專利名稱：用于高溫氧化的嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及合成甲烷單加氧酶的嗜熱細菌(甲胺氮營養(yǎng)菌)有機體的共生體。該共生體在甲烷存在時形成并在高于50℃的溫度下起作用。該有機體的共生體可用于降解有機污染物并用于化學物質(zhì)，尤其是立體專一性異構(gòu)體的合成。
背景技術(shù)：
稱為甲胺氮營養(yǎng)菌的厭氧微生物群體已用來降解有機污染物。該有機體群體合成單加氧酶，能氧化甲烷，并且在此酶合成后無甲烷時，該酶將隨機氧化其它化合物，如鹵化的碳氫化合物，烴類，醇類等。
由使用甲胺氮營養(yǎng)菌的共代謝降解的多個優(yōu)勢污染物之一是三氯乙烯(TCE)，三氯乙烯是在金屬加工，干洗和鍍膜工業(yè)中廣泛使用的有機溶劑。由于泄漏，溢出和排出，常常在地下土壤環(huán)境中發(fā)現(xiàn)TCE。TCE也是在危險廢物處最常見的污染物之一。TCE和其他氯化碳氫化合物是地下水中常見的污染物。大多數(shù)治理土壤和含水層的污染的嘗試涉及使用泵或真空裝置以將污染物運到表面處理。這些方法的結(jié)果是有限地去除污染物。現(xiàn)有技術(shù)的實際應(yīng)用非常昂貴而且一般沒有操作的終點。當實際應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)的治理方法時，涉及水電導(dǎo)率，土塊，解吸附作用和殘余物飽和或污染物貯存的限制存在真正的問題。
由Casagrande發(fā)展的電動方法已用于使土壤脫水。這個方法也用于從土壤和含水層去除污染物。這個方法利用直流電(直流電場)引發(fā)水的移動并使離子溶解作為轉(zhuǎn)運污染物的方法。這種方法僅僅在污染物適當溶于水時有效(例如苯，甲苯，二甲苯，酚和氯化溶劑)。而且，電動方法的結(jié)果是污染物的轉(zhuǎn)運，而不是降解。因此在土壤中的電動應(yīng)用僅僅提供對土壤和水污染問題不完全的解決方法。H。運用電動方法使用裝有顆粒狀活性碳(GAC)的盒子移動并俘獲對-硝基苯酚(PNP)。然而，涉及除去和處理污染的盒子的問題仍未解決。
發(fā)明概述本發(fā)明是培養(yǎng)基中嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌有機體的共生體，包括在50℃到80℃溫度下該共生體的繁殖，上述共生體主要包括卵圓形或桿狀有機體。此共生體可以注入到土壤或水中以降解污染物，尤其碳氫化合物和取代的碳氫化合物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供嗜熱甲胺氨營養(yǎng)菌的共生體，此共生體用于降解污染物，尤其是土壤和地下水中發(fā)現(xiàn)的污染物。共生體將在超過50℃的溫度下生長并使污染物代謝。本發(fā)明的共生體可以與電動方法一起使用以減輕環(huán)境污染，尤其地下水和土壤的污染。使用水力傳送方法如電動力學將污染物收集到含共生體的處理區(qū)域(remediation zone,RZ)。共生體已在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(在Rockville,Maryland,U.S.A)保存，并得到ATCC號55945。
本發(fā)明的共生體也可以在現(xiàn)有技術(shù)的工業(yè)發(fā)酵過程中使用。這些過程包括將含纖維素的物質(zhì)搗成漿狀并再利用以生產(chǎn)中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物，如醇類，其改進是工序可以在更高的溫度下進行。這也包括從烴類生產(chǎn)醇類及形成環(huán)氧化物和有用中間產(chǎn)物。本發(fā)明的共生體也可用于降解醇類，如甲醇。材料和方法嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌共生體的形成嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌共生體從在黃石國家公園收集的土壤和水樣品中得到。從中得到共生體的樣品最初來自藝術(shù)家繪畫作品匯集區(qū)(ArtistPaint Port area)和方解石泉(the Calcite Springs)。方解石泉是公園中僅有的兩個天然油泉之一，并與溫泉相連。取樣區(qū)域的溫度在46℃到78℃的范圍內(nèi)變動。樣品通過郵件隔夜運到實驗室。
