用于在細胞中體內產生突變體文庫方法

專利名稱：用于在細胞中體內產生突變體文庫方法
技術領域：
本發明涉及用于體內產生多肽變體文庫，篩選這些變體以及選擇那些顯示所需性質的變體的方法。本發明還涉及用于產生要求的多肽變體的方法。
背景技術：
日益增加的多肽(包括酶和非酶的蛋白質)正在工業上生產，這些多肽用于各種工業、家庭、食品/飼料、化妝品、醫藥等的用途。這些蛋白質的主要來源之一是而且一直是天然發現的微生物。
用于發現這些具有新和特殊性質的多肽的經典方法一直是篩選天然存在的野生型有機體。這曾經是獲得多肽的一種十分成功的方法，其中所說的多肽用于如上述的應用的各種領域。
然而，如果因為在天然宿主系統中產生的數量太少而不能使得生產，往往不可能產生足夠量的這類多肽，即使成本沒有問題，要提供適合要求的足夠量的多肽(例如人生長激素)，也可能遇到困難。
這類問題已通過用于產生多肽的重組技術的出現在很大程度上得以克服。在本領域，多肽通過利用生物系統產生。把編碼某些多肽的基因克隆并轉移到細胞中，其中該細胞將產生的多肽在量上比那些在原始有機體中產生的大得多。在最近的二十年中，按照這類技術，已發展了大量用于產生多肽的方法。
經常，來自天然源的蛋白質不滿足某些應用的需要，修飾現有蛋白質使之具有一定活性或生物物理學性質將是必要的。
利用輻射(X射線和UV)或化學誘變劑，通過微生物的經典誘變，產生新的蛋白質變體是可能的。然而，由于這種方法是一種十分麻煩且耗時的過程，在相同的最近二十年中，研究者一直在通過利用更具特異性和選擇性的重組技術(如用于創造人工多樣性的蛋白質和基因工程)發展對現有多肽的改進。
利用結構功能的關系與普通蛋白質化學的知識，基于需要考慮的事，研究者已在設計多肽變體方面進行了很久，其中所說的多肽變體顯示了各種性質的改進。
然而，也已認識到多肽參與的各種相互作用是那么復雜，因此按照這些知識的合理設計有嚴重的局限性，近年來，利用隨機誘變，接著從由誘變產生的大量變體中篩選或選擇的方法已引起人們的興趣。
為了這一目的，產生了突變體的微生物文庫用于隨后的表達與篩選，以測定具有要求的性質的變體。
多年來，許多用于創造多肽的大量不同變體的體外和體內DNA誘變技術都已發展。
考慮到事實一種典型的天然存在的多肽由100-1000個氨基酸組成，每個氨基酸可以20種方式變化(僅在天然存在的氨基酸內發生)，特定多肽的可能變體的數量是巨大的。由于主要參數(規定或測量微生物收集品或文庫的有效性以鑒定多肽的改進變體)是不同變體的數目N，其中所說的不同變體N包含于收集品，所以已出現對大文庫的需要。
尤其在當一種強大的選擇系統可供使用時，鑒定要求的多肽的限制因子是文庫的大小。
在體外系統情況下，本領域狀態下，對N的實際限制是大約108。這主要由于操縱的DNA進入宿主有機體的轉化(把DNA引入細胞)的低效能。這個數目從有機體到有機體變化很大，在現存的最好情況大腸桿菌下，通常操縱的DNA的體外轉化(例如DNA片段的連接或DNA的化學處理)的效率，最多達到108細菌的文庫大小(Greg Winter，現代免疫學方法5:253-255,1993)。極少數這一大小的文庫的例子已報導了。
在其它原核生物(如Bacillus sp.、Streptococcus sp.或Staphylococcussp.)中的體外文庫構建，由于實際原因將是低于這個數目的數量級。
考慮到真核生物宿主(如釀酒酵母或各種Aspergillus sp.)，甚至更少數量的轉化體可期待來自體外操縱的DNA。
已報導了大文庫的一種特殊的情況是基于抗體輕鏈和重鏈文庫的體內重組基于用于那種特殊情況的一個專門設計的系統(Griffiths,A.D.等，1994,EMBO J.14:3245-3260)。
許多方法可用以在微生物中體內產生多肽的變體，從十分簡單的方法(如利用化學或物理誘變劑處理細胞)到相當復雜的方法，該方法依賴于包含易錯的DNA聚合酶但缺乏糾正錯誤的錯配修復系統的細胞(Stratagene,XL1-red(mutS、mutD、mutT)目錄#200129)。但這些技術有一主要的弊端，由于誘變的目標不是基因組的特定部分(編碼興趣多肽)，且高頻突變也在對細胞必須的基因以及靶基因中產生，導致大量細胞死亡，而且在高數量的細胞中所說的突變不影響興趣多肽。這類“噪音”將限制突變在靶區域的積累。
因此，本發明的目的是提供一種特定區域的體內靶誘變方法以產生很大數量N的多肽變體。
本發明的第二目的涉及利用現有的和未來的技術，篩選或選擇具有所需性質的變體。
發明概述因此，本發明涉及用于在包含大量突變的遺傳元件的細胞中體內產生文庫的方法，其中易錯聚合酶用于各祖代細胞復制所有或部分遺傳元件，該遺傳元件包含ⅰ)復制起點，復制從該點開始，ⅱ)可有可無的遺傳標記，例如，編碼具有抗抗生素抗性的基因，ⅲ)編碼興趣多肽的基因，該基因不依賴于宿主染色體的復制機制。
本發明還涉及一種用于產生編碼興趣多肽的所需變體的DNA序列的方法，其中ⅰ)突變體文庫利用上述方法產生，ⅱ)在利于所說的興趣基因表達的條件下，培養所說的文庫以產生多肽變體，ⅲ)篩選或選擇所說的具有所需性質的變體多肽，鑒定并分離產生這類所需變體的宿主，ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列；和用于測定編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中
(ⅰ)突變體文庫用上述方法產生，(ⅱ)把所說的文庫在利于所說的興趣基因表達的條件下培養，以產生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所說的所需性質的變體多肽，鑒定并分離產生所需變體的宿主，(ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列。
文庫的篩選或變體的選擇取決于特定多肽，及它的所需改進和/或保持的性質。因此，對每種情況建立篩選方案是必要的。這類方案包括文獻中描述的許多檢驗(Clackson等，自然352:624-628,1991,Bryan,P等，蛋白質1:326-334,1986)。
產生多樣性的結合并選擇具有所需性質的變體的優雅的途徑將是本發明的以噬菌體顯示系統體內產生多樣性的方法的結合(Greg Winter，同上)。
興趣多肽的特定例子是堿性蛋白酶，該酶用于從織物除去蛋白質污點的去污劑工業。在那種情況下，篩選可在實際去污劑組合物中完成以調查性質(如熱穩定性、氧化穩定性、存儲穩定性、底物特異性以及親和性、對不含水的溶劑的穩定性、pH輪廓、離子強度依賴性、催化效率和洗滌性能)。
