280(從轉錄起點處計算)的啟動子范圍內(Fischer(1994)，文獻同上)，含有堿基對-280至-430的VstⅠ序列范圍是通過臭氧強烈激活基因表達所必需的。根據我們的實驗，可以表明剩下直至并包括-280的唯一堿基對的VstⅠ啟動子(因而缺乏位于其上游的VstⅠ-啟動子序列)不再是臭氧可誘導的啟動子。然而，如上所述，所述變短的啟動子仍能表現出由其控制的編碼序列的病原體-誘導的基因表達(見Fischer(1994)，文獻同上)。
上述分析也讓我們懷疑用臭氧處理植物與植物細胞中乙烯生物合成或釋放增加之間的關系，因此，臭氧誘導的基因表達中乙烯反應元件的參與不能被排除，通過考慮最近在乙烯反應能力方面被討論的熟悉的順式元件(Sessa等，(1995)，植物分子生物學，28,145-153；Shinshi等，(1995)，植物分子，27,923-932)，在臭氧誘導的STS基因表達中不能排除含有堿基對-283至-273的VstⅠ啟動子之序列范圍的參與。
因此，首次在本文中描述的臭氧反應性DNA序列范圍含有葡萄樹VstⅠ啟動子的堿基對-270至-430。
因此，本發明涉及權利要求1所限定的DNA序列(SEQ ID NO:1):
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAA T，所述序列是植物中臭氧誘導的基因表達所必需的。本發明優選的DNA序列涉及得自葡萄樹的DNA序列，特別優選得自葡萄樹1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ的DNA序列(堿基對-270至-430)。
另外，本發明涉及至少缺乏含有VstⅠ基因之堿基對-270至-430的DNA序列的VstⅠ基因啟動子區域。優選本發明涉及僅含有VstⅠ基因翻譯起始點至堿基對-270的序列范圍的VstⅠ基因啟動子區域。特別優選缺乏VstⅠ基因之序列范圍-270至-430的啟動子區域能賦予植物病原體誘導的基因表達。
本發明也涉及嵌合的核酸分子，其中插入了VstⅠ基因之堿基對-270至-430的DNA序列或至少插入此序列范圍的片段。特別優選本發明的嵌合核酸分子因VstⅠ基因之堿基對-270至-430的DNA序列或至少其片段的存在可為含有所述核酸分子的植物提供編碼區的臭氧誘導的表達。
核酸分子可以是任何核酸分子，尤其是DNA或RNA分子，如cDNA，基因組DNA,mRNA等。它們可以是天然產生的分子或通過基因技術或化學合成方法制備的分子。
目前，通過利用本發明的DNA序列，啟動子區域，核酸分子或載體，可以利用基因技術方法以使植物細胞顯示出臭氧誘導特性的方式突變所述植物細胞。另外，可以利用基因技術方法以使植物細胞顯示出一個或多個基因不再能被臭氧誘導，但優選主要被病原體誘導之特性的方式突變所述植物細胞，所述基因因權利要求1所述DNA序列或衍生自該序列的DNA序列或與所述DNA序列同源的DNA序列而天然地可被臭氧誘導。
本發明特殊的優點是這一事實可通過在基因中缺失權利要求1所述的DNA序列，或至少缺失其片段來消除植物和植物細胞中天然可被臭氧誘導的基因的臭氧誘導，所述基因中天然含有此DNA序列或可衍生自此DNA序列的DNA序列或與所述DNA序列同源的DNA序列。
本發明的另一優點是通過使用本發明的核酸序列能使植物和植物細胞中不能或基本上不能天然地被臭氧誘導的基因顯示出能被臭氧誘導的特性。在優選的實施方案中，負責臭氧誘導之表達的核酸分子或至少其片段控制著基因表達，所述基因的基因產物能解毒植物細胞中由臭氧引起的除別的以外還可產生的活性氧類。在特別優選的實施方案中，核酸分子控制過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因的表達。
在其它的實施方案中，負責臭氧誘導之基因表達的DNA序列控制著報道基因的表達，為了定量和/或定性地測定臭氧濃度和評價臭氧的影響可測定報道基因的表達。這種報道基因可以是例如植物生物技術中常規的大腸桿菌編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)的uidA基因，螢光素基因或其它基因。生物技術，生物化學或分子生物學領域的每一位技術人員都熟悉適當的報道基因。
另外，本發明涉及含有上述DNA序列或其啟動子區域或其片段的載體，因此，本發明也涉及基因技術中常見的含有本發明的上述核酸分子的載體，特別是質粒，粘粒，病毒，噬菌體和其它載體，如有必要，可使用所述載體將所述核酸分子轉移到植物或植物細胞中。
本發明也涉及含有本發明核酸分子的經轉化的微生物，如細菌，病毒和真菌。
本發明的另一個目的是提供植物和植物細胞，所述植物和植物細胞的特征在于缺乏在植物中可天然地通過臭氧誘導的基因的臭氧誘導的表達。
通過提供負責臭氧誘導的DNA序列和通過利用缺乏所述序列的啟動子，因而可以不再為受該啟動子控制的植物和植物細胞中的基因提供臭氧誘導的基因表達解決了這一難題。
通過提供本發明的DNA序列可類似地解決為不能天然地被臭氧誘導的基因提供臭氧反應性基因表達的難題，因此，利用了在臭氧存在的條件下可特異性地確定某些特性的植物和植物細胞。
優選的實施方案涉及經轉化的植物和植物細胞，其中基因經臭氧誘導而表達，其基因產物能解毒植物細胞中的活性氧類。在此方面特別優選過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因。或者，也可以產生植物和植物細胞(包括原生質體)，所述植物和植物細胞經臭氧誘導后顯示出所謂的報道基因的特性，所述報道基因必要時可用作生物監測器。
