真核生物中基因表達的調節的制作方法

專利名稱：真核生物中基因表達的調節的制作方法
技術領域：
本發明涉及真核生物中基因表達的調節方法。
本發明特別而不是唯獨應用于靶器官中高度特異性表達的調節或者植物功能的調節，所以為了闡述起見將參考這類應用。然而，應懂得，本發明可用于其它用途，例如其它真核基因表達的調節如靶器官中特異性表達的調節以及酵母和動物的功能調節。
包括植物、動物和低級有機體如酵母的商業上有益的真核有機體經常轉換生長源成為非商品化結構，或者表達經濟有害的其它基因。引入增強商用價值的特性將有益于其它商品化種。
例如，林區樹繁殖結構的發育代表樹源的一個重要負擔，該繁殖成果有損樹林生長。成熟樹木的種子產生下木苗，必須定期除去下木苗以免它們與樹木競爭土壤資源并將森林火災的危險性減到最小。
澳大利亞專利說明書No.86224/91公開了在林場增強營養生長的方法。該公開例舉了一種方法，其中有關繁殖結構特異性基因的大致組織特異性啟動子的選擇基于開花調節劑赤霉素A4/7的誘導，該基因產物的早期出現、以及雄性和雌性再生芽中表達的特異性。分離并鑒定了該基因和啟動子，通過將包括該基因的組織特異性啟動子的一部分基因與RNA酶的結構基因融合而修飾該基因。
然而該轉化體卻缺乏繁殖結構，啟動子滲漏傾向于引起非靶組織中致死RNA酶積累量較低，導致生長減少于是減小商品化可能性。
通常將基因表達啟動子看作下列三大類之一在所有組織中連續表達基因的組成型啟動子；在特定組織或在特定階段的組織中表達基因的發育啟動子；響應代謝物、外源化合物或其它刺激因素如光、熱或壓力的存在而開啟或關閉表達的誘導型啟動子。
已知在大體上花組織特異性啟動子控制下致死基因產物如芽孢桿菌RNA酶(Barnase)的表達可通過該基因產物的抑制劑(B*或“芽孢桿菌RNA酶抑制劑(Barstar)”)的組成型共表達而變得更為組織特異性。當抑制作用不足以抑制基因產物的作用時靶細胞中就會出現被抑制基因產物的作用，以及該啟動子的非特異性的程度或者啟動子滲漏引起的非靶細胞芽孢桿菌RNA酶活性基本上被抑制了。
然而，插入的啟動子通常是易滲漏的，且較優的強啟動子可能在不充分的抑制以防非靶細胞死亡的其它組織中有害地表達，這將不利地影響商業上重要的非靶組織。啟動子滲漏不能預測，例如，若轉化體如樹首次開花前有一段長生長期，則非靶細胞中形成的基因產物活性將消除或減小開花抑制的優勢。通常優選的強啟動子限制啟動子選擇。
本發明旨在基本上減輕上述缺點的至少一個并提供應用中可靠且有效的、調節真核基因表達的方法。本發明的其它目的和優點將在下文中變得明了。
考慮前述和其它目的，本發明的一方面主要在于調節真核活性基因的方法，它包括用構建物轉化細胞，該構建物表達調節真核基因或其產物的調制基因產物以及調節所述調制基因或其產物的另一基因產物，所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩個的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。
該真核活性基因可以包括目的有機體的天然基因或者可以包括引入的基因。該基因可被它的天然啟動子啟動或者包括該基因的異源構建物。該真核活性基因可編碼任意選擇的細胞功能的表達產物。例如該基因可編碼包括酶的活性多肽，其中的酶例如有對靶組織有致死效果的RNA酶或者賦予根組織以線蟲抗性的過氧化物酶。該基因可編碼能使下列物質的產生途徑得以實現的產物顏料和染料如花青苷，殺蟲化合物如Bti毒素，或者香料。
在誘導型啟動子控制下報道基因的表達可顯示靶組織中靶細胞的準確位置而不會有任何至周圍細胞的滲漏。這將對于研究病原體和昆蟲與植物細胞之間相互作用的基本步驟很有用。GUS,Luc，花青苷基因和GFP可能包括報道基因的候選物。可在商品化之前對微量繁殖物質進行比色分析和熒光分析。
如本文應用的，“致死基因”這種表述表示編碼肽或反義或核酶或其它非肽的一個或多個基因，該致死基因所編碼的物質顯著地破壞靶細胞于是導致靶細胞死亡。本發明將在下文參照包括真核有效致死基因的實施方案來描述。
該致死基因可以是編碼肽或反義或核酶的任意基因或基因的組合，它們明顯地破壞靶細胞于是導致靶細胞死亡。例如，該致死基因可選自編碼下列酶的那些基因RNA酶如得自解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的芽孢桿菌RNA酶，得自A.aryzae的RNA酶T1，牛RNA酶A、得自大腸桿菌(E.coli)的RNA酶Ⅰ和RNA酶H以及植物RNA酶類(S蛋白系列)。備擇地，該致死基因可選自核酸酶如限制酶系列，包括下列酶的酶葡聚糖酶例如1-4-β-葡聚糖酶或1-3-葡聚糖酶，泛素，酸性焦磷酸酶以及植物細胞壁合成的抑制劑。
優選地，該致死基因是RNA酶。可構建嵌合致死基因，它包括在基因的上游(啟動子)序列控制下編碼解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶的區，其中所述基因是在發育早期植物繁殖器官的雄性和雌性部分中表達的。
在靶細胞中病原體-宿主植物最早的相互作用期間可實現靶細胞中致死基因表達的限制。例如，在受攻擊細胞內芽孢桿菌RNA酶或者其它毒素如β-葡聚糖酶或殼多糖酶的表達將導致這些細胞的壞死，這就會防止感染向周圍細胞擴散。該人工過敏性反應方案中的關鍵步驟是封阻周圍細胞中可能的啟動子滲漏。
細菌水楊酸鹽-羥基化物基因的表達可減小水楊酸的量，在所有植物中該水楊酸負責在病原體誘導的啟動子控制下盒的系統表達。例如，病原體誘導的啟動子可從大麥分離，它在用粉狀霉Eresifygraminis(Mouradov等，1993)接種后被強烈地表達。該基因的基因組克隆已被分離和鑒定(Mouradov等，1994)。該啟動子區可融合至包括致死基因或其它功能基因的盒。
與其它植物MADS-盒基因同源的、被稱為EGM1、3&2的三種桉樹基因已被克隆并測序。進行了系統發育分析以檢查該桉樹基因與其它MADS-盒基因的相關性。結果表明，EGM2可能與花瓣和雄蕊發育中涉及的GLOBOSA MADS-盒基因組是同源的而EGM3和EGM1二者都落入MADS-盒基因的AGL2組。這些基因最常在花內三種輪生體(花瓣、雄蕊和心皮)中表達。
已鑒定了所有三種EGM基因的表達模式。在任何營養組織中都沒有檢測到這些基因的表達。EGM1基因是在桉樹花的花瓣、雄蕊和心皮中表達的。EGM3是在花的分生組織和萼片中表達的。EGM2是在花瓣和雄蕊中表達的。已由Southern分析法證實EGM3基因和EGM2基因是單基因。EGM1也好象是單基因。
所有這三種基因的啟動子區都可用于不育性基因構建物，它們可從桉樹基因組文庫中分離并被人工改造為致死基因構建物。
該真核活性基因、調制基因和另外的基因及其各自的啟動子可包括轉化盒，應用該轉化盒可通過任意已知方法轉化靶有機體。結合選擇該真核活性基因、調制基因和另外的基因的啟動子使得該真核活性基因的表達特異性被提高。例如，真核活性基因可通過誘導型或發育型啟動子啟動，而調制基因則可是組成型的。于是，甚至弱啟動子的特異性和效用可通過運用與用于啟動真核活性基因的啟動子具有相同特異性的啟動子來啟動另外的基因而提高。
備擇地，真核活性基因的組織特異性啟動子可通過組成性啟動的抑制基因產物來抑制，它反過來受誘導性啟動的另外基因產物控制。
在又一備擇方面，真核活性基因產物可在調制基因的調制作用下、在組織特異性啟動子控制下被組成性表達，該調制基因或產物本身通過在不同組織或補充組織特異性的啟動子控制下另一基因的表達而控制。例如通過該方法，賦予昆蟲抗性的組成性啟動的基因可通過在種子特異性啟動子控制下表達基因抑制劑而集中它的效果排除種子，該基因抑制劑本身被在非種子組織特異性的啟動子控制下表達的另一基因產物控制。
本發明的另一方面主要在于調節真核活性基因表達的方法，它包括用轉化盒轉化細胞，該轉化盒包括所述真核活性基因，表達調節該真核基因或其產物的產物的調制基因，以及表達調節所述調制基因或其產物的產物的另一基因，所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩個的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。
本發明的另一方面主要在于轉化盒，該轉化盒包括真核活性基因，表達調節該真核基因或其產物的產物的調制基因，以及表達調節所述調制基因或其產物的產物的另一基因，所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩個的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。
本發明的又一方面主要在于用表達盒轉化繁殖性真核細胞的方法，該表達盒包括于靶組織中在所述靶組織的大致特異性啟動子的控制下表達細胞毒性肽的致死基因；組成性表達所述細胞毒性肽的生產或作用的抑制劑的調制基因；以及受所述大致特異性啟動子控制并起封阻所述抑制劑或調制基因的作用的另外基因。
本發明的又一方面主要在于表達盒，它包括表達對靶組織呈細胞毒性的肽的基因，它受所述靶組織的大致特異性誘導型啟動子的控制；表達所述細胞毒性肽的生產或作用的抑制劑的抑制基因；以及受所述誘導型啟動子控制并起封阻所述抑制劑或抑制基因的作用的阻抑基因。