本發明還涉及用于產生所需的多肽變體的方法，其中(ⅰ)把編碼已經按照上述方法測定的興趣多肽的DNA序列以一定的方式引入合適的宿主中，以便此序列可在所說的宿主中表達，(ⅱ)在利于所說的DNA序列表達的條件下培養所說的宿主，并且(ⅲ)回收所說的多肽變體。
用于引導選擇的DNA序列進入合適的宿主系統的方法在(Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY.)中描述。
選擇合適的生長培養基和選擇的宿主系統的其它條件也在技術人員的能力之內，這些條件利于興趣多肽變體的表達。有關這些內容的指導可在(Sambrook等，同上)中找到。
用于多肽回收的大量方法也可供蛋白質的分離與純化使用，例如，在(Scopes,R.K.,蛋白質純化(1987)，Springer-Verlag)。
最后，本發明涉及用上述方法產生的多肽。
發明詳述本發明包括體內構建興趣基因變體文庫的方法。此方法包括利用遺傳元件(如能夠不依賴于宿主染色體復制系統復制的噬菌體或質粒)。通過利用分離宿主染色體的復制和遺傳元件復制(噬菌體/質粒)的可能性，通過修飾一種復制系統以選擇性地在保持宿主完整染色體的遺傳元件(噬菌體/質粒)中引入突變是可能的。這意味著在興趣基因中產生變異不危及宿主的生存力。
DNA復制是一種高度精確的過程，在大腸桿菌中染色體復制的誤導入率已估計為每輪復制每個堿基10-10次。DNA復制期間進行的堿基配對導致對聚合酶的優先選擇以在一定位置摻入正確的堿基，占全面復制保真性約為105。如果一個不正確的堿基已摻入，聚合酶將停止，3’-5’外切核酸酶常除去3’不正確摻入的堿基。這部分表明的正確讀框占全面復制保真性大約為102。細胞的修復系統占最后103的保真率。
大腸桿菌中染色體的復制大多數通過DNA聚合酶Ⅲ全酶進行，此酶是包含10種不同多肽(包括聚合酶(α-亞單位，polC基因)和3’-5’外切核酸酶(dnaQ基因))的多種蛋白質復合物。
另一種聚合酶(DNA聚合酶Ⅰ(DNA polⅠ,polA基因)包含三種不同的活性，即，DNA聚合酶活性、3’-5’外切核酸酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，盡管事實上它是一種單一的多肽。這種聚合酶在細胞中有多種功能。除DNA修復外，由于它在遲滯DNA鏈合成期間參與DNA片段的組裝，染色體DNA復制也需要DNA polⅠ。然而，它復制的僅是基因組的十分次要的部分。
這種聚合酶還用于某些種類質粒DNA復制的起始，例如，基于ColEⅠ復制起點的質粒(如大腸桿菌和革蘭氏陰性細菌中的pBR322或革蘭氏陽性細菌中的pAMβ1樣質粒)。這類質粒可在沒有以活性形式存在的DNA聚合酶Ⅲ時(例如，如果這種酶由于基因原因機能不良，如在非允許溫度下的溫敏變體)，或細胞中僅存在有限量的DNA聚合酶Ⅲ的條件下，通過DNA聚合酶Ⅰ的活性完全復制。
眾所周知某些突變導致DNA復制保真性的降低(或增加)。已把這些突變作圖以主要駐留于聚合酶、外切核酸酶或修復系統的元件中。遺憾地，這些突變大多數改變/修復現存的完全基因組的保真率，且這類非靶突變也不理想。
這類突變的一個例子可以是DNA polⅠ的3’-5’外切核酸酶活性的滅活。
然而，按照本發明，利用的事實是復制系統的某些元件可以暫時“關閉”(全部或部分)，因此，停止或大大地降低基因組的復制，而如本文限定的某些遺傳元件的復制繼續進行。
包含溫敏DNA polⅢ(即聚合酶α-亞基或使全酶有條件地無功能的另一個溫敏亞基)或染色體復制的起始所需的功能(如基于DnaA、易錯的DNApolⅠ和colEⅠ的包含興趣基因的質粒)的大腸桿菌菌株是按照本發明設計的遺傳系統的例子，以在質粒(和興趣基因)中特異性地引入突變。
在這類系統中，提高溫度至非允許的值將具有的影響是使DNA polⅢ完全停止作用，而易錯的DNA polⅠ將保持它的功能，并以減少的保真性復制質粒，產生質粒的突變拷貝。
由于突變的產生是隨機的，每一種細胞將產生獨特的突變，經降低溫度，溫敏功能將再一次變得活躍，細胞的正常復制繼續。
變體將是具有polⅢ和polⅠ溫敏等位基因的大腸桿菌菌株，且該菌株可(通過ts阻抑物(溫敏)或通過化學誘導)誘導表達易錯聚合酶。在一限制性溫度下，且在誘導物存在時，突變將在遺傳元件中積累。在允許溫度下，且缺乏誘導物時，完全系統作為野生型細胞起作用。
因此，本發明的第一方面涉及用于在包含大量突變的遺傳元件的細胞中體內產生突變體文庫的方法，其中易錯聚合酶用于各祖代細胞復制所有或部分遺傳元件，該遺傳元件包含ⅰ)復制起點，復制由此開始，ⅱ)可有可無的遺傳標記，例如賦予對抗生素的抗性的基因，ⅲ)編碼興趣多肽的基因，該基因不依賴于宿主染色體的復制機制。
因而，本發明包含用于在包含大量突變的遺傳元件的細胞中體內產生突變體文庫的方法，此方法包括A)提供細胞，該細胞具有
ⅰ)易錯聚合酶將復制全部或部分遺傳元件，其中所說的酶不依賴于所說的細胞的染色體復制機制，所說的遺傳元件包含a)復制起點，復制由此開始，b)可有可無的遺傳標記，例如，賦予對抗生素的抗性的基因，c)編碼興趣多肽的基因，和ⅱ)染色體的復制機制，這可以可逆地誘導為實質上無功能的，B)在利于這種細胞復制的條件下，培養這種細胞以獲得大量祖代細胞，C)在所說的祖代細胞中可逆地誘導所說的染色體的復制機制以成為實質上無功能的，達足夠的時間以使得所說的遺傳元件通過所說的異錯聚合酶復制以在所說的遺傳元件中產生突變，D)在這類突變細胞中，可逆地誘導所說的染色體的復制機制以成為實質上無功能的，E)在利于這類突變細胞復制的條件下，培養這類突變細胞。
在本文中，表達“突變體文庫”意味著一套細胞(細菌或噬菌體)(典型地為105-1013個細胞或噬菌體)，它們由于編碼興趣多肽的一種特殊基因而不同。典型地，人們將可能在文庫的每個成員中，引入一種或多種不同的氨基酸以改變這種特殊的多肽。
在本文中，表達“易錯聚合酶”意指在DNA復制過程中，聚合酶將以比通常用于這一目的的聚合酶(例如大腸桿菌DNA polⅠ、枯草芽孢桿菌DNA polⅠ、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶)更高的頻率摻入錯誤(在一個給定位置的一個錯誤的核苷酸或引起一個或幾個核苷酸的缺失或插入)。
在本文中表達“祖代細胞”意指其中沒有突變引入的這類細胞。在本發明的某些實施方案中，突變循環可以重復，在那種情況下，這類最初突變的細胞將成為第二個突變循環的祖代細胞，等等。
在本文中表達“宿主染色體復制機制”意指DNA聚合酶或DNA聚合酶全酶，這些酶主要負責宿主染色體的復制，例如，大腸桿菌中的DNA聚合酶Ⅲ。