因此，本發明的主題是轉基因植物，所述轉基因植物含有整合至植物基因組的如上所述的重組核酸分子，這種植物在理論上可以是任何植物，優選這種植物是單子葉或雙子葉的有用植物。單子葉植物的例子是屬于下列屬的植物燕麥，小麥，黑麥，大麥，水稻，稷，狼尾草，狗尾草，小米，玉米。有用的雙子葉植物如棉花，豆科植物，如豆，尤其是苜蓿，大豆，油菜，番茄，甜菜，馬鈴薯，觀賞植物，樹。其它有用的植物可以是產果植物(尤其是蘋果，梨，櫻桃，葡萄樹，柑橘，鳳梨和香蕉)，油棕櫚，茶樹和可可灌木，煙草，西沙爾麻以及藥用植物，如蘿芙木屬植物和洋地黃。特別優選谷類植物，如小麥，黑麥，燕麥，大麥，水稻，玉米和黍，甜菜，油菜，大豆，番茄，馬鈴薯和煙草。
另外，本發明的主題是本發明植物的增殖材料，如種子，果實，插條，塊莖，根狀莖等以及這種植物的組成成分，如植物細胞，原生質體和愈傷組織。
植物細胞包括分化的和未分化的植物細胞(包括原生質體)以及其中核酸分子整合至植物基因組中或以自主分子的形式存在(包括瞬時轉化)的植物細胞(包括原生質體)。
在另一個實施方案中，本發明涉及已被上述重組核酸分子或載體轉化或接種的宿主細胞，特別是原核或真核細胞，和衍生自所述宿主細胞并含有所述核酸分子或載體的細胞。宿主細胞可以是細菌或真菌細胞以及植物或動物細胞。
本發明的目的還在于描述生產植物和植物細胞的方法，所述植物和植物細胞的特征在于在植物和植物細胞中的其表達能天然地被臭氧刺激的基因缺乏臭氧誘導的表達。
通過利用生產新的不具有這種天然產生的臭氧誘導的基因表達的植物和植物細胞的方法可解決這一難題。
如上所述，本發明的另一目的是提供在臭氧刺激后表達這種基因的植物和植物細胞的生產方法，所述基因的表達天然地不被，或基本上不被臭氧激活。通過生產植物和植物細胞的方法可解決這一難題，所述植物和植物細胞在本發明的DNA序列或至少其片段插入天然不能被臭氧誘導的基因或僅在很低水平上被臭氧誘導的基因之后，經臭氧刺激可表達這種基因。
有多種生產這種新植物或植物細胞的方法，首先，通過常規的基因技術轉化方法，以新的核酸分子整合至植物基因組的方式(這意味著產生穩定的轉化體)突變植物或植物細胞。
根據本發明，可通過包括下列步驟的方法生產因缺乏本發明的核酸序列或至少其片段而不再顯示出天然含有所述序列之基因的臭氧誘導現象的植物或植物細胞a)從基因中缺失如權利要求1所限定的DNA序列，或能衍生自所述序列的序列，或與所述序列同源的序列，或至少缺失這種序列的片段，所述基因缺失了本發明的DNA序列之后，包括植物細胞中可能被調節的轉錄和翻譯所必需的調節元件，并具有至少一種編碼序列，以及可能有的用于終止轉錄和給各個轉錄物加上poly-A-尾的終止信號。
b)用步驟a)產生的基因或核酸分子轉化植物細胞，和c)可以再生轉基因植物和增殖植物。
可選擇的另一種方法是在步驟a)中不必缺失負責臭氧誘導的序列，只需通過例如誘變將所述序列或至少其片段滅活或阻斷，使其在基因中以失活的形式存在。不論以何種方式缺失臭氧反應性基因的序列范圍，利用常規方法并借助于重組基因技術(例見Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)可進行所有的操作檢測。
在特別優選的實施方案中，在步驟b)中被轉移至植物或植物細胞的核酸分子含有允許例如編碼序列經病原體誘導而進行基因表達的調節元件。
根據本發明，可通過包括下列步驟的方法生產因本發明核酸序列或至少所述序列的片段存在而顯示出臭氧誘導的基因表達的植物或植物細胞，所述核酸序列是含有該序列之基因的臭氧誘導的表達所必需的或共同負責所述表達a)在天然地不被，或基本上不被臭氧誘導表達的基因中插入至少一種在植物中可產生臭氧誘導的基因表達的本發明的DNA序列，或衍生自所述序列的序列，或與所述序列同源的序列，或至少插入所述序列的片段。
b)用步驟a)產生的具有在植物細胞中表達所天然必需的所有元件的基因或核酸分子轉化植物細胞，和c)可以再生轉基因植物和增殖植物。
在優選的實施方案中，涉及的基因是過氧化氫酶歧化酶，超氧化物歧化酶或一般的報道基因。
本發明的另一目的是顯示本發明核酸序列有利的應用。
因此，本發明包括新的DNA分子用于生產上述本發明植物和植物細胞的用途，所述植物和植物細胞的特征在于或者缺乏正常情況下受臭氧影響的某些表型區別性標志，或者就是因為本發明DNA序列的存在，通過臭氧誘導的特性即可將它們自身與非轉基因植物和植物細胞區分開。
另外，本發明包括本發明的核酸分子用于生產其特征在于病原體誘導的而不是臭氧誘導的抗病性有所增加的植物的用途。
本發明也涉及本發明的核酸序列或其片段用于檢測和鑒定臭氧反應性核酸元件的用途。
技術人員通過應用常規的分子生物學方法，如雜交實驗或DNA蛋白質結合研究可鑒定這種臭氧反應性核酸元件。例如，第一步可從經臭氧處理的組織中分離poly(A)*RNA，然后建立cDNA庫。第二步可借助于基于未經處理之組織的poly(A)*RNA分子的cDNA克隆，利用雜交來鑒定第一個庫中的那些克隆，所述雜交中相應的poly(A)*RNA分子在臭氧處理過程中被嚴格誘導。借助于以此方式鑒定的cDNA，隨后可分離具有臭氧反應性元件的啟動子。當檢查和鑒定這些分離的啟動子時，核酸序列和分子可能是有用的工具。
本發明的主題也包括與本發明的上述核酸分子之一或上述DNA序列之一雜交的核酸分子或其片段。在本發明范圍內，術語“雜交”指的是在常規雜交條件下，優選在嚴緊條件下進行的雜交，所述條件描述于例如Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約。
可從例如基因組文庫或cDNA文庫中分離與本發明的分子雜交的核酸分子。
