生產成熟型骨形態發生蛋白的方法

專利名稱：生產成熟型骨形態發生蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及生產一種成熟型骨形態發生蛋白的方法。更具體地，本發明涉及生產成熟骨形態發生蛋白的方法，包括使加工酶作用于骨形態發生蛋白前體。
背景技術：
骨基質中存在骨形態發生蛋白因子是由Urist et al.發現的(Science,150,pp.893-899,1965)并被命名為“骨形態發生蛋白”(此后略作“BMP”)。近年，許多BMP相關的基因被克隆且已知都屬于轉化生長因子β(此后略作“TGF-β”)超家族。已由其中一些生產重組蛋白。它們用來確認骨形態發生活性并期望應用于骨疾治療。
從基因結構認為，上述屬于TGF-β超家族的蛋白在體內合成為前體，再經各種加工，形成成熟型(活性型)肽純合二聚體。已知人成熟型TGF-β1為COOH端112殘基肽的二聚體(Nature,316,701-705,1985)。實際上，已知哺乳動物細胞中，引入編碼前體cDNA來生產BMP-2或BMP-6/Vgr-1，除與成熟肽二聚體作用外，還與培養上清中許多各類肽二聚體(由大分子量單體組成的純合二聚體及由一個大分子量單體和一個成熟型單體組成的雜合二聚體)作用，其分子量大于成熟型(Growth Factors 7,pp.139-150,1992；J.Biol.Chem.126,pp.1595-1609,1994)。這些分子量大于成熟型的肽二聚體被認為是對應于從前體至成熟型加工過程中的分子。分子量大于成熟型的肽二聚體此后稱作“前體二聚體”。技術上難于從上述各類二聚體中，大規模地選擇生產一定分子量的肽二聚體，如成熟型二聚體；或有效分離成熟型二聚體。因此強烈要求攻克這一技術難關。
發明公開本發明的目的是要提供一種有效的方法，在哺乳動物細胞骨形態發生蛋白不同分子量的前體二聚體混合物中，大規模地選擇性地生產同一分子量的成熟型二聚體。
近年，一組似Kex-2蛋白酶，弗林蛋白酶，PC-2,PC-3,PACE4,PC6和類似物被鑒定為高等動物蛋白前體的加工酶(Biochem.J.299,PP.1-18,1994)。其中，弗林蛋白酶COOH端具疏水跨膜域并局部位于高爾基膜。編碼人弗林蛋白酶的cDNA序列已由van den Ouweland et al.報道(Nucleic Acids Res.18,pp.664,1990)。已揭示弗林蛋白酶識別Arg-X1-X2-Arg(其中X1和X2代表任何氨基酸，但主要是Lys或Arg)作為其裂解位點上游4個氨基酸的序列(J.Biol.Chem.266,pp.12127-12130,1991)。進一步，已報道當哺乳動物細胞中只表達NH2端域無跨膜域的弗林蛋白時，它被分泌出細胞外，專一于氨基酸序列的裂解活性既便在分泌部位仍保持(J.Biol.Chem.269,pp.25830-25837,1994)。
本發明人第一次成功地基于重組DNA技術，使用上述弗林蛋白酶，在哺乳動物細胞中，大規模地有效生產只有成熟型二聚體而無前體二聚體。
根據本發明，可由使加工酶作用于骨形態發生蛋白前體來生產成熟型骨形態發生蛋白。
根據本發明，在哺乳動物細胞品系中引入骨形態發生蛋白前體表達載體和加工酶表達載體，使加工酶作用于骨形態發生蛋白前體。培養細胞系，然后從培養上清中分離獲得成熟型骨形態發生蛋白。
根據本發明，也可向含骨形態發生蛋白前體的培養上清中加入含加工酶的培養上清，來使加工酶作用于骨形態發生蛋白前體。保溫產物混合物來生產成熟型骨形態發生蛋白。
優選地，在哺乳動物細胞系中引入人MP52前體表達載體和分泌弗林蛋白酶突變體表達載體，培養細胞系，然后從培養上清中分離如此生產的成熟型骨形態發生蛋白。
此處所用術語“成熟型骨形態發生蛋白”意指基本上由同源于活性型人TGF-β1 COOH端112氨基酸殘基的一段氨基酸序列組成的骨形態發生蛋白。認為骨形態發生蛋白活性位于同源于活性型人TGF-β1 COOH端112氨基酸殘基的氨基酸序列區，來期望骨形態發生蛋白不含其他氨基酸序列區。