在本文中，表達“遺傳元件”意指由RNA或DNA組成的一種小(從1或2千個堿基到100千個堿基)實體，此實體可獨立地復制，即它包含復制起點。典型地，遺傳元件將是噬菌體、噬菌粒或質粒。按照本發明，遺傳元件也必須包含編碼興趣多肽的基因，它還可包含遺傳標記，例如賦予對抗生素的抗性的基因。
能夠不依賴于宿主復制機制復制的病毒、逆轉錄病毒或轉座子(例如逆轉錄轉座子)也可用作“遺傳元件”。
Kim和Loeb(1995,PNAS 92:684-688)已表明HIV逆轉錄酶(HIV-RT)能夠補充大腸桿菌DNApolⅠ關于染色體DNA的復制和質粒DNA復制的起始。HIV-RT(和相關的逆轉錄病毒的逆轉錄酶)的誤摻入率比DNA polⅠ的比率高幾個數量級的大小，即每輪復制中每個堿基10-3-10-4個誤摻入。在本發明的實施方案中，這類聚合酶替代突變的易錯大腸桿菌DNA polⅠ的利用將明顯地增加上述系統中復制錯誤的頻率。
在本發明的另一個實施方案中，上述的突變循環可重復，即開關誘變聚合酶數次，因此產生更多突變體。此外，如果多拷貝質粒用作遺傳元件，這個步驟還可幫助質粒的分離。
在某些遺傳元件中，人們可預見僅部分定位在復制起點附近的遺傳元件由易錯聚合酶復制。在這種情況下，興趣基因應該位于這一區域內。
在本發明的特定實施方案中，遺傳元件是噬菌體，其中編碼興趣多肽的基因定位于基因座，在此表達的多肽從噬菌體表面顯示，因此篩選可直接完成(參見，Greg Winther，同上)。為確保噬菌體的DNA序列和顯示的蛋白質之間的對應，選擇或篩選前，初級噬菌體庫應以低感染復數通過野生型大腸桿菌。
為進一步增加突變的頻率，本發明的方法包括實施方案，在這些實施方案中，所說的方法與修復缺損的宿主(例如mutL、mutS、mutH)或增變基因基因組類型的組合結合使用。
在本文中，表達“修復缺損的宿主”意指包含一種或多種基因變化的細胞，其中所說的基因編碼已知直接或間接參與DNA修復的蛋白質。這類突變的結果是引入的更高頻率的突變(通過聚合酶、化學藥品、X-射線、UV線等)將被修復并將“永久地”摻入基因組中，成為所謂的增變基因表型。這類基因的例子是mutL、mutS、mutH、mutT。
作為遺傳元件，如上述表明的，人們可能利用噬菌粒替代質粒，以將變體產生連接到顯示系統上，例如M13、fI、fd。
在本文中，表達“噬菌粒”意指一種質粒，除它的質粒復制起點外，該質粒還含有噬菌體的復制起點。噬菌粒依賴于能夠作為一種質粒或作為一種噬菌體(經用輔助噬菌體感染)復制的條件。
基于噬菌粒的系統將包括噬菌粒的構建，該噬菌粒包含1)質粒的復制起點，例如ColEⅠ2)M13噬菌體的復制起點3)由興趣基因組成的嵌合基因，其中該興趣基因融合于編碼GⅢ蛋白質的基因(φrum,P等，核酸研究21:4491-4498,1993)。
第一個步驟是通過生長/保持大腸桿菌菌株產生多樣性，其中所說的大腸桿菌菌株以如上述的這種噬菌粒轉化。第二個步驟是以輔助噬菌體感染以構造將包裝到噬菌體微粒中的單鏈噬菌粒。然后，可對顯示變體蛋白質的噬菌體進行選擇。
某些噬菌體(如大腸桿菌中的T4或T7或芽孢桿菌中的SPOⅡ及Phi29)也包含它們自己的DNA聚合酶，且按照本發明，人們能預見實施方案，其中如上述的遺傳元件是包含易錯DNA聚合酶的噬菌體。
按照本發明，易錯聚合酶典型地選自DNA聚合酶Ⅰ或逆轉錄酶。一種優選的易錯聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或HIV逆轉錄酶的變體。
作為一種興趣多肽，大數量是可能的，尤其是，這類顯示生物活性的多肽可論及。其中，這些多肽是對預防和治療人類和動物中各種紊亂和疾病重要的酶、激素、受體、凝血因子、抗微生物劑及其它這類多肽。
用于工業目的的酶也可論及。在這類工業酶中，這些酶屬于羰基水解酶、羧基水解酶、氧化還原酶、轉移酶、植酸酶、抗微生物的多肽、氧化還原酶、異構酶、裂合酶及連接酶。
在本文中，表達“羰基水解酶”意指水解包含-C(=O)-X基團的化合物，其中所說的X是氧或氮的酶。
屬于羰基水解酶的特定種類是如水解酶(脂酶)和肽水解酶(蛋白酶)。
本文蛋白酶意指作為按照國際生物化學聯合會與分子生物學(IUBMB)的提議(1992)在酶分類號E.C.3.4下劃分的酶。
實施例包括選自那些在酶分類(E.C.)號下劃分的蛋白酶
3.4.11(即所謂的氨肽酶)，包括3.4.11.5(脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.10(細菌亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12(嗜熱桿菌氨肽酶)、3.4.11.15(賴氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰氨肽酶)、3.4.11.18(蛋氨酰氨肽酶))；3.4.21(即所謂的絲氨酸內肽酶)，包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(Cucumisin)、3.4.21.32(Brachyurin)、3.4.21.48(塞里維辛)和3.4.21.62(枯草菌素)；3.4.22(即所謂的半胱氨酸內肽酶)，包括3.4.22.2(番木瓜酶)、3.4.22.3(無花果蛋白酶)、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(蘿摩蛋白酶)、3.4.22.14(Actinidain)、3.4.22.30(番木瓜蛋白酶)以及3.4.22.31(Ananain)；3.4.23(即所謂的天冬氨酸內肽酶)，包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(曲霉胃蛋白酶Ⅰ)、3.4.23.20(青霉蛋白酶)以及3.4.23.25(酵母蛋白酶)；和3.4.24(即所謂的有機金屬內肽酶)，包括3.4.24.28(桿菌溶素)。
相關的枯草桿菌蛋白酶的例子包含枯草桿菌蛋白酶BPN＇、枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶腸膜菌素肽酶、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、thermitase、水溶素、芽孢桿菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7以及蛋白酶TW3。