通過使用本發明的核酸分子，或所述分子的片段或這種分子的反向互補物，根據標準方法(例見Sambrook等，文獻同上)雜交即可實現這種核酸分子的鑒定和分離。
因此，本發明也涉及本發明DNA序列或其片段用于從植物或其它生物體中鑒定和分離同源序列的用途。
例如，精確地或大體上具有本發明核苷酸序列的核酸分子或這種序列的片段可用作雜交探針。用作雜交探針的片段也可以是合成的片段，借助于常規的合成技術可產生這種合成片段，該片段的序列基本上相當于本發明核酸分子的序列。一旦鑒定和分離出與本發明核酸分子雜交的基因，必需測定序列并分析其特性。為此，技術人員可使用大量分子生物學，生物化學和生物技術的標準方法。
與本發明的核酸分子雜交的分子也包括上述DNA分子的片段，衍生物和等位基因變體，所述DNA分子含有活性形式或失活形式的臭氧反應性序列，或者其特征在于它們不再具有這種序列。本文中所用術語“衍生物”指的是這些分子的序列與上述核酸分子之序列僅在一個或幾個位置上有差別，在很大程度上與所述序列同源。在此方面的同源性指的是序列同一性至少為40％，特別是同一性至少為60％，優選為80％以上，特別優選為90％以上。缺失，添加，取代，插入或重組可導致得自上述核酸分子的衍生物。
至于與上述分子同源并構成這種分子的衍生物的核酸分子，它通常包括這種分子的變體，所述變體具有修飾，但行使相同的生物學功能。這些變體可包括天然產生的變異，如得自其它生物體的序列，或突變，所述突變中這些修飾可天然產生或通過定點誘變導入。另外，變異可涉及合成產生的序列。至于等位基因變體，它們可以是天然產生的，也可以是合成產生的變體，或通過重組DNA方法產生的變體。
為了將外源基因插入高等植物或其細胞，可使用大量克隆載體，所述載體含有大腸桿菌復制信號和用于選擇經轉化的細菌細胞的標記基因。這種載體的例子是pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。可在適當的限制性切割位點處將所需序列插入載體中，將所得質粒用于轉化大腸桿菌細胞，在適當的培養基中培養經轉化的大腸桿菌細胞，隨后收獲細胞并裂解之，回收質粒。通常將限制性分析，凝膠電泳和其它生物化學，分子生物學方法用作分析方法以鑒定所得的質粒DNA。每次操作后，裂解質粒DNA，將所得的DNA片段與其它DNA序列連接，每個質粒DNA序列可被克隆至相同的或其它的質粒中。
可使用很多眾所周知的方法將DNA導入植物宿主細胞中，技術人員可毫不困難地確定各個適當的方法。這些技術包括通過使用根瘤農桿菌或毛根農桿菌作為轉化介質用T-DNA轉化植物細胞，原生質體融合，將分離的DNA直接基因轉移至原生質體中，DNA電穿孔，利用biolistic方法導入DNA以及其它方法。轉化過程中可產生穩定的以及瞬時的轉化體。
當將DNA注射和電穿孔至植物細胞中時，對所用的質粒沒有特殊的需求，直接基因轉移也是如此。可使用簡單的質粒，如pUC衍生物。然而，如果需由以此方式轉化的細胞再生整個植株，需要選擇性標記基因的存在。本領域技術人員熟知通常的選擇性標記，對于他們而言不難選擇適當的標記，通常使用的選擇性標記是使經轉化的植物細胞對殺蟲劑或抗生素具有抗性，所述殺蟲劑或抗生素如卡那霉素，G418，博來霉素，潮霉素，氨甲碟呤，glyphosate，鏈霉素，磺酰脲，慶大霉素或膦絲菌素等。
根據所選擇的將基因導入植物細胞中的方法，也需要另外的DNA序列，例如，如果使用Ti或Ri質粒轉化植物細胞，至少應將Ti或Ri質粒中所含T-DNA的右邊界，但通常將其右和左邊界作為側翼區與被導入的基因連接。
如果使用農桿菌轉化，需導入的DNA必需被克隆至特殊的質粒中，即或者克隆至中間質粒中或者克隆至二元載體中。由于存在與T-DNA中的序列同源的序列，通過同源重組可將中間質粒整合到農桿菌的Ti或Ri質粒中。另外，后者包括T-DNA轉移所需的vir-區域。中間載體不能在農桿菌中復制，利用輔助質粒可將中間質粒轉移至根瘤農桿菌中(接合)。二元載體可在大腸桿菌以及農桿菌中復制，它們含有選擇性標記基因和接頭或多接頭，框內還含有T-DNA右和左邊界區域。它們可以直接被轉化至農桿菌中(Holster等(1978)，分子和普通遺傳學，163,181-187)。用作宿主細胞的農桿菌應含有具有vir-區域的質粒，vir-區域是T-DNA轉移至植物細胞所必需的。可以存在另外的T-DNA，將按所述方式轉化的農桿菌用于轉化植物細胞。
已深入研究了T-DNA用于轉化植物細胞的用途，有關內容詳細描述于EP120515；Hoekema二元植物載體系統，OffsetdrokkerijKanters B.V,Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，(1993),Crit.Rev.Plant.Sci,4,1-46和An等，(1985),EMBO J,4,277-287。
為了將DNA轉移至植物細胞，可將植物外植體與根瘤農桿菌或毛根農桿菌一起適當地培養。在含有抗生素或殺蟲劑以選擇經轉化細胞的適當培養基中，由被感染的植物材料(葉片，莖節，根，也有原生質體或懸浮培養的植物細胞)可再生出整個植株。根據常規的再生方法，使用眾所周知的培養基可進行植物的再生。然后檢查按上述方式得到的植物或植物細胞中被導入的DNA的存在。通過應用biolistic法或原生質體轉化導入外源DNA的其它方法是已知的(例見Willmitzer L,(1993)，轉基因植物Biotechnology,A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J.Rehm.G.Reed,A.Puhler,P.Stadler編)，vol.2,627-659,V.C.H.Weinheim-紐約-Basel-Cambridge)。