本發明的又一方面涉及用于從解淀粉芽孢桿菌的提取物PCR分離芽孢桿菌RNA酶基因和芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的引物，這些引物被稱為P1和P2(芽孢桿菌RNA酶抑制劑的)以及P3和P4(芽孢桿菌RNA酶的)，包括P1 5′GCG AAT TCC GCA CAT GAA AAA AGC 3′EcoRⅠP2 5′GCA AGC TTA AGA AAG TAT GAT GGT G3′HindⅢP3 5′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′NcoⅠP4 5′ CGG GTA CCT TAT CTG ATT TTT GTA A3′KpnⅠ
致死基因表達產物的細胞毒性效果可通過將定位信號序列與構建物偶聯而增大。例如，優選的RNA酶的細胞毒性效果可通過定向入大多數前RNAs和成熟RNAs以未保護形式存在的核中而被增大。為此，例如芽孢桿菌RNA酶的編碼區可通過將核定位信號(NLS)序列與RNA酶基因融合而修飾。
因此，本發明的進一步方面提供了用于將得自根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)VirD2基因的NLS序列與芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因融合的一組PCR引物，它們包括P35′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′NcoⅠBD1 5′CCT TAC AAA AAT CAG AGT CCT TTC AAA GCG TCC G3′芽孢桿菌RNA酶的3′端VirD2的NLS的5′端BD2 5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC TCT GAT TTT TGT AAA G3′VirD2的NLS的5′端芽孢桿菌RNA酶的3′端D23 5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′KpnⅠ組織特異性啟動子或發育啟動子可選自在花的發育早期階段中控制植物繁殖器官內基因的那些組織特異性啟動子。這些基因在所有植物器官中在未開花期間被保持在阻抑狀態，而在開花期間基本上在繁殖器官中被誘導。
該發育啟動子可通過任何已知方法分離。例如，可鑒定和分離只在靶組織發育期間存在的mRNA，制備得自這些特定的mRNAs的cDNA并用于探測基因組文庫，接著鑒定含有這些基因的啟動子區的植物基因組部分。該組織特異性啟動子可以是同源的(天然的)或異源(外源)的。對于植物繁殖器官組織來說，該啟動子可選自雄性和雌性器官內不同花組織細胞中表達的那些，或者只在特定組織如萼片、花瓣、子房、花柱、柱頭、胚珠、花冠和其它組織中表達的那些。至于不育植物的生產，在雄性和雌性器官發育早期階段的組織中表達的啟動子是優選的。
例如，編碼那些在花的發育中起重要作用的同源異型MADS-盒基因的基因家族在花原基發育早期階段表述。我們已從輻射松(P.radiata)分離了MADS基因，它們表現出與被稱為AGAMOUS AGL-2和AGL-4基因的擬南芥屬(Arabidopsis)同源異型MADS-盒基因強烈的同源性。這些基因在未成熟花原基中表達而不是在花序分生組織中表達。
編碼致死基因產物的抑制劑的基因可包括阻抑該致死基因的表達的基因、轉錄反義RNA的基因，或者可包括表達能使致死蛋白質失活的蛋白質的基因。該抑制基因一般將受在非靶組織中表達該抑制劑的組成型啟動子的表達控制，不過預計可應用包裝的操縱基因-阻抑蛋白系統。
例如，可將芽孢桿菌RNA酶基因/瀪殖器官-組織特異性啟動子系統與抗-芽孢桿菌RNA酶(B*或芽孢桿菌RNA酶抑制劑)基因/啟動子系統聯合。
備擇地，大腸桿菌內噬菌體λN基因和SOS系統的表達中的負調節可被用于表達盒。該噬菌體λN基因的表達由PL啟動子緊密調節并控制從該啟動子表達的水平。可應用該系統來提供靶組織中抑制基因的表達所必需的負控制。
該SOS系統是由兩種蛋白質的相互作用調節的。轉錄阻抑蛋白(LexA)通過與它的操縱基因靶的特異性結合而抑制轉錄的起始。RecA蛋白封阻LexA蛋白，因而防止在其特定位點上的抑制。這會是單組分致死基因系統，所以不需毒素封阻基因。
可選擇處于誘導型啟動子控制下的阻抑基因來阻抑抑制基因的轉錄、RNA轉錄物的翻譯或其肽產物的作用。優選地，該阻抑基因編碼直接阻抑該抑制基因的表達的肽產物。因此，優選地該阻抑基因和抑制基因應適合形成特定的阻抑蛋白/操縱基因偶聯物。例如，受與該致死基因構建物相同的組織特異性啟動子控制的大腸桿菌laclq基因可用于阻抑通過插入lac操縱基因序列而修飾的阻抑基因啟動子的作用。
該阻抑基因啟動子可以是修飾的35S-RNA-CaMV啟動子，它至少具有一個位于該啟動子和該阻抑基因的編碼區之間的lac操縱基因。在下文例舉的修飾了的35S-RNA-CaMV啟動子的選擇中，本發明人開發了用于擴增該修飾了的35S-RNA-CaMV序列的引物。
因此，本發明的進一步方面提供了用于PCR擴增修飾了的35S-RNA-CaMV序列、被稱為35S1和35S2的引物，該引物包括35S1 5′ GCC TCG AGC ATG GTG GAG CAC GAC AC3′XhoⅠ35S2 5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′SalⅠ至于將lac操縱基因引入修飾了的35S-RNA-CaMV啟動子的3′區和5′區，該序列可由如下PCR引物擴增OP15′ GCC TCG AGC TTT GTG AGC GGA TAA C3′XhoⅠ35S2 5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′SalⅠ已很詳細地了解乳糖操縱子的分子機制，DNA結合蛋白(阻抑蛋白，laclq)和靶啟動子序列(操縱基因)之間的相互作用。該lac操縱子的表達處于laclq阻抑蛋白的強烈而緊密的負控制之下。純化了的阻抑蛋白是由4個相同的亞單位形成的四聚體，各個亞單位具有360個氨基酸(MW38,350kDa)。該操縱基因序列由35個堿基對構成，它包括對稱序列的28個堿基對。
對于最大程度地阻抑該抑制基因的表達，該阻抑蛋白優選被定向入靶細胞核中。這可通過將核定位信號序列與該阻抑蛋白的C端融合來實現。
本發明的又一方面涉及適合于分離該laclq基因的一組引物，它們具有供克隆入植物載體的適當的限制酶切割位點，這兩種引物相應于該基因的5′端和3′端并且被稱為AM1和AM2AM15′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′XbaⅠAM25′GCG GTA CCT CAC TGC CCG CTT TC3′KpnⅠ
本發明的又一方面提供了用于將NLS序列與laclq基因的3′端融合的一組PCR引物，它們包括AM15′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′XbaⅠLD15′CTG GAA AGC GGG CAG GTC CTT TCA AAG CGT CCG 3′laclq的3′端VirD2基因中NLS的5′端LD25′CGG ACG CTT TGA AAG GAC CTG CCC GCT TTC CAG 3′VirD2中NLS的5′端laclq的3′端D235′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′KpnⅠ如果需要的話，本發明的方法可以是可逆方法。例如，該基因級聯系統可應用能將人工改造的不育性逆變為能育性的分子元件，于是允許產生種子。該逆轉機制可包括將抗阻抑基因置于化學開關啟動子的控制之下。例如當需要恢復能育性時，可向植物噴灑或者施用誘導抗阻抑RNA的表達的化學物質，其中該抗阻抑RNA將會封阻已修飾的抑制基因的表達的抑制作用。該抑制產物在花器官內的聚集將抑制致死基因的作用，于是允許形成正常的花。
例如，就所述lac/laclq系統而言，可在植物上噴灑可誘導抗-laclqRNA的表達的化學物質，其中該抗-laclq RNA將會封阻已修飾的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的表達的抑制作用。該芽孢桿菌RNA酶抑制劑產物在花器官中的聚集將抑制致死基因的作用，于是允許形成正常的花。玉米谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTⅡ)基因的啟動子區可被用于化學誘導的表達。該GSTⅡ啟動子的表達可通過化學物質如二氯胺(dichloramin，N,N-二烯丙基-2,2-二氯乙酰胺)或解草胺(fluorazole，芐基-2-氯-4-三氟甲基-5-噻唑-羧酸酯)開啟。
至于桉樹屬(Eucalyptus)，包括EGM3基因的上游序列的EGM3啟動子可被用于特異性地在桉樹花組織中表達致死基因。應用該啟動子，可在發育的很早階段于花的分生組織中特異性地表達細胞毒性芽孢桿菌RNA酶基因。抑制劑芽孢桿菌RNA酶抑制劑可在攜帶lac-操縱基因序列的35S-RNA-CaMV啟動子控制下被表達。