本發明中可用的加工酶的實施例包括一組似Kex2蛋白酶，弗林蛋白酶，PC-2,PC-3,PACE4和PC6。其中，弗林蛋白酶尤為優選。因為編碼弗林蛋白酶的cDNA，可用編碼弗林蛋白酶全部氨基酸序列的DNA堿基序列，但優選的是編碼一部分氨基酸序列(此后稱作“分泌型弗林蛋白酶突變體”)的DNA堿基序列，其中不包括跨膜域并另保持專一于氨基酸序列的裂解活性。
在本發明優選實施方案中，用合成的DNA引物，通過RT-PCR方法，從抽提自人細胞系HepG2(ATCC HB8065)的總RNA中克隆了含分泌弗林蛋白酶突變體cDNA的DNA片段。分泌弗林蛋白酶突變體cDNA，如其DNA堿基序列，有第163至第2014核苷酸，公開于序列表中SEQ IDNo:1。該DNA片段插入表達載體中，由此構建分泌弗林蛋白酶突變體的表達載體。此處用的表達載體含真核啟動子下游，添加的poly(A)信號，這是表達基因克隆的限制酶位點。該表達載體可以進一步含抗藥標記以利于篩選轉化子。這種表達載體的實施例包括人巨細胞病毒啟動子增強子，多[位點]接頭，牛生長素poly(A)添加信號和含新霉素抗性標記的pRc/CMV(自INVITROGEN公司)。
本發明可用于生產人TGF-β超家族的一種骨形態發生蛋白，更具體地，是由同樣分子量的單體組成的成熟型骨形態發生蛋白，如MP52,BMP-2,BMP-4,BMP-6或BMP-7)。作為骨形態發生蛋白，公開于PCT申請WO93/16099或WO95/04819并有骨形態發生活性的人MP52尤被優選。在優選實施方案中，將編碼人MP52前體的cDNA插入表達載體來構建人MP52前體的表達載體，隨后引入哺乳動物細胞，由此制備生產前體和成熟MP52二聚體的哺乳動物細胞系。適于作為寄主細胞的哺乳動物細胞實施例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，BHK細胞，293細胞和鼠L細胞。其中，CHO細胞為優選。在如此得到的產人MP52哺乳動物細胞系(MC-2保藏號FERM BP-5142)中，引入分泌弗林蛋白酶突變體的表達載體，來共表達二種蛋白，由此在培養上清中只生產成熟MP52二聚體。
也可由混合含加工酶的溶液與含前體的溶液，并將混合物于32至40℃，優選37℃，保溫過夜，來使蛋白前體轉變為成熟型。
本發明方法所得成熟型骨形態發生蛋白可通過添加所需的醫藥學上可接受的載體，添加劑，稀釋劑和/或賦形劑用于治療或預防骨，軟骨或牙齒損傷或義牙根植。
為治療骨代謝障礙引起的骨疾病，可通過傳統方式全身施用成熟型骨形態發生蛋白，如注射，靜脈注射，肌內注射，或腹膜內注射，口服施用或腸胃外施用如栓劑。
為治療骨折，可通過注射，口服施用或腸胃外施用全身或局部施用成熟型形態發生蛋白。也可在骨折區附近植入含成熟型形態發生蛋白的基質。合適的基質實施例包括天然多聚物如膠原蛋白或血纖蛋白粘合劑和合成聚合物如聚乳酸和乙醇酸的共聚物。
在矯型重建，骨移植或植假牙時，成熟型骨形態發生蛋白可用于待植入的骨或牙表面，覆以膠原蛋白膏，血纖蛋白粘合劑或其他粘合劑。骨移植時，它可用于天然和人工骨。
根據目的和施用方法確定成熟型骨形態發生蛋白的劑量。通常，全身施用劑量為每公斤1至100μg，局部施用每處30μg至30mg。
附圖簡述

圖1為人分泌弗林蛋白酶突變體表達載體pDfurpRC/CMV(7.2kb)質粒圖。
圖2為人MP52表達載體pMSS99(5.0kb)質粒圖。
圖3為還原條件下的Western印跡分析照片，示共表達成熟型人MP52二聚體和人分泌弗林蛋白酶突變體細胞系的無血清培養上清。
圖4為還原條件下的Western印跡分析照片，示由人分泌弗林蛋白酶突變體作用于二聚體而使各種前體人MP52二聚體轉化為成熟型MP52。
優選實施方案說明本發明的優點將于此后通過實施例更具體地說明。實施例1由共表達人分泌弗林蛋白酶突變體和人MP52的CHO細胞系生產成熟型人MP52二聚體(1)克隆人分泌型弗林蛋白酶突變體cDNA并構建其表達載體人弗林蛋白酶蛋白結構自NH2端結構域依次為信號肽，似枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶結構域，跨膜結構域和細胞質側結構域。本發明中，通過RT-PCR方法克隆編碼NH2端蛋白酶域而無跨膜結構域的人分泌弗林蛋白酶突變體cDNA，并供表達。