盡管通過Ti質粒載體系統并借助于根瘤農桿菌轉化雙子葉植物或其細胞的方法已被完善地建立，但新的研究表明單子葉植物或其細胞也很能接受用基于農桿菌的載體轉化(Chan等，(1993)，植物分子生物學，22,491-506；Hiei等，(1994)，植物學雜志，6,271-282；Deng等，(1990)，中國科學，33,28-34；Wilmink等，(1992)，植物細胞報道，11,76-80；May等，(1995),Bio/Technology,13,486-492；Conner和Domiss,(1992)，國際植物科學雜志，153,550-555；Ritchie等，(1993)，轉基因研究，2,252-265)。
轉化單子葉植物或其細胞的另外的系統是利用biolistic setup轉化(Wan和Lemaux,(1994)，植物生理學，104,37-48；Vasil等，(1993),Bio/Technology,11,1553-1558；Ritala等，(1994)，植物分子生物學，24,317-325；Spencer等，(1990),Theor.Appl.Genet,79,625-631)，原生質體轉化，部分透化之細胞的電穿孔和利用玻璃纖維導入DNA。
以一般的方法在植物內培養經轉化的細胞(見McCormick等，(1986)，植物細胞報道，5,81-84)。正常地培養所得植物，并用具有相同的，經轉化的遺傳性狀或其它遺傳性狀的植物嫁接。所得的各個雜交植物具有各自的表型特性。
應培養兩代或更多代以確保表型特性能穩固地維持和增殖。也應收獲種子以確保各個表型或其它特性能得以維持。
通過利用一般的方法可確定其中新的核酸分子為純合的轉基因品系，另外，可檢查表型行為中存在的或不存在的臭氧反應能力并與半雜合品系的相比較。
一般也可將含有本發明核酸分子的植物細胞作為植物細胞(包括原生質體，愈傷組織，懸浮培養物等)進一步培養。
本發明的另一目的是本發明的核酸分子，或這種分子的片段，或這種分子的反向互補物用于從植物或其它生物體中鑒定和分離包括臭氧反應元件的同源分子的用途。至于術語“同源性”的定義可參見上文給出的定義。
為了解釋本發明給出了下列實施例。
實施例實施例1在二元載體pPCV002中將VstⅠ啟動子的5’-缺失構建為GUS融合結構葡萄樹VstⅠ基因的5’非編碼序列范圍(下文稱之為啟動子)由1570個堿基對組成。此啟動子的序列公開于德國專利申請DE4107396和Fischer(1994)，文獻同上中，借助于使用下列寡核苷酸作為引物的通常的聚合酶鏈反應和含有整個VstⅠ基因(DE-A-4107396；Fischer(1994)，文獻同上)的質粒pVstⅠ，擴增所述啟動子的序列以作為模板5’-CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT-3’(引物1,SEQ ID NO:2)5’-CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT-3’(引物2,SEQ ID NO:3)。
根據Perking Elmer(Norwalk,USA)的方法，使用由Perkin Elmer提供的天然Taq DNA聚合酶進行PCR，隨后用限制性酶HindⅢ(此限制性位點位于引物1的5’端)和BamHⅠ(此限制性位點位于引物2的5’端)重新切割在一般的PCR條件下擴增的DNA片段，并通過pUC18-多接頭的HindⅢ和EcoRⅠ限制性切割將所得片段與得自載體pBI101.2(Jefferson(1987),Plant Mol.Biol.Reporter,5,387-405)且含有大腸桿菌β-葡糖醛酸酶報道基因(GUS,uidA)以及根瘤農桿菌nos基因終止信號的BamHⅠ/EcoRⅠ片段一起亞克隆至pUC18-質粒中。使用常規的分子生物學方法和輔助物(例如Sambrook等，(1989)，文獻同上)進行所有的克隆步驟；用于克隆的限制性酶和其它酶得自Boehringer Mannheim。因此，所得克隆(pUC-VstⅠ/GUS)含有VstⅠ啟動子與GUS基因的翻譯融合，其中閱讀框中的前5個STS密碼子通過BamHⅠ切割與GUS基因連接。利用酶促鏈終止法(Sanger等，(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467)，通過使用Pharmacia(Freiburg)之T7測序試劑盒檢查融合轉換之序列范圍以及VstⅠ啟動子序列的正確性。
下文將解釋5’缺失突變體在二元載體pPCV002(Koncz和Schell,(1986),Mol.Gen.Genet,204,383-396)中的克隆。在大多數情況下可使用pUC18亞克隆作為中間載體，因為與相對較大的二元載體相比，較小的pUC質粒易于操縱。
質粒的命名源于從位于距起始密碼子73個堿基對的轉錄起始點開始計算的各個啟動子片段的大致長度(Hain等，(1993)，文獻同上；Fischer(1994)，文獻同上)。用于逐漸縮短VstⅠ啟動子的限制性位點示于

圖1。
-p1500GUS含有完整的STS啟動子以及GUS基因的HindⅢ/EcoRⅠ片段分離自上述質粒pUC-VstⅠ/GUS，此片段被插入pPCV002多接頭中的限制性位點HindⅢ和EcoRⅠ之間。