受EGM3啟動子控制的大腸桿菌laclq基因可被用作阻抑基因而防止開始開花時花分生組織中芽孢桿菌RNA酶抑制劑的表達。在開花期間，EGM3啟動子將會在花分生組織中表達芽孢桿菌RNA酶和laclq，而修飾了的35S-RNA-CaMV啟動子將會在除了花分生組織之外的所有組織中表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑，給予保護以防啟動子滲漏。在未開花期間，35S-RNA-CaMV啟動子通常會表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑，給予保護以防滲漏。
線蟲每年給全世界農業帶來的損失遠遠超過1000億美元。迄今侵襲廣范圍植物的最重要病原體是線蟲假根瘤線蟲(Meloidogyne incognita)和爪哇根瘤線蟲(Meloidogyne javanica)。控制措施包括應用有害的化學物質，栽培實踐如輪作以及在有限的作物范圍內應用抗性品種。人工改造對線蟲的抗性的優點包括不需特別的栽培實踐以及減小了環境危險性。
該致死基因/抑制劑/阻抑蛋白方法可被用于人工改造對線蟲的抗性。激活植物防御線蟲的理想位點是在植物根的維管區內攝食細胞(feedingcell)中。在數種植物-線蟲相互作用中，正在用示差篩選鑒定基因啟動子，該基因啟動子可被用于在線蟲攝食位點上特異性地表達芽孢桿菌RNA酶基因。最近已鑒定了兩種基因(Lemmi9和Lemmi10)，它們是在感染了假根瘤線蟲的番茄根內巨細胞攝食位點中被高水平表達的(Vander Eycken等，(1996)植物雜志(Plant Journal)9,45-54)。
致死基因在攝食細胞中的表達會迅速殺傷該細胞并破壞攝食過程，該攝食過程尤其對雌性植物的發育相當關鍵。需要抑制基因在非靶組織中的表達以防因啟動子滲漏引起對根的其它部分的損害。這尤為重要，因為在巨攝食細胞內高水平表達的啟動子也在非靶組織中低水平表達。在攝食位點啟動子之下該阻抑基因的表達將會封阻該抑制基因在靶組織中的充分表達以允許致死基因破壞該細胞。
為了使本發明更容易被理解并付諸實施，現在可參照闡述本發明優選的實施方案的下述實施例和附圖，其中

圖1表示芽孢桿菌RNA酶/NLS基因定域致死基因系統的構建；圖2表示包括lac操縱子修飾的35S-RNA-CaMV操縱基因/芽孢桿菌RNA酶抑制劑抑制基因系統的構建物；圖3表示laclq/NLS定域阻抑基因系統的構建；圖4表示本發明的芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑lac/laclq級聯系統的作用方式，圖5表示本發明的備擇級聯芽孢桿菌RNA酶op/LexA/RecA，圖6表示本發明的可逆芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑lac/laclq/反義laclq級聯系統的作用方式；圖7用圖解表示該控制盒以及圖1的致死基因/NLS系統的作用方式；圖8是PrMADS1、PrMADS2、PrMADS3、PrFL1和PrCON1這些基因在輻射松的繁殖組織和營養組織中的表達；圖9是PrMADS3基因在雄性球花和雌性球花中的表達；圖10是PrMADS1、PrMADS2和PrMADS3的凝膠移位分析；圖11是EGM1啟動子的核苷酸序列；圖12是EGM2啟動子的核苷酸序列；圖13是桉樹花特異性MADS基因EGM3的啟動子的推定序列；圖14是從用EGM1 cDNA(曝光6小時)探測的桉樹屬組織提取的全部RNA的RNA印跡圖解說明；圖15是從用EGM3 cDNA探測的桉樹屬組織提取的全部RNA的RNA印跡圖解說明；圖16是從用EGM2 cDNA(曝光6小時)探測的桉樹屬組織提取的全部RNA的RNA印跡圖解說明；圖17是數種植物MADS-盒基因的MADS-盒區的預測蛋白質序列的對比；
圖18是表示數種植物MADS--盒基因的相關性的系統樹；圖19是用EcoRⅠ和HindⅢ消化然后用EGM3基因和EGM2基因探測的巨桉(Eucalyptus grandis)DNA的DNA印跡；圖20是從用EGM3 cDNA(曝光6小時)探測的桉樹組織提取的全部RNA的RNA印跡；圖21是質粒7prom芽孢桿菌RNA酶抑制劑的圖解說明；圖22是含有V1-啟動子的質粒pBR芽孢桿菌RNA酶prom芽孢桿菌RNA酶抑制劑的圖解說明；圖23是含有V2-啟動子的質粒的圖解說明；圖24是EGM3雙倉(double bin)的Pst1消化物的瓊脂糖分離圖解說明。假定EcoRⅠ克隆位點是在EGM3倉(bin)的堿基6772上，則從該圖對此消化預測的片段大小是4.9,4.8,4.4,3.3,1.9,1.1和0.6kb。
圖25是EGM3倉的Pst1消化物的兩凝膠曝光的圖解說明，顯示該克隆化插入片段的其它可能取向。從該消化物預計的片段大小是7.4,4.9,4.4,1.1,0.7和0.6kb。
圖26是EGM3雙倉的質粒圖。
圖27是EGM3 V1有義的質粒圖。
圖28是質粒V1(芽孢桿菌RNA酶-芽孢桿菌RNA酶抑制劑)的質粒圖。
圖29是質粒V2(laclq NLS-35s啟動子Op-芽孢桿菌RNA酶抑制劑)的質粒圖。
圖30說明了啟動子探測方案；圖31是PrMADS2啟動子的核苷酸序列；圖32是PrMADS3 cDNA的核苷酸序列；圖33是PrMADS3蛋白質的氨基酸序列；圖34是PrMADS啟動子的核苷酸序列；圖35是PrFL1 cDNA克隆的核苷酸序列；圖36是PrFL1蛋白質的氨基酸序列；圖37是PrFL1啟動子的核苷酸序列；
圖38是PrCon1基因的核苷酸序列(部分的)；以及圖39是從用EGM2 cDNA(曝光3天)探測的桉樹組織提取的全部RNA的RNA印跡。實施例1構建包括繁殖器官特異性啟動子和得自解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因的嵌合繁殖器官特異性表達盒，其中該啟動子和該基因受編碼得自解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶的抑制劑〔芽孢桿菌RNA酶抑制劑(B*)]的基因的正控制〔其中的基因受具有引入的lac-操縱基因序列、已修飾的組成型啟動子(35S RNA CaMV)的控制〕，表達盒中的啟動子和基因還受大腸桿菌laclq基因的負控制〔其中該laclq基因受與用于按圖4表達該致死基因的相同的繁殖器官特異性啟動子的控制〕。
該繁殖器官特異性啟動子包括如下文所述在花發育早期狀態的繁殖器官中表達的基因的上游序列。芽孢桿菌RNA酶的細胞毒性效果是通過將其定向入大多數前RNAs和成熟RNAs以未保護形式存在的核中而提高的。為此，如圖1所示，通過將得自根瘤土壤桿菌菌株C58的VirD2基因的核定位信號(NLS)序列融合至該B基因的3′區而修飾該B基因的編碼區。
按圖2構建在35S-RNA-CaMV啟動子區的5′區、3′區以及5′區加3′區攜帶lac-操縱基因序列的抑制劑芽孢桿菌RNA酶抑制劑(B*)基因部分載體。
受與用于表達致死基因的相同的繁殖器官特異性啟動子控制的該大腸桿菌laclq基因，通過按圖3將得自根瘤土壤桿菌VirD2基因的NLS融合至該laclq蛋白的C端而使其laclq蛋白定向入該核。實施例2按圖5構建備擇的嵌合繁殖器官特異性表達盒，其中該繁殖器官特異性啟動子和芽孢桿菌RNA酶基因受處于35S-RNA-CaMV啟動子控制下的LexA產物的正轉錄控制，并且受RecA基因產物(該RecA基因產物受與用于按圖5表達致死基因的相同的繁殖器官特異性啟動子的控制)的負控制。實施例3基本上按實施例1構建一個可逆系統。此外還包括得自調節反義laclqRNA基因的玉米谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTⅡ)基因的化學開關啟動子。這就允許按圖6生產種子。于是通過噴灑誘導物如二氯胺(N,N-二烯丙基-2,2-二氯乙酰胺)或解草胺(芐基-2-氯-4-三氟甲基-5-噻唑-羧酸酯)可實現能育性的恢復。該化學誘導的抗laclq RNA的表達封阻已修飾的35S-RNA-CaMV-B*基因的表達的抑制作用。B*在花器官中的聚集將抑制致死基因的作用，于是允許形成正常的花。實施例4laclq阻抑基因的修飾以及插入植物表達載體。
用Xbal和Kpnl消化pRT99GUS載體以釋放GUS基因的編碼區并且變成供植物中表達的合適載體。
laclq阻抑蛋白幾乎可從所有商品化大腸桿菌菌株獲得。一些商品化質粒也含該阻抑基因。為了在植物中表達該基因，將原核翻譯起始密碼子(GTG)變成ATG。為了分離該laclq基因，設計了相應于該基因的5′端和3′端的兩種引物(AM1和AM2)。這兩種引物具有合適的限制酶切割位點供克隆入植物載體。
AM1 5′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′Xba ⅠAM2 5′GCG GTA CCT CAC TGC CCG CTT TC3′Kpn Ⅰ擴增后，用XbaⅠ和KpnⅠ消化PCR片段并連接入pBR-35SGUS載體(該載體被同樣的酶消化)以便置換該GUS基因(pBR-35Slaclq)。
為了將NLS序列融合至該laclq基因的3′端，進行了數個PCR。
引物AM1 如前所述。