這類易于得到的市售蛋白酶的特定例子包括Esperase、Alcalase、Neutrase、Dyrazym、Savinase、Pyrase、胰蛋白酶NOVO(PTN)、Bio-FeedTMPro、Clear-Lens Pro(由Novo Nordisk A/S提供所有酶)。
其它市售蛋白酶的例子包括由Gist-Brocades N.V.銷售的Maxatase、Maxacal、Maxapem、由Solvay et Cie銷售的Opticlean和由Genencor International銷售的Purafect。
人們將理解蛋白酶變體也期待作為興趣多肽。這類蛋白酶變體的例子在EP 130.756(Genentech)、EP214.435(Henkel)、WO87/04461(Amgen)、WO 87/05050(Genex)、EP251.446(Genencor)、EP260.105(Genencor)、Thomas等，(1985)，自然318,p.375-376,Thomas等，(1987)，分子生物學雜志，193,pp.803-813,Russel等，(1987)，自然328,p.496-500,WO 88/08028(Genex)、WO88/08033(Amgen)、WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)、WO91/00345(Novo Nordisk A/S)、EP525 610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.)中公開。
蛋白酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第5卷描述的測定。
本文的脂酶意指作為依據國際生物化學聯合會與分子生物學(IUBMB)的提議(1992)，在酶分類號E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)下劃分的酶。
實施例包括選自屬于酶分類(E.C.):3.1.1(即所謂的羧酸酯水解酶)(包括(3.1.1.3)三酰甘油脂酶、(3.1.1.4.)磷脂酶A2)的那些酶中的脂酶。
脂酶的例子包括來源于下列微生物的脂酶。指明的專利出版物本文一并參考腐質霉屬(例如H.brevispora、H.lanuginosa、H.brevis var.thermoidea和H.insolens(US 4,810,414))、假單胞菌屬(例如莓實假單胞菌、施氏假單胞菌、蔥頭假單胞菌和熒光假單胞菌(WO 89/04361)或Pseudomonas plantarii或Pseudomonas gladioli(US專利號4,950,417(Solvay酶))或產堿假單胞菌和假產堿假單胞菌(EP 218 272)或門多薩假單胞菌(WO 88/09367；US 5,389,536))、鐮孢屬(例如尖鐮孢(EP130,064)或腐皮鐮孢pisi(WO 90/09446))、毛霉屬(也稱根毛霉屬)(例如米黑毛霉(EP 238 023))、色素桿菌屬(尤其是粘稠色素桿菌)、曲霉屬(尤其是黑曲霉)、假絲酵母屬(例如C.cylindracea(也稱皺落假絲酵母)或C.antarctica(WO 88/02775)或C.antarctica脂酶A或B(WO 94/01541和WO89/02916))、地霉屬(例如白地霉(Schimada等，(1989)，生物化學雜志，106,383-388))、青霉屬(例如沙門柏干酪青霉(Yamaguchi等)，(1991)，基因，103,61-67))、根霉菌屬(例如R.delemar(Hass等，(1991)，基因，109,107-113)或雪白根霉(Kugimiya等，(1992)，生物科學生物技術生物化學，56,716-719)或米曲霉))、芽孢桿菌屬(例如枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993),Biochemica等，生物物理學學報，1131,253-260)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/7744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422))。
易于得到的市售脂酶的特定例子包括Lipolase、LipolaseTMUltra、Lipozyme、Palatase、Novozym435、Lecitase(全部由Novo Nordisk A/S提供)其它脂酶的例子是LumafastTM，來自Genencor Int.公司的門多薩假單胞菌脂酶、LipomaxTM，來自Gist Brocades/Genencor Int.公司的假產堿假單胞菌脂酶、來自Unilever的腐皮鐮孢脂酶(角質酶)、來自Solvayenzymes的Bacillus sp.脂酶。其它脂酶可由其它公司得到。
脂酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinhein，第4卷描述的，或如在AF 95/5 GB(可向Novo NordiskA/S請求獲得)中描述的測定。
在本文中，表達“糖酶”意指所有能夠打斷五碳和六碳的特定環狀結構的糖鏈(例如淀粉)的酶(即按照國際生物化學和分子生物學聯合會(IUBMB)的提議(1992)，屬于酶分類號E.C.3.2(糖苷酶)的酶。能夠使碳水化合物，例如六碳環狀結構的碳水化合物(如D-葡萄糖)異構化為例如五碳環狀結構(如D-果糖)的酶也包括在本發明的糖酶組中。
糖酶的例子包括選自屬于酶分類(E.C.)號的糖酶α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、內-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、殼多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1,4-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖內1,3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精內1,6-葡糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內1,3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內1,6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖內1,5-α-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、殼多聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖異構酶(5.3.1.5)。