從人HepG2細胞抽提總RNA，并以此為模板由rTth RNA聚合酶，將上游反義引物1(人弗林蛋白酶cDNA序列第931至第914號，公開于序列表中SEQ ID No:1)和下游反義引物2(第2095至第2071號)用于逆轉錄。將這些產物分別聯合有義引物3(序列表SEQ ID No:2)和反義引物4(序列表中SEQ ID No:3)，有義引物5(序列表中SEQ ID No:4)和反義引物6(序列表中SEQ ID No:5)用于PCR反應，由此得到上游和下游兩個cDNA片段。連接這些片段并插入質粒pUC119(自TakaraShuzo有限公司)的HindⅢ-SalⅠ位點，由此得到編碼595個氨基酸的人分泌弗林蛋白酶突變體cDNA。產物cDNA由限制酶消化和DNA堿基序列測定驗證。發現人分泌弗林蛋白酶突變體具有如序列表SEQ ID No:1第163至第2014核苷酸的DNA堿基序列。人分泌弗林蛋白酶突變體cDNA的DNA序列與van den Ouweland et al.報道的不同在于，第165號堿基是腺嘌呤從而刪除了可能對翻譯不利且非必須的啟始密碼子；第2004號堿基是腺嘌呤從而形成終止密碼子。然后，以HindⅢ-XbaⅠ消化切下人分泌弗林蛋白酶突變體cDNA，隨后插入購自INVITROGEN公司的pRc/CMV載體的HindⅢ-XbaⅠ位點，由此制備人分泌弗林蛋白酶突變體cDNA的表達載體，pDfurpRC/CMV，示于圖1。(2)構建人MP52表達載體從Biopharm GmbH的Hoetten博士提供的含人MP52基因的pSK52s質粒中，以HindⅢ消化分離含人MP52基因的DNA片段，隨后插入Behringwerke AG的Zettlmeissl博士提供的pABstop載體的HindⅢ位點，由此制備人MP52表達載體pMSS99，示于圖2。其結構由DNA堿基序列測定和限制酶消化驗證。結果發現pMSS99的人MP52 DNA堿基序列是序列表中SEQ ID No:6的第576至第2279核苷酸。(3)建立MC2，即生產各種前體人MP52二聚體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系在Behringwerke AG的Zettlmeissl博士提供的CHO-DUKX-Bll細胞，即CHO細胞突變系中，以磷酸鈣DNA共沉降方法引入Zettlmeissl博士提供的pMSS99和pSVOAdhfr。然后，用氨甲蝶呤(MTX)基因擴增法建立人MP52高產細胞系。
pMSS99(10μg)和pSVOAdhfr(2μg)溶于1ml 25mM HEPES,140mM NaCl和0.75mM Na2HPO4(pH7.05)，后與50μl 2.5M CaCl2混合。沉淀物置于10cm皿內CHO-DUKX-Bll細胞上，室溫30分鐘。在細胞層上，加8ml含核糖核酸和脫氧核糖核酸及10％胎牛血清的MEM-ALPHA(MEM-α+)培養基，所得混合物于CO2保溫箱中培養4至6小時。室溫以10％甘油處理3分鐘后，細胞培養于含10％FBS的MEM-α+培養基。然后再將培養細胞接種于無核糖核酸和脫氧核糖核酸，含10％透析FBS的MEM-ALPHA(MEM-α-)培養基并篩選轉化子。人MP52生產由Western印跡分析檢測，下述于(5)。