LD1 5＇CTG GAA AGC GGG CAG GTC CTT TCA AAG CGT CCG 3′laclq的3′端VirD2基因中NLS的5′端LD2 5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC CTG CCC GCT TTC CAG 3′VirD2中NLS的5′端 laclq的3′端D23 5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′KpnⅠ用XbaⅠ和KpnⅠ消化含有被融合至laclq基因的編碼區的、得自根瘤土壤桿菌的VirD2基因的NLS的最終PCR片段并連接入用相同的酶消化的植物表達載體pBR322-35SGUS(pBR-35Slaclq-NLS)。將該載體從XL1 Blue轉化入JC8697(recA-)大腸桿菌菌株以消除可能的同源重組。實施例5芽孢桿菌RNA酶基因和芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。
應用P1和P2(對于芽孢桿菌RNA酶抑制劑)以及P3和P4(對于芽孢桿菌RNA酶)這些引物通過PCR從解淀粉芽孢桿菌的粗提取物分離這些基因。
P15′GCG AAT TCC GCA CAT GAA AAA AGC 3′EcoRⅠP25′GCA AGC TTA AGA AAG TAT GAT GGT G3′HindⅢP35′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′NcoⅠP45′CGG GTA CCT TAT CTG ATT TTT GTA A3′KpnⅠ用EcoRⅠ和HindⅢ消化該P1-P2 PCR片段(芽孢桿菌RNA酶抑制劑)并連接入用相同的酶消化的Bluescript SK載體(BS-B*)。將BS-B*載體的BamHⅠ-HindⅢ片段引入蛋白質表達載體pQE32(pQE-B*)。
將P3-P4 PCR片段(芽孢桿菌RNA酶)連接入PCR克隆載體p/GEM-T(pGEM-T-B)。為了將NLS序列融合至該B基因的3′端，進行了數個PCR。
引物P35′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′NcoⅠBD1 5′CCT TAC AAA AAT CAG A GT CCT TTC AAA GCG TCC G3′芽孢桿菌RNA酶的3′端VirD2的NLS的5′端BD2 5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC TCT GAT TTT TGT AAA G3′VirD2的NLS的5′端芽孢桿菌RNA酶的3′端D23 5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′KpnⅠ將含有融合至芽孢桿菌RNA酶基因的編碼區的、得自根瘤土壤桿菌的VirD2基因的NLS的最終PCR片段連接入PCR克隆載體pGEM-T(pGEM-T-B-NLS)。
實施例6將lac-操縱基因序列引入35S-RNA-CaMV啟動子。
商品化質粒pQE-32包含兩種lac操縱基因(操縱基因Ⅰ和Ⅱ)的理想結合。第一步，將得自pRT99GUS載體的HindⅢ片段引入Bluescript SK載體(A1)。攜帶融合入35S-RNA-CaMV啟動子的GUS基因以及終止區的該A1載體的EcoRⅠ-SaⅡ片段被引入用相同的酶消化的pQE32載體。
所得載體含在上游區(Op+35S-GUS)有兩種lac操縱子的35S-RNA-CaMV啟動子。
為了將該lac操縱基因引入35S-RNA-CaMV啟動子和GUS基因的編碼區之間，先將攜帶無啟動子GUS基因的、該A1載體的BamHⅠ-SaⅡ片段連接入用相同的酶消化的pUC19載體(pUC19-啟動子GUS)。下一步，用EcoRⅠ和SaⅡ酶消化pUC19-啟動子GUS載體再將它連接入用相同的酶消化了的pQE32載體(pQE-啟動子GUS)。應用相應于35S-RNA-CaMV啟動子的5′區和3′區的35S1引物和35S2引物通過PCR擴增35S-RNA-CaMV啟動子區。
35S15′GCC TCG AGC ATG GTG GAG CAC GAC AC3′XhoⅠ35S25′GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′SalⅠ用XhoⅠ和SaⅡ消化該PCR片段再將它引入用XhoⅠ消化了的pQE-啟動子GUS。選擇含正確取向的啟動子的克隆，并將所得質粒(35S-GUS)從XL1 Blue轉化入JC8697(recA-)大腸桿菌菌株以消除可能的同源重組。
為了將lac操縱基因引入35S-RNA-CaMV啟動子的5′區和3′區，應用相應于該-35S啟動子的5′區和3′區的OP1引物和35S2引物通過PCR擴增該-35S-GUS載體的操縱基因-35S啟動子區。
OP15′GCC TCG AGC TTT GTG AGC GGA TAA C3′XhoⅠ用XohⅠ和SaⅡ消化該PCR片段再將它引入用XohⅠ消化了的pQE-啟動子GUS。選擇含正確取向的啟動子的克隆，并將所得質粒(-35S-啟動子GUS)從XL1 Blue轉化入JC8697(recA-)大腸桿菌菌株以消除可能的同源重組。
在用EcoRⅠ+KpnⅠ消化二者后將芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因克隆入pQE-啟動子GUS載體。
組織摘除術的一個難點是啟動子滲漏的影響或在其它組織中的表達。為克服該困難，我們開發了一個控制系統(基因級聯系統)，憑該系統抵銷致死基因在非靶組織中的表達(圖7)。設計了攜帶芽孢桿菌RNA酶(V1)和芽孢桿菌RNA酶抑制劑加這些級聯系統的阻抑蛋白(1aclq)(V2)部分的兩種不同載體。
為了將啟動子區克隆入載體V1和V2，應用幾組引物擴增了它們，其中這些引物V1具有SalⅠ限制位點(SalⅠ引物)并在V2具有EcoRⅠ限制位點(EcoRⅠ引物)。為了檢查該啟動子在V1和V2載體中的取向，在正向SalⅠ引物中SalⅠ位點的下游設計了EcoRⅠ限制位點，并在EcoRⅠ引物中EcoRⅠ的下游設計了SalⅠ位點SalⅠ引物PrMADS2啟動子正向引物5′CCGGTCGACGAATTCCGACAGTGGAGTCCACAAAGAAAGATGCG3′SalⅠ EcoRⅠ反向引物5′CCGGTCGACTTCTTTCCTTCTTTTCTTTCTGC3′SalⅠPrMADS3啟動子正向引物5′ACGCGTCGACGAATTCAAGATTTCAAATCAGTCC3′SalⅠ EcoRⅠ反向引物5′ACGCGTCGACCAAGATCCCTCTGCTTCTTCACC3′SalⅠPrFL1啟動子正向引物5′ACGCGTCGACGAATTCGAACTTCTGGAATAAGCTGC3′SalⅠ EcoRⅠ反向引物5′ACGCGTCGACTTCATCTTACGTCACGCGAGG 3′SalⅠEcoRⅠ引物PrMADS2啟動子正向引物5′ CCGGAATTCGTCGACCGACAGTGGAGTCCACAAAGAAAGATGCG3′EcoRⅠ SalⅠ反向引物5′ CCGGAATTCTTCTTTCCTTCTTTTCTTTCTGC3′EcoRⅠPrMADS3啟動子正向引物5′CGGAATTCGTCGACAAGATTTCAAATCAGTCC3′EcoRⅠ SalⅠ反向引物5′GCGAATTCCAAGATCCCTCTGCTTCTTCACC 3′EcoRⅠPrFL1啟動子正向引物5′ CGGAATTCGTCGACGAACTTCTGGAATAAGCTGC 3′EcoRⅠ SalⅠ反向引物5′GCGAATTCTTCATCTTACGTCACGCGAGG 3′EcoRⅠ用SalⅠ限制酶消化SalⅠ引物的PCR片段，再將該片段引入用SalⅠ消化了的V1載體。應用EcoRⅠ酶的消化檢查啟動子的取向。
用EcoRⅠ限制酶消化EcoRⅠ引物的PCR片段，再將該片段引入用EcoRⅠ消化了的V1載體。應用SalⅠ酶的消化檢查啟動子的取向。所得質粒的圖示于圖21和22。
用Hind Ⅲ酶將這些載體線性化后將它們引入用Hind Ⅲ消化了的Bin19二元載體(binary vector)。在有卡那霉素和氨芐西林抗生素的板上選擇攜帶已修飾的Bin19載體的菌落。下一步將Bin19-V1-啟動子載體和Bin19V2-啟動子載體轉化入幾種土壤桿菌(agrobacterium)菌株。用土壤桿菌菌株共轉化擬南芥、巨桉和輻射松的胚以及外植體。
質粒pRT99 gus(Topfer等，核酸研究(Nucleic acid Research)(1988)16(17):8725)的Hind Ⅲ片段被克隆入pBR322的Hind Ⅲ位點。該插入產生兩種質粒，它們相當于在兩個方向克隆的插入片段。該插入區包含花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA啟動子、β葡糖苷酸酶(GUS)基因以及CaMV 35S終止區。這些質粒被稱為pBrGUS1和pBrGUS2，提供致死基因構建物的基礎。用BamHⅠ消化物檢查該插入過程的取向。pBRGUS2生成2.5kb和4.4kb的BamHⅠ片段，pBRGUS1生成6.1kb和0.8kb的片段。
應用5′引物LacⅠ(它具有EcoR1位點)和具有KpnⅠ位點的3′引物D23通過PCR從質粒pGEM laclqNLS擴增編碼laclq核定位信號肽的DNA。用EcoRⅠ和KpnⅠ限制已擴增的DNA片段并將它克隆入用該相同的酶切割了的pBRGUS2。生成的質粒稱為pBRLac。然后用SphⅠ切割pBRLac質粒后使它走瓊脂糖凝膠以純化該質粒片段，該質粒片段包含Laclq基因、氨芐西林抗性基因以及遠離小SphⅠ片段的復制起點，它含我們希望除去的限制位點。生成的質粒稱為pBRLac BH-。