-p1060GUS通過限制性切割BamHⅠ和SspⅠ從pUC-VstⅠ/GUS中分離1130bp的啟動子片段并將此片段克隆至經BamHⅠ/HincⅡ線性化的pUC18中(得到pUC1130)，隨后從pUC-VstⅠ/GUS中分離出BamHⅠ/EcoRⅠ形式的GUS基因，并將GUS基因克隆至pUC1130的BamHⅠ位點和EcoRⅠ位點之間。最后，通過HindⅢ/EcoRⅠ雙消化分離融合物并經由相同的位點插入pPCV002的多接頭中。
-p930GUS通過限制性酶BamHⅠ和HincⅡ從pUC-VstⅠ/GUS中分離出1.0kb的啟動子片段并經由相同的位點插入pUC18的多接頭中(得到pUC1000)，接下來的操作與p1060GUS中的類似。
-p740GUS從質粒pUC-VstⅠ/GUS中分離出大致1.6-kb-長的HindⅢ/BamHⅠ啟動子片段并用限制性酶DraⅠ消化。隨后，經由限制性位點BamHⅠ和HincⅡ將所得的810-bp-長的BamHT/DraⅠ片段克隆至pUC18中(得到pUC810)，隨后從pUC-VstⅠ/GUS中分離出BamHⅠ/EcoRⅠ片段形式的GUS基因，并將GUS基因克隆至pUC810的BamHⅠ位點和EcoRⅠ位點之間，最后，通過HindⅢ/EcoRⅠ雙消化分離融合物并經由相同的位點插入pPCV002的多接頭中。
-p550GUS用限制性酶AF1Ⅱ消化pUC-VstⅠ/GUS，根據廠商說明用Klenow酶(Boehringer Mannheim；dNTP，也得自BoehringerMannheim)補平突出的5’端，隨后用限制性酶BamHⅠ重新切割，將所得的620bp-啟動子片段連接至用BamHⅠ/HincⅡ線性化的pUC18中(得到pUC620)，接下來的操作與p1060GUS中的類似。
-p500GUS通過BamHⅠ/HaeⅢ雙消化從pUC-VstⅠ/GUS中分離出570bp-長的啟動子片段并連接至用BamHⅠ/HincⅡ線性化的pUC19載體中(得到pUC570)，接下來的操作與p1060GUS中的類似。
-p430GUS使用限制性酶SnaBⅠ使上述質粒pUC1000線性化，然后用HincⅡ消化，再重新連接線性化的載體，從而缺失了-930至-430之間500個堿基對的啟動子(-＞pUC500)，接下來的克隆與pUC1060GUS中的類似。
-p280GUS用限制性酶BanⅡ消化pUC-VstⅠ/GUS，用K1enow酶補平突出的5’端，隨后用限制性酶BamHⅠ消化線性化的載體，分離出350-bp-長的平端/BamHⅠ-啟動子片段之后，接下來的克隆與p1060GUS中的類似。
-p140GUS用限制性酶NsiⅠ和PstⅠ消化上述pUC亞克隆pUC620，隨后純化線性化的載體并重新連接，這可導致啟動子序列-550至-140的缺失(得到pUC210)，隨后從pUC-VstⅠ/GUS中分離出BamHⅠ/EcoRⅠ片段形式的GUS基因，并將GUS基因克隆至pUC1130的BamHⅠ位點和EcoRⅠ位點之間，最后，通過HindⅢ/EcoRⅠ雙消化分離融合物并經由相同的位點插入pPCV002的多接頭中。
-p40GUS通過NheⅠ/EcoRⅠ雙消化從pUC-VstⅠ/GUS中分離出110bp的啟動子片段以及GUS基因，隨后將此片段克隆至經XbaⅠ/EcoRⅠ線性化的pPCV002中。
-pΔGUS用限制性酶BamHⅠ消化結構p1500GUS，隨后重新連接純化的載體(cleaned vector)，因此，通過載體pPCV002多克隆位點中天然含有的除HindⅢ位點以外的BamHⅠ位點(Koncz和Schell(1986)，文獻同上)可消除整個啟動子片段。
-p35SGUS從表達載體pRT99GUS(Topfer等，(1988)，核酸研究，16,8725)中以HindⅢ片段的形式分離出用作陽性對照的花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子與GUS基因的融合物，并插入pPCV002的多克隆位點。
實施例2轉基因植物的植物材料，植物轉化和再生在26℃,3000勒和16小時光周期的條件下，在含有1％蔗糖的無激素1/2 LS-培養基(Linsmaier和Skoog(1965)，植物生理學，18,100-127)中將煙草品種Petit Havana SR1(Maliga等(1973),Nature NewBiol,224,29-30)培養成無菌幼芽培養物。6-8周的間隔之后，將芽節斷轉移至新鮮的LS培養基中。為了用根瘤農桿菌轉化葉切片(Horsch等，(1985)，科學，227,1229-1231)，將無菌幼芽培養物2-3cm長的葉壓成直徑為1cm的切片，并與含有上述質粒結構之一的農桿菌懸浮液(約109個細胞/ml YEB培養基)一起保溫5分鐘，于26℃，將經保溫的葉節斷置于無激素的LS培養基上放2至3天，其時，細菌長滿葉節斷，隨后用不含激素的液體LS培養基洗滌葉節斷，并將該葉節斷置于含卡那霉素(75μg/ml；Sigma,Munich)，頭孢噻肟(500μg/ml；Hoechst,Frankfurt)和芐氨基嘌呤(BAP,0.5mg/l；Duchef,Haarlem,TheNetherlands)的LS培養基上。2至3周后，可以看見經轉化的芽，該芽生根于含75μg/ml卡那霉素和100μg/ml頭孢噻肟的無激素LS培養基上。