在產人MP52細胞系的培養基中，加入MTX。通過逐步增加MTX濃度，篩選擴增MP52基因的細胞系。當MTX濃度為400nM時，得到產不同分子量的前體人MP52二聚體和成熟型人MP52二聚體的細胞系MC-2。所得細胞系MC-2于1995年6月21日保藏于工業和科學技術省生命科學和人體技術研究院(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，保藏號FERM BP-5142。(4)由向產人MP52的CHO細胞系MC-2引入人分泌弗林蛋白酶突變體表達載體來建立人MP52和人分泌弗林蛋白酶突變體的共表達細胞系由磷酸鈣DNA共沉降法向生產各種前體人MP-52二聚體和成熟型MP52二聚體的CHO細胞系MC-2中引入人分泌弗林蛋白酶突變體表達載體，然后在333μg/ml G418和400nM MTX條件下篩選轉化細胞，建立人MP52和人分泌弗林蛋白酶突變體的共表達細胞系。
以類似于實施例1(2)的方式，用pDfurpRC/CMV(4.8μg)形成磷酸鈣DNA共沉降。在10cm皿內覆蓋MC-2細胞，室溫置30分鐘。8ml無核糖核酸和脫氧核糖核酸含10％FBS的MEM-ALPHA(MEM-α-)培養基加到細胞層，所得混合物于CO2保溫箱培養4至6小時。以10％甘油室溫處理3分鐘后，細胞于含10％FBS的MEM-α-培養基培養2天。培養細胞然后再接種于含10％FBS,400nM MTX和333μg/ml G418的MEM-α-培養基，并篩選轉化品系。人MP52生產由Western印跡分析檢測，如下述于(5)。人分泌弗林蛋白酶突變體生產由酶活性量法檢測，如下述于(6)。所得人MP52弗林蛋白酶和人分泌弗林蛋白酶突變體共表達細胞系的無血清培養上清之一每天更換培養基，收集的培養上清在還原條件下用于聚丙烯酰胺電泳并繼以Western印跡分析。結果示于圖3照片。各泳道上樣0.5μl培養上清。泳道1,2和3分別為1,2和3日的培養上清。成熟型MP52單體帶示以箭頭。已發現上清中檢測不到大分子量的前體MP52，所有MP52都是分子量約15K的肽，與成熟型MP52單體相符。非還原條件下的分析結果是，這些肽各形成分子量約28K的成熟型MP52二聚體。用共表達細胞系生產的二聚體量約為8μg/ml/24小時，約為用MP52表達細胞系MC-2的三至八倍。這樣，通過使用人MP52和人分泌弗林蛋白酶突變體，本發明者們第一次比傳統方法大規模地成功生產成熟型MP52二聚體。(5)以Western印跡分析檢測培養上清中的人MP52以SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(15-25％聚丙烯酰胺梯度凝膠，Daiichi KagaKu有限公司)分離培養上清中的蛋白，然后轉移蛋白至PVDF膜(Clear Blot Membrane-P,ATTO)。膜封以Block Ace(DainipponPharmaceutical有限公司)一小時，以Tris鹽緩沖液(TBS)漂洗，再以10μg/ml雞抗人MP52抗體處理過夜。膜以含0.1％吐溫20的TBS(TTBS)漂洗，然后以堿性磷酸酶兔抗雞IgG復合物(Sigma A9171)處理。膜以TTBS漂洗并以堿性磷酸酶底物試劑盒(BIO-RAD)使相應于MP52的帶顯現。(6)檢測培養上清中人分泌弗林蛋白酶突變體活性20μl培養上清以30μl純水稀釋并混以200μl熒光底物溶液；以含100μM Boc-Arg-Arg-Val-Arg-MCA(購自Protein Technology Institute)和1.25mM CaCl2的125 mM MES/NaOH(pH7.0)37℃保溫10分鐘。在380nm激發波長和450nm發射波長處測量AMC熒光。弗林蛋白酶活性單位是，將每分鐘釋放1pmol AMC的活性定義為1單位(U)。(7)純化與人分泌弗林蛋白酶突變體共表達生產的成熟型MP52并分析NH2端氨基酸序列將人MP52和人分泌弗林蛋白酶突變體共表達細胞系的無血清培養上清與0.1體積的0.2M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)混合。所得混合物施于以含50mM NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡過的HiTrap SF(1ml,Pharmacia)柱，然后以同樣的緩沖液淋洗。蛋白以含6M鹽酸胍的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗脫。洗脫物施于反相HPLC柱ResourceRPC(3ml,Pharmacia)，蛋白以25-55％乙腈洗脫。含成熟型MP52的分離物以脈沖液氣相測序儀分析NH2端氨基酸序列(AppliedBiosystems model 476)。結果示于表1。