質粒構建的第二個階段是預備在已修飾的CaMV加lac操縱啟動子調節下克隆芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。這是從包含該啟動子/基因序列的質粒p35S-op-芽孢桿菌RNA酶抑制劑EcoRⅠ-擴增的，其中的啟動子/基因序列已被修飾以除去啟動子與編碼序列之間的EcoRⅠ位點。是這樣完成該修飾作用的，即用EcoRⅠ切割35S-op-芽孢桿菌RNA酶抑制劑質粒，用T4 DNA聚合酶進行鈍化反應(blunting reaction)，然后重新連接該鈍化質粒。是應用5′引物pQE-F和3′引物Bar-3′進行該PCR的。用XhoⅠ和KpnⅠ切割PCR片段。將它克隆入也用XhoⅠ和KpnⅠ切割了的35S-op-芽孢桿菌RNA酶抑制劑EcoRⅠ-質粒，并通過凝膠電泳對它純化了不需要的基因。這使得能除去芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼區的3′端上的限制位點。該質粒稱為p35S-op-芽孢桿菌RNA酶抑制劑EcoRⅠ-2。
然后用XhoⅠ和SalⅠ將芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因從p35S-op-芽孢桿菌RNA酶抑制劑EcoRⅠ-2質粒上切下，再將該基因克隆入用SalⅠ切割的pBrLacBH-。該芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因可呈任一取向進入SalⅠ位點，但只發現一種取向。該插入片段的取向是由KpnⅠ消化物確定的。只見到一條1kb帶，它指示在質粒pBRLac Op芽孢桿菌RNA酶抑制劑1中見到的該插入片段的取向。產生的質粒稱為V2。
然后該質粒準備在該情況下將花特異性啟動子克隆入單一EcoRⅠ克隆位點，即laclq基因的5′。得自桉樹屬MADS基因EGM3的EGM3啟動子用于該用途。是用EcoRⅠ從質粒pEGM3切割它的。該啟動子呈兩種取向被克隆，生成的質粒稱為V2 EGM3有義和V2 EGM3反義。將質粒V2 EGM3有義用作EGM3調節的laclq和CaMVop芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的來源，用于植物轉化載體。EGM3啟動子的取向是由Xbal PstⅠ消化物確定的。2.3和0.9kb帶的存在指示正確取向。
含無啟動子芽孢桿菌RNA酶基因的第二種構建物V1，是用pBrGUS2作起點構建的。應用引物芽孢桿菌RNA酶5′Sal，以及芽孢桿菌RNA酶3′Kpn從基因組解淀粉芽孢桿菌擴增芽孢桿菌RNA酶基因。用KpnⅠ和SalⅠ象限制pBrGus1那樣限制生成的PCR產物并進行連接反應。將得自生成的菌落的質粒用作應用該擴增引物測序的模板。發現質粒SB4包含與解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因相同序列的芽孢桿菌RNA酶片段，該質粒被稱為pBR芽孢桿菌RNA酶，將它用于進一步的構建。
應用芽孢桿菌RNA酶作為植物中致死基因的先前工作已證實，要求存在并從與芽胞桿菌RNA酶相同的質粒表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑的抗毒素基因，這是在啟動子區可被克隆該芽孢桿菌RNA酶基因的5′之前進行的(Paul等，1992，植物分子生物學(Plant MolecularBiology)19:611-622)。這是通過應用含芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因和得自解淀粉芽孢桿菌的啟動子的質粒而達到的，其中該啟動子與芽孢桿菌RNA酶序列呈順式。為此，應用引物5′芽孢桿菌RNA酶抑制劑啟動子和Bar3′從解淀粉芽孢桿菌基因組DNA擴增該啟動子加芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA區。用KpnⅠ象限制pGEM 3f那樣限制PCR片段并進行連接反應。從產生的白色菌落篩選插入片段。將得自菌落7的DNA用于測序，發現該DNA含基因組解淀粉芽孢桿菌DNA中的那種芽孢桿菌RNA酶抑制劑啟動子加芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列。該質粒被稱為7啟動子芽孢桿菌RNA酶抑制劑，如圖21所示。
用KpnⅠ象限制pBR芽孢桿菌RNA酶那樣限制該7啟動子芽孢桿菌RNA酶抑制劑質粒，再將啟動子芽孢桿菌RNA酶抑制劑片段克隆入PBR芽孢桿菌RNA酶DNA的KpnⅠ位點。產生的質粒稱為V1。用EcoRⅠ將該EGM3啟動子從pEGM3切下，應用DNA聚合酶Ⅰ(克列諾片段)鈍化，再克隆入也已被限制和鈍化了的V1 DNA的單一SalⅠ克隆位點。產生的(插入的啟動子呈正確取向)質粒被稱為EGM3 V1有義(圖27)。
用Hind Ⅲ將該EM3V1有義DNA線性化再克隆入也用Hind Ⅲ線性化了的植物轉化載體Bin19。產生兩種質粒，即EGM3 V1 Bin1和2，相應于插入的兩種取向。在取向2中，存在于EGM3 V1 Bin中的兩個EcoRⅠ位點大約相隔80bp。EGM3 V1 Bin2被EcoRⅠ切割后用DNA聚合酶Ⅰ(克列諾片段)鈍化。應用AatⅡ和Hind Ⅲ將EGM3啟動子laclq基因以及CaMV35S op芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因從EGM3 V2有義上切下。該片段也被鈍化后被連接入EcoRⅠ切割并鈍化了的EGM3 V1Bin2而產生質粒EGM3 Double BinⅠ和Ⅱ(圖26)，也相應于兩種可能的取向。這些質粒被用于經由根瘤土壤桿菌轉化植物。
然后進一步用桉樹屬MADS啟動子重復該操作。這些是EGM2長形式和短形式，以及EGM3的更短形式。引物。芽孢桿菌RNA酶5′Sal5′CCGYCGACATGGCACAGGTTATCAA 3′SalⅠ芽孢桿菌RNA酶3′Kpn5′CGGGTACCTTATCTGATTTTTGTAAAGG 3′KpnⅠ5′芽孢桿菌RNA酶抑制劑啟動子5′CGGGTACCGTCCAATCTGCAGCCGTCCGA 3′KpnⅠBar3′5′GCGGTACCTTAAGAAAGTATGATGGTG3′KpnⅠD235′CGGGTACCTATCTCCTATTCCCCCACG 3′KpnⅠpQE-F5′ GCGTATCACGAGGCCCTTTC 3′LacⅠ5′ GCGAATTCAACATGGAACCAGTAACGTTATA 3′EcoRⅠ實施例7繁殖器官特異性啟動子的分離從制備自未成熟雌球花和雄球花的輻射松cDNA文庫分離表現為與擬南芥和Anthirrhinum majus花分生組織有強同源性的5種球花特異性基因以及器官同一性基因。其中的3種，即PrMADS1、2和3屬于MADS--盒基因家族，顯示分別與擬南芥屬(Arabidopsis)AGL-2、AGL-4和AGL6基因以及得自另一種非被子植物即歐洲云杉(Picea abies)(挪威云杉)的dal1基因的同源性。PrFL1基因是得自Anthirrhinum的Arabidopsis Leafy(Lfy)和Floricaula(Flo)基因的松直向同源基因。PrCon1顯示與擬南芥屬CONSTANS(co)基因的強同源性。為了闡釋這些基因的作用，我們采取了這種方法即在球花發育的不同階段鑒定它們在雄球花和雌球花中的表達模式。
在營養組織、營養芽、針葉、莖和根中檢測到很低水平的表達。原位雜交表明，這些基因的表達只能在繁殖組織細胞中檢測到。
表達分析揭示所有這5種基因在雄球花和雌球花的不同發育階段中表現為不同的表達模式(圖8和9)。PrMADS1、2和3基因是球花特異性的兩種基因的表達受限于繁殖器官原基組織。在營養組織營養芽、針葉、莖、根中未觀測到這些基因可檢測的表達。至于PrFL1和PrCon1，在營養芽中觀測到低可檢測量的表達。
在球花發育早期階段(5mg球花)檢測到繁殖器官中兩種基因的低水平表達，表達水平在球花發育期間(50mg球花)增大了。在雄球花中，兩種基因的表達受含初生造孢細胞的小孢子囊限制。在雌球花中，兩種基因的表達受早熟胚珠的限制。
為了在體外鑒定MADS蛋白質為DNA結合蛋白，我們在大腸桿菌中表達了這兩種蛋白質并鑒定了它們的DNA結合性能。PrMADS1、2、3蛋白質都是序列特異性DNA結合蛋白。它們的DNA結合共有序列與AGAMOUS蛋白的相似。所有這三種蛋白質都結合與CArG盒的共有序列配對的DNA序列，關于PrMADS1和PrMADS2的是TT(A/T)CC(A/T)(A/t)2(T/A)NN GG(-G)(A/T)2(oligo A)(圖32)。這些共有序列的突變(oligo B)明顯地減弱了它們與PrMADS1、2或3蛋白質的結合。與非放射性oligos的競爭未減弱任何這些蛋白質與CArG共有序列的結合。這表明我們正處理特異性DNA-蛋白質相互作用。
