改變由生物體產生的磷脂組成的方法和其重組載體的制作方法

專利名稱：改變由生物體產生的磷脂組成的方法和其重組載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及改變由生物體產生的磷脂組成的方法和其重組載體。
磷脂是天然存在的非離子表面活性劑，它們在食品、醫學和各種物質的制備領域中具有使用價值。磷脂主要由生物物質產生，磷脂的組成是決定物質質量的要素之一。
目前人們尚不清楚確定磷脂組成的因素，還未曾報道過通過基因工程改變磷脂組成的方法。
本發明的一個目的是提供一種人工改變由細胞產生的磷脂組成的方法。
本發明人進行了深入的研究，發現通過抑制基因編碼磷脂酶D(下文也稱為“PLD”)的表達可以改變由細胞產生的磷脂的組成，從而完成本發明。
也就是說，本發明提供了一種改變由寄主細胞產生的磷脂組成的方法，所述方法包括用重組體DNA轉化所述的寄主細胞，而重組體DNA具有磷脂酶D基因的反義基因，所述反義基因被表達在所述寄主細胞內，以產生在所述寄主細胞內和磷脂酶D基因的mRNA雜交的mRNA，由此抑制所述磷脂酶D基因的表達。本發明也提供了具有磷脂酶D基因的反義基因的重組體DNA，所述反義基因被表達在所述寄主細胞內，以產生在所述寄主細胞內和磷脂酶D基因的mRNA雜交的mRNA，由此抑制所述磷脂酶D基因的表達。
PLD是一種磷脂酶，例如它催化水解卵磷脂反應以釋放磷脂酸和膽堿。已知這種酶存在于植物、動物和微生物中。在本發明的方法中所使用的寄主細胞可以是任何植物、動物和微生物細胞，只要它們具有PLD基因即可。優選的寄主細胞是植物細胞，更優選地是種子植物的細胞。
本文使用的術語“種子植物”是指開花并形成種子的植物。在本發明的種子植物細胞中，優選使用單子葉植物，尤其是大米。
本發明方法所使用的重組載體包括PLD基因的反義基因，所述反義基因能抑制PLD基因在寄主細胞內的表達。PLD基因的核苷酸序列是已知的。例如，微生物和動物的PLD基因的核苷酸序列描述于日本延遲公開專利申請號平3-187382Adrian L.M.Hodgson，Phllip Bird，和Ian T.Nisbet 1990，“在由假結核病棒狀桿菌產生的磷脂酶D的大腸桿菌中的克隆，核苷酸序列和表達”細菌學(Journal of Bacteriology)172，1256-1261；和日本延遲公開專利申請號平5-76357中。就植物的PLD基因而言，在WO95/09234中公開了大米和玉米的PLD基因的核苷酸序列。此外，還報道了由擬南芥屬和蓖麻子產生的PLD基因(《植物生理學》(Plant Physiol)(1995)1091497-1499，植物基因登記號PG95-096，《生物化學》(J.Biol.Chem.)(1994)26920312-20317)。
在上述參考文獻(植物基因登記號PGR95-096)中，描述了由大米、玉米、擬南芥屬和蓖麻子產生的PLD基因彼此是高同系的，因而建議種子植物的PLD基因是很好保藏。
因此，通過常規方法，采用上述的大米、玉米和諸如探針的PLD基因序列可以容易地獲得種子植物的PLD基因。
由于PLD基因的核苷酸序列是已知的，因此反義基因易于制備，它們產生的mRNAs互補于使用PLD基因作模板而產生的mRNAs的至少一個區域。也就是說，PLD基因的反義基因是一種具有相同的序列的雙鏈DNA作為完整的或部分的PLD基因，它們將被插入在起反義鏈作用的PLD基因的有義鏈方向上(下文也稱之為“插入在反義方向上”)。反義基因的長度未必是PLD基因的全部長度，但可以是抑制PLD基因表達的長度。即反義基因的長度優選地不少于300bp并且不超過PLD基因的全部長度，更優選地不超過lkbp并且不超過PLD基因的全部長度。
由于PLD基因的核苷酸序列是已知的，所以PLD基因的反義基因可容易地通過化學合成，通過采用PLD基因作為模板的PCR或通過采用PLD基因的cDNAs作為模板的RT-PCR而制備。