有關糖酶的例子包括來源于Trichoderma harzianum的α-1,3-葡聚糖酶、來源于阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、殼多聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖異構酶(5.3.1.5)的α-1,6-葡聚糖酶。
有關糖酶的例子包括來源于Trichoderma harzianum的α-1,3-葡聚糖酶、來源于擬青霉屬菌株的α-1,6-葡聚糖酶、來源于枯草芽孢桿菌的β-葡聚糖酶、來源于Humicola insolens的β-葡聚糖酶、來源于黑曲霉的β-葡聚糖酶、來源于木霉屬菌株的β-葡聚糖酶、來源于溶黃嘌呤厄氏菌菌株的β-葡聚糖酶、來源于黑曲霉的外-1,4-α-D-葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)、來源于枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶、來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶、來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶、來源于米曲霉的α-淀粉酶、來源于非病原微生物的α-淀粉酶、來源于黑曲霉的α-半乳糖苷酶、來源于Humicola insolens的戊聚糖酶(Pentosanases)、木聚糖酶、纖維二糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、來源于Trichoderma reesei的纖維素酶、來源于非病原霉菌的纖維素酶、來源于黑曲霉的果膠酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶(arabinases)、半纖維素酶、來源于薄青霉的葡聚糖酶、來源于非病原霉菌的內葡聚糖酶、來源于Bacillus acidopullyticus的pullulanases、來源于脆壁克魯維酵母的β-半乳糖苷酶、來源于Trichoderma reesei的木聚糖酶。
易于得到的市售糖酶的特定例子包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTMAlpha、Bio-FeedTMBeta、Bio-FeedTMPlus、Bio-FeedTMPlus、Novozyme188、Carezyme、Celluclast、Cellusoft、Ceremyl、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、Finizym、FuneamylTM、GamanaseTM、Glucanex、Lactozym、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、Promozyme、PulpzymeTM、NovamylTM、Termamyl、AMG(淀粉葡糖苷酶Novo)、Maltogenase、Sweetzyme、Aquazym(由Novo Nordisk A/S提供所有的酶)。其它糖酶可由其它公司得到。
人們將理解這類糖酶變體也期待作為興趣多肽。
糖酶的活性可如在“酶促分析方法”，第三版，1984,Vellag Chemie,Weinheim，第4卷中描述的測定。
本文氧化還原酶意指依據國際生物化學與分子生物學聯合會(IUBMB)的提議(1992)，屬于酶分類號E.C.1(氧化還原酶)下的酶。
氧化還原酶的例子包括選自屬于酶分類(E.C.)號的氧化還原酶甘油-3-磷酸脫氫酶(NAD+)(1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脫氫酶NAD(p)+(1.1.1.94)、甘油-3-磷酸1-脫氫酶(NADP)(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、兒茶酚氧化酶(1.1.3.14)、膽紅素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脫氫酶(1.4.1.1)、谷氨酸脫氫酶(1.4.1.2)、谷氨酸脫氫酶(NAD(P)+)(1.4.1.3)、谷氨酸脫氫酶(NADP+)(1.4.1.4)、L-氨基酸脫氫酶(1.4.1.5)、絲氨酸脫氫酶(1.4.1.7)、纈氨酸脫氫酶(NADP+)(1.4.1.8)、亮氨酸脫氫酶(1.4.1.9)、甘氨酸脫氫酶(1.4.1.10)、L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)、6-賴氨酸蛋白質氧化酶(1.4.3.13)、L-賴氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-氨基酸脫氫酶(1.4.99.1)、蛋白質二硫化物還原酶(1.6.4.4)、硫氧還蛋白還原酶(1.6.4.5)、蛋白質二硫鍵還原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、過氧化氫酶(1.11.1.6)、過氧化物酶(1.11.1.7)、脂氧合酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。
所說的葡萄糖氧化酶可來源于黑曲霉。
所說的漆酶可來源于Polyporus pinsitus、Myceliophtorathermophila、灰蓋鬼傘、立枯絲核菌、Rhizoctonia praticola、Scytalidiumthermophilum和Rhus vernicifera。
膽紅素氧化酶可來源于Myrothechecium verrucaria。
例如，過氧化物酶可來源于大豆、辣根或灰蓋鬼傘。
蛋白質二硫鍵還原酶可以是任何DK專利申請no.768/93,265/94和264/94(Novo Nordisk A/S)中論及的任意一種，這些本文一并參考，也包括牛來源的蛋白質二硫鍵還原酶、來源于米曲霉或黑曲霉的蛋白質二硫鍵還原酶及來源于大腸桿菌的DsbA或DsbC。