表1循環 氨基酸序列1(pmol) 氨基酸序列2(pmol)1 Arg 11.95 Ala 25.512 Ala 28.75 Pro 14.753 Pro 17.55 Leu 18.074 Leu 16.47 Ala 14.465 Ala 16.99 Thr 5.026 Thr 7.15 Arg 7.387 Arg 9.21 Gln 9.088 Gln 9 54 Gly 13.239 Gly 11.29 Lys 5.2910 Lys 8.04 Arg 6.52由表1，推測氨基酸序列1和氨基酸序列2分別來自序列表中SEQ IDNo:6的始自Arg 354和Ala 355的氨基酸序列，且其摩爾比約為1∶1。實施例2以人分泌弗林蛋白酶突變體使人MP52前體二聚體轉化為成熟型二聚體(1)建立生產人分泌弗林蛋白酶突變體的CHO細胞系以磷酸鈣DNA共沉降法向Behringwerke AG的Zettlmeissl博士提供的CHO-DUKX-Bll細胞中，引入述于實施例1(1)的人分泌弗林蛋白酶突變體表達載體pDfurpRC/CMV。在G418存在下篩選轉化細胞，由此建立人分泌弗林蛋白酶突變體的高表達品系。
以類似于實施例1(3)所述方法，制備pDfurpRC/CMV和磷酸鈣的共沉淀，覆于10cm皿內CHO-DUKX-Bll細胞上并于室溫放置30分鐘。往細胞層加8ml含10％FBS和核糖核酸及脫氧核糖核酸的MEM-ALPHA(MEM-α+)培養基，然后于CO2保溫箱培養4至6小時。細胞以10％甘油室溫處理3分鐘后，再接種于含10％FBS和400μg/ml G418的MEM-α+培養基，由此篩選轉化子。以上述于實施例1(6)的酶活性量法檢測產人分泌弗林蛋白酶突變體的細胞系，并得到弗林蛋白酶活性為500至1000 U/ml/24小時的細胞系。(2)以人分泌弗林蛋白酶突變體轉化人前體MP52二聚體為成熟型將產人MP52的CHO細胞系MC-2的無血清培養上清(含前體和成熟型MP52二聚體)與人分泌弗林蛋白酶突變體表達細胞系的無血清培養上清(1000U/ml)以不同比例混合，然后37℃保溫過夜。反應后，在還原條件下進行上述于實施例1(5)的Western印跡分析并檢測到前體MP52轉化為成熟型。結果示于圖4照片。在泳道1至5，上樣1μl MC-2培養上清和不同體積的人分泌弗林蛋白酶突變體細胞系培養上清。人分泌弗林蛋白酶突變體的終濃度分別為，1泳道0U/ml,2泳道50U/ml,3泳道100U/ml,4泳道200U/ml和5泳道400U/ml。成熟型MP52單體帶示以箭頭A和B，而成熟型MP52單體帶示以箭頭C。如圖4示，加入表達人分泌弗林蛋白酶突變體細胞系的培養上清以使MP52完全轉化為成熟型的最終活性濃度為至少200U/ml。結果，成熟型MP52二聚體增量約3倍。
工業應用性傳統地骨成熟型形態發生蛋白由從哺乳動物細胞生產的具不同分子量的骨形態發生蛋白二聚體混合物中分離獲得，但難于大規模選擇生產成熟型骨形態發生蛋白或有效獲得成熟型骨形態發生蛋白，因為尚未發展出一種技術把它從上述混合物中有效分離出來。然而，本發明的方法使得由骨形態發生蛋白前體制備成熟型骨形態發生蛋白成為可能，從而大規模促產。更進一步，本發明方法提供的成熟型骨形態發生蛋白是由基本上相同分子量的肽組成的高純物，以使其尤適于用作藥物。