在本發明中，對欲引入的反義基因是沒有限制，只要該反義基因編碼mRNA即可，而該mRNA在活體內和在寄主細胞內的PLD基因的mRNA雜交。由反義基因產生的mRNA和寄主內的PLD基因的mRNA互補鏈之間的同系現象優選地不超過70％，更優選地不超過80％，最優選地不超過90％，尤為優選地不超過95％，最好不超過100％(即寄主細胞內的PLD基因的反義基因)。
在本發明方法中使用的重組載體是一種可以在寄主細胞內表達上述PLD基因的反義基因的重組載體。因此，重組載體在寄主細胞和啟動子內具有復制起點的作用，并且反義基因被插入到啟動子的下游中。優選地，重組載體具有終止區和選擇性標記，例如抗藥基因。這類表達載體的數量對于各種寄主細胞來說是已知的并且可以從市場上購得。由于市售的表達載體具有稱為多克隆位點的區域，而該位點具有多個啟動子下游的限制性位點，所以本發明的重組載體可以容易地通過將上述反義基因插入到多克隆位點上來制備。
然后用按上述方法制備的重組載體來轉化寄主細胞。可以通過對于各種類型的寄主細胞來說眾所周知的方法進行這種轉化。例如，在下面描述的實施例中，采用眾所周知的電穿孔法來轉化大米細胞。但是，不用說，轉化方法并不限于電穿孔法。
然后選擇轉化的細胞。這種選擇可以根據表達載體內的選擇標記來進行。此外，更可靠的是通過Southern分析或類似方法確證在含有選擇性標記的細胞內存在反義基因。
隨后從轉化細胞中回收磷脂。磷脂的提取可以按常規方法進行。例如，可以通過在沸水中處理細胞，然后用有機溶劑萃取所得產物而提取磷脂。在寄主細胞是能從愈傷組織中再生植物的諸如大米細胞的植物細胞的情況下，所述的轉化處理可以在原生質體上進行，植物可以通過培養愈傷組織而得到再生，并且可以從再生的植物中回收磷脂。這種方法特別適合于大規模生產。在這種情況下，優選地是通過Southern法確證在再生植物中有反義基因存在。
磷脂分子由磷脂酰膽堿(下文也稱之為“PC”)，磷脂酰絲氨酸(下文也稱之為“PS”)和磷脂酰乙醇胺(下文也稱之為“PE”)等組成，可以通過這些組分含量的比例確定磷脂的組成。本發明的方法是改變構成磷脂的所有組分的含量比例，并且不改變特定的磷脂的含量。另外，盡管在下面描述的實施例中僅測定了PE，PS含量的比例，但是改變磷脂的組成并不受到它們的限制。
按照本發明，首先通過基因工程方法改變由生物體產生的磷脂的組成。因此，本發明能夠產生在食品、醫學和生產各種物質領域使用價值比天然存在的磷脂更大的磷脂。
本發明的具體效果如下1.作為磷脂主要組分的PC被用作可消化的表面活性劑，食品添加劑，例如乳化劑和用作為藥物的包裹膜。例如，通過改變磷脂的組成可以獲得如下的效果。
通過增加PC的含量，可以很容易地提純PC。
通過增加除PC外的磷脂的含量，可以容易地提純這些磷脂，以便可以研制所要求的具有新特性的表面活性劑和乳化劑等物質。
可以研制所要求的具有不同消化和吸收特性的藥物的包裹膜。
2.在需要從油中除去磷脂的情況下，所要求的是通過改變磷脂的組成，可以容易地除去磷脂。
3.在使用含磷脂的油的情況下，可以通過改變磷脂的組成而獲得下面的效果從這些普通的油中可以研制所要求的具有不同物理特性(優選地是粘度，味覺和舌頭的觸覺等)的油。
通過降低使油變褐色的PE的含量，可以研制所要求的難以變成褐色的油。
4.通過改變作為生物膜主要組分的磷脂的組成，可以改變所要求的生物膜的特性(溫度敏感性和抗干燥性等)。
另外，所要求的是改變磷脂的組成可以對生物膜的代謝產生影響，以便減緩或加速老化。