易于得到的市售氧化還原酶的特定例子包括GluzymeTM(由NovoNordisk A/S提供的酶)。然而其它氧化還原酶可由其它公司得到。
人們將理解氧化還原酶變體也期待作為興趣多肽。
氧化還原酶的活性可如在“酶促分析方法”，第三版，1984,VerlagChemie,Weinheim，第3卷中描述的測定。
在本文中，轉移酶按照國際生物化學與分子生物學聯合會(IUBMB)的提議(1992)，屬于酶分類號E.C.2的酶。
轉移酶可以是轉移酶亞組的任何轉移酶轉移一碳基團的轉移酶(E.C.2.1)、轉移醛或殘基的轉移酶(E.C.2.2)、酰基轉移酶(E.C.2.3)、葡糖基轉移酶(E.C.2.4)、轉移烷基或芳基基團、其它甲基基團的轉移酶(E.C.2.5)、轉移含氮基團的轉移酶(2.6)。
在一優選的實施方案中，轉移酶是轉谷氨酰胺酶E.C 2.3.2.13(谷氨酰胺蛋白質γ-谷氨酰胺轉移酶)。
轉谷氨酰胺酶是能夠催化酰基轉移反應的酶，其中結合肽的谷氨酰胺殘基的γ-甲酰氨基是酰基供體。在各種化合物中，伯氨基基團可作為酰基受體起作用，隨后形成結合肽的谷氨酸的單一取代的γ-酰胺。當肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基用作酰基受體時，轉移酶形成分子內或分子間γ-谷氨酰基-ε-賴氨酰交叉連接。
轉谷氨酰胺酶的例子在未決的DK專利申請990/94(Novo Nordisk A/S)中描述。
轉谷氨酰氨酶可以是來源于人、動物(例如牛)或微生物的。
這類轉谷氨酰胺酶的例子是動物衍生的轉谷氨酰胺酶、FXⅢa；來源于Physarum polycephalum的微生物轉谷氨酰胺酶(Klein等，細菌學雜志，174,p.2599-2605)；來源于Streptomyces sp.(包含Streptomycelavendulae、利迪鏈霉菌(以前的黎巴嫩鏈霉菌)及Streptoverticillium sp.(包括茂原鏈輪絲菌、肉桂鏈輪絲菌和灰肉色鏈輪絲菌)的轉谷氨酰胺酶(Motoki等，US5,156,956；Andou等，US5,252,469；Kaempfer等，普通微生物學雜志，137,1831-1892；Ochi等，國際系統細菌學雜志，44，285-292；Andou等，US5,252,469；Williams等，普通微生物學雜志，129,1743-1813)。
人們將理解轉移酶變體也期待作為興趣多肽。
轉谷氨酰胺酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,VerlagChemie,Weinheim，第1-10卷中描述的測定。
在本文中，植酸酶依據國際生物化學與分子生物學聯合會(IUBMB)的提議(1992)，屬酶分類號E.C.3.1.3(磷酸單酯水解酶)的酶。
植酸酶是由微生物產生的酶，該酶催化植酸酯轉化為肌醇和無機磷。
產生植酸酶的微生物包含細菌(如枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和假單胞桿菌)、酵母(如釀酒酵母)及真菌(如黑曲霉、無花果曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、土曲霉或構巢曲霉以及各種其它曲霉屬物種)。
植酸酶的例子包括選自屬于酶分類(E.C.)號3-植酸酶(3.1.3.8)和6-植酸酶(3.1.3.26)的那些植酸酶。
植酸酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷描述的測定，或可按照EP-A1-0 420 358，實施例2A中描述的方法測定。
在本文中，抗微生物多肽可以是任何顯示抗微生物活性(如抗真菌、抗細菌和/或抗殺蟲劑活性)的多肽。
這類多肽也可以顯示其它活性，如酶活性。
按照本發明，抗微生物的多肽的例子包括WO 94/01459(NovoNordisk A/S)中描述的，來源于霉菌彎孢霉屬的殺真菌活性多肽；EP403.458(Kabigen AB)描述的抗細菌多肽；WO 92/15691(ImperialChem Ind.PLC)中描述的從Mirabilis種子分離的抗微生物蛋白質；WO92/22578(Boman等)中描述的從豬小腸的抽提物中分離的抗細菌多肽；如JP-60130599中描述的，具有由Hansenula spp.的酵母積累的酵母致死作用的多肽；Phytolacca insularis抗病毒蛋白質，此蛋白質可用作美國專利no.5,348,865(Jin Ro有限公司)中描述的抗微生物劑；來源于美國專利no.5,354,681(Novo Industri A/S)中描述的達松維爾擬諾卡氏菌的細菌裂解酶制劑。
其它抗微生物多肽的例子是爪蟾抗菌肽、protegrin、防衛素、假霉菌素、mutanolysin和N-乙酰溶菌酶。
另一方面，本發明涉及用于產生編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)突變體文庫用上述方法產生，(ⅱ)在利于所說的興趣基因表達的條件下，培養所說的文庫以產生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質的所說的變體多肽，以及鑒定并分離產生所需變體的宿主，(ⅳ)分離編碼所說的變體的DNA。
另一方面，本發明涉及用于測定編碼興趣多肽所需變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)如上述的產生突變體文庫，
(ⅱ)把所說的文庫在利于所說的興趣基因表達的條件下培養以產生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質的所說的變體多肽，及鑒定并分離產生所需變體的宿主，(ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列。
本發明的這一方面可通過稀釋(例如，在微滴定板上)并培養文庫完成，因此，形成每一源于文庫的一個成員的群體，篩選每個群體中產生的具有所需性質的變體多肽。作為選擇，可把文庫在包含所需的生長培養基的瓊脂板上培養，其中所說的培養基可使得篩選或選擇具有所需性質的變體多肽。
如果利用噬菌體顯示方法，篩選或選擇直接由噬菌體完成。
用于選擇的標準將按照興趣多肽變體的最終用途變化，但典型地，檢驗的性質可包括各種培養基的溶解性和半衰期、抗原性和變應原性、熱穩定性、氧化穩定性、存儲穩定性、底物特異性和親和性、對非水溶劑的穩定性、pH輪廓、離子強度依賴性、催化效率以及與其它預見的終產品的組分的相容性，其中，多肽變體將形成終產品的一部分。