序列表SEQ ID NO:1長度4180類型氨基酸鏈數雙鏈拓撲學線性分子類型肽片段類型來源有機體人組織類型人肝癌特征定位其他信息加工酶弗林蛋白酶序列描述SEQ ID NO:1:GCGGGGAAGC AGCAGCGGCC AGGATGAATC CCAGGTGCTC TGGAGCTGGA TGGTGAAGGT60CGGCACTCTT CACCCTCCCG AGCCCTGCCC GTCTCGGCCC CATGCCCCCA CCAGTCAGCC 120CCGGGCCACA GGCAGTGAGC AGGCACCTGG GAGCCGAGGC CCTAAGACCA GGCCAAGGAG 180ACGGGCGCTC CAGGGTCCCA GCCACCTGTC CCCCCC ATG GAG CTG AGG CCC TGG 234Met Glu Leu Arg Pro Trp15TTG CTA TGG GTG GTA GCA GCA ACA GGA ACC TTG GTC CTG CTA GCA GCT 282Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala10 15 20GAT GCT CAG GGC CAG AAG GTC TTC ACC AAC ACG TGG GCT GTG CGC ATC 330Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn Thr Trp Ala Val Arg Ile25 30 35CCT GGA GGC CCA GCG GTG GCC AAC AGT GTG GCA CGG AAG CAT GGG TTC 378Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val Ala Arg Lys His Gly Phe40 45 50CTC AAC CTG GGC CAG ATC TTC GGG GAC TAT TAC CAC TTC TGG CAT CGA 426Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Tyr His Phe Trp His Arg55 60 65 70GGA GTG ACG AAG CGG TCC CTG TCG CCT CAC CGC CCG CGG CAC AGC 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Tyr Ser Ala Asp Gly Phe Asn Asp Trp Ala Phe Met520 525 530ACA ACT CAT TCC TGG GAT GAG GAT CCC TCT GGC GAG TGG GTC CTA GAG 1866Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser Gly Glu Trp Val Leu Glu535 540 545 550ATT GAA AAC ACC AGC GAA GCC AAC AAC TAT GGG ACG CTG ACC AAG TTC 1914Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr Gly Thr Leu Thr Lys Phe555 560 565ACC CTC GTA CTC TAT GGC ACC GCC CCT GAG GGG CTG CCC GTA CCT CCA 1962Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu Gly Geu Pro Val Pro Pro570 575 580GAA AGC AGT GGC TGC AAG ACC CTC ACG TCC AGT CAG GCC TGA2004Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser Ser Gln Ala ***585 590 595GTGGTGTGCG AGGAAGGCTT CTCCCTGCAC CAGAAGAGCT GTGTCCAGCA CTGCCCTCCA 2064GGCTTCGCCC CCCAAGTCCT CGATACGCAC TATAGCACCG