致病性大腸桿菌相關蛋白的制作方法

專利名稱：致病性大腸桿菌相關蛋白的制作方法
技術領域：
概括地說，本發明是關于致病性微生物的毒力，更具體地說，是關于與致腸道病細菌有關的毒力因子。
背景技術：
抗生素已經使用了多年，成功地治療了多種細菌感染。但是，細菌對抗生素的抗性，在以往的的若干年內已經成為日益嚴重的問題。許多病原菌現在已對幾種抗生素有抗性，在某些情況下，它們引起的疾病已不再能用常規的抗生素治療。盡管抗生素有過去成功的歷史，但是，在以往的二十年間，即使有，也只發展了少數幾種新的抗生素。還對現有的藥物引入了新的改變，但是，通常在短時間內，對這些化合物又產生了抗性。
很多研究已表明，如果使編碼毒力因子的基因發生突變，含有此基因的有機體則不再有致病性。另外，如果對宿主作預防毒力因子的接種，則常常可以阻止疾病發生。但是，尚未有研究表明，對毒力因子的特異性抑制能減少疾病的發生。
已對毒素、粘附、侵入和細胞內產生感染的作用機制進行了研究。但是，每種毒力因子采用不同的機制，這就使發展廣譜抑制劑成為不可能。每一個被認為可能是治療靶標的保守因子，都是一個雙組成的調節系統。但是，此系統對毒力因子不是特異性的，并在幾個細菌管家系統中被使用。加之在真核細胞系統中已發現了這些系統，如果使用抑制劑，將增加對宿主毒性的危險性。為了發展理想的抗感染劑，抗生素影響的細菌致病機制對許多病原體應該是通用的，對致病機制是特異性的，而在宿主細胞中不存在。最近發現的這樣一個系統是細菌Ⅲ型分泌系統。
革蘭氏陰性菌利用專門的機構排出分子跨越它們的雙層膜和外原生質，這是一個將毒力因子轉移到細菌表面的關鍵性過程，在細菌表面它們才能與宿主成分相互作用。革蘭氏陰性菌分泌作用已被區分為四種主要的途徑。第一是Ⅰ型分泌作用，是小分子毒素家族和大腸桿菌原型溶血素采用的分泌作用。第二是Ⅱ型分泌系統，是大多數革蘭氏陰性菌用以排出包括某些毒力因子的多種分子的主要輸出途徑；它與哺乳動物的藥物抗性有相同的機制。第三是Ⅳ型分泌系統，它被編碼在分泌產物內，作為分泌機制的一部分切割自身；奈瑟氏球菌屬(Neisseria)IgA蛋白酶是此系統的原型。第四是Ⅲ型途徑，是最近發現的分泌途徑。
Ⅲ型分泌系統最初被描述是作為耶爾森氏菌屬(Yersinia)分泌毒力蛋白YOPs的分泌系統，它對耶爾森氏菌的毒力是關鍵性的。爾后在幾種植物病原體中發現了同源分泌系統，包括丁香假單胞菌，青枯假單胞菌和野油菜黃單胞菌。這些植物病原菌利用這種分泌路徑分泌對引起植物疾病所需要的毒力因子(harpins及其它的)。雖然分泌系統相似，但是harpins和YOPs(即所分泌的毒力因子)不是同源多肽。更最近在其它一些病原菌中，發現了對毒力所必需的另外幾種Ⅲ型分泌系統。這些系統包括沙門氏菌屬(Salmonalla)和志賀氏菌屬(Shigella)用于進入細胞和引起疾病的侵染系統。在沙門氏菌屬中還發現了另一個對疾病起決定性作用的Ⅲ型分泌系統，雖然對此路徑的分泌產物和毒力機制尚未確定。綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有分泌胞外酶S，一種蛋白質毒力因子，所必需的Ⅲ型分泌系統。
致腸病大腸桿菌(EPEC)是嬰兒腹瀉的主要原因，是發現引起胃腸炎的第一個大腸桿菌(大腸桿菌)。致腸道病大腸桿菌激活宿主上皮細胞的信號傳導途徑，并引起細胞骨架重排，同時形成底坐狀和附著/表面損傷性病灶。
可用三階段模型描述致腸道病大腸桿菌的致病機理。開始是定位粘附于上皮細胞，是由TV型細菌纖毛介導的，隨后是激活宿主上皮細胞信號傳導途徑，并緊密地附著在宿主細胞上。最后的二步被統稱為附著和表面損傷。宿主上皮細胞內的信號傳導作用包括，激活宿主細胞酪氨酸激酶的活性，導致90千道爾頓的宿主膜蛋白Hp90的酪氨酸磷酸化，以及流出細胞內的磷酸肌醇(IP3)和鈣。經過這種信號傳導作用之后，細菌緊密地粘附于上皮細胞的表面，同時損傷了宿主上皮細胞的微絨毛，并在細菌下面堆積了細胞骨架蛋白。
發明概述本發明是基于在致病菌中例如致腸道病大腸桿菌中發現的一種與毒力有關的蛋白質。
對eaeA和espB之間腸道細胞表面損傷基因座(Locus of EnterocyteEffacemant)的DNA序列分析，發現了一個與25千道爾頓致腸道病大腸桿菌分泌蛋白氨基末端序列匹配的基因(espA)。在espA中帶有插入序列的突變體不分泌這種蛋白質，也不能激活上皮細胞信號傳導作用或引起細胞骨架重排。但是，這些功能可以通過一個克隆化野生型espA基因來彌補。
對分別編碼分泌性毒力因子EspA和EspB的二個致腸道病大腸桿菌基因espA和espB，進行了克隆和測序。已表明這些蛋白質與宿主上皮細胞信號傳導路徑和侵染過程的啟動有關。因為EspA是一種分泌性蛋白，所以它理想地適合用于與所需多肽連接的融合蛋白中。
Ⅲ型分泌路徑是潛在抑制劑理想的靶標，因為它是在細菌中發現的一條毒力因子特異性的保守性路徑。本發明提供了一種方法，用于鑒定Ⅲ型分泌系統的抑制劑。本發明的目標是指向發展新的抗菌治療法。不同于其它抗生素，通過本發明的方法鑒別的化合物并不殺死病原菌或抑制病原菌生長；而是這種化合物將阻止分泌對引起疾病起決定性作用的毒力因子。因為Ⅲ型分泌系統是在多種病原菌中顯示較大程度保守性的首要毒力機制，所以借助于本發明方法鑒別的某些化合物將是廣譜性治療劑。其優點是將可能找到一種可用于治療某些人，動物和植物疾病的新治療劑。
附圖簡要說明

圖1顯示espA的核苷酸序列和推導的氨基酸序列(在此分別被稱為SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)。對可能的核蛋白體結合位點下面加線標明。包含在引物Donne-99和Donne-100中的位于在pLCL121中構建的缺失側翼的核苷酸加陰影標明。
圖2顯示espA中非極性突變的構建。引物Donne-90和其反引物被用于擴增含有基因5′部分的片段，然后被克隆進入pCRscript，構成pLCL119。引物Donne-100和此通用引物用于擴增含3′部分的片段，該片段被克隆進入pCR script，構成pLCL120。將新NruⅠ位點摻入Donne-99和Donne-100中，以便pLCL120的NrnⅠ-SalⅠ片段可被克隆進入pLCL119，構成pLCL121，在其espA基因中有一個150bp的缺失。將來自pUC 18K的SmaⅠ片段克隆進入pLCL 121的NruⅠ位點，構成pLCL 122，此pUC 18K中含有aphA-3卡那霉素抗性基因。這種插入導致aphA-3基因的轉錄融合和espA基因3′末端的翻譯融合，同時保存espA讀框。核糖體結合位點下面被加線標明。
圖3表示質粒的基因圖譜，質粒中含有RDEC-1(A)和致腸道病大腸桿菌(EPEC)(B)的espA,espD和espB基因。箭頭指示在espA和espB中作終止密碼子插入的位置(A)，以及被構建進入espD中BglⅡ位點的移碼突變(B)。espB中250堿基對的缺失被用//標記出。實心粗線和空心粗線表示開放讀框和預測的開放讀框。限制性內切酶以如下標明Bam,BamHⅠ；Ec,EcoRⅠ；Bg,BglⅡ；Xb,XbaⅠ；Sa,SalⅠ。
圖4顯示RDEC-1 espA的核苷酸序列(A)(在此分別稱為SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4)，以及espB的核苷酸序列(B)(在此分別稱為SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6)。星號指示終止密碼子。可能的核糖體結合位點下面被加線標明。預測的EspA和EspB氨基酸序列在C)中排列成直線(SEQ IDNO:7-10)。陰影區域表示完全相同。已被存入EMBL GenBank(歐洲分子生物學實驗室核酸序列)的核苷酸和氨基酸序列，以及它們的檢索號碼如下RDEC-1 espA(U80908),RDEC-1 espB(U80796)，致腸道病大腸桿菌E2348/69株的espA(Z54352)，致腸道病大腸桿菌E2348/69株的espB(Z21555)，致腸道病大腸桿菌E2348/69株的espD(Y09228)，致腸道出血大腸桿菌EDL933血清型0157株的espB(X96953)，致腸道出血大腸桿菌413/89-1血清型026株的espB(X99670)。
詳細說明本發明提供了一種被稱為EspA的多肽，它是由致病性大腸桿菌，如致腸道病大腸桿菌(EPEC)和致腸道出血大腸桿菌(EHEC)分泌的。對由這種致病性大腸桿菌引起疾病的診斷可借助可標準的技術進行，例如那些基于應用抗體的技術，此抗體能與EspA結合而對此蛋白質進行檢測，以及那些基于應用核酸探針的技術，用于檢測編碼EspA多肽的核酸。本發明還提供了編碼EspA多肽的分離的核酸序列，EspA肽，用于產生重組EspA的重組構建方法，能與EspA結合的抗體，以及用于檢測產生EspA的大腸桿菌的試劑盒。本發明還提供了一種以EspA免疫宿主，以便誘發對EspA預防性免疫反應的方法。
本發明的優選實施方案在以下附圖和詳述具體敘述。一旦…的細節。
在此使用的名稱“EspA”(EPEC Secreted〔or signaling〕Protein A,EPEC分泌〔信號〕蛋白A)指的是一種多肽，它是來自致腸道病或致腸出血大腸桿菌的分泌性蛋白，通過SDS-PAGE測定具有大約25千道爾頓的分子量。EspA是致腸道病大腸桿菌分泌的蛋白質，它對激活上皮細胞信號傳導，緊密接觸，并形成附著和表面損傷病灶，激活與疾病相關的過程是必需的。上皮細胞是示例性細胞。
在此使用的名詞“多肽”，包括其任何天然存在的等位基因變異體以及人工重組體形式。在此使用的EspA多肽，既包括天然存在的形式，也包括重組體形式，即某種蛋白質和肽的非天然存在形式，它與天然存在的EspA肽充分地相似，使之具有引起致病性的類似功能。這種多肽的實例包括來自致腸道病大腸桿菌和致腸道出血大腸桿菌的EspA多肽，但是不局限于這些。蛋白質和多肽還包括其衍生物，相似物和擬態肽。另一方面，EspA肽可以用本領域技術人員熟知的合成技術進行化學合成，優選地是使用自動肽合成儀，以NaFmoc氨基酸在聚乙二醇-聚苯乙烯(PEGPS)接合樹脂上進行合成。例如可利用適當的接頭如肽酰胺接頭(PAL)，形成碳氧酰胺(Carboxamide)末端基團。
名詞“基本上純的”在此用于描述一種分子如多肽(例如EspA多肽，或者其片斷)，其中基本上不含有其它蛋白質，脂類，碳水化合物，核酸和天然與它結合的其它生物物質。例如，一種基本上純的分子如多肽，可以是至少60％的干重是所需分子。本領域的技術人員可用標準的蛋白質純化法純化EspA多肽，用標準的方法測定此多肽的純度，這些方法包括例如聚丙烯酰胺凝膠電泳(如SDS-PAGE)，柱層析(如高效液相層析法(HPLC))，以及氨基末端氨基酸序列分析。