5g樣品放入60ml血清小瓶中，并在其中加入20ml改進的硝酸礦物鹽(MNMS)培養(yǎng)基[Bowman和Sayler，生物降解51-11(1994)]。改進的MNMS培養(yǎng)基在1升去離子水中含有2mM NaNO3,2mM磷酸緩沖液pH(6.8),50μM FeCl3·6H2O,50μM MgSO4·7H2O,10μg/LD型生物素和0.5μg/L維生素B12。小瓶用TEFLONTM線型連續(xù)瓶塞密封。排空小瓶內(nèi)氣體，加入含3％甲烷的氣體，在50℃,60℃,70℃或80℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。(溫度的選擇以采集時原始樣品的溫度為基礎(chǔ)。)在培養(yǎng)期間，在空氣/培養(yǎng)基接觸面形成菌膜。培養(yǎng)后，收獲菌膜。收獲的菌膜結(jié)合在一起以提供單一的共生體。
負染后，用透射電鏡(TEM)拍攝共生體。共生體培養(yǎng)物在55℃生長，150rpm混合。旋轉(zhuǎn)離心后，將在離心管中得到的細胞放置于噴碳銅網(wǎng)上，然后用2％磷鎢酸染色。然后觀察細胞并用Jeol 1200 EXⅡTEM以20，000×到50,000×的放大倍數(shù)拍攝。大部分細胞看起來很小并呈卵圓形或桿狀。在很多細胞中可看到內(nèi)膜圓盤。這樣的結(jié)構(gòu)是Ⅱ型甲胺氮營養(yǎng)菌的典型結(jié)構(gòu)。
甲胺氮營養(yǎng)菌一般是生長緩慢的有機體。這些嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌生長非常緩慢。正如所測試的，需雙倍時間，在最適條件下在20到30天之間變動。在60°-70℃觀察到的生長比50°或80℃更好(以前描述甲胺氮營養(yǎng)營僅在最高45℃的溫度下生長。)因此，共生體表現(xiàn)了在真正嗜熱溫度下生長的獨特能力。然而，在70℃和80℃下，萘酚的產(chǎn)率(暗示了TCE降解)低得多。也發(fā)現(xiàn)，正如以下在實施例中描述的，加入新鮮培養(yǎng)基恢復(fù)舊培養(yǎng)物的可溶甲烷單加氧酶活性(sMMO)。這個發(fā)現(xiàn)暗示培養(yǎng)基的缺乏和抑制產(chǎn)物隨著時間產(chǎn)生。
實施例進行一些研究以確定共生體對于TCE降解和可溶甲烷單加氧酶活性(sMMO)的最適生長溫度。共生體在裝有300ml改進MNMS培養(yǎng)基的1升帶側(cè)壁的培養(yǎng)瓶中生長。培養(yǎng)瓶密封并排空氣體。每天向培養(yǎng)物供應(yīng)合3％甲烷的氣體。培養(yǎng)物在50℃,60℃,70℃和80℃的幾種不同溫度水浴中靜置培養(yǎng)。定期地進行培養(yǎng)物取樣。樣品在培養(yǎng)箱中冷卻到24℃之后，培養(yǎng)物的生長情況用600nm分光光度法測定。為測定TCE降解率，根據(jù)在Bowman和Saylar[生物降解5:1-11(1994)]中描述的一般方法測定萘酚的產(chǎn)率，除了試驗是在與其生長相同的溫度水浴中靜置進行。嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌共生體降解TCE在嗜熱溫度下TCE的降解使用培養(yǎng)物進行，培養(yǎng)物在來自NewBrunswick Scientific公司，New Brunswich,New Jersey的培養(yǎng)箱/搖床上生長。培養(yǎng)物于55℃和150rpms生長。