對將用于去污劑的酶，調查的進一步性質是洗滌性能和與各種表面尤其是織物的相容性。
其它的許多標準可能論及。
一經鑒定產生滿足選擇的標準的變體多肽的群體，便可利用本領域眾所周知的方法，分離編碼興趣多肽變體的DNA，并測序。
本發明還包含用于產生所需的多肽變體的方法，其中ⅰ)把如上表明的測定的DNA序列以一定方式引入合適的宿主中，因此，此序列可在所說的宿主中表達，(ⅱ)在利于所說的DNA序列表達的條件下培養所說的宿主，并且(ⅲ)回收所說的多肽變體。
本發明可以任何細胞，尤其是以任何微生物細胞利用，但通常適合于利用原核生物，尤其是細菌，優選地為芽孢桿菌屬的細菌等。
在芽孢桿菌中，優選的是利用選自遲緩芽孢桿菌、地衣型芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等的菌株。
對于某些用途，優選的是利用微生物細胞，該細胞是真菌，尤其是絲狀真菌，優選地是曲霉屬、木霉屬等的細胞。
在曲霉屬中，優選的是利用選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等的菌株。
在木霉屬中，優選的是利用選自T.reseei等的菌株。
在其它的情況下，更有利的是利用選自BHK等細胞的哺乳動物細胞。
本發明不應該僅限于以上說明書中提及的特定例子或實施方案或以下實施例。
材料和方法實施例實施例1利用的系統是大腸桿菌宿主細胞，該細胞由許多染色體突變來表征，這些突變是ⅰ)poIC基因的ts(溫敏)突變，其中所說的基因編碼DNA聚合酶Ⅲ，該酶是主要的復制聚合酶ⅱ)poIA基因的突變，其中所說的基因編碼DNA聚合酶Ⅰ，其中所說的突變3’-5’外切核酸酶活性的降低導致錯誤率增加。
ⅲ)由于mutL突變的修復缺陷。
體內誘變的靶是具有(ⅰ)讀框變換突變或(ⅱ)引入到tet基因中的終止密碼子的質粒pBR322(colEl起點)，編碼具有抗四環素抗性的蛋白質。
每一種情況下，突變的修復導致一種顯性四環素抗性表型。
pBR322也含有編碼具有抗氨芐青霉素抗性的bla基因。平板培養暴露在“引入突變”的條件下的培養物后，靶區域的高頻誘變被看作是四環素抗性菌落的高頻出現。
把在37℃下生長至660nm處測得光密度為1的大腸桿菌培養物暴露于限制性溫度(例如42℃)下2、4或16小時。在所述的這些時間點，把培養物的稀釋系列鋪覆在以1)氨芐青霉素(AmpR菌落)，2)四環素和氨芐青霉素(AmpR和tetR菌落)補充的LB瓊脂平板上。
四環素抗性菌落與氨芐青霉素抗性菌落的比率表明在含有修復的tet基因的一個拷貝的培養物中的細胞數目，其中所說的修復的tet基因表明一個特異性誘變事件。
這意指，如果克隆具有四環素抗性，至少已發生一種特異性突變，以修復最初引入的基因缺損。
說明書中引用的參考文獻Greg Winter，現代免疫學方法5:253-255,1993Griffiths,A.D.等，1994,EMBO雜志，14:3245-3260Clackson等，自然352:624-628,1991Bryan,P等，蛋白質1:326-334,1986Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NYScopes,R.K.，蛋白質純化(1987),Springer-Verlag Kim和Loeb(1995,PNAS 92:684-688)φrum,P等，核酸研究21:4491-4498,1993EP130.756(Genentech),EP214.435(Henkel),WO87/04461(Amgen),WO 87/05050(Genex),EP251.446(Genencor),EP260.105(Genencor),Thomas等(1985)自然318,375-376,Thomas等(1987)，分子生物學雜志，193:803-813,Russel等，(1987)，自然328:496-500,WO 88/08028(Genex),WO 88/08033(Amgen),WO89/06279(Novo Nordisk A/S),WO 91/00345(Novo Nordisk A/S),EP525610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.),US4,810,414,WO89/04361，美國專利no.4,950,417(Solvay enzymes),EP218 272,WO88/09367,US 5,389,536,EP130,064,WO 90/09446),EP238 023,WO 88/02775,WO 94/01541,WO 89/02916,Schimada等，(1989),生物化學雜志106,383-388,Yamaguchi等，(1991)，基因103,61-67,Hass等，(1991)，基因109,107-113,Kugimiya等，(1992)，生物科學、生物技術、生物化學56,716-719,Dartois等，(1993)，生物化學和生物物理學學報1131,253-260,JP 64/7744992,WO 91/16422,WO93/01285,WO 95/22615,DK專利申請no.768/93、265/94和264/94(Novo Nordisk A/S),DK專利申請no.990/94(Novo Nordisk A/S),Klein等，細菌學雜志，174,p.2599-2605,Motoki等，US 5,156,956；Andou等，US 5,252,469；Kaempfer等，普通微生物學雜志，137,1831-1892；Ochi等，國際系統細菌學雜志，44,285-292；Andou等，US 5,252,469；Williams等，普通微生物學雜志，129,1743-1813,WO 94/01459(Novo Nordisk A/S),EP403.458(Kabigen AB),WO92/15691(Imperial Chem Ind.PLC),WO 92/22578(Boman等)，JP-60130599，美國專利no.5,348,865(Jin Ro有限公司)，美國專利no.5,354,681(Novo Industri A/S)。
酶促分析方法，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷。