本發明的EspA多肽可以具有一個來自人或家兔致腸道病大腸桿菌的EspA氨基酸序列，例如圖1或圖4的氨基酸序列。EspA多肽，如在圖1和4中顯示的多肽，可通過以SDS-PAGE測定時，具有大約25kD分子量對其進行鑒定。
具有與EspA多肽序列例如圖1和4中的EspA多肽，基本上相同序列的多肽也包括在本發明中。“基本上是相同的”氨基酸序列，是僅通過保守氨基酸的替代而不同于標準序列的序列，例如以一個氨基酸代替另一個同類氨基酸(例如以一個疏水性氨基酸如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸，代替另一個疏水性氨基酸，或者以一個極性氨基酸代替另一個極性氨基酸，例如以精氨酸代替賴氨酸，以谷氨酸代替天冬氨酸，或以谷氨酰胺代替天冬酰胺)，或者是通過一個或幾個非保守替代，缺失，或插入而不同于標準序列的序列，只要該多肽還保留至少一種EspA特異性活性或一個EspA特異性表位。例如，EspA多肽中可缺失一個或幾個氨基酸，導致多肽結構發生改變，而不明顯地改變其生物活性。例如對EspA生物活性不是必需的氨基末端或羧基末端的氨基酸可以被除去。這種修飾可導致產生較小活性的EspA多肽。
包括在本發明中的其他EspA多肽是，具有與EspA多肽的氨基酸序列，如圖1和4中EspA的氨基酸序列，有至少50％相同氨基酸序列的多肽。在氨基酸序列同源性的測定中，比較的長度可以是例如至少15個氨基酸，或者至少20,25或35個氨基酸。可以用標準的序列分析軟件(例如GeneticComputer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,WI 53705的序列分析軟件包；也可參見Ausubel等，同上)。
本發明還包括保留至少一種EspA特異性活性或表位的EspA多肽片段。例如，含有至少8-10個氨基酸的EspA多肽片段，可在產生EspA特異性抗體中用作免疫原。此片段可以含有，例如，EspA中保守的氨基酸序列。除了用作肽免疫原之外，上述EspA片段還可以用于免疫測定，如ELISA，檢測樣品中EspA特異性抗體的存在。
用任何一種標準的方法都可以獲得本發明的EspA多肽。例如，EspA多肽可以在標準的重組表達系統中產生(見下面)，通過化學合成(這種方法可能僅局限于EspA小肽片段)，或者從它們在其中被天然表達的組織中純化得到(參見例如Ausubel,et al，同上)。
本發明還提供了編碼上述EspA多肽的分離的核酸分子以及其片段。例如，編碼如圖1和4中EspAs的核酸被包括在本發明中。這些核酸可以含有天然存在的核苷酸序列(見圖1和4)，或者可以是由于遺傳密碼的簡并，而不同于編碼EspAs的天然核酸但編碼相同氨基酸的核苷酸序列。本發明的核酸可以含有DNA或RNA核苷酸，二者的組合或其修飾形式。
用“分離的核酸”意指不與5′和3′側翼序列直接鄰接的核酸如DNA或RNA分子，當存在于其來源生物體的天然存在的基因組中時，正常情況下是與這種側翼序列直接鄰接，因此該名詞是描述例如被整合進載體如質粒或病毒載體中的核酸；被整合進異種細胞基因組中(或者是同種細胞的基因組中，但是在不同于其自然存在的位點上)的核酸；以及作為單獨分子存在的核酸，如通過PCR擴增或限制性內切酶消化產生的DNA片段，或通過體外轉錄產生的RNA分子。該名詞還用于描述構成編碼輔助多肽序列的雜合基因一部分的重組核酸，該輔助多肽序列可用于例如產生融合蛋白。
本發明的核酸分子在產生EspA基因產物(如EspA RNA和EspA多肽，見下文)的標準方法中，可以被用作模板。此外，編碼EspA多肽(及其片段)的核酸分子和相關的核酸，可在以其雜交特性為基礎的方法中應用，該相關的核酸包括例如(1)此核酸含有與編碼EspA多肽的核酸互補的，或可與之雜交的序列，或者是此核酸的片段(例如含有至少12,15,20，或25個核苷酸的片段)；以及(2)此核酸含有可與如下序列雜交的序列，該序列與編碼EspA多肽的核酸是互補的，或者是此核酸的片段(例如含有至少12,15,20，或25個核苷酸的片段)。例如在下面將要進一步詳述的，這樣一些核酸分子可被用于如下的方法用于合成EspA核酸的PCR法，用于檢測樣品中存在EspA核酸的方法，用于鑒別編碼新EspA家族成員核酸的篩查法以及治療方法。
本發明還包括用于鑒別某種核酸分子的方法，這種核酸分子除了編碼圖1和4中所示的EspA之外，還編碼其它的EspA多肽家族成員。在這些方法中，是用EspA-特異性探針如EspA-特異性核酸探針，對含有編碼EspA多肽核酸的樣品，例如cDNA核酸文庫進行篩查。EspA-特異性核酸探針是特異性地與編碼EspA多肽的核酸，或者與其互補序列雜交的核酸分子(例如含有DNA或RNA核苷酸分子，或其組合或修飾形式)。名詞“EspA-特異性探針”，據本發明的方法指的是可與編碼EspA多肽的核酸，或者其互補序列結合的探針，這種結合比與編碼其它多肽的核酸，或者其互補的序列結合具有更大的可檢測程度。因此名詞“EspA特異性探針”包括可以同編碼EspA多肽的核酸(或其互補序列)結合的探針。
本發明有助于方便地產生EspA-特異性核酸探針。可根據圖1-3中所示的氨基酸序列順序設計獲得這種探針的方法。可以使用任何標準的方法(參見例如Ausubel,et al，同上)產生此探針，它可以含有至少12個，或者至少15,25,35,50,100，或150個核苷酸。例如，優選地此探針可用PCR擴增法產生。在這種方法中，需設計與EspA-保守序列相對應的引物，此保守序列可以包含有EspA-特異性氨基酸，產生的PCR產物可用作篩查核酸文庫如cDNA文庫的探針。通常在此過程之后，根據對圖1和4中EspA序列的分析，可對編碼EspA的核苷酸序列進行鑒定。
如本領域專業人員所知，PCR引物典型地應被設計成含有至少15個核苷酸，例如15-30個核苷酸。下面將闡述對EspA-特異性引物的設計，此引物含有編碼7個氨基酸EspA肽的21個核苷酸。優選的情況是，這種探針中的絕大多數或全部的核苷酸都編碼EspA-保守性氨基酸，包括EspA-特異性氨基酸。例如，可使用的引物其所含序列編碼的肽至少應含有40％EspA-保守性氨基酸。含有21個核苷酸的這樣一種引物，可包括至少編碼3個EspA-保守性氨基酸的序列。這樣，該引物可含有編碼至少1個，例如7個EspA特異性氨基酸的序列。一旦EspA-特異性氨基酸序列，作為針對它設計引物序列的模板被選定，就可以應用例如標準的化學方法合成這種引物。如上所述，由于遺傳密碼的簡并性，這種引物應該被設計包括適當簡并的序列，這樣本領域的技術人員可容易地進行測定。
在此使用的名詞“espA”代表編碼EspA多肽的多核苷酸。這些多核苷酸包括編碼EspA的DNA、cDNA和RNA序列。在此還包括編碼全部或部分EspA的所有多核苷酸。這種多核苷酸包括天然存在的，人工合成的，和被特定處理的多核苷酸。例如，可使espA多核苷酸遭受定位誘變。此epsA多核苷酸序列還包括其反義序列。所有簡并的核苷酸序列都包括在本發明中，只要由此核苷酸序列所編碼的EspA肽氨基酸序列未發生功能改變。
本發明還包括可與本發明多核苷酸雜交的核酸分子。在此使用的名詞“核酸”包括RNA以及單鏈和雙鏈的DNA和cDNA。編碼EspA的多核苷酸包括圖1和4中的核苷酸序列，以及與此序列互補的核酸序列。互補序列可能包括反義核苷酸。當該序列是RNA時，圖1和4中的脫氧核苷酸，A,G,C和T，將分別被核苷酸A,G,C和U代替。上述核酸序列的片段也包括在本發明中，其長度至少為15個堿基，這足以使此片段在生理條件下能選擇性地與編碼圖1或4中蛋白質的DNA雜交。
在核酸雜交反應中，用于達到特定嚴緊性水平的條件將各不相同，這取決于待雜交核酸的性質。例如，在選擇雜交條件時，核酸雜交區的長度，互補程度，核苷酸序列的構成(例如GC對AT的含量)，以及核酸的類型(例如RNA或DNA)都可能被考慮到。進一步的考慮是其中的一個核酸是否被固相化在例如濾膜上。
下面是逐漸提高嚴緊性條件的實例大致在室溫下的2×SSC/0.1％SDS(雜交條件)，大致在室溫下0.2×SSC/0.1％SDS(低度嚴緊性條件)；在大約42℃下的0.2×SSC/0.1％SDS(中度嚴緊性條件)；在大約68℃的0.1×SSC(高度嚴緊性條件)。漂洗可以只用其中一種條件進行，例如用高度嚴緊性條件，或者可用其中每種條件，例如按上面列舉的順序，每種條件10-15分鐘，重復所列舉的任何一步或所有的步驟。但是，如上面所述，最佳的條件將各不相同，這取決于所包含的特定雜交反應，可以憑經驗決定。
可以通過幾種方法獲得本發明的DNA序列。例如，該DNA可以用本領域熟知的雜交技術分離出。這些技術包括，但不局限于(1)使文庫與探針雜交，以便檢測同源核苷酸序列，(2)使用能夠與所需DNA序列退火的引物，對DNA進行聚合酶鏈反應(PCR)，以及(3)對表達文庫進行抗體篩選，以便檢測具有同樣結構特征的克隆化DNA片段。
依賴于核酸雜交的篩選程序使之有可能從任何生物體分離出任何基因序列，只要有適合的探針可以利用。與編碼所需蛋白質的部分序列相對應的寡核苷酸探針，可以被化學合成，或者通過裂解天然序列產生。化學合成需要知道短寡肽片段的氨基酸序列。編碼該蛋白質的DNA序列可以根據遺傳密碼推導出，但是必須考慮到密碼的簡并性。當此序列是簡并性的，就有可能進行混合加成反應。這包括變性雙股DNA的不均一混合物。為了這種篩選，優選地是對單股DNA或變性的雙股DNA進行雜交。當與聚合酶鏈反應技術結合應用，即使是稀少的表達產物也能被克隆。
本發明提供了編碼EspA多肽的核酸序列，含有它們的載體和宿主細胞，以及表達方法。分離出EspA肽之后，就可以借助于本領域熟知的方法分離出編碼此肽的核酸。可以將這些分離的核酸連接進入載體，并導入適合的宿主細胞進行表達。核酸的連接和在細胞內表達的方法是本領域熟知的(參見Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989，在此引入作為參考)。
在此使用的名詞“espB”和“eaeA”，指的是編碼致腸道病大腸桿菌分泌蛋白質的不同于espA的基因。在此使用的名詞“EspB”和“EaeA”，指的是分別由espB和eaeA基因編碼的蛋白質。
本發明提供了包含有編碼EspA多肽的多核苷酸的載體。例如，帶有完整espA的質粒(pMSD2)在espA缺陷菌株內可使其恢復分泌EspA蛋白質。在此使用的“載體”包括本領域技術人員熟知的質粒，DNA和RNA病毒載體，桿狀病毒載體，用于酵母的載體以及其它載體。幾種類型的載體可以購得，并可用于實現本發明。用于實現本發明的載體的實例包括那些廣泛改變如低拷貝載體pMW118的載體，正選擇自殺載體pCVD442，以及可購得的pBluescriptⅡ SK(+)(Stragene,La Jolle,CA)。