應用‘啟動子探測’方案(圖30)分離了上游序列。將特定的銜接子連接至DNA片段的末端，這些DNA片段是通過分別用EcoRV、ScaⅠ、DraⅠ、PvulⅠ和SspⅠ消化輻射松的基因組DNA而產生的。選擇應用的酶，因為它們具有六個堿基的識別位點并產生平端。在銜接子連接后，將這些DNA片段用作PCR的模板，該PCR應用第一銜接子引物AP1、AP2以及基因特異性引物GSP-1,2。
銜接子序列(第一序列)、銜接子引物和聚合酶封阻引物如下所示。應注意，銜接子引物AP1相應于銜接子22的堿基1至22，銜接子引物AP2相應于堿基13至31，而該聚合酶封阻引物則相應于堿基41至48。銜接子5′GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGG-CTGGT-3′聚合酶封阻引物AP13′-NH2-CCCGACCA-PO4-5′AP2銜接子引物1(AP1):5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′銜接子引物2(AP2):5-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′下鏈3′端氨基的存在封阻聚合酶催化的未連接的單體銜接子分子增長，于是防止引物結合位點的產生，除非一確定的、基因特異性引物延長與銜接子上鏈相反的DNA鏈。
應用Advantage Tth Plymerase Mix(Clontech)以及有關PrMADS2,3基因和PrFL1基因的銜接子引物AP1和GSP-1進行首次PCR。GSP-1序列PrMADS2: 5′ CGGCGCTTCCGAACTCATAGAGTTTTCCTC 3′PrMADS3: 5′ TTAGCGCCACTTCGGCATCGCACAGC 3′PrFL1: 5′ CAAGGGACTTCAAATCCTTTCTCCCATTCATGG 3′PCR兩步循環參數7次循環94℃25秒72℃4分32次循環 94℃25秒67℃4分最后一次循環后又一次67℃達4分鐘。
將1ml首次PCR用于第二次PCR，其中應用相同的循環參數以及第二組GSP引物與AP2銜接子-引物。GSP-2引物序列PrMADS2: 5′ CGCCTTTTTCAGCAGACCATTCCGGC 3′PRMADS3: 5′ CAGCAGTCCGTTTCCGGCGCTTCG 3′PrFL1: 5′ CGTCCATGGTCCTTGTTAAAGACAGTTGTTGTTGG 3′將1～2kb PCR片段克隆入TA型克隆載體并測序。cDNAs和蛋白質的序列以及PrMADS2、PrMADS3和PrFL1的啟動子區示于圖31、34&37。
實施例8將嵌合DNA序列引入植物中應用根瘤土壤桿菌系統將嵌合DNA序列共轉移入植物組織。使轉化體保持生長在選擇性培養基上。應用標準分子生物學技術(Southern雜交、Northern雜交、PCR)證實兩種質粒的存在。質粒A具有芽孢桿菌RNA酶基因，質粒B具有受植物啟動子控制的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。這就引起共轉化的另外選擇。
設計的載體系統包括基因的級聯系統，該基因的表達受繁殖器官特異性啟動子的正控制以及大腸桿菌乳糖(lac)阻抑蛋白-操縱基因系統的負控制。在未開花期間，缺乏阻抑蛋白時，操縱基因序列將允許在所有器官中組成性表達芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因或反義RNA。由于繁殖器官特異性啟動子的可能滲漏，在不同植物器官和細胞中致死基因產物將以低水平存在。
芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白在這些細胞的細胞質中或反義RNA在細胞核中的積聚將封阻致死基因產物的細胞毒性效果。在開花的早期階段，該B(或其它RNA酶)和laclq基因在繁殖器官合適的細胞中的表達將急劇增多。laclq蛋白在這些繁殖器官細胞核中的積聚將通過lac阻抑蛋白-操縱基因相互作用封阻芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因(或反義RNA)的表達，這就會增大致死基因產物在靶繁殖器官細胞中的量。
實施例9與其它植物MADS-盒基因具有同源性的三種桉樹基因(EGM1、3&2)已被克隆并測序(圖10～13和17)。進行了系統發育分析以檢查這些桉樹基因與其它MADS-盒基因的相關性(圖18)。表明EGM2很可能與花瓣和雄蕊的發育中涉及的GLOBOSA MADS-盒基因組是同源的。EGM3和EGM1都屬于MADS-盒基因的AGL2組。這些基因最常在花內部三種輪生體(花瓣、雄蕊和心皮)中表達，但尚未確定它們在花發育中的作用。
鑒定了所有三種EGM基因的表達模式(圖14、15&16)。在任何營養組織中都未檢測到這些基因的表達。EGM1基因是在桉樹花的花瓣、雄蕊和心皮中表達的。EGM3是在花分生組織和萼片中表達的，EGM2是在花瓣和雄蕊中表達的。已由Southern分析(圖19)證實EGM3和EGM2基因是單基因。EGM1也可能是單基因。
所有這三種基因的啟動子區都可用于不育性基因構建物并且已從桉樹基因組文庫中分離出來。EGM3啟動子已被人工改造入致死基因構建物中。
對一系列組織進行了RNA印跡分析以測定三種EGM MADS-盒基因表達的組織特異性。用于從根、苗、莖、枝、葉和成熟的花分離RNA的組織得自巨桉植物。用于從包括花托、花瓣、雄蕊、心皮和花柱的花組織分離RNA的組織是從藍桉(E.globulus)花采集的。應用該物種是由于它生長很大的花，使得采集足量RNA容易得多。將10微克總的RNA用于包括不同花組織的印跡分析，而將20微克用于包括營養組織的巨桉RNA的印跡分析。是對三種EGM基因探測了印跡，其中該EGM基因已用合適的限制酶消化以除去MADS盒。
RNA印跡指示，所有三種EGM基因在桉樹花中被高水平表達。當RNA印跡長期暴露于膠片時，在營養組織中檢測到EGM2基因和EGM1基因的弱表達。EGM3三基因尤其是在營養組織中表達的。在花中，觀測到EGM2基因在雄蕊和花瓣中表達。EGM3基因是在花托、花瓣、雄蕊、心皮和花柱中表達的。實施例10該級聯系統的第一部分(組分1)包含報道GUS基因，它受帶有lac操縱基因(LEAFY-op)的花分生組織同一性基因啟動子(即擬南芥的LEAFY)的控制。第二種構建物(組分2)包含受玉米GST-27基因啟動子控制的阻抑laclq基因。通過用防護劑、二氯丙烯胺(dichlormid)和R-29148處理植物而上調該啟動子。是用兩種組分對擬南芥屬植物共轉化的。
一種備擇方案是關于攜帶待分別雜交的組分1和2的轉基因擬南芥屬系。只從組分1表達在用X-gal染色后產生藍花。在表達組分1的植物中，化學誘導性誘導從組分2的表達可消除見于花中的藍色。
實施例11該級聯系統的第一個組分包含芽孢桿菌RNA酶基因，它受帶有lac操縱基因的花分生組織同一性基因啟動子(即擬南芥的LEAFY)的控制。第二種組分包含受玉米GST-27基因啟動子控制的阻抑laclq基因。擬南芥屬植物是用這兩種組分共轉化的。在未誘導的植物中，只有組分1的表達產生不育性擬南芥屬植物。在表達組分1的植物中，誘導從組分2的表達阻止了從LEAFY-op啟動子的表達并恢復了初始不育性擬南芥屬植物的能育性。實施例12在下文中應用了一些縮寫。這些是常用于植物組織培養領域中的縮寫。BA芐基腺嘌呤，也稱為6-芐基氨基嘌呤。IBA吲哚-3-丁酸。NAA1-萘乙酸TDZ苯基噻二唑基脲，也稱為1-苯基-3-[1,2,3-噻二唑-5-基]脲。
下面是從枝和苗外植體材料生產轉基因桉樹屬的優選步驟詳細描述。枝外植體1．每月在含0.2mM BA的固體KG培養基上傳代培養枝。保持在低光度(16小時光照周期，100～350Lux或1～8mmolm-2s-1PAR)和22.5℃。2．傳代培養3～4周后應用全部枝條。3．除去下方葉子留下上部4～6片葉。4．用針(例如25G)刺傷葉片5～6次并將全部枝條置于含10～100mM乙酰丁香酮的土壤桿菌屬懸浮液(大約1×108cfu ml-1)中達10分鐘至2小時。在600nm處光密度為1.0的土壤桿菌屬懸浮液稀釋1/20約為1×108cfu mL-1。當創傷靠近葉基時得最佳結果。備擇地，不將刺傷的枝條置于土壤桿菌屬懸浮液中達1小時，可將枝條用土壤桿菌屬懸浮液在40～100Kpa下真空浸潤10～30分鐘。供真空浸潤處理的枝不需刺傷。然而，當用針刺傷而不是通過真空浸潤時形成的胼胝體更大。5．在無菌濾紙之間吸干枝條，再將枝條垂直插入含0.2mM BA的KG培養基。在暗處共培養2天。6．轉移枝條(仍直立)至包含0.2mM BA和200mgL-1頭孢噻肟的KG培養基。在低光度中保持5天(16小時光照周期，100～350Lux或1～8mmolm-2s-1PAR)。7．切下4～6片上方的葉子，將它們近軸面朝上放在固體胼胝體誘導培養基G22上，該培養基包含2mM BA、2.5mM NAA、200mgL-1頭孢噻肟和5～10mgL-1遺傳霉素(geneticin)。在暗處培養2周。8．將該外植體轉至包含2mM BA、2.5mM NAA、1.0mM TDZ、200mgL-1頭孢噻肟和15mgL-1遺傳霉素的G22培養基。每2周在暗處傳代培養。當在亮處培養時產生棕色酚類化合物。9．6周后將外植體轉至含有200mgL-1頭孢噻肟和15mgL-1遺傳霉素的枝誘導培養基GBA(即含5mM BA和0.5mM NAA的G22)。在暗處放置5～6天后移到亮處(16小時光照周期，100～350Lux或1～8mmolm-2s-1PAR)。每2周傳代培養。10．在含200mgL-1頭孢噻肟和15mgL-1遺傳霉素的GBA上培養8～10周后，將帶芽的胼胝體和在原來的外植體上形成的胼胝體的切片轉至含200mgL-1頭孢噻肟和30mgL-1遺傳霉素的GBA上。每2周傳代培養。11．在該培養基上培養4～6周后，將再生枝置于含0.01mM BA、50mgL-1頭孢噻肟和5mgL-1遺傳霉素的液體KG培養基中達2周，然后轉至含更高遺傳霉素(10mgL-1)的培養基中達2～4周。在100～120rpm下振蕩這些液體培養物，其中在70ml容器中盛有8ml液體。12．將存活的枝和胼胝體轉至固體培養基(KG，包含200mgL-1頭孢噻肟和10mgL-1遺傳霉素但不含激素)以及更高的光強度(16小時光照周期，450Lux或10mmol m-2s-1PAR)。每2周傳代培養。13．對推定已轉化的枝分析標志基因活性。14．從確證為陽性的枝材料再生植物。通過將枝條轉至含10mgL-1遺傳霉素但不含激素的KG上而誘導生根。但是，如果三周后未生根就移到含IBA 0.2mgL-1(9.8mM)的相同培養基上。