AGAATGACGT GGAGACCATC 2124CGGGCCAGCG TCTGCGCCCC CTGCCACGCC TCATGTGCCA CATGCCAGGG GCCGGCCCTG 2184ACAGACTGCC TCAGCTGCCC CAGCCACGCC TCCTTGGACC CTGTGGAGCA GACTTGCTCC 2244CGGCAAAGCC AGAGCAGCCG AGAGTCCCCG CCACAGCAGC AGCCACCTCG GCTGCCCCCG 2304GAGGTGGAGG CGGGGCAACG GCTGCGGGCA GGGCTGCTGC CCTCACACCT GCCTGAGGTG 2364GTGGCCGGCC TCAGCTGCGC CTTCATCGTG CTGGTCTTCG TCACTGTCTT CCTGGTCCTG 2424CAGCTGCGCT CTGGCTTTAG TTTTCGGGGG GTGAAGGTGT ACACCATGGA CCGTGGCCTC 2484ATCTCCTACA AGGGGCTGCC CCCTGAAGCC TGGCAGGAGG AGTGCCCGTC TGACTCAGAA 2544GAGGACGAGG GCCGGGGCGA GAGGACCGCC TTTATCAAAG ACCAGAGCGC CCTCTGATGA 2604GCCCACTGCC CACCCCCTCA AGCCAATCCC CTCCTTGGGC ACTTTTTAAT TCACCAAAGT 2664ATTTTTTTAT CTTGGGACTG GGTTTGGACC CCAGCTGGGA GGCAAGAGGG GTGGAGACTG 2724TTTCCCATCC TACCCTCGGG CCCACCTGGC CACCTGAGGT GGGCCCAGGA CCAGCTGGGG 2784CGTGGGGAGG GCCGTACCCC ACCCTCAGCA CCCCTTCCAT GTGGAGAAAG GAGTGAAACC 2844TTTAGGGCAG CTTGCCCCGG CCCCGGCCCC AGCCAGAGTT CCTGCGGAGT GAAGAGGGGC 2904AGCCCTTGCT TGTTGGGATT CCTGACCCAG GCCGCAGCTC TTGCCCTTCC CTGTCCCTCT 2964AAAGCAATAA TGGTCCCATC CAGGCAGTCG GGGGCTGGCC TAGGAGATAT CTGAGGGAGG 3024AGGCCACCTC TCCAAGGGCT TCTGCACCCT CCACCCTGTC CCCCAGCTCT GGTGAGTCTT 3084GGCGGCAGCA GCCATCATAG GAAGGGACCA AGGCAAGGCA GGTGCCTCCA GGTGTGCACG 3144TGGCATGTGG CCTGTGGCCT GTGTCCCATG ACCCACCCCT GTGCTCCGTG CCTCCACCAC 3204CACTGGCCAC CAGGCTGGCG CAGCCAAGGC CGAAGCTCTG GCTGAACCCT GTGCTGGTGT 3264CCTGACCACC CTCCCCTCTC TTGCACCCGC CTCTCCCGTC AGGGCCCAAG TCCCTGTTTT 3324CTGAGCCCGG GCTGCCTGGG CTGTTGGCAC TCACAGACCT GGAGCCCCTG GGTGGGTGGT 3384GGGGAGGGGC GCTGGCCCAG CCGGCCTCTC TGGCCTCCCA CCCGATGCTG CTTTCCCCTG 3444TGGGGATCTC AGGGGCTGTT TGAGGATATA TTTTCACTTT GTGATTATTT CACTTTAGAT 3504GCTGATGATT TGTTTTTGTA TTTTTAATGG GGGTAGCAGC TGGACTACCC ACGTTCTCAC 3564ACCCACCGTC CGCCCTGCTC