當此載體是質粒時，如本領域技術人員所知，它通常包含有多種成分，包括啟動子，信號序列，表型選擇基因，復制起點，以及其它必要的成分。最普遍地用于原核生物載體的啟動子包括LacZ啟動子系統，堿性磷酸酶phoA啟動子，噬菌體λPL啟動子(一種溫度敏感的啟動子)，tac啟動子(一個由lac阻抑物調節的雜合trp-lac啟動子)，色氨酸啟動子，和噬菌體T7啟動子。例如，在LacZ啟動子控制下的低拷貝載體pMW118。
信號序列一般被發現以5′端直接地與編碼此肽的核酸連接，因此將被轉錄在融合蛋白的氨基端。
典型的表型選擇基因是那些編碼這樣一種蛋白質的基因，此蛋白質能使宿主細胞具有抗生素抗性。例如，氨芐青霉素抗性基因(amp)和四環素抗性基因(tet)易于用于此目的。另一個例子是，為了在卡那霉素平板上選擇載體，可以將編碼卡那霉素抗性基因(kan)的aphA-3盒克隆進入一個載體區域，此區域含有編碼EspA多肽的多核苷酸。
用本領域的技術人員熟知的規范化重組DNA程序，構建適合的載體，使之含有編碼EspA多肽的多核苷酸。將要被組合形成載體的，編碼EspA多肽的分離多核苷酸斷開，并按特定的順序和取向連接在一起產生所需的載體。
本發明還提供了一種宿主細胞，它含有攜帶編碼EspA多肽的多核苷酸的載體。為了提高表達EspA的產量，可將本發明的多核苷酸用于產生轉化的或轉染的細胞。借助于本領域技術人員熟知的標準方法，可從轉化的細胞中分離出EspA。例如可應用免疫親和純化作用分離此蛋白質。
通過將DNA轉移進入適合的宿主細胞，編碼EspA的DNA序列可在體外進行表達。“宿主細胞”是在其中載體可以增殖，載體的DNA可表達的細胞。此名詞還包括目標宿主細胞的任何子代。應該認識到，所有的子代都可能與親代細胞不相同，因為在復制過程中可能發生突變。但是，當使用名詞“宿主細胞”時，也包括這種子代。穩定的轉移意味著外來的DNA被繼續保留在宿主細胞中，本領域建立了這種穩定轉移的方法。
根據本發明，EspA多核苷酸序列可被插入進重組表達載體中。名詞“重組表達載體”指的是通過插入或摻入EspA基因序列處理的本領域熟知的質粒，病毒或其它運載體。這種表達載體含有的啟動子序列可促進宿主細胞有效地轉錄插入的基因序列。此表達載體通常含有復制起點，啟動子，以及使之有可能對轉化的細胞進行表型選擇的特異性基因。
編碼EspA的多核苷酸序列可以在原核生物或真核生物中進行表達。宿主可以是微生物，酵母，昆蟲和哺乳動物。在原核生物中表達帶有真核生物序列或病毒列序的DNA序列的方法，是本領域熟知的。能夠在宿主中表達和復制的生物功能性病毒和質粒DNA載體，也是本領域熟知的。將這些載體用于摻入本發明的DNA序列。
可借助于本領域技術人員熟知的常規技術以重組DNA對宿主細胞進行轉化。當宿主是原核生物，如大腸桿菌，能攝取DNA的感受態細胞可以從指數生長期收獲的細胞中制備，隨后可用本領域熟知的程序，通過CaCl2法進行處理。或者，也可使用MgCl2或RbCl。如果需要，轉化也可以在形成宿主細胞原生質體之后進行。另一個例子是可應用三親結合作用，將載體遺傳導入大腸桿菌特別是致腸道病大腸桿菌或者兔致腸病大腸桿菌。通過生長在抗生素上對轉化的細胞進行選擇，抗生素通常是四環素(tet)或氨芐青霉素(amp)，由于載體上存在tet或amp抗性基因，轉化細胞對抗生素有抗性。在特定的實施方案中，是根據對卡那霉素和蔗糖的抗性進行細胞選擇。
當宿主是真核生物時，可應用像磷酸鈣共沉淀，常規的機械處理技術如顯微注射，電穿孔，插入包裝在脂質體內的質粒，或者插入病毒載體等的DNA轉染法。也可以用編碼本發明EspA的DNA序列，以及編碼可選擇表型的第二種外來的DNA分子如單純胞疹胸苷激酶基因，轉化真核細胞。另一種方法是使用真核生物的病毒載體，如猴病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒，瞬時感染或轉化真核細胞，并表達此蛋白質(參見例如，Eucaryotic ViralVectors(真核生物的病毒載體)，Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman ed,1982)。
可借助于常規的方法對微生物表達的本發明的多肽或其片段進行分離和純化，包括制備層析和應用單克隆抗體或多克隆抗體的免疫分離。
可能用作宿主細胞的原核生物有大腸桿菌；JM101株，大腸桿菌K12294株(ATCC號31,446)，大腸桿菌W3110株(ATCC號27,325)，大腸桿菌X1776(ATCC號31,537)，大腸桿菌XL-1 Blue(Stratagene)，和大腸桿菌B；但是，還可以使用很多其它的大腸桿菌菌株，如HB101,NM522,NM538,NM539及原核生物的其它許多種和屬。除了上面列舉的大腸桿菌菌株之外，桿菌如枯草芽胞桿菌(Bacillus subtillis)，其它腸桿菌科細菌如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimunium)或粘質沙雷氏菌(Serratiamarcesans)，以及各種假單胞菌都可用作宿主細胞。在一個特定的實施方案中，原核宿主細胞是致腸道病大腸桿菌。在另一個特定的實施方案中，原核宿主細胞是兔致腸道病大腸桿菌。
可用作宿主細胞的真核生物有酵母菌株如PS23-6A,W301-18A,LL20,D234-3,INVSC1,INVSC2,YJJ337。啟動子序列和增強子序列如ga11和pEFT-1也是有用的。Vra-4也可提供適合的增強子序列。用作功能性復制起點的序列包括ars1和2μ環形質粒。
革蘭氏陰性菌是一組多樣性的微生物，包括螺旋體屬(Spirochaetes)如密螺旋體屬和疏螺旋體屬，革蘭氏陰性桿菌如假單胞桿菌科，軍團菌科，腸桿菌科，弧菌科，巴斯德氏菌科，革蘭氏陰性球菌如奈瑟氏球菌科，厭氧擬桿菌屬，以及其它革蘭氏陰性菌如立克次氏體，衣原體，支原體。
革蘭氏陰性桿菌對臨床醫學是很重要的。它們包括(1)腸桿菌科，這是一個由許多主要的病原菌屬組成的菌科，(2)弧菌，彎曲桿菌和螺桿菌屬，(3)機會致病微生物(例如假單胞菌，黃桿菌和其它一些菌)以及(4)嗜血桿菌和博德特氏菌屬。革蘭氏陰性桿菌是在腹部內臟，腹膜和尿道感染中，以及在呼吸道，灼傷或創傷的皮膚，和宿主抵抗力減弱部位的繼發性入侵菌中發現的主要微生物。目前，它們是威脅生命的敗血癥的最常見原因。致病性革蘭氏陰性桿菌的例子有大腸桿菌(腹瀉，尿道感染，新生兒腦膜炎)，志賀氏菌屬菌(痢疾)，傷寒沙門氏菌(傷寒熱)，鼠傷寒沙門氏菌(胃腸炎)，結腸炎耶爾森氏菌(結腸炎)，鼠疫耶爾森氏菌(黑鼠疫)，霍亂弧菌(霍亂)，空腸炎彎曲菌(結腸炎)，空腸炎螺桿菌(胃炎，胃潰瘍)，綠膿假草胞菌(機會感染，包括燒傷，尿道，呼吸道，傷口感染，以及原發性皮膚，眼，耳感染)，流感嗜血桿菌(兒童腦膜炎，會厭炎，中耳炎，竇炎和支氣管炎)，以及百日咳博德特氏菌(百日咳)。弧菌是能動的革蘭氏陰性桿形菌屬(弧菌科)。霍亂弧菌引起人霍亂，其它種弧菌引起動物疾病。大腸桿菌宿主在人和溫血動物的腸內，它們是腸內共棲菌群的一部分，但是存在引起人和動物腸道疾病的大腸桿菌種類。它們包括腸內集結大腸桿菌(enteroaggregative大腸桿菌)(EaggEC)，腸出血大腸桿菌(EHEC)，腸侵入大腸桿菌(enteroinvasive大腸桿菌)(EIEC)，致腸道病大腸桿菌(EPEC)和產腸毒素大腸桿菌(ETEC)。致尿道感染大腸桿菌(Uropathogenic大腸桿菌)(UPEC)引起尿道感染。還有新生兒胞膜炎大腸桿菌(NMEC)。除了對動物引起與人類某些感染類似的感染之外，還存在一些特殊的動物疾病，包括小牛敗血癥，牛乳腺炎，豬水腫病，以及家禽肺泡病。
奈瑟氏球菌屬(Neisseria)的種類包括灰質奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌Kochii亞種，乳糖奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，多糖奈瑟氏球菌，粘膜奈瑟氏球菌，干燥奈瑟氏球菌，淡黃色奈瑟氏球菌，金黃色奈瑟氏球菌非糖解種，豚鼠奈瑟氏球菌，兔奈瑟氏球菌以及羊奈瑟氏球菌，某些分類學家認為粘膜炎摩拉氏菌(布蘭漢氏菌)也屬于奈瑟氏球菌屬。其它相關的菌種包括金氏菌，艾肯氏菌，西蒙斯氏菌，小鏈菌，CDCEF-4群，和CDC M-5群。韋榮氏球菌是革蘭氏陰性球菌，屬于奈瑟氏球菌屬的厭氧相似菌。這些非能動雙球菌是口腔正常菌群的一部分。
革蘭氏陰性好氧球菌群中的致病菌包括奈瑟氏球菌，摩拉氏菌(布蘭漢氏菌)和不動桿菌。奈瑟氏球菌屬包括二個重要的人類病原菌，淋病奈瑟氏球菌(尿道炎，子官頸炎，輸卵管炎，直腸炎，咽炎，結膜炎，骨盆炎癥性病，關節炎，傳播性疾病)，和腦膜炎奈瑟氏球菌(腦膜炎，敗血癥，肺炎，關節炎，尿道炎)。以前認為是無害的其它一些革蘭氏陰性球菌，最近又發現是人類感染的常見原因，包括粘膜炎摩拉氏菌(布蘭漢氏菌)(慢性肺病病人的支氣管炎和支氣管肺炎，竇炎，中耳炎)。
本發明的EspA多肽還可以用于產生對EspA多肽表位具有免疫活性或與之結合的抗體。提供了基本上由具有不同表位特異性的混合單克隆抗體組成的抗體，以及不同的單克隆抗體制劑。單克隆抗體可借助于本領域熟知的方法由含有抗原的蛋白質片段制備(Kohler,et a1,Nature,256:495,1975；Current Protocols in Molecular Biology,Auswbel,et al.ed,1989)。
在本發明中使用的名詞“抗體”包括能結合表位的完整分子以及其片段，如Fab,Fab′,F(ab′)2，和Fv。這些抗體片段保留了某些選擇性地與其抗原或受體結合的能力，被定義如下(1)Fab，包含有抗體分子單價抗原結合部分的片段，可通過以木瓜蛋白酶消化完整的抗體而產生完整的輕鏈和一條重鏈的一部分來制備；(2)Fab′，抗體分子的此片段可通過以胃蛋白酶處理完整的抗體，然后還原，產生完整的輕鏈和部分重鏈來獲得，每個抗體分子可得到二個Fab′片段；(3)(Fab′)2，通過以胃蛋白酶處理完整的抗體，未進行隨后的還原作用可得到抗體的該片段，F(ab′)2是由二個二硫鍵結合在一起的二個Fab′片段的二聚體；(4)Fv，定義為作為雙鏈被表達的含有輕鏈可變區和重鏈可變區的遺傳工程構建片段；(5)單鏈抗體，定義為含有輕鏈可變區，重鏈可變區的遺傳工程構建分子，此二個可變區由適當的肽接頭連接，為遺傳融合的單鏈分子。