按下述方法產生用于轉化煙草葉節斷的農桿菌培養物首先將上述pPCV002衍生物插入大腸桿菌轉移菌株S17-l(Simon等(1983),Bio/Technology,1,784-790)中。這可產生感受態的S17-1大腸桿菌細胞，根據Taketo(1988),Biochem.Biophys.Acta,949,318-324或Hanahan(1983)，分子生物學雜志，166,557-580所述方法用各個質粒轉化感受態細胞，隨后，在相關的培養基中將含有各個二元載體的大腸桿菌菌株和根瘤農桿菌菌株GV3101 C58C1 Rifr pMP90RK(Koncz和Schell(1986)，文獻同上)培養至OD580=1.0。使用下列條件培養大腸桿菌37℃，常規的YT培養基(Miller(1972)，分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)細菌用胰蛋白胨0.8％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v),NaCl0.5％(w/v,pH7.0)。為了培養根瘤農桿菌，于28℃使用YEB培養基(牛肉膏0.5％(w/v)，酵母提取物0.1％(w/v)，細菌用胰蛋白胨0.5％(w/v)，蔗糖0.5％(w/v),MgSO42mM,pH7.2)。為了進行接合，通過于1500×g離心5分鐘分離細菌，并用新鮮制備的10mM MgSO4溶液將細菌洗滌兩次，然后以1∶1的比率混合供體(大腸桿菌)和受體(根瘤農桿菌)并滴在YEB瓊脂平板上。28℃保溫16小時后，用10mM MgSO4溶液沖洗細菌菌落，將10-2,10-3和10-4的稀釋液平鋪在YEB選擇平板上。于28℃，由單個培養物培養用于轉化煙草的農桿菌培養物。
通過芽培養增殖各含有上述VstⅠ啟動子/GUS融合物之一的轉基因煙草芽，并將所述煙草芽部分轉移至土壤中，在正常條件下(22℃,60％相對大氣濕度，約15,000勒)于溫室中培養至開花。利用羊皮紙袋保護花免受外源傳粉，4至6周后收獲成熟的含F1-代種子的種子莢。為了在溫室中進行生物學試驗，將F1-代的種子平鋪在含75μg/ml卡那霉素的LS培養基上，在無菌條件下，直接在莢外進行這些操作，或消毒表面后(1．用無菌水粗略地洗滌；2．在70％乙醇中保溫2分鐘；3．在3％的NaOCl(13％的活性氯)中保溫10分鐘；4．用水洗滌3次；5．在安全工作區的分層空氣流中干燥)進行這些操作。于25-26℃,2000-3000勒和60％大氣濕度下，在含75μg/ml卡那霉素的LS培養基上培養約2周后，可以明顯地區分卡那霉素抗性煙草胚和卡那霉素敏感的煙草胚。與敏感的胚相比，抗性胚顯示出明顯的初生根生長。除了子葉以外，2周后在抗性胚中還可辨認出初生的葉，在這種“四葉階段”，將抗性F1-胚轉移至土壤中，使之變得結實后，再在適當條件下進一步培養。
實施例3
植物培養，臭氧處理和葉的收獲為了進行臭氧處理，首先將轉基因的卡那霉素抗性的煙草胚從瓊脂平板上轉移至花盆中，所述花盆中含有標準基質(T型/Fruhstofer/Lauterbach)和Pearlit的2∶1混合物，在氣候室中，以12小時-晝/夜周期，15,000勒，白晝溫度為25℃，夜晚溫度為20℃，大氣濕度為65-70％和過濾空氣的條件將所述煙草胚培養3周。
隨后，使煙草植株經受單次臭氧脈沖10小時，然后在無污染的，經過濾空氣中保溫2-14個小時。在特定的氣候條件下，于置于氣候室中的密閉的有機玻璃盒中進行所有的通氣實驗。臭氧處理總在早上9點鐘開始，并延續完一天的周期。通過在干燥的氧氣中放電可產生臭氧，在計算機的控制下進行劑量安排和分析(Langebartels等，(1991)，植物生理學，95,882-889)。從植株的頂端至底部計數煙草植株的葉，然后按葉數目1-10分類，其中第一片葉至少為8cm長。在臭氧處理開始后的不同的時間點將煙草葉(從1-10分類)各冷凍于液氮中，并儲存于-80℃中。
實施例4β-葡糖醛酸酶活性試驗嚴格按照Jefferson(1987)，文獻同上或Jefferson等(1987),EMBOJ,6,3901-3907所述，使用4-甲基-umbelliferyl-葡糖苷酸(MUG,Sigma,Munich)進行GUS酶活性的熒光計分析。用熒光光度計(PerkinElmer LS-2B濾片熒光計)在石英流式池中測定產物4-甲基傘形酮(MU)的濃度。植物提取物中的GUS活性被計算為pmol MU×mg-1×min-1。根據Bradford(1976),Analyt.Biochem,72,248-254所述測定煙草葉提取物中的蛋白質濃度。
用經臭氧處理的葡萄樹植株進行平行實驗，隨后進行Northern印跡分析，結果表明用0.2μl/l和0.4μl/l臭氧通氣導致在mRNA水平上大量誘導STS基因的表達。為此，葡萄樹的STS基因應特別適于鑒定臭氧反應性DNA元件。在這一點上應說明的是與未經處理的植株相比，經臭氧處理的植株中至今已顯示出顯著的，能可靠測定的臭氧誘導的基因是沒有的。
為了能分析臭氧對啟動子水平的影響，在臭氧通氣實驗中使用了確實被轉化的煙草品系的F1-煙草植株(11周齡)，該植株中含有具完整啟動子區的VstⅠ啟動子/GUS融合結構(p1500GUS)。用熒光計測定葉粗提取物中的GUS-酶活性，所述葉收獲于通入不同濃度的臭氧(0.1μl/l臭氧，0.2μl/l臭氧或0.4μl/l臭氧)10小時和在未經污染的空氣中保溫14小時后的不同時間點。圖2所示結果表明與僅置于無污染空氣中的對照植物的相比，GUS活性呈快速的臭氧誘導的增加。因此，開始用臭氧處理12小時之后，用0.1μl/l臭氧處理導致11倍的由STS啟動子控制的GUS基因表達誘導，用0.2或0.4μl/l臭氧處理甚至可導致高達25倍的誘導。