用壓縮氣排除培養(yǎng)物的氣體之后，將5ml培養(yǎng)物加入到15個60ml血清小瓶中。作為對照，將5ml無菌MNMS加入60ml血清小瓶中。每個小瓶加入TCE溶液以使血清小瓶中TCE終濃度到大約0.5μg/l。將小瓶倒置，并放回培養(yǎng)箱/搖床。培養(yǎng)5天后，測定并比較TCE濃度。MNMS和L培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物的耐熱生長和萘酚的產(chǎn)生培養(yǎng)物按如上所述準備，除了一部分樣品含L培養(yǎng)基，L培養(yǎng)基包含2g/l NaNO3,0.2g/ml MgSO4·7H2O,0.001g/l FeSO4·7H2O,0.21g/lMa2PO4,0.09g/l NaH2PO4,0.04g/l KCl,0.015g/l CaCl2和1ml貯備液，在每0.1升貯備液中包含0.5mg CuSO4·5H2O,1mg H3BO3,1mgMnSO4·7H2O,7mg ZnSO4·7H2O和1mg MoO3。培養(yǎng)物于55℃,150rpm在培養(yǎng)箱/搖床中搖瓶生長。生長情況和1-萘酚的產(chǎn)生如上所述測定。產(chǎn)生萘酚的測試在55℃同樣搖床上進行。
作為測試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對于TCE降解(從sMMO活性數(shù)據(jù)表明)的最適溫度看來在50℃和60℃之間。既然使用靜置生長培養(yǎng)物得到了嗜熱共生體的結(jié)果，那么積極混合的含共生體的培養(yǎng)物也在55℃生長并同樣得到測定。比較在L和MNMS培養(yǎng)液中生長的嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌共生體培養(yǎng)物的生長情況和sMMO活性。發(fā)現(xiàn)嗜熱共生體在MNMS中比在L培養(yǎng)基中生長得更好。如果比較快速混合和靜置生長下的生長率，靜置生長的生長率看來是混合的幾乎兩倍。因為甲烷和氧氣在水環(huán)境中溶解度低，快速混合可能增加這些氣體在培養(yǎng)基中的保留時間。
在兩種培養(yǎng)基中生長的細胞也表現(xiàn)了非常不同的sMMO活性。當細胞在L培養(yǎng)液中生長時，沒有活性。L培養(yǎng)液中含有銅，缺少活性可能是由于培養(yǎng)液中的銅的抑制活性(典型的Ⅱ型甲胺氮營養(yǎng)菌已知是銅敏感的。)無甲烷加入時萘酚的產(chǎn)率在停止加入甲烷后，測定上面使用的培養(yǎng)物的可溶甲烷單加氧酶活性(sMMO)的穩(wěn)定性。將培養(yǎng)物排空氣體，培養(yǎng)瓶密封并放回到培養(yǎng)箱/搖床中，但不加入甲烷。每天根據(jù)以上所述測定sMMO活性。觀察到sMMO活性增加兩天，隨后如果不加甲烷則下降。因此，如果在治理區(qū)域使用此共生體，兩天后通過加入甲烷置換或復(fù)原是有益的。復(fù)原可以通過在合適間隔時間向RZ注入甲烷進行。(當在發(fā)酵過程中使用共生體，如果甲烷不是此過程的產(chǎn)物，應(yīng)考慮加入甲烷。然而，因為一些工業(yè)發(fā)酵過程導(dǎo)致甲烷產(chǎn)生，所以不需要加入甲烷。)當其生體細胞固定在ISOLITETM時共生體的sMMO活性sMMO活性率的研究使用固定在ISOLITETM上的共生體細胞完成，ISOLITETM是用于固定細胞和土壤通氣的硅藻土產(chǎn)品(78％SiO2,12％Al2O3和5％Fe2O3)。這是一種不吸附TCE的惰性材料。ISOLITETM預(yù)先在去離子水中洗滌去除臟物，然后在120℃烤箱中烘干48小時。300ml MNMS培養(yǎng)液中的20天的共生體樣品加入到培養(yǎng)瓶中150g ISOLITETM上。培養(yǎng)瓶放置到培養(yǎng)箱/搖床(20rpm,55℃)上兩周以使細胞結(jié)合到ISOLITETM上。然后從ISOLITETM上去除水相。然后1g接種材料在測量從萘產(chǎn)生萘酚的試驗中使用。