制備這些片段的方法是本領域已知的(參見例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual，(抗體實驗手冊)，Cold Spring HarborLaboratory,New York(最新版)，在此引入作為參考)。
表位是抗原上抗體的抗原旁位與之結合的任何抗原決定簇。表位通常由例如氨基酸或糖側鏈分子的化學活性表面基團組成，并且通常具有特異性的三維結構特征，以及特異性的電荷特征。
如有需要，多克隆抗體或單克隆抗體可被進一步純化，例如通過結合于一個基質，并從其中洗脫出，此基質上結合了一種肽，或者一種該抗體針對它產生的肽。本領域的技術人員都熟悉用于純化和/或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的免疫學技術中常用的各種技術(參見例如Coligan等，Unit9,Current Protocols in Immunology,Wiley Interscience，最新版，在此引入作為參考)。
本發明還提供了用于設計espA特異性核苷酸探針或抗-EspA抗體的肽表位。這種探針或抗體可用于鑒定可能與其它病原體毒力有關的蛋白質或基因，包括但不局限于來自革蘭氏陰性菌的多肽或多核苷酸。
本發明的抗體，包括多克隆和單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體等，具有以高度免疫特異性結合于本發明的EspA蛋白質，肽或核苷酸序列或其片段的能力。這些抗體可以不被標記，或者被適當地標記。本發明的抗體可被用于對例如EspA進行親和性純化。本發明的抗體可以按已知的免疫學方法，用于定性或定量檢測細胞，組組樣品，樣品制劑或液體中的這些蛋白質或肽。本發明的抗體還可以按已知的免疫學方法，用于定性或定量檢測核苷酸序列或其蛋白質。
本發明提供了一種用于檢測樣品中EspA多肽的方法，包括使來自待檢對象的樣品與針對EspA多肽的抗體接觸；并檢測抗體對EspA多肽的結合。結合是樣品中存在EspA多肽的指示。在此使用的名詞“樣品”包括來自哺乳動物或人對象，或者其它動物的材料。這種樣品包括但不局限于毛發，皮膚樣品，組織樣品，培養細胞，培養細胞的培養基，和生物液體。例如，可以在HeLa細胞(例如人)培養物中檢測EspA多肽。
在此所用的名詞“組織”指的是來自人或其它動物的連接的細胞塊(例如CNS組織，神經組織或眼組織)，包括與該細胞有關的連接材料和液體材料。例如，兔致腸道病大腸桿菌可在兔胃，肓腸和結腸中找到。在此使用的名詞“生物液體”指的是來自人或其它動物的液體材料。這些生物液體包括但不局限于血液，血漿，血清，血清衍生物，膽汁，粘液，唾液，汗液，羊水，以及腦脊液(CSF)，如腰部或腦室CSF。
在此使用的名詞“樣品”還包括含有該分離多肽的溶液，該多肽被分泌至其中的培養基，以及含有產生此EspA多肽的宿主細胞的培養基。例如，樣品可能是將被SDS-PAGE分辨，并轉移至硝酸纖維素膜進行Western免疫印跡分析的蛋白質樣品。本領域的技術人員可借助于標準的實驗技術確定獲得某一反應所需要的樣品量。最佳樣品量可通過系列稀釋來確定。
在一個實施方案中，樣品中存在EspA多肽是被致腸道病大腸桿菌感染的指示。在另一個實施方案中，樣品中存在EspA多肽是被致腸出血大腸桿菌感染的指示。
預計本發明的蛋白質，蛋白質片段，和合成的肽具有多種用途，包括預測，治療，診斷或藥物設計等應用。本發明的蛋白質，蛋白質片段和合成的肽，將為制備與本發明的蛋白質具有特異性免疫反應的單克隆和多克隆抗體提供基礎。在一個實施方案中，本發明提供了一種方法，用于對由產生EspA的大腸桿菌引起的疾病敏感的宿主，通過對宿主給予權利要求1的多肽進行免疫；并且誘導宿主對EspA多肽產生保護性免疫應答。因此可預防產生EspA的微生物對宿主的感染。在更特定的實施方案中，產生EspA的微生物是大腸桿菌菌株。在更加特定的實施方案中，該大腸桿菌菌株是致腸道病大腸桿菌或致腸出血大腸桿菌。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種方法，用于緩解由產生EspA的微生物引起的疾病，是通過以EspA多肽免疫宿主，誘導宿主對EspA多肽的免疫應答。在更特定的實施方案中，產生EspA的微生物是大腸桿菌菌株。在更加特定的實施方案中，該大腸桿菌菌株是致腸道病大腸桿菌或致腸出血大腸桿菌。本發明提供了一種檢測樣品中espA多核苷酸的方法，是通過使懷疑含有espA多核苷酸的樣品與能同espA多核苷酸雜交的核探針相接觸；并檢測此探針與espA多核苷酸的雜交作用。發現雜交作用是樣品中存在espA多核苷酸的指示。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種帶有espA突變基因的微生物。其中的espA基因可被突變的優選微生物包括但不局限于細菌。其中的espA基因可被突變的細菌是大腸桿菌。其中的espA基因可被突變的大腸桿菌是致腸道病大腸桿菌和致腸出血大腸桿菌。
本發明提供了用于產生重組espA多核苷酸的方法，包括將編碼選擇性標記的核酸插入編碼EspA多肽的多核苷酸中。產生的多核苷酸編碼含有選擇性標記的重組EspA多肽。例如，選擇性標記可以是單純瘡疹病毒(HSV)標志，市場上可購得針對此標志的抗體。
本發明提供了用于產生重組EspA多肽的方法，是通過使含有編碼EspA多肽的多核苷酸的宿主細胞，在允許其表達和分泌EspA多肽的條件下生長再分離出此多肽。以重組技術產生多肽和肽的方法在本發明的范圍之內。在此使用的“允許其表達和分泌的條件”指的是這樣適合的條件，以致于核酸可能轉錄和翻譯，并可分離出這樣產生的多肽。所產生的多肽可能是被分泌進培養基中的蛋白質。培養基包括微生物可在其中生長或者微生物可在其中生存的液體，物質或有機體。這樣的環境可以是例如，動物組織或體液，水和其它液體，食物，食物產品或食品提取液，以及某些無生命的物體。例如，微生物可生長在Luria-Bertani(LB)培養基中。不必要此環境能促進微生物生長，只要它允許其生存。
本發明提供了一種鑒定抑制細菌Ⅲ型分泌系統的化合物的方法，是通過將編碼選擇性標記的多核苷酸，引入具有Ⅲ型分泌系統的細菌；使細菌在允許細菌生長并分泌由此多核苷酸編碼的多肽的條件下生長；再使推測抑制細菌Ⅲ型分泌系統的化合物與此細菌接觸；誘導此多肽的表達；然后檢測此多肽的分泌。在實施本方法中，分泌缺乏指示對細菌Ⅲ型分泌系統的抑制作用。在發明中使用的名詞“Ⅲ型分泌”和“Ⅲ型分泌途徑”指的是排出分子跨越細胞膜的特殊機構。排出分子跨越細胞膜，對將毒力因子轉移到能夠與宿主成分相互作用的表面是關鏈性的過程。Ⅲ型分泌路徑使用三磷酸腺苷(ATP)作能源。Ⅲ型分泌路徑不同于革蘭氏陰性菌中發現的其它分泌路徑，雖然它具有與鞭毛和絲狀噬菌裝配基因同源的基因。它不同于任何的哺乳動物路徑。它經常與疾病的發生有關。由Ⅲ型分泌路徑分泌的毒力因子，在各種病原菌之間各不相同，雖然Ⅲ型分泌機構的部件，至少對沙門氏菌，志賀氏菌和耶爾森氏菌是可以互換的。
而且，本發明的多肽或核苷酸序列，可用于鑒定與它們相互作用(例如結合)并影響它們生物活性的化合物或組合物。這種作用包括抑制或激活EspA活性或分泌。
本發明提供了一種方法，通過在編碼EspA多肽的核苷酸中引起突變，而產生非致病性微生物，將編碼選擇性標記物的核酸序列插入突變位點；將突變的espA多核苷酸導入一種微生物的染色體espA基因，引導在染色體espA基因中發生突變；然后選擇具有突變的微生物。在此使用的名詞“突變”指的是在基因核苷酸序列，特別是在編碼EspA多肽的多核苷酸中的改變。突變包括產生具有不同氨基酸序列EspA多肽的突變，錯義突變(包括移碼突變)，無義突變(包括敲除突變)，以及產生含有部分EspA多肽的融合蛋白的基因重組技術。在一個實施方案中，編碼選擇性標記的核酸序列能編碼對卡那霉素的抗性。例如，可將編碼卡那霉素抗性基因(Kan)的aphA-3盒克隆進入編碼EspA多肽的多核苷酸，用于在產生敲除突變的卡那霉素培養板上選擇突變的espA多核苷酸。
在其中實施本發明的優選微生物包括但不局限于細菌。在另一個實施方案中，用于在編碼EspA多肽的多核苷酸中產生突變的微生物是大腸桿菌。在大腸桿菌中可被轉化的是致腸道病大腸桿菌和致腸出血大腸桿菌。
本發明提供了一種激活宿主細胞中酪氨酸激酶活性的方法，是通過將表達Eae多肽的espA缺陷型突變細菌和表達EspA多肽的eaeA-缺陷型突變細菌都加入到宿主細胞中，使細菌與宿主細胞結合，因而激活宿主細胞中酪氨酸激酶的活性。在一個實施方案中，宿主細胞中酪氨酸激酶活性的激活，引起了90千道爾頓的宿主膜蛋白Hp90的酪氨酸磷酸化，并導致細胞內磷酸肌醇(IP3)和鈣流出。例如，當此二個突變體株被用于共感染HeLa細胞時，eaeA突變體可用于補充espA突變體的侵染作用。因此，本發明提供了一種有用的科學方法，借助于細胞生物學研究致病機理。
本發明包括一種包含有本發明的一種或幾種抗體的試劑盒，以及一種基于核苷酸的試劑盒。在一個實施方案中，該試劑盒可用于檢測EspA多肽，它是一種被分隔的裝載工具，容納了緊密封裝的容器，其中裝有能與EspA多肽結合的抗體。在此使用的“包裝工具”包括小藥瓶，試管等，每個包裝工具內裝有用于本方法的一種分離的成分。在一個實施方案中，這種能與EspA多肽結合的抗體是可檢測標記的。在更特定的實施方案中，此標記物選自放射性同位素，生物發光化合物，化學發光化合物，熒光化合物，金屬螯合劑以及酶。
在另一個實施方案中，此試劑盒可用于檢測EspA多核苷酸，它是一種被分隔的裝載工具，容納了緊密封裝的容器，其中裝有能與EspA多核苷酸雜交的核酸探針。在一個實施方案中，這種能與EspA多核苷酸雜交的核酸探針是可檢測標記的。在更特定的實施方案中，此標記物選自放射性同位素，生物發光化合物，化學發光化合物，熒光化合物，金屬螯合劑以及酶。
因為EspA是一種分泌蛋白，所以它可以作為融合配偶體用于克隆和表達其它的肽和蛋白質，例如，融合于所研究蛋白質的EspA，可通過重組技術在宿主細胞如大腸桿菌中產生，此融合蛋白被分泌到該轉化的宿主細胞在其中生長的培養基中。此融合蛋白可借助于抗-EspA抗體被分離出，隨后使EspA與所研究的肽或蛋白質斷開。用ELISA或其它免疫親和性方法可對此EspA融合蛋白進行鑒定。本發明提供了一種產生EspA融合蛋白的方法，包括使宿主細胞在允許其表達和分泌融合多肽的條件下生長，然后分離出融合多肽，此宿主細胞含有編碼EspA的多核苷酸，此多核苷酸可操作地連接于編碼所研究多肽或肽的多核苷酸。名詞“可操作地連接或結合”指的是啟動子序列和結構基因之間，或者在融合蛋白的情況下是被啟動子核酸序列調節的基因之間的功能性連接。可操作地連接的啟動子控制由結構基團編碼的多肽(如融合蛋白)的表達。