AF 95/5 GB(可以向Novo NordiskA/S請求獲得)。
權利要求
1．一種用于在包含許多突變的遺傳元件的細胞中體內產生文庫的方法，其中，一種易錯聚合酶用于各祖代細胞復制所有或部分遺傳元件，該遺傳元件包括ⅰ)復制起點，復制從此開始，ⅱ)可有可無的遺傳標記，例如，賦予對抗生素的抗性的基因，ⅲ)編碼興趣多肽的基因，該基因不依賴于宿主染色體的復制機制。
2．一種用于在包含許多突變的遺傳元件的細胞中體內產生文庫的方法，該方法包括A)提供微生物細胞，該細胞具有ⅰ)易錯聚合酶，該酶不依賴于所說的細胞的染色體復制機制，復制全部或部分遺傳元件，該遺傳元件包含a)復制起點，復制從此開始，b)可有可無的遺傳標記，例如，賦予對抗生素的抗性的基因，c)編碼興趣多肽的基因，ⅱ)染色體的復制機制，此機制可以可逆地誘導為實質上無功能，B)在利于這類細胞復制的條件下，培養這類細胞以獲得許多祖代細胞，C)在所說的祖代細胞中可逆地誘導所說的染色體復制機制以成為實質上無功能的，達一段時間以使得足可通過所說的易錯聚合酶復制所說的遺傳元件，以在所說的遺傳元件中產生突變，D)在這類突變細胞中可逆地誘導所說的染色體復制機制成為實質上無功能的，E)在利于這類突變細胞復制的條件下，培養這類突變細胞。
3．權利要求1或2的方法，其中所說的細胞還包含缺損修復系統。
4．權利要求1-3之任一的方法，其中所說的遺傳元件是質粒、噬菌粒、噬菌體、病毒、逆轉錄病毒或逆轉錄轉座子。
5．權利要求1-4之任一的方法，其中所說的細胞是微生物細胞。
6．權利要求1-5之任一的方法，其中所說的易錯聚合酶選自DNA polⅠ、DNA pol Ⅱ、逆轉錄酶，更具體地說選自大腸桿菌DNA polⅠ、枯草芽孢桿菌DNA polⅠ、HIV逆轉錄酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶。
7．權利要求1-6之任一的方法，其中所說的可以可逆誘導為實質上無功能的染色體復制機制是溫敏大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ。
8．一種用于測定編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)用權利要求1-7之任一的方法產生突變體文庫，其中所說的遺傳元件包含編碼所說的興趣多肽的基因，(ⅱ)在利于所說的興趣基因表達的條件下，培養所說的文庫以產生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質的所說的變體多肽，鑒定并分離產生所需變體的宿主，(ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列。
9．一種用于產生編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)用權利要求1-7之任一的方法產生突變體文庫，其中所說的遺傳元件包含編碼所說的興趣多肽的基因，(ⅱ)在利于所說的興趣基因表達的條件下，培養所說的文庫以產生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質的所說的變體多肽，鑒定并分離產生所需變體的宿主，(ⅳ)分離編碼所說變體的DNA。
10．一種產生所需多肽變體的方法，其中(ⅰ)把按照權利要求9獲得的或按照權利要求8測定的DNA序列以一定方式引入合適的宿主中，以便該DNA序列可在所說的宿主中表達，(ⅱ)在利于所說的DNA序列表達的條件下，培養所說的宿主，(ⅲ)回收所說的多肽變體。
11．權利要求1-10之任一的方法，其中所說的興趣多肽是一種酶。
12．權利要求11的方法，其中所說的酶是羰基水解酶、糖酶、氧化還原酶、轉移酶、植酸酶、連接酶、裂合酶及抗微生物多肽。
13．權利要求12的方法，其中所說的羰基水解酶是蛋白酶或脂酶。
14．權利要求12的方法，其中所說的糖酶是淀粉酶、葡糖苷酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、殼多糖酶、聚半乳糖醛酸酶、溶菌酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、乳糖酶、殼質酶、木糖異構酶、果膠酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶、內葡聚糖酶。
15．權利要求12的方法，其中所說的氧化還原酶是脫氫酶、氧化酶、還原酶、漆酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、脂氧合酶、超氧化物歧化酶。
16．權利要求12的方法，其中所說的轉移酶是轉移一碳基團的轉移酶、轉移醛或殘基的轉移酶、酰基轉移酶、葡糖基轉移酶、轉移烷基或芳基、其它甲基基團的轉移酶、轉移含氮基團的轉移酶。
17．權利要求1-16之任一的方法，其中所說的細胞是原核生物，尤其是細菌，優選的是芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、葡萄球菌屬及鏈球菌屬細菌。
18．權利要求17的方法，其中所說的埃希氏桿菌屬是從大腸桿菌中選擇的菌株。
19．權利要求17的方法，其中所說的芽孢桿菌是選自遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的菌株。
20．權利要求1-16之任一的方法，其中所說的細胞是真菌，尤其是酵母或絲狀真菌，優選的是曲霉屬、木霉屬的真菌。
21．權利要求20的方法，其中所說的曲霉屬選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉。
22．權利要求20的方法，其中所說的木霉屬選自T.reseei。
23．權利要求1-16之任一的方法，其中所說的細胞是選自BHK細胞或昆蟲細胞的哺乳動物細胞。
全文摘要
本文描述了一種用于在包含許多突變的遺傳元件的細胞中體內產生文庫的方法,其中,一種易錯聚合酶用于各祖代細胞復制所有或部分不依賴于宿主染色體復制機制的遺傳元件。這些遺傳元件包括:i)復制起點,從該起點開始復制,ii)可有可無的遺傳標記,例如,賦予對抗生素的抗性的基因,iii)編碼興趣多肽的基因。本文也描述了用于產生編碼所需的興趣多肽變體的DNA序列以及測定這類DNA序列的方法。
文檔編號C12N15/10GK1210557SQ9719197
公開日1999年3月10日 申請日期1997年1月10日 優先權日1996年1月10日
發明者T·V·伯徹特, S·D·埃爾利克 申請人:諾沃挪第克公司