當使用接種的ISOLITETM時，在sMMO測試中，發(fā)現(xiàn)固定的共生體細胞以10μm/小時/g ISOLITMTM的速率從萘產(chǎn)生萘酚。上述表明這些固定細胞可以用于在土壤中降解TCE。ISOLITETM不吸附TCE并且不俘獲TCE。因此，如果在RZ中使用ISOLITETM，可以簡單地通過改變受到治理的物質(zhì)中放置的電極極性將TCE送回并通過RZ直到生物降解。
在存在TCE時，使用培養(yǎng)物的早期生長狀態(tài)檢測使用嗜熱共生體的TCE降解。此培養(yǎng)物在55℃,150rpm搖瓶生長。實驗對照僅裝有MNMS培養(yǎng)基并加入TCE。在55℃溫育5天后，TCE濃度的測量結(jié)果表明在有嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌的小瓶中TCE顯著降解。對照平均有0.47μg/lTCE，處理的小瓶平均為0.03μg/l。結(jié)果是，TCE濃度出現(xiàn)94％的減少。使用方差檢定的一元分析結(jié)果表明，嗜熱菌降解與對照的明顯差異在0.05α水平。
本發(fā)明的共生體也可以在生物過濾器中使用以降解工業(yè)廢物，包括液體和揮發(fā)性廢物。
如此處說明的，共生體產(chǎn)生單加氧酶。而且，通過現(xiàn)有技術(shù)的方法，可能從共生體得到其他細胞酶，包括蛋白水解酶，DNA聚合酶，脂肪酶，纖維素酶，等。
權(quán)利要求
1．甲胺氮營養(yǎng)菌的共生體，此共生體在50℃到80℃表現(xiàn)最適生長，而且在甲烷存在的情況下生長后降解三氯乙烯和萘。
2．權(quán)利要求1的共生體，在經(jīng)過發(fā)酵的組合物中。
3．權(quán)利要求1的共生體，在治理區(qū)域(Remediation Zone)內(nèi)。
4．權(quán)利要求1的共生體，在生物過濾器中。
5．權(quán)利要求1的共生體，在含甲烷的培養(yǎng)基中。
6．降解污染物的方法包括以下步驟1)制備權(quán)利要求1的組合物，2)將權(quán)利要求1的組合物加入到含環(huán)境污染物的混合物中，3)將在步驟2中得到的混合物在至少50℃的溫度下生長以降解污染物。
7．權(quán)利要求6的方法，其中包含污染物的混合物在治理區(qū)域內(nèi)。
8．權(quán)利要求7的方法，其中將甲烷加入治理區(qū)域以促進生長。
9．權(quán)利要求1的共生體，其中最適生長在50℃和60℃之間得到。
10．在生長培養(yǎng)基中包含權(quán)利要求1的共生體的物質(zhì)組合物。
11．權(quán)利要求10的組合物，其中生長培養(yǎng)基含有甲烷。
12．權(quán)利要求11的組合物，其中存在于培養(yǎng)基中的甲烷濃度是大約3％。
13．通過將要氧化的化合物暴露于權(quán)利要求1的共生體進行高溫(高于50℃)氧化的方法。
14．權(quán)利要求13的方法，其中氧化的化合物是烴類，醇類或鹵化物。
15．通過培養(yǎng)權(quán)利要求1的共生體生產(chǎn)酶的方法。
16．權(quán)利要求15的方法，其中生產(chǎn)的酶至少是蛋白水解酶，DNA聚合酶，脂肪酶，纖維素酶之中的一種。
17．權(quán)利要求15的方法，其中生產(chǎn)的酶是單加氧酶。
全文摘要
本發(fā)明是培養(yǎng)基中嗜熱甲胺氮營養(yǎng)菌有機體的共生體,包括在50℃到80℃的溫度下該共生體的繁殖,上述共生體主要包括卵圓形或桿狀有機體。此共生體可以注入到土壤或水中以降解污染物,尤其碳氫化合物和取代的碳氫化合物。
文檔編號C12N9/00GK1219920SQ97194899
公開日1999年6月16日 申請日期1997年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月26日
發(fā)明者S·J·威斯帕, W·J·戴維斯－霍夫爾 申請人:美國環(huán)境保護署