如上詳述的方案從轉化到再生出枝將歷時1～8個月。苗外植體1．將種子消毒后使之在含0.2mM BA的KG上發芽。2．應用10～12天齡的苗，除去根后將它們放入過夜生長的、含50mM乙酰丁香酮的土壤桿菌屬懸浮液(大約1×108cfu ml-1)。在600nm處光密度為1.0的土壤桿菌屬懸浮液稀釋1/20約為1×108cfu mL-1。在解剖顯微鏡下用30G注射針輕輕地刺入而損傷子葉和下胚軸。培養1小時后從懸浮液中取出苗，在無菌的濾紙之間吸干它們以除去多余的液體。不將刺傷的子葉置于土壤桿菌屬懸浮液中達1小時，可將子葉用土壤桿菌屬懸浮液在95KPa(28mmHg)下真空浸潤20分鐘。供真空浸潤處理的子葉不需刺傷。然而，即使運用真空浸潤，下胚軸也需刺傷。3．在暗處的KG培養基(包含0.2mM BA)上共培養2天，確保這些苗在培養基中直立。4．將苗(仍直立)轉移到含200mgL-1頭孢噻肟的KG培養基(含有0.2mMBA)上。在低光度(16小時光照周期，100～350Lux或1～8mmol m-2s-2PAR)中繼續培養5天。5．切下這些下胚軸和子葉。將下胚軸轉移到包含0.5mM BA、1.0mMNAA、1.0mM TDZ、200mgL-1頭孢噻肟和10mgL-1遺傳霉素的胼胝體誘導培養基G22。將子葉轉移到包含1.0mM BA、1.0mM NAA、0.3mM TDZ、200mgL-1頭孢噻肟和10mgL-1遺傳霉素的G22培養基。在暗處繼續培養2周。6．將外植體轉移到含15mgL-1遺傳霉素和200mgL-1頭孢噻肟的相同培養基。繼續暗處培養。每兩周傳代培養直至約6周為止。7．6周后，轉移到含15mgL-1遺傳霉素的枝誘導培養基GBA(即包含5mMBA和0.5mMNAA的G22)。將培養物在暗處放置5～7天再轉到光亮處(16小時光照周期，100～350Lux或1～8mmol m-2s-1PAR)。8．在含15mgL-1遺傳霉素和200mgL-1頭孢噻肟的GBA上培養約10周后，一些外植體將已長出了枝。切下這些枝并轉移到含有30mgL-1遺傳霉素和200mgL-1頭孢噻肟的KG培養基(含0.2mM BA)上。同時，將也已在原來的外植體上形成的胼胝體返回到含有15mgL-1遺傳霉素和200mgL-1頭孢噻肟的GBA上傳代培養且再放置一個月，那時可長出更多的枝，然后可將這些枝轉移到含30mgL-1遺傳霉素和200mgL-1頭孢噻肟的KG培養基(含0.2mM BA)上。9．現將所有的枝和胼胝體轉移到包含30mgL-1遺傳霉素和200mgL-1頭孢噻肟的新鮮KG培養基(含0.2mM BA)再培養一個月左右。10．在該培養基上4～6周后，將再生枝放入含0.01mM BA、50mgL-1頭孢噻肟和5mgL-1遺傳霉素的液體KG培養基中達2周，然后轉至含更高遺傳霉素(10mgL-1)的培養基中達2～4周。11．將存活的枝和胼胝體轉移到固體培養基(KG，包含200mgL-1頭孢噻肟和10mgL-1遺傳霉素但不含激素)上以及更高的光強度(16小時光照周期，450Lux或10mmol m-2s-1PAR)。每2周傳代培養。12．對推定已轉化的枝分析標志基因活性。13．從確證為陽性的枝材料再生植物。通過將枝條轉至含10mgL-1遺傳霉素但不含激素的KG上而誘導生根。但是，如果三周后未生根就移到含IBA 0.2mgL-1(9.8mM)的相同培養基上。
12天齡或更嫩的苗最適于轉化，但高達20天齡的苗可用于再生。
就未選擇的未轉化子葉和下胚軸外植體來說，枝再生率約為80％。
經驗證實，即使3個月后，從培養基除去頭孢噻肟將導致土壤桿菌屬迅速過分生長。頭孢噻肟的濃度在液體培養基和固體培養基之間變化。
當與在固體培養基上生長的枝相比時，枝材料在液體培養基中生長更快且形成更多的枝。與固體生長培養物相比，液體選擇步驟具有通過提高選擇壓力、減少殘余的土壤桿菌屬以及增大枝組織的量而減少假陽性枝的優點。
然后將再生的已長根的轉基因植物移到土壤基培養基上，使它們長成適合栽插的大小和形式的樹。可通過組織培養繁殖技術微小繁殖克隆并使它們生長成適合栽插的大小和形式的樹。
用于該研究的培養基有如Laine和David(1994)描述的G22、GBA和KG。不過，測試了包括MS、B5和P24的各種基本培養基，發現它們可維持枝再生。該植物生長調節方法一般不同于Laine和David(1994)的那些，后者是結合1～3mMBA、0.05～2mM TDZ和0.5～2.5mMNAA用于從葉誘導胼胝體；1～3mM BA、0.05～1mM TDZ和0.5～2.5mM NAA用于子葉；以及1～3mM BA、0.05～2mM TDZ和0.5～2.5mM NAA用于下胚軸。分化培養基通常是GBA培養基，它是G22但補加了2.5～5mM BA和0.5mM NAA(Laine和David,1994)。包含0.2mM BA的KG培養基通常用作克隆物質的傳代培養基。所有培養基都用0.25％Gelrite或Phytagel固化。在121C高壓滅菌15分鐘之前應用氫氧化鉀將pH調節到5.7～5.8。
制備土壤桿菌屬接種物的優選方法描述如下1．將包含構建物的土壤桿菌屬菌株劃線到選擇板上，例如YEP+利福平(50mg/L)+卡那霉素(100mg/L)用于含pBin GUSINT構建物的LBA4404、EHA105和AGL1。2．在280C下將板培養2天。3．將單一菌落選入YEP選擇性液體培養基，在280C下的搖床上生長一夜。4．應用該過夜培養物接種(1％種子培養物)新鮮的選擇性培養基，在280C下的搖床上生長一夜。該另加的步驟將產生供植物轉化的更稠密的種子培養物。5．收獲土壤桿菌屬，洗滌并重懸浮于組織培養基中。稀釋至適合轉化的合適濃度。6．將重懸浮的土壤桿菌屬劃線到乳糖酵母培養基板上，在280C下將板培養2天。對菌落進行本尼迪特試驗(Bernaerts和Deley,1963)以確定它們是土壤桿菌屬。
在轉化的那天本方法將給出良好的稠密土壤桿菌屬培養物。從板或甘油貯存物接種的培養物生長一夜將給出不同的結果。
如上述那樣生長并被稀釋到0.98的光密度(600nm)的AGL1培養物存活數為2.37×109cfu/ml。
當然應認識到，雖然給出了上述闡釋性的本發明的實施例，對本領域技術人員顯而易見的所有這些以及其它的更改和變化形式都認為屬于本發明的寬范圍(正如附后的權利要求中所要求的那樣)。
權利要求
1．調節真核活性基因的方法，它包括用構建物轉化細胞，該構建物表達調節該真核基因或其產物的調制基因產物以及調節所述調制基因或其產物的另一基因產物，所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩種的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。
2．權利要求1的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因選自目的有機體的天然基因或引入的基因。
3．權利要求2的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因編碼選自活性多肽、酶或者能完成合成途徑的基因產物的表達產物。
4．權利要求3的調節真核活性基因的方法，其中所述合成途徑是為生產顏料和染料而選擇的。
5．權利要求4的調節真核活性基因的方法，其中所述染料例如是花青苷。
6．權利要求4的調節真核活性基因的方法，其中所述合成途徑是為生產殺蟲化合物而選擇的。
7．權利要求6的調節真核活性基因的方法，其中所述殺蟲化合物是Bti毒素。
8．權利要求3的調節真核活性基因的方法，其中所述酶選自對靶組織具有致死效果的RNA酶以及賦予根組織以線蟲抗性的過氧化物酶。
9．權利要求8的調節真核活性基因的方法，其中所述RNA酶基因是得自解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶的基因。
10．權利要求9的調節真核活性基因的方法，其中所述基因被構建，它包括得自解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶的編碼區，受在發育早期階段植物繁殖器官的雄性部分和雌性部分中表達的基因的啟動子序列控制。