打算用下面的實施例對本發明進行說明，而不是限制它。盡管所應用的那些實施方法都是典型的，但是還可以選擇地應用本領域技術人員熟知的其它程序。
實施例1致腸道病大腸桿菌espA基因的DNA序列分析此實施例的目的是為了描述espA的特征，這是一個造成致腸道病大腸桿菌具有附著和表面損傷活性的基因。espA基因編碼25千道爾頓的分泌蛋白，定位于致腸道病大腸桿菌染色體組，在兩個為緊密粘附所需要的基因座eaeA和espB之間的腸細胞表面損傷基因座中(Locus of EnterocyteEffacement)。
對致腸道病大腸桿菌eaeA和espB之間的腸細胞表面損傷基因座的DNA序列進行了測定。DNA測序按如下進行將從eaeA中延伸至espB(5′)上游的腸細胞表面損傷基因座的SalⅠ-BglⅡDNA片段，克隆進入可購得的質粒pBluescript中，形成質粒pLCL109。從質粒pLCL109的閉合子(closer)末端到eaeB基因，形成了一系列嵌套式DNA缺失。使用按需要合成的寡核苷酸引物，[a-35S]dATP，以及測序酶，可將質粒pLCL109的這些DNA缺失用作模板，測定DNA雙股的核苷酸序列。借助于由Wisconsin大學GeneticComputer Group開發的軟件包對DNA序列數據進行分析。
對此DNA序列的分析顯示出三個開放讀框。由位于第二個開放讀框(espA)5′末端的DNA序列預測的氨基酸序列，與一種蛋白質的氨基末端序列相同，此蛋白質具有由致腸道病大腸桿菌分泌的大約25千道爾頓的MR。用TEASTA檢索Genbank數據庫時，未檢測出具有相似序列的蛋白質。因此，該espA基因編碼致腸道病大腸桿菌分泌蛋白。
由espA編碼的完整蛋白的預測分子量是20468道爾頓(圖1)。在所報告的分泌產物的氨基末端之前，沒有前導序列。強共有核糖體結合位點止于起始密碼子之前7個核苷酸。在氨基末端的頭19個殘基中的11個被預測是絲氨酸或蘇氨酸。
實施例2在質粒和染色體上的espA基因中構建突變本實施例的目的是在微生物染色體上的espA基因中構建突變。本實施例的目的是在質粒上的espA基因中構建突變。然后可將此質粒用于在其它微生物的espA基因中產生突變。構建了在espA基因中帶有非極性突變的質粒。并且產生了在其染色體espA基因中帶有非極性突變的突變菌株。
在圖2中描述了帶有非極性突變的espA基因。用聚合酶鏈反應(PCR)形成了帶有限制性酶切位點的缺失，這樣可以使編碼卡那霉素抗性的aphA-3盒被克隆進入此缺失區。在所有的三個讀框中，此aphA-3盒的前面(5′)是翻譯終止密碼子，緊接此盒后面(3′)的是共有核糖體結合位點和起始密碼子。設計在espA基因插入時保留了espA 3′端的讀框，因此可以不影響下游(3′)基因的轉錄和翻譯。DNA測序證實了此突變的讀框。
按如下借助于聚合酶鏈反應，在質粒espA基因中構建非極性突變PCR模板是質粒pLCL114，它含有被克隆進入pBluescrit的pLCL119 ClaⅠ-BglⅡ片段。使用了二對引物，帶有Donne～99的通用引物和帶有Donne-100的反向引物。寡核苷酸Donne-99和Donne-100分別是SalⅠ-BglⅡ片段的核苷酸4157至4140和4297至4324。為了克隆的目的，在Donne-99和Donne-100的5′端都設計了NruL限制性酶切位置。寡核苷酸是在Baltimore的Maryland大學生物聚合物實驗室構建的，在小循環器內對50μl樣品進行了PCR。進行了30個PCR反應循環，在94℃DNA變性1分鐘，在55℃對引物退火2分鐘，在72℃多核苷酸延伸3分鐘。形成的2個擴增片段各自被克隆進可購得的質粒pCRscript，分別構成pLCL119和pLCL120。然后用SalⅠ和NruⅠ將pLCL120的插入片段克隆進入pLCL119，構成含有所需缺失的pLCL121。然后將在SmaⅠ位點側面的850堿基對的aphA-3卡那霉素抗性盒插入進pLCL121的NruⅠ位點。
將突變的espA等位基因克隆進正選擇自殺載體PCVD442，并通過等位基因交換被導入野生型致腸道病大腸桿菌E2348/69株。按如下構建了espA突變菌株將含有中斷的espA基因的來自具有aphA-3卡那霉素抗性質粒的SalⅠ-SacⅠ片段，克隆進入DH5 apir中的正選擇自殺載體pCVD442，用于通過三親結合作用，或者通過用設定在1.8kV的大腸桿菌脈中發生器，在0.1cm的比色杯內進行電穿孔處理而導入E2348/69菌株。
在修改的LB卡那霉素培養板上對espA突變體進行選擇。形成的致腸道病大腸桿菌突變株UMD872對蔗糖和卡那霉素具有抗性，對氨芐青霉素敏感。用二個突變側翼的引物Donne-52和Donne-73進行的PCR擴增，證實了espA突變的構建。此細菌在50％LB液體培養基/50％甘油(體積/體積)中，-70℃貯存，在LB瓊脂板上或LB液體培養基中培養生長，需要時加入氯霉素(20μg/ml)，氨芐青霉素(200μg/ml)，萘啶酮酸(50μg/ml)，或卡那霉素(50μg/ml)。
實施例3致腸道病大腸桿菌espA基因的破壞消除了EspA蛋白的分泌本實施例的目的是鑒別由espA基因編碼的蛋白質。對EspA蛋白質的氨基末端序列數據進行比較表明，它與被翻譯的espA基因序列是一致的。為了證實此結果，使espA缺失突變體UMD872在放射性標記的組織培養基中培養生長。espA基因的缺失，導致喪失了25千道爾頓的放射性標記分泌蛋白。通過用與EspA分泌蛋白反應的抗-EPEC血清進行免疫沉淀作用，證實了此結果。用抗-EPEC血清進行的Western分析顯示沒有25千道爾頓的分泌蛋白質。當以帶有完整espA的質粒(pMSD2)轉化espA缺限菌株，EspA蛋白的分泌得到恢復。該細菌增加產生由質粒編碼的EspA蛋白，而使得Ⅲ型分泌路途對其它蛋白質的分泌減少了。
實施例4致腸道病大腸桿菌侵染培養的上皮細胞需要EspA本實施例的目的是測定致腸道病大腸桿菌EspA蛋白是否與對上皮細胞的侵染有關。激發宿主的信號傳導通路和侵染宿主細胞都需要EspA蛋白。
以親本野生型或espA突變型致腸道病大腸桿菌菌株感染單層上皮癌細胞(Hela)3小時。測定粘附的和細胞內的(即侵入的)致腸道病大腸桿菌菌的數目。與突變型和親本型致腸道病大腸桿菌菌株之間不同的生長速度相對應，二株菌對Hela細胞粘附的絕對數目不相同，盡管espA突變株UMD872對上皮細胞有足夠數量的粘附，但缺乏侵入的數量。但是，當通過編碼了完整espA基因的質粒pMSD2，以遺傳技術補充espA基因后，侵入單層HeLa細胞的UMD872的數量接近野生型的水平。
對HeLa單層細胞進行了共感染試驗，用于測定在espA,espB和eaeA方面突變菌株的入侵行為缺陷，是否可以通過遺傳技術反式互補，介導隨后的入侵作用。eaeA突變菌株可激活信號傳導，但缺乏緊密的粘附。由eaeA突變株介導的信號傳導可使espB缺陷的菌株進入上皮細胞，但是反之則不能。當用eaeA和espA突變株共感染HeLa細胞時，eaeA突變株彌補了espA突變株的侵入作用，但eaeA突變株的侵入作用沒有增加。確實，由較強粘附的eaeA突變株誘發的信號傳導，導致增加了對espA突變株的攝入。用espA和espB缺失株共感染沒有使其中任何一株增強入侵作用，表明espA和espB不能互相補充。
共感染實驗證明，像espB那樣，espA突變株的入侵行為被eaeA彌補了，但是反之則不能。確實，由較強粘附的eaeA突變株引起的信號傳導，導致增加了表達intimin的espA突變株的攝入。相反，espA或espB突變株都不能相互彌補，意味著這二種蛋白質可能共同對誘發上皮細胞信號傳導的相同步驟起作用。
實施例5EspA對誘發上皮細胞中信號傳導事件是必需的本實施例的目的是測定是否EspA對誘發上皮細胞中信號傳導事件是必需的。致腸道病大腸桿菌誘發宿主細胞90千道爾頓膜蛋白的酪氨酸磷酸化作用，并隨后發生磷酸化的蛋白質，肌動蛋白和其它細胞骨架成分在粘附的細菌下面聚積。對缺乏侵染作用的espA突變株誘發哺乳細胞這二種信號傳導事件的能力進行了測定。與野生型致腸道病大腸桿菌不同，espA突變株UMD872不能誘發宿主Hp90的磷酸化作用。通過編碼EspA蛋白的質粒(pMSD2)可使誘發這種磷酸化事件的能力恢復。
粘附和侵入測定按如下進行用不同的致腸道病大腸桿菌菌株感染(m.o.i.1∶100)培養在DMEM中的105 HeLa細胞3小時。在補充了10％(體積/體積)胎牛血清的Dulbecco′s Minimal Eagles培養基(DMEM)中，以5％CO237℃培養HeLa細胞。先將單層細胞在磷酸緩沖鹽水中洗三次，然后在磷酸緩沖鹽水配制的1％Triton(體積/體積)中作細胞溶解，并在LB瓊脂板上以系列稀釋液作平板培養。為了測定侵入作用，在對細胞漂洗，溶解細胞和作平板培養之前，將洗過的單層細胞與慶大霉素(100μg/ml)共同溫育1小時，以便殺死外部的細菌。
用野生型或突變型致腸道病大腸桿菌菌株感染單層HeLa細胞3小時。分離出HeLa細胞的Triton X-100可溶性和不溶性上皮蛋白。蛋白質樣品通過SDS-PAGE進行分離，并轉移至硝酸纖維素膜上，然后用抗-磷酸酪氨酸特異性抗體進行探測。
按如下分離出致腸道病大腸桿菌分泌蛋白和HeLa細胞蛋白以106 HeLa細胞接種組織培養板培養過夜。在感染之前，用含有放線菌酮(100μg/ml)而沒有甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM替換此培養基。使HeLa細胞在補充了10％(vol/vol)胎牛血清的DMEM中，以5％CO2在37℃下培養生長。加入致腸道病大腸桿菌(m.o.i.100∶1)，在5％CO2孵箱內37℃培育2.5小時，然后加入200μg/ml的35S半胱氨酸/甲硫氨酸培育30分鐘。分離出培養上清液，并通過離心(18000×g,10分鐘)沉淀其中的細菌。通過加入冰冷的三氯醋酸(10％vol/vol)使上清液中的分泌蛋白沉淀，并在冰上孵育60分鐘。同上通過離心使蛋白質沉淀，然后再混懸于Laemelli樣品緩沖液中。借助于12％SDS-PAGE使樣品分離，通過放射自顯影技術測定蛋白質分布圖，或者轉移至硝酸纖維素膜，然后用抗-EPEC抗體探測。
所有的致腸道病大腸桿菌菌株都在不溶性組分中顯示出了85千道爾頓的酪氨酸磷酸化蛋白Ep85，證明在單層細胞上存在致腸道病E.coli菌株。