為了鑒定負責已觀察到的STS啟動子之強臭氧誘導的順式調節序列，在臭氧通氣實驗中將含有與細菌GUS報道基因融合的上述VstⅠ啟動子5’缺失的轉基因煙草品系作為獨立的FO-植物來分析。將初次再生的植株無菌培養幾個月，并通過芽培養增殖，還需檢查這些穩定轉化體的F1煙草植株(11周齡)的臭氧誘導的GUS表達。
用0.1μl/l臭氧處理轉基因的煙草植株10小時，然后在未污染的空氣中保溫2小時，測定培養基-老葉粗提取物中的GUS活性并與未經處理的對照植株中的酶活性相比。GUS酶活性的熒光計分析結果示于表1。盡管GUS活性導致臭氧誘導略為降低(在經臭氧誘導的受試植株以及未經處理的對照植株中，隨著啟動子范圍逐漸由-1500縮短為-430，誘導系數也由約12(-1500)降至約10(-430))，但啟動子范圍-430和-280之間的另外的缺失使經臭氧處理的受試植株中GUS表達大幅度的降低。而其中GUS基因受-430-5’缺失啟動子控制的植株與對照植株相比顯示出10倍的臭氧誘導，其中GUS基因受較短的-280-5’缺失啟動子控制的植株僅顯示出最大為2倍的GUS表達臭氧誘導。因此，含有堿基對-430至-280的葡萄樹VstⅠ基因之啟動子范圍中含有顯著臭氧誘導的STS基因表達所必需的順式活性元件。
通過含有上述結構并在植物細胞培養中培養的植物細胞可證實這些結果。
圖和表圖1質粒pUC-VstⅠ/GUS中VstⅠ啟動子/GUS翻譯融合物的限制性圖譜。所述質粒含有葡萄樹VstⅠ啟動子與大腸桿菌GUS基因的翻譯融合物。已標出用于克隆5’缺失突變體的限制性位點。nos ter=根瘤農桿菌胭脂氨酸合酶基因的終止信號。
圖2通過多種濃度的臭氧在轉基因F1煙草植株中由VstⅠ啟動子控制的GUS表達的誘導的動力學，所述植株含有GUS基因與葡萄樹完整的VstⅠ啟動子的翻譯融合物(p1500GUS)。
根據Jefferson(1987)，文獻同上所述，用熒光計測定煙草葉(4號葉)粗提取物中的GUS活性，從圖中可確定多種收獲時間。10小時臭氧處理后，將煙草植株在未污染的空氣中保溫14小時。對照植株僅置于未污染的空氣中(沒有通入臭氧)，n=3或4；平均值±標準誤差；所有試驗都進行雙份。
表1用熒光計測定培養基-經臭氧處理(+)和未經處理的(-)，獨立的煙草轉化體之老葉的蛋白質提取物中的GUS酶活性。轉基因的煙草品系含有與細菌GUS報道基因融合的VstⅠ啟動子的多種5’缺失。在FO-轉化體和F1植株(11周齡)中通入100nl/l臭氧達10小時，隨后在未污染的空氣中保溫2小時。平均值±標準誤差；所有試驗都進行雙份。表1
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表1用熒光計測定培養基-經臭氧處理(+)和未經處理的(-)，獨立的煙草轉化體之老葉的蛋白質提取物中的GUS酶活性。
轉基因的煙草品系含有與細菌GUS報道基因融合的VstⅠ啟動子的多種5’缺失。在FO-轉化體和F1植株(11周齡)中通入100nl/l臭氧達10小時，隨后在未污染的空氣中保溫2小時。平均值±標準誤差；所有試驗都進行雙份。
表1
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und GesundheitGmbH[Research Center for Environment and Health Inc.](B)街道Ingolstaedter Landstr.l(C)城市Oberschleissheim(E)國家德國(F)郵政編碼85764(A)姓名BAYER AG(B)街道BAYERWERK(C)城市Leverkusen(E)國家德國(F)郵政編碼51368(ⅱ)發明題目臭氧誘導的植物基因表達(ⅲ)序列數3(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC可兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度161個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型基因組-DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:1:ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTTTGAAAAGGAG 60GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTAATGAAATCAAAGTCAC 120TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAAT161(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT33(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ IN NO:3CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT3權利要求
1．植物DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAAT。
2．權利要求1所述的DNA序列，其來源于葡萄樹(Vitis vinifera)。
3．權利要求1或2所述的DNA序列，該序列天然包含在1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ中，并對應于堿基對-270至-430。