CTCCCTGGCT GCCCTGGCCC TGAGGTGTGG GGGCTGCAGC 3624ATGTTGCTGA GGAGTGAGGA ATAGTTGAGC CCCAAGTCCT GAAGAGGCGG GCCAGCCAGG 3684CGGGCTCAAG GAAAGGGGGT CCCAGTGGGA GGGGCAGGCT GACATCTGTG TTTCAAGTGG 3744GGCTCGCCAT GCCGGGGGTT CATAGGTCAC TGGCTCTCCA AGTGCCAGAG GTGGGCAGGT 3804GGTGGCACTG AGCCCCCCCA ACACTGTGCC CTGGTGGAGA AAGCACTGAC CTGTCATGCC 3864CCCCTCAAAC CTCCTCTTCT GACGTGCCTT TTGCACCCCT CCCATTAGGA CAATCAGTCC 3924CCTCCCATCT GGGAGTCCCC TTTTCTTTTC TACCCTAGCC ATTCCTGGTA CCCAGCCATC 3984TGCCCAGGGG TGCCCCCTCC TCTCCCATCC CCCTGCCCTC GTGGCCAGCC 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1．一種生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其特征在于以加工酶處理骨形態發生蛋白前體。
2．一種生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟在哺乳動物細胞中引入骨形態發生蛋白前體的表達載體并轉化入加工酶；培養該哺乳動物細胞系，由此生產成熟型骨形態發生蛋白；然后分離從培養上清中純化的成熟型骨形態發生蛋白。
3．權利要求1的生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其中成熟型骨形態發生蛋白選自成熟型MP52,BMP-2,BMP-4,BMP-6和BMP-7。
4．權利要求1至3至少之一的生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其中加工酶為弗林蛋白酶。
5．權利要求1至4至少之一的生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其中加工酶為由全部氨基酸序列組成的弗林蛋白酶。
6．權利要求1至4至少之一的生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其中加工酶是分泌弗林蛋白酶突變體。
7．權利要求1至5至少之一的生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其特征在于包括步驟在哺乳動物細胞中引入MP52前體表達載體并轉化入分泌弗林蛋白酶突變體；培養該哺乳動物細胞系，由此生產成熟型骨形態發生蛋白；然后分離從培養上清中純化的成熟型骨形態發生蛋白。
8．一種生產成熟型骨形態發生蛋白的方法，其特征在于將含加工酶的溶液加入含骨形態發生蛋白前體的溶液，然后保溫該混合物。
全文摘要
一種生產成熟型骨形態發生蛋白的方法,由加工酶作用于骨形態發生蛋白前體,包括在動物細胞系中引入骨形態發生蛋白前體表達載體和加工酶表達載體,培養所得細胞系來生產成熟型骨形態發生蛋白,并從培養物中分離出來,或將加工酶溶液加入骨形態發生蛋白前體溶液并保溫所得混合溶液。適宜方法包括在已建立的動物細胞系中引入人MP52前體表達載體和分泌弗林蛋白酶變異體表達載體,培養所得細胞系來生產成熟型骨形態發生蛋白,并從培養物中分離出來。
文檔編號C12N15/12GK1224467SQ97195700
公開日1999年7月28日 申請日期1997年4月28日 優先權日1997年4月28日 公開號97195700.發明者高橋美樹子, 牧島房夫, 木村道夫 申請人:赫斯·馬里恩·魯索株式會社