按如下對HeLa細胞磷酸酪氨酸蛋白進行了分析先用冰冷的磷酸緩沖鹽水洗感染的單層HeLa細胞3次，然后在含有蛋白酶抑制劑的1％TritonX-100中使細胞溶解。分離出Triton不溶性和可溶性組分，重新懸浮于Leamelli樣品緩沖液中，用抗-磷酸酪氨酸抗體，借助于Western免疫印跡分析法，分析磷酸酪氨酸蛋白。
用熒光標記的抗-磷酸酪氨酸抗體或若丹明一次毒蕈環肽，通過免疫熒光顯微鏡檢測感染的HeLa細胞顯示，不同于野生型親本致腸道病大腸桿菌，espA突變株不使酪氨酸磷酸化蛋白或細胞骨架肌動蛋白在粘連微菌落下聚積。但是，通過使用在質粒pMSD2上攜帶espA基因的菌株，可以使磷酸酪氨酸和肌動蛋白聚積作用恢復。
按如下進行免疫熒光顯微鏡檢測對接種培養在圓形蓋玻片上的HaLa細胞，以致腸道病大腸桿菌或突變菌株感染3小時。漂洗此單層細胞，并在2.5％多聚甲醛中固定，然后對絲狀肌動蛋白染色(用次毒蕈環肽-若丹明)，或者以帶有適當的熒光標記第二抗體的抗-磷酸酪氨酸抗體染色。
實施例6對兔致腸道病大腸桿菌(RDEC-1)分泌性毒力蛋白EspA和EspB的特征鑒定本實施例的目的是研究兔致腸道病大腸桿菌(RDEC-1)中EspA和EspB的結構。對espA和espB基因進行克隆，并將它們的序列與致腸道病大腸桿菌(EPEC)的基因序列作比較。EspA蛋白表現出一些類似性(88.5％相同)。EspB蛋白內部是異源的(69.8％相同)，但是與致腸道出血大腸桿菌(EHEC)的一個菌株相同。
按如下對espA和espB基因進行克隆和序列分析編碼RDEC-1 espA和espB的DNA片段可通過PCR從RDEC-1染色體DNA得到，使用來自已公布的致腸道病大腸桿菌基因序列的引物，使用Vent DNA聚合酶進行PCR，從RDEC-1和致腸道病大腸桿菌菌株擴增染色體DNA。進行30次PCR反應循環，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，以及72℃延伸2分鐘。將形成的4.3千堿基對產物連接進入購得的質粒pBluescript中，并對雙鏈測序。按如下進行DNA測序通過PCR擴增編碼espA和espB基因的此4.3千堿基對的DNA片段，使用引物AA01(+)和MSll(-)，以RDEC-l染色體DNA作為DNA模板。形成的鈍末端片段用SalⅠ消化，并克隆進入購得的質粒pBluescript-IISK(+)的SalⅠ-SmaⅠ位點。應用購得的TaqDyeDeoxy試劑盒對RDEC-1 espA的DNA序列和雙鏈進行測序(圖3)。
在此克隆化區域內發現了二個開放讀框，這些DNA序列類似于致腸道病大腸桿菌的espA和espB。預測的RDEC-1 EspA的分子量(192個氨基酸)是23533道爾頓，RDEC-1 EspB的分子量(314個氨基酸)是33219道爾頓。RDEC-1 EspA與致腸道病大腸桿菌的EspA有些相似，具有88.5％相同性(圖4A和4B)。
一個未預料的結果是，RDEC-1 EspB蛋白與最近報導的，來自致腸出血大腸桿菌413/89-1株，026血清型的EspB相同，但在12堿基對和729堿基對位置存在二個核苷酸差異(T變為C，和G變為T)，此菌株最初是從胎牛分離出，以后也從患有溶血性尿毒綜合癥的病人分離出。并且，RDEC-1 EspB與致腸出血大腸桿菌0157血清型和致腸道病大腸桿菌菌株的相比較，分別顯示70.3％和69.8％的相同性。當與致腸道病大腸桿菌的序列比較時，在RDEC-1和致腸出血大腸桿菌(026和0157血清型)的EspB中，在相同位置發現了小缺失序列(4A-C)。
這些結果顯示RDEC-1可編碼espA和espB基因，并表明預測的EspA多肽在RDEC-1和致腸道病大腸桿菌中是高度保守性的。但是，此EspB與致腸出血大腸桿菌，而不是致腸道病大腸桿菌的EspB更相似。espA下游開放讀框(3′)顯示與致腸道病大腸桿菌的EspD有相似性，EspD是一種調節EspB分泌的分泌蛋白，是激發宿主細胞信號傳導路徑所需要的(EMBL GenBank資料，查詢號Y09228)。這些結果表明，espD在RDEC-1中也位于espA和espB之間。
實施例7對RDEC-1 EspA和EspB的特征鑒定本實施例的目的是研究兔致腸道病大腸桿菌(RDEC-1)中EspA和EspB的功能。RDEC-1中espA和espB的突變揭示，RDEC-1的基因產物對激發宿主信號傳導路徑和侵入HeLa細胞是必需的。含有致腸道病大腸桿菌espA和espB的質粒對RDEC-1突變株有彌補作用證明，它們在功能上是可以互換的，雖然致腸道病大腸桿菌蛋白介導更高水平的侵入作用。并且，RDEC-1和致腸道病大腸桿菌分泌蛋白的最大表達，是發生在它們各自宿主的體溫之下，體溫可能是致腸道病大腸桿菌對兔缺乏感染性的原因之一。
為了證實RDEC-1 espA和espB在宿主上皮細胞信號傳導路徑中的作用，在espA和espB中設計構建了非極性終止密碼子突變。構建了二個自殺性載體，并通過回復結合被導入RDEC-1野生型菌株。形成的突變菌株AAF001ΔA(EspA-),AAF001ΔB(EspB-)，和雙突變株AAF001ΔAB(EspA-/EspB-)，通過BgⅡ消化被證實。
按如下在RDEC-1 espA和espB基因中構建了非極性終止密碼子突變通過PCR擴增了編碼espA和espB基因的2.7千堿基對的腸細胞表面損傷基因座DNA片段，使用引物BK25(+)和MSll(-)，以pORF123B作DNA模板。用EcoRⅠ消化形成的平端片段，并被克隆進入pBluescriptll SK(+)載體的EcoRⅠ-SmaⅠ位點，得到pORF23B。將1.1千堿基對的EcoRⅠ-BglⅡ DNA片段，它是來自含有espA的pORF23B，克隆進入pBluescriptⅡSK(+)的EcoRⅠ-BamHⅠ位點，得到pORF23。
為了在espA中構建非極性突變，進行了反向PCR，使用含有BglⅡ限制性酶切位點和終止密碼子的ΔespA(+)和ΔespA(-)引物，使用環狀pORF23作DNA模板，然后使PCR產物平端連接得到pORF23Δ。形成的質粒含有一個終止密碼子和一個espA起始密碼子下游(3′)235堿基對處的BaglⅡ位點，通過DNA測序證實了這點。將含有來自pORF23A的突變espA的1.1千堿基對SalⅠ-SacⅠDNA片段插入進自殺載體pCVD442的相同位點，得到PAA23Δ，此載體pCVD442含有正選擇SacB基因和氨芐青霉素抗性基因。將形成的質粒導入大腸桿菌SM10(pir，并反向結合進入攜帶有pACYC184的RDEC-1。
為了在espB內構造非極性突變，使用ΔespB(+)和ΔespB(-)引物，用pBxb作DNA模板進行了反向PCR。pBxb含有來自pORF23B的1.4千堿基對XbaⅠ片段，此pORF238編碼被克隆進入pBluescript載體的espB。形成的PCR產物自身連接而獲得pBxbΔ，它含有一個終止密碼子和一個由ΔespB(-)和ΔespB(+)引物導入的BglⅡ位點。在pBxbΔ中，形成的esp基因被刪除了250堿基對，始于espB起始密碼子下游154堿基對(3′)將1.1千堿基對的SalⅠ-SacⅠDNA片段插入進pCVD442的相同位點，得到pAABxbΔ，其中的DNA片段含有來自pBXbA的突變espB。將形成的此質粒轉導進入大腸桿菌SM10λpir，并反向結合進入攜帶有pACYC184的RDEC-1。為了在espA和espB中構建雙突變，可將pAABxbΔ導入AAF001ΔA(EspA-)菌株。通過它們的表型保持有對蔗糖和氯霉素的抗性，以及對氨芐青霉素敏感，證明是三個RDEC-1非極性突變株。為了證實在espA和espB中插入了終止密碼子，可以從每個突變株制備染色體DNA，用含有esp基因的引物進行PCR。形成的PCR產物用BglⅡ進行酶切消化，以便證實存在這種構造的限制性酶切位點。espA或/和espB中含有終止密碼子的突變株分別被命名為AAF001ΔA(EspA-),AAF001ΔB(EspB-)和AAF001ΔAB(EspA-/EspB-)。
為了證實自殺載體不影響各自的側翼區或其它基因座，可實施突變返回到野生型(“回復突變”)。通過將自殺載體pAA23和pAABxb反向結合進入AAF001ΔA(EspA-)和AAF001ΔB(EspB-)菌株，得到了二個回復突變株。通過PCR和BglⅡ酶切消化，證實了所形成的是回復突變株，AAF003和AAF004。按如下在EspA和EspB株中構造回復突變將1.1千堿基對的SalⅠ-SacⅠDNA片段插入pCVD442的SalⅠ-SacⅠ位點，得到pAA23，其中的DNA片段是來自含有espA的pORF23。將pBxb的1.4千堿基對的SalⅠ-SacⅠ片段插入pCDD422的SalⅠ-SacⅠ位點，得到pAAFBxb。將pAA23的pAABxb導入SMλpir，并反向結合進入AAF001AA和AAF001AB。如上所述證實了所形成的是回復突變株，被命名為AAF002(Esp+)和AAF003(EspB+)。
按如下對致腸道病E.coli espA和espB進行克隆通過PCR擴增編碼espA和espB的2.8千堿基對DNA片段，使用引物EespA(+)和EespB(-)，以致腸道病大腸桿菌2348/69的染色體DNA為模板。用BamHⅠ和SalⅠ酶切消化此片段，并在lacZ啟動子的控制下被導入低拷貝載體pMW118的Bam[HI-〕SalⅠ位點，得到pMWespAB。用BglⅡ酶切消化在espD開放讀框內具有限制性酶切位點的pMWespAB，與Klenow片段平端連接，然后自身連接到了pMW6espD，還可用BglⅡ和BamHⅠ酶切消化pMWespAB，然后自身連接得到了pMWespB。用BglⅡ-SalⅡ酶切消化pMWespAB，并以Klenow片段填補，然后自身連接得到了pMWespA。
對RDEC-1和它的突變株在組織培養基中的分泌成分進行了分析。致腸道病大腸桿菌在組織培養基中分泌5種蛋白質，110千道爾頓的(EspC)，40千道爾頓的，39千道爾的，37千道爾頓的(EspB)，和25千道爾頓的(EspA)。RDEC-1顯示有相似的分泌成分，不同的是它不分泌與EspC等同的蛋白質。致腸道病大腸桿菌誘發宿主信號傳導路徑不需要EspC。雖然有二個分泌蛋白(40和39千道爾頓的)難以分辨，但是應用不同條件的SDS-PAGE可分辨這些蛋白質。RDEC-1分泌二個與致腸道病大腸桿菌EspA和EspB具有相似遷移率的蛋白質。