4．葡萄樹1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ的啟動子區域，所述區域至少缺乏權利要求1所述的DNA序列。
5．權利要求4所述的啟動子區域，所述區域僅含有翻譯起始點至堿基對-270的序列范圍。
6．權利要求4或5所述的啟動子區域，所述區域還能賦予植物細胞病原體誘導的基因表達。
7．嵌合的核酸分子，其中導入了權利要求1所述的DNA序列或至少其片段。
8．權利要求7所述的嵌合核酸分子，所述核酸分子可為植物提供所述分子中所含編碼區的臭氧誘導的表達。
9．含有上述權利要求之一所述的DNA序列，啟動子區域或嵌合核酸分子，或其片段的載體。
10．含有上述權利要求之一所述的DNA序列，啟動子區域或嵌合核酸分子，或衍生自所述DNA序列的DNA序列的轉基因植物，以及這種植物的組分及其增殖材料，如原生質體，植物細胞，愈傷組織，種子，塊莖或插條等，以及這種植物的后代。
11．轉基因植物，所述植物因缺乏(天然狀態下存在)DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAA T或至少缺乏其一個片段而不再顯示出天然可被臭氧誘導之基因的臭氧誘導的表達。
12．權利要求11所述的植物，其中抗病基因的臭氧誘導的表達被大大降低。
13．權利要求11或12所述的植物，其中1,2-二苯乙烯合酶基因，尤其是葡萄樹VstⅠ基因的臭氧誘導的表達被大大降低。
14．權利要求10所述的植物，其中因導入了權利要求1所述的DNA序列，或至少其片段，在不會天然出現所述DNA序列的基因中可發生臭氧誘導的基因表達。
15．權利要求14所述的植物，其中可發生那些其在植物細胞中的表達產物能解毒活性氧類的基因的臭氧誘導的表達。
16．權利要求14或15所述的植物，其中可發生過氧化氫酶或超氧化物歧化酶基因的臭氧誘導的表達。
17．權利要求14所述的植物，其中可發生報道基因的臭氧誘導的表達。
18．權利要求10至17中任一個所述的雙子葉植物，尤其是有用的植物，如大豆，油菜，番茄，甜菜，馬鈴薯，棉花，煙草以及觀賞植物或樹。
19．權利要求10至17中任一個所述的單子葉植物，尤其是如燕麥，小麥，黑麥，大麥，水稻，小米或玉米的谷類作物。
20．包括原生質體的轉基因植物細胞，含有權利要求1至9中任一個所述的DNA序列，啟動子區域或嵌合的核酸分子，或衍生自它們的DNA序列。
21．包括原生質體的植物細胞，所述植物細胞因缺乏(在天然狀態下存在)DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAAT或至少缺乏所述DNA序列的一個片段而不再顯示出天然可被臭氧誘導之基因的臭氧誘導的表達。
22．權利要求20所述的植物細胞，其中因導入了權利要求1所述的DNA序列，或至少其片段，在不會天然出現所述DNA序列的基因中可發生臭氧誘導的基因表達。
23．產生轉基因植物或植物細胞的方法，其中通過從天然含有權利要求1所述DNA序列或衍生自所述DNA序列的DNA序列的防御基因中缺失所述DNA序列或至少其片段可大大降低或消除天然可被臭氧誘導的防御基因的臭氧誘導的表達。
24．權利要求23所述的方法，其中1,2-二苯乙烯合酶基因的臭氧誘導的表達可被大大降低或消除。
25．權利要求23或24所述的方法，其中葡萄樹VstⅠ基因的臭氧誘導的表達可被大大降低或消除。
26．產生轉基因植物或植物細胞的方法，其中因導入了權利要求1所述的DNA序列或至少其片段而使一個或幾個基因可被臭氧誘導，所述基因的表達天然不被或基本上不被臭氧誘導。
27．權利要求26所述的方法，其中通過臭氧可誘導一個或幾個過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因。
28．權利要求26所述的方法，其中通過臭氧可誘導一個或幾個報道基因。
29．通過缺失或滅活權利要求1所述的DNA序列或至少其片段以除去天然含有權利要求1所述DNA序列或衍生自所述DNA序列的DNA序列的天然可被臭氧誘導的防御基因的臭氧誘導能力的方法。
30．權利要求29的方法，其中基因是1,2-二苯乙烯合酶基因。
31．權利要求29或30所述的方法，其中基因是葡萄樹的VstⅠ基因。
32．通過將權利要求1所述的DNA序列或至少其片段插入天然不被或基本上不被臭氧誘導的那些基因中而在轉基因植物或植物細胞中產生臭氧誘導之特性的方法。
33．權利要求1所述DNA序列或其片段用于檢測植物基因中臭氧反應性序列范圍的用途。
34．權利要求1所述DNA序列或其片段用于在轉基因植物或植物細胞中產生臭氧誘導之特性的用途。
35．權利要求1所述DNA序列或其片段用于產生權利要求17所述的植物的用途，所述植物可用作生物監測器以定量和/或定性地檢測臭氧濃度。
36．權利要求4至6中任一個所述的啟動子區域用于在轉基因植物中產生可被病原體更強誘導但不能被臭氧誘導的抗病性的用途。
全文摘要
本發明涉及新的DNA序列,產生含有新DNA序列新植物的方法,該DNA序列的編碼序列經臭氧誘導之后被表達。本發明也涉及所述的新植物和DNA序列用于在植物和植物細胞中產生臭氧反應性基因表達的用途。另外,本發明還涉及新的啟動子,通過除去其臭氧反應性能力可增強其特異性。
文檔編號C12N5/10GK1235640SQ97195837
公開日1999年11月17日 申請日期1997年6月18日 優先權日1996年6月25日
發明者羅蘭·舒伯特, 海因里希·桑德曼, 迪特里希·厄恩斯特, 魯迪格·海恩, 里賈納·費希爾 申請人:Gsf環境與健康研究中心有限公司, 拜爾公開股份有限公司