11．前述權利要求任一項的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是應用啟動子構建的，該啟動子選自在巨桉中啟動稱為EGM1、3&2的桉樹基因的那些啟動子。
12．權利要求1～10中任一項的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是用啟動子構建的，該啟動子選自在輻射松中啟動稱為PrMADS1、2和3的松基因的那些啟動子。
13．前述權利要求任一項的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因、調制基因和另外的基因及其各自的啟動子可包括轉化盒，用該轉化盒可轉化靶有機體。
14．權利要求13的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是由發育啟動子啟動的，且其中所述調制基因的啟動子是組成型。
15．權利要求13的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因的啟動子是組織特異性的并受組成性啟動的抑制基因產物的抑制，它反過來受誘導性啟動的其它基因產物的控制。
16．權利要求13的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因產物是在調制基因的調制作用下被組成性表達的，該調制基因的表達受組織特異性啟動子的控制，該調制基因或產物本身通過在不同組織或補充組織特異性的啟動子控制下另外基因的表達而被控制。
17．調節真核活性基因的表達的方法，它包括用轉化盒轉化細胞，該轉化盒包括所述真核活性基因、表達調節該真核基因或其產物的產物的調制基因、以及表達調節所述調制基因或其產物的產物的另一基因，所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩種的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。
18．用表達盒轉化繁殖性真核細胞的方法，該表達盒包括于靶組織中在所述靶組織的大致特異性啟動子的控制下表達細胞毒性肽的致死基因；組成性表達所述細胞毒性肽的生產或作用的抑制劑的調制基因；以及受所述大致特異性啟動子控制并起封阻所述抑制劑或調制基因的作用的另外基因。
19．前述權利要求1～16任一項的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因選自得自解淀粉芽孢桿菌提取物的芽孢桿菌RNA酶基因和芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，是由被稱為P1和P2(對于芽孢桿菌RNA酶抑制劑)以及P3和P4(對于芽孢桿菌RNA酶)的引物通過PCR分離的，這些引物包括P1 5′GCG AAT TCC GCA CAT GAA AAA AGC 3′EcoRⅠP2 5′GCA AGC TTA AGA AAG TAT GAT GGT G3′HindⅢP3 6′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′NcoⅠP4 5′CGG GTA CCT TAT CTG ATT TTT GTA A3′KpnⅠ
20．前述權利要求1～16任一項的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是致死基因，其中該致死基因表達產物的細胞毒性效果是通過將定位信號序列與構建物偶聯而提高的。
21．權利要求20的調節真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因編碼RNA酶，該RNA酶是通過將核定位信號(NLS)序列與RNA酶基因融合而被定向入核的。
22．權利要求21的調節真核活性基因的方法，其中該基因是芽孢桿菌RNA酶基因且所述融合是通過PCR進行的，其中應用一組PCR引物將得自根瘤土壤桿菌的VirD2基因的NLS序列與B基因融合，這組引物包括P35′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′NcoⅠBD15′CCT TAC AAA AAT CAG AGT CCT TTC AAA GCG TCC G3′芽孢桿菌RNA酶的3′端VirD2的NLS的5′端BD25′CGG ACG CTT TGA AAG GAC TCT GAT TTT TGT AAA G3′VirD2的NLS的5′端芽孢桿菌RNA酶的3′端D235′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′KpnⅠ
23．前述權利要求1～22任一項的調節真核活性基因的方法，其中所述阻抑基因和抑制基因適于形成特定的阻抑蛋白/操縱基因偶聯物。
24．權利要求23的調節真核活性基因的方法，其中所述阻抑蛋白/操縱基因偶聯物包括大腸桿菌laclq基因，該laclq基因受與真核活性基因構建物相同的啟動子控制而且用于阻抑通過插入lac操縱基因序列而修飾的阻抑基因啟動子的作用。
25．權利要求24的調節真核活性基因的方法，其中所述阻抑基因啟動子是已修飾的35S RNA CaMV啟動子，它在該啟動子和該阻抑蛋白的編碼區之間具有至少一個lac操縱基因。
26．權利要求25的調節真核活性基因的方法，其中所述已修飾的35S-RNA-CaMV序列是應用被稱為35S1和35S2的引物通過PCR擴增的，該引物包括35S1 5′ GCC TCG AGC ATG GTG GAG CAC GAC AC3′XhoⅠ35S2 5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′SalⅠ
27．權利要求25的調節真核活性基因的方法，其中所述已修飾的35S-RNA-CaMV序列是應用被稱為OP1和35S2的引物通過PCR擴增的，該引物被用于將lac操縱基因引入已修飾的35S啟動子的3′和5′區OP15′ GCC TCG AGC TTT GTG AGC GGA TAA C3′XhoⅠ35S2 5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′SalⅠ
28．權利要求24的調節真核活性基因的方法，其中所述laclq基因是用供克隆入植物載體的酶切割位點分離的，應用相應于該基因的5′和3′端、被稱為AM1和AM2的兩種引物AM1 5′GGT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′Xba ⅠAM2 5′GCG GTA CCT CAC TGC CCG CTT TC3′KpnⅠ
29．權利要求28的調節真核活性基因的方法，其中該laclq基因的3′端通過一組PCR引物與NLS序列融合，該PCR引物為AM15′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′XbaⅠLD1 5′CTG GAA AGC GGG CAG GTC CTT TCA AAG CGT CCG 3′laclq的3′端VirD2基因中NLS的5′端LD2 5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC CTG CCC GCT TTC CAG 3′VirD2中NLS的5′端laclq的3′端D23 5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′KpnⅠ
30．一種轉化盒，它包括真核活性基因、表達調節該真核基因或其產物的產物的調制基因、以及表達調節所述調制基因或其產物的產物的另一基因，所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩種的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。
31．一種表達盒，它包括在靶組織的大致特異性誘導型啟動子控制下表達所述靶組織的細胞毒性肽的基因；表達所述細胞毒性肽的生產或作用的抑制劑的抑制基因；以及受所述誘導型啟動子控制并起封阻所述抑制劑或抑制基因的作用的阻抑基因。
全文摘要
調節真核活性基因的方法,它包括用轉化盒轉化細胞,該轉化盒表達調節真核基因或其產物的調制基因產物和調節所述調制基因或其產物的另一基因產物,所述基因、調制基因和另外的基因之中的兩種的啟動子選自相同組織或補充組織的誘導型啟動子和發育啟動子。表達芽孢桿菌RNA酶(即解淀粉芽孢桿菌的RNA酶)的致死基因被置于組織特異性啟動子的控制之下,該組織特異性啟動子例如有得自輻射松的PrMADS1、2或3的那些或者得自巨桉的EGM1、2或3的那些。相同的組織特異性啟動子被用于表達laclq基因,芽孢桿菌RNA酶的阻抑蛋白(芽孢桿菌RNA酶抑制劑)被包括lac操縱子的修飾了的35sRNACaMV啟動子啟動。該轉化盒被用于轉化植物細胞使之再生成為在靶組織內表達該芽孢桿菌RNA酶的植物,具有改進的特異性和減少的啟動子滲漏。
文檔編號C12N15/82GK1216066SQ97193833
公開日1999年5月5日 申請日期1997年2月19日 優先權日1996年2月19日
發明者R·D·提斯達勒, A·默拉多夫, S·G·薩瑟頓, T·I·薩布里吉 申請人:福拜爾研究有限公司