可按如下制取RDEC-1分泌蛋白將培養過夜的細菌培養物在DMEM中作1∶100稀釋，然后培養至在600nm的光密度(OD600)為1.0。為了對含有致腸道病大腸桿菌espA和espB重組質粒的RDEC-1突變株誘發轉錄，在DMEM中加入了異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。通過離心(18000xg,10分鐘)除去細菌，加入10％冰冷的三氯醋酸使上清液沉淀，并在冰上放量1小時。離心之后，將沉淀重新懸浮于Lavemmli樣品緩沖液中，并通過12％SDS-PAGE進行分析。
在Western免疫印跡檢測中，EspA和EspB蛋白對抗-致腸道病E.coliEspA和抗-致腸道病大腸桿菌EspB抗血清都有交叉反應，表明RDEC-1也分泌EspA和EspB蛋白。在Western印跡檢測中，使用了抗致腸道病大腸桿菌EspA和EspB的兔多克隆抗體。
突變株AAF001ΔA,AAF001ΔB和AAF001ΔAB，分別缺乏分泌EspA,EspB和EspA/EspB，這是根據對它們的分泌成分和Western印跡分析所作的判斷。對于突變株AAF00ΔA(EspA-)仍然可分泌EspB，它的基因定位在espA下游(3′)，表明終止密碼子插入突變不影響下游基因表達。這些結果也證明，RDEC-1 EspA和EspB蛋白是由我們稱為espA和espB的序列編碼的。而且，二個最初從AAF001ΔA(EspA-)和AAF001ΔB(EspB-)得到的回復突變株AAF002和AAF003，現在可表達親本的分泌蛋白，表明AAF001ΔA和AAF001ΔB中的每種非極性突變正如所預測，并且不影響下游基因和其它的基因座。盡管在SDS-PAGE中RDEC-1 EspA和EspB的遷移率比致腸道病大腸桿菌的稍快些，但是計算的RDEC-1 EspA和EspB的分子量比致腸道病大腸桿菌的更大。
與野生型RDEC-1株相比較，EspA-,EspB-和EspA-/EspB-菌株中其它分泌蛋白的量減少了。并且，在EspA-/EspB-菌株中40千道爾頓和39千道爾頓蛋白質可檢測分泌作用的減少，比在EspA-和EspB-菌株中發現的更大。分泌除EspC外的致腸道病大腸桿菌蛋白，是由Sep簇編碼的Ⅲ型分泌系統介導的。可能通過插入終止密碼子對EspA或EspB的截短會干擾此分泌路徑，或者干擾此系統的反饋調節，從而影響其它Ⅲ型依賴性分泌蛋白的分泌。
Esp蛋白為激發宿主信號傳導路徑所需要。致腸道病大腸桿菌EspA和EspB蛋白誘發宿主信號傳導路徑，導致酪氨酸磷酸化蛋白，細胞骨架肌動蛋白和其它成分在粘附的細菌下面聚積。為了測定RDEC-1 EspA和EspB是否在HeLa細胞中觸發這些事件，可用若丹明-次毒蕈環肽和熒光標記的抗-磷酸酪氨酸抗體對細胞骨架肌動蛋白和酪氨酸-磷酸化蛋白染色。雖然粘附著的RDEC-1細胞骨架肌動蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白聚積水平，比致腸道病大腸桿菌的低，但是對于致腸道病大腸桿菌這些行為是不易辨別的。相反，RDEC-1 EspA-,EspB-和EspA-/EspB-菌株，在粘附的細菌下面不聚積細胞骨架肌動蛋白或酪氨酸-磷酸化蛋白。但是，回復突變株AAF003和AAF004與其親本菌株相似，聚積了這些蛋白質。
當將含有致腸道病大腸桿菌espA或espB的質粒，或者含有此二個基因的質粒導入RDEC-1 EspA-,EspB-，和EspA-/EspB-菌株，細胞骨架肌動蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白的聚積也可恢復。但是，當用仍然分泌EspB的致腸道病大腸桿菌EspA-株同RDEC-1 EspB共感染時，則不能恢復誘發宿主信號傳導事件。在共感染中致腸道病大腸桿菌EspB也不能彌補RDEC-1 EspA。因此，對于激活宿主信號傳導路徑，在RDEC-1和致腸道病大腸桿菌中EspA和EspB的功能是相似的，但需要由同一菌株分泌這二種蛋白。
當用致腸道病大腸桿菌感染HeLa細胞時，借助于免疫印跡法可檢測出酪氨酸-磷酸化Hp90。以RDEC-1感染的細胞不能檢測出酪氨酸-磷酸化Hp90，盡管借助于免疫熒光法在粘附RDEC-1細菌細胞下面可觀察到酪氨酸磷酸化蛋白。
如根據免疫熒光顯微鏡的觀察判斷，對HEp-2和T84細胞致腸道病大腸桿菌不誘發酪氨酸磷酸化。測序結果表明，與致腸道病大腸桿菌相比較，RDEC-1 EspB更類似于致腸出血大腸桿菌的EspB。本實施例中的這些結果表明，在RDEC-1感染過程中，較少的酪氨酸-磷酸化蛋白聚積是由于RDEC-1較低的粘附效率，因為粘附水平不同或Esp蛋白的異質性，或者是二者兼而有之。
粘附和侵入能力。在體外試驗中，致腸道病大腸桿菌的EspA和EspB不僅與激發宿主信號傳導路徑有關，而且也是侵入所必需的。為了研究RDEC-1的EspA和EspB在粘附和侵入中的作用，對RDEC-1esp突變株和RDEC-1株進行了比較。EspA-,EspB-和EspA-/EspB-菌株的粘附能力與野生型RDEC-1菌株的粘附能力相似，表明粘附與EspA和EspB表達無關。雖然野生型RDEC-1的侵入能力比致腸道病大腸桿菌的侵入能力低大約90倍，但是在突變株EspA-，EspB-和EspA-/EspB-中，這種能力將進一步降低。然而，回復突變株AAF002和AAF003的侵入能力恢復了，這些結果表明，RDEC-1的侵入能力取決于EspA和EspB。
為了測定致腸道病大腸桿菌EspA和EspB對RDEC-1突變株的互補能力，將含有致腸道病大腸桿菌espA和espB基因的各種質粒導入了RDEC-1突變株，與野生型RDEC-1菌株進行了侵入效率的比較。有趣的是，攜帶有pMWespAB的AAF001ΔAB(RDEC-1 EspA-/EspB-)(EPECEspA+/EspB+)其侵入水平比野生型RDEC-1高4倍，盡管AAF001ΔAB株分泌致腸道病大腸桿菌EspA和EspB的量比在RDEC-1正常見到的更低。因此，在RDEC-1和致腸道病大腸桿菌株之間見到的對HeLa細胞的不同侵入水平，可歸因于Esp蛋白，在這種組織培養模型中，致腸道病大腸桿菌的EspA和EspB介導侵入作用更有效。同源性比較表明，在RDEC-1和致腸道病大腸桿菌中EspA是高度保守性的，但是EspB是較異質性的，表明RDEC-1和致腸道病大腸桿菌之間侵入能力的差異可能是由于EspB蛋白。有趣的是，致腸出血大腸桿菌0157粘附于，但不侵入進入人回盲腸(HCT-8)上皮細胞。RDEC-1的EspB與致腸出血大腸桿菌的EspB，而不是致腸道病大腸桿菌的更相似，這可能更突出了EspB在侵入中的作用。這些發現有力地證明，Esp的異質性影響致腸道病大腸桿菌，RDEC-1和致腸出血大腸桿菌的侵入能力。
EspD突變也影響EspA和EspB分泌，致腸道病大腸桿菌含有一個開放讀框，espD，位于espA和espB之間。為了證實espD產物在分泌中的作用，構建了編碼致腸道病大腸桿菌espA,ΔespD(在BglⅡ位點的移碼突變)，和espD的質粒pMWespD，并被導入進RDEC-1雙突變株AAF001AAB。致腸道病大腸桿菌EspA和EspB分泌蛋白的量，在AAF001AAB〔pMWespD〕中比在AAF001AAB〔pMWespAB〕中低，后者含有編碼完整致腸道病大腸桿菌espA,espD和espB基因的片段。并且侵入能力也降低了。這些結果表明，破壞espD會影響致腸道病大腸桿菌EspA和EspB蛋白的分泌。在此實施例中，我們發現，espA和/或espB突變也減少了其它分泌蛋白的量，這可能是由于它們的截短產物所致。與espA或espB突變株相比較，espA和espB雙突變株的分泌水平更加降低了。因此，被截短的致腸道病大腸桿菌EspD由于干擾Ⅲ型分泌系統，可能影響AAF001AAB〔pMW6espD〕中EspA和EspB的分泌。是否EspD直接與此分泌系統有關尚不清楚。
致腸道病大腸桿菌和RDEC-1分泌蛋白受溫度的密切控制，此溫度與它們相關的宿主體溫相對應。溫度可調節致腸道病大腸桿菌和致腸出血大腸桿菌413/89-1分泌蛋白的表達。而溫度從20℃提高至37℃，對EspB的表達大大增加。因為EspA和EspB蛋白受適當的宿主體溫調節，可將野生型致腸道病大腸桿菌和RDEC-1株接種在DMEM中，在不同的溫度下培育之后制取分泌蛋白，然后通過SDS-PAEG分析。致腸道病大腸桿菌分泌蛋白的表達在33℃就明顯可見，36℃達到最大分泌水平。39℃表達降低了，42℃未見有分泌蛋白。與此不同，RDEC-1分泌蛋白的最大表達在39℃，在42℃這些蛋白仍然被表達。這些結果表明，在致腸道病大腸桿菌和RDEC-1中，Esp蛋白的最大表達是由它們相關宿主的體溫人(37℃)和兔(39℃)激發的。
結論是，激發宿主信號傳導路徑和侵入作用需要這二種蛋白。用致腸道病大腸桿菌esp基因所作的互補實驗揭示，由RDEC-1和致腸道病大腸桿菌激發的宿主信號傳導事件，看來是由相同的分泌蛋白介導的。最后，RDEC-1和致腸道病大腸桿菌分泌蛋白的最佳表達，與它們天然宿主的體溫相關聯。這可以解釋它們嚴格的宿主特異性，以及兔和其它動物不感染致腸道病大腸桿菌的原因。用RDEC-1 espA和espB株進行的動物感染研究，將提供有關這些分泌蛋白對毒力作用的信息，并且可能對疫苗研究有用。
實施例8二種兔致腸道病大腸桿菌(RDEC-1)分泌蛋白EspA和EspB是毒力因子本實施例的目的是證明EspA和EspB蛋白在致病機理中的作用。為了研究這些蛋白在毒力中的作用，在兔致腸道病大腸桿菌菌株RDEC-1的espA和espB中構建了突變。
通過口腔胃途徑對幼年兔接種RDEC-1和其espA和espB突變株。感染1周后發現，絕大多數RDEC-1在盲腸和結腸中。但是，在這些組織中二個突變株的數量大大少于其親本菌株。在盲腸中還觀察到RDEC-1特異性地粘附于圓形小囊(囊泡相關上皮)，盲腸中也可見細菌定居，表明盲腸的圓形小囊是此病原菌的重要定居位置。EspA-和EspB-株對圓形小囊的粘附水平比親本株小70和8000倍。這些結果表明，RDEC-1的粘附能力和組織趨向性取決于這二種Esp分泌蛋白。而且，對細菌的定居作用和致病機理，EspB比EspA似乎有更重要的作用。這首次證明，與激發宿主細胞信號傳導路徑有關的致腸道病大腸桿菌分泌蛋白EspA和EspB，也是其定居和毒力所需要的。
按如下對動物進行感染離心收集培養過夜的細菌，重新懸浮于1ml磷酸緩沖鹽水中。使New Zealanl白兔(體重1.0-1.6kg)禁食過夜，然后用口腔胃管向胃內接種5ml無菌的2.5％碳酸氫鈉和1ml RDEC-1或者espA或espB菌株(2.5×1010)。第二天對每只兔再接種同樣劑量的細菌。
按如下進行臨床評定對每只兔每天稱體重，通過直腸棉拭子，并從糞球中收集糞便排出的細菌。將直腸棉拭子在含有萘啶酮酸的Mac Conkey培養板上滾動其一半表面。從每只兔收集5個糞球或相同量的液體糞便，懸浮于3ml磷酸緩中鹽水中，每個糞便懸浮液取0.1ml在含有萘啶酮酸的MacConkey板上作平板培養。按如下對萘啶酮酸抗性菌落的生長情況評分0，無生長；1，有稀疏的菌落；2，有致密的菌落；3，有匯合生長的菌落。
按如下進行組織取樣和制備在通過靜脈注射氯氨酮和超劑量戊巴比妥鈉給藥殺死動物之后，立即切取組織。
按如下測定腸組織內細菌集群的數量取除去盲腸的腸段(10cm)，在其近端和遠端作雙結扎，在雙結扎的部分之間切開腸段，然后用10ml冰冷的磷酸緩沖鹽水沖洗。取1g粘稠的盲腸內含物，加到9ml磷酸緩沖鹽水中。將形成的磷酸緩沖鹽水懸液稀釋，并在含有萘啶酮酸的MacConkeg板上作平板培養。
按如下測定粘附于腸組織的細菌數量用9mm直徑的軟木塞打孔器切取組織樣品，以磷酸緩沖鹽水洗3次，放入2ml冰冷的磷酸緩沖鹽水中，并用勻漿器作勻漿，然后將系列稀釋的樣品在MacConkey板上作平板培養。按如下計算粘附在每平方厘米組織上的細菌數量CFU/cm2=每塊板上的細菌數目×稀釋倍數×2ml/～0.452。
實施例9建立篩選細菌Ⅲ型分泌作用抑制劑的測定法本實施例的目的是提供一種用于篩選細菌Ⅲ型分泌作用抑制劑的測定方法。
將編碼EspA多肽的多核苷酸與幾種熟知的分子，包括HSV標志融合。從致腸道病大腸桿菌仍然可分泌基因融合物。一種質粒含有編碼EspA(介導Ⅲ型分泌作用所需要的)氨基末端部分的espA基因區，它已融合于編碼標志序列的單純皰疹病毒(HSV)序列，針對標志序列的抗體可以購得。將此質粒轉化進入一個菌株，此菌株含有espA突變，但仍然分泌使用Ⅲ型分泌系統的其它致腸道病大腸桿菌分泌的蛋白質。收集含有這些融合蛋白的上清液，對ELISA檢測板加樣，進行標準的ELISA測定。比色計讀數指示分泌了融合蛋白。
此質粒還被轉化進入缺乏Ⅲ型分泌的菌株(即陰性對照)。當此融合蛋白在這株細菌中被表達時，此融合蛋白被表達而不被分泌。以此突變株作的ELISA測定結果證實它沒有被分泌。
因此，提供了一種方便的，用于檢查分泌的ELLSA測定法。此檢測法簡便，不需要特殊的技術。此方法也是經濟的，因為不需要昂貴的試劑。此方法是自動化的，可用于篩選鑒別細菌Ⅲ型分泌作用抑制劑的試劑。
為了測定分泌作用，使細菌在存在待測化合物的組織培養液中靜止培養過夜。這些條件可引發出致腸道病大腸桿菌介導的分泌。第二天通過離心除去細菌，將此上清液置于96孔微量滴定板中。對此上清液進行標準的ELLSA測定。如果此待測化合物是殺菌的，此細菌不能生長過夜。
將編碼致腸道病大腸桿菌分泌的另一個多肽的多核苷酸與幾個熟知的分子融合。將編碼EspB多肽的多核苷酸融合于HSV標志，對此tag序列的抗體可購得。致腸道病大腸桿菌仍然可分泌基因融合產物。將此質粒轉化進入一個菌株，此菌株含有espA突變，并仍然分泌使用Ⅲ型分泌系統的其它致腸道病大腸桿菌分泌蛋白。收集含有這些融合物的細菌上清液，對ELISA檢測板加樣，用例如抗-HSV抗體進行標準的ELISA測定。這種篩選法可用于測定來自有醫療作用植物的提取物。1/200-1/1000的稀釋度(約250μg/ml)是適當的。對有希望的化合物可按此ELISA分泌測定法重復篩選，以便檢查其再現性。
雖然已使用現有的優選實施方案作參考對本發明進行了描述，但是應該認識到，各種修改形式要按照本發明的精髓才能實現。因此，本發明只通過下列權利要求加以限定。
權利要求
1．一種分離的EspA多肽，其特征是a)是一種來自致腸道病大腸桿菌或致腸出血大腸桿菌的分泌性蛋白；以及b)包含如在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
2．一種編碼權利要求1多肽的分離的多核苷酸。
3．一種選自如下的分離的多核苷酸a)SEQ ID NO:1中列出的核酸序列；b)SEQ ID NO:1中列出的核酸序列，其中的T變為U；c)與a)互補的核酸序列，以及d)a),b)或c)的片段，其長度為至少15個核苷酸堿基，并可在嚴緊條件下與編碼SEQ ID NO:2中列出的多肽的DNA雜交。
4．一種選自如下的分離的多核苷酸a)SEQ ID NO:3中列出的核酸序列；b)SEQ ID NO:3中列出的核酸序列，其中的T變為U；c)與a)互補的核酸序列，以及d)a),b)或c)的片段，其長度為至少15個核苷酸堿基，并可在嚴緊條件下與編碼SEQ ID NO:4中列出的多肽的DNA雜交。
5．一種含有權利要求2多核苷酸的載體。
6．一種含有權利要求5載體的宿主細胞。
7．一種與權利要求1多肽結合的抗-EspA抗體。
8．權利要求7的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。
9．權利要求7的抗體，其中該抗體是多克隆抗體。
10．一種檢測樣品中EspA多肽的方法，包括a)使樣品與權利要求7的抗體接觸；和b)檢測權利要求7的抗體與EspA多肽的結合，其中此結合是樣品中存在EspA多肽的指示。
11．權利要求10的方法，其中的樣品是組織。
12．權利要求10的方法，其中的樣品是生物液體。
13．權利要求10的方法，其中樣品中存在EspA多肽是被致腸道病大腸桿菌感染的指示。
14．權利要求10的方法，其中樣品中存在EspA多肽是被致腸出血大腸桿菌感染的指示。
15．一種免疫宿主的方法，此宿主對由產生EspA的大腸桿菌引起的疾病敏感，該方法包括a)對該宿主給予權利要求1的EspA多肽；和b)誘發宿主對EspA的保護性免疫反應。
16．權利要求15的方法，其中產生EspA的微生物是大腸桿菌。
17．權利要求16的方法，其中產生EspA的大腸桿菌是致腸道病大腸桿菌。
18．權利要求16的方法，其中產生EspA的大腸桿菌是致腸出血大腸桿菌。
19．一種緩解由產生EspA的微生物引起的疾病的方法，包括a)以權利要求1的多肽免疫宿主；和b)誘發宿主對EspA多肽的免疫應答，從而緩解由產生EspA的微生物感染宿主引起的疾病。
20．權利要求19的方法，其中產生EspA的微生物是大腸桿菌。
21．權利要求19的方法，其中產生EspA的大腸桿菌是致腸道病大腸桿菌。
22．權利要求19的方法，其中產生EspA的大腸桿菌是致腸出血大腸桿菌。
23．一種檢測樣品中espA多核苷酸的方法，包括a)使懷疑含有espA多核苷酸的樣品與能同權利要求2的espA多核苷酸雜交的核酸探針接觸；和b)檢測該探針與espA多核苷酸的雜交作用，其中此雜交作用的檢出是樣品中存在espA多核苷酸的指示。
24．一種用于產生espA多核苷酸的重組方法，包括將編碼選擇性標記的核酸插入權利要求2的多核苷酸，使形成的多核苷酸編碼含有選擇性標記的重組EspA多肽。
25．一種通過權利要求24的方法產生的多核苷酸。
26．一種含有權利要求25的多核苷酸的宿主細胞。
27．一種用于產生EspA多肽的重組方法，包括a)使含有編碼權利要求1EspA多肽的多核苷酸的宿主細胞，在允許其表達和分泌EspA多肽的條件下培養生長；和b)分離此多肽。
28．一種鑒別抑制細菌Ⅲ型分泌系統的化合物的方法，包括a)將權利要求25的多核苷酸導入具有細菌Ⅲ型分泌系統的細菌；b)使該細菌在允許細菌生長并分泌由此多核苷酸編碼的多肽的條件下培養生長；c)使懷疑能抑制細菌Ⅲ型分泌系統的化合物與該細菌接觸；d)誘發對該多肽的表達；和e)檢測該多肽的分泌，其中缺乏分泌作用是對細菌Ⅲ型分泌系統有抑制作用的指示。
29．一種用于產生非致病性微生物的方法，包括a)在編碼權利要求1的EspA多肽的多核苷酸中產生突變；b)將編碼選擇性標記的核酸序列插入此突變位點；c)將步驟b)中突變的espA多核苷酸導入微生物的染色體espA基因，以便在染色體espA基因中產生突變；以及d)選出具有該突變的微生物。
30．權利要求29的方法，其中編碼選擇性標記的核酸序列編碼對卡那霉素的抗性。
31．權利要求29的方法，其中的微生物是大腸桿菌。
32．一種通過權利要求29方法產生的，具有突變espA基因的微生物。
33．一種用于檢測權利要求1 EspA多肽的試劑盒，包括被分隔可容納一個或多個緊密封裝容器的裝載工具，所述容器包括一個裝有能與EspA多肽結合的抗體的容器。
34．權利要求33的試劑盒，其中的抗體是可檢測標記的。
35．權利要求34的試劑盒，其中的標記是選自放射性同位素，生物發光化合物，化學發光化合物，熒光化合物，金屬螯合劑，以及酶。
36．一種用于檢測權利要求2 espA多核苷酸的試劑盒，包括被分隔可容納一個或多個緊密封裝容器的裝載工具，所述容器包括一個裝有能與espA多核苷酸雜交的核酸探針的容器。
37．一種通過權利要求34方法產生的，具有突變espA基因的微生物。
38．一種用于檢測EspA多肽的試劑盒，包括被分隔可容納一個或多個緊密封裝容器的裝載工具，所述容器包括一個裝有能與EspA多肽結合的抗體的容器。
39．權利要求38的試劑盒，其中的抗體是可檢測標記的。
40．權利要求39的試劑盒，其中的標記是選自放射性同位素，生物發光化合物，化學發光化合物，熒光化合物，金屬螯合劑，以及酶。
41．一種用于檢測espA多核苷酸的試劑盒，包括被分隔可容納一個或多個緊密封裝容器的裝載工具，所述容器包括一個裝有能與espA多核苷酸雜交的核酸探針的容器。
42．權利要求41的試劑盒，其中的探針是可檢測標記的。
43．權利要求42的試劑盒，其中的標記是選自放射性同位素，生物發光化合物，化學發光化合物，熒光化合物，金屬螯合劑，以及酶。
44．一種產生EspA融合蛋白的方法，包括a)使宿主細胞在允許其表達和分泌融合蛋白的條件下生長，此宿主細胞含有編碼EspA的多核苷酸，此多核苷酸可操作地連接于編碼所研究多肽或肽的多核苷酸；和b)分離出此融合蛋白。
全文摘要
本發明提供了一種EspA多肽,它是由致病性大腸桿菌如致腸道病大腸桿菌(EPEC)和致腸出血大腸桿菌(EHEC)分泌的。對于由這種致病大腸桿菌引起的疾病可借助于標準的技術進行診斷,如那些基于用能與EspA結合的抗體檢測此蛋白質的技術,以及那些基于用核酸探針檢測編碼EspA蛋白的核酸的技術。本發明還提供了編碼EspA的分離的核酸序列,EspA多肽,EspA肽,一種用于產生重組EspA的方法,能與EspA結合的抗體,以及一種用于檢測產生EspA的大腸桿菌的試劑盒。本發明還提供了一種以EspA免疫宿主,以便誘發對EspA保護性免疫應答的方法。
文檔編號C12N15/62GK1222937SQ97195690
公開日1999年7月14日 申請日期1997年4月23日 優先權日1997年4月23日
發明者B·B·芬萊, M·斯泰恩, B·肯奈 申請人:不列顛哥倫比亞大學