實施例現在，本發明將通過實施例進行更詳細的描述。應該注意的是本發明不受下面這些實施例的限制。實施例1構建用于轉化的質粒采用在WO95/09234中描述的含有大米PLD基因(在下面的序列表中在SEQ ID 1號中表明其核苷酸序列)的pBluescript質粒(從Stratagene購得，在WO95/09234中描述了含有大米PLD基因的pBluescript質粒)作為模板，并且采用在其末端具有SacI和XbaI識別位點的引物，它所具有的核苷酸序列為5’-GCAGGAGCTCTAGAGGGATGACAGGACTTCAGTTGGT-3’和在其末端具有BamHI和EcoRI識別位點的引物，它所具有的核苷酸序列為5’-GGGAATTCGGATCCGCTTCTGGTTGTTCTTCAGGC-3’，通過常規方法用市售的試驗盒進行PCR。采用這些引物擴增的區域是在下面所列序列表中的SEQ ID 1號中所示的核苷酸序列中的1008nt至2115nt的區域。用Bam HI和Sac I消化含有部分(1108bp)PLD基因的PCR產物，并且將生成物插入到pBI221質粒(從Toyobo處購得)中，通過Bam HI和Sac I從質粒中除去葡萄苷酸酶基因。通過上面描述的方法，得到在35S啟動子的反義方向下游插入部分PLD基因的質粒(pB35P)。實施例2通過電穿孔法將基因引入大米中用70％乙醇滅菌Japonica大米品種“Tsukinohikari”的未成熟種子的表面30秒，然后用1％次氯酸鈉溶液滅菌40分鐘，接著用消毒水將種子沖洗三次。將種子放置在2N6固體培養基中，并在暗處在30℃下培養。將從未成熟種子的小盾片中去分化的愈傷組織分培到N6液體培養基上，并將生成物在25℃下，在旋轉搖動器(125rpm)中培養。每周將培養的細胞分培到新鮮的培養基上。
將從開始分培第3天的細胞懸浮在酶溶液中，所述酶溶液含有1.0％纖維素酶(cellulase)Onozuka RS(Yakult Honsha有限公司)，1.0％MacerozymeR10(Yakult Honsha有限公司)0.1％溶果膠酶(Pectolyase)Y-23(SeishinSeiyaku)，0.5％Dricellase(Kyowa Hakko)和0.4M甘露糖醇，并將懸浮液在30℃下在暗處培育3小時。然后通過20μm尼龍目篩過濾所述細胞懸浮液，將所得到的濾液在50×g下離心分離5分鐘。使所得到的原生質體的沉淀物懸浮在0.4M甘露糖醇中，用該溶液沖洗該原生質體兩次。將所得到的原生質體懸浮在EPAA緩沖液中(Tada Y.，Sakamoto M.，Fujimura T.(1990)，通過電穿孔和轉基因植物的分析將高效基因引入大米中使用無氯離子的電穿孔緩沖液。Theor.Appl.Genet.80475-180)，以使群體密度為2×106細胞/ml，將懸浮液放置在冰上5分鐘。向原生質體懸浮液中加入10μg pGL2質粒(BilangR.，Iida S.，Peterhans A.，Potrykus I.，Paszkowski J.(1991)抗潮酶素B基因的3’-末端區域對于大腸桿菌和煙草，(Nicotiana tabacum)中的活性來說是重要的。基因100247-250)和30μg通過Eco RI線性化的pB35P質粒，并采用電穿孔裝置(Bio-Rad，USA)向懸浮液施加250μF，600V/cm的電脈沖。將經脈沖處理的原生質體放置在冰上15分鐘，然后在室溫下放置30分鐘。通過離心分離收集原生質體，并將它們懸浮在含有1.25％Seeplaque(商品名)瓊脂糖(FMC)的R2-1培育基中，以使細胞群體為3×105細胞/ml。然后將懸浮液以小液滴的形式固化在9cm培育皿上。在進行培育時，加入R2-1培養基和大米Oc細胞(Baba A，Hasezawa S，Shono K通過農桿菌屬原生質體介導的大米原生質體的培養和其轉化，(《植物細胞生理學》(Pant Cell Physiol.)27463-471(1986))并在25℃下在暗處培養生成物。
兩周后，除去液體培養基和Oc細胞，加入R2-t培養基，接著在25℃，在照明的條件下進行培養。一周后，將培養基換成含有40mg/l潮酶素的R2-t培養基并繼續進行培養。一周后，將直徑為約0.2-0.5mm含愈傷組織的瓊脂糖液滴與少量的消毒水一起破裂，將生成物放置在含有40mg/l潮酶素的N6-12培養基中，接著在25℃，在繼續照明的條件下進行培養。當愈傷組織生長到直徑大于2mm時，將愈傷組織移植到含有40mg/l潮酶素的N6S3培養基中，再繼續進行培養。將生長高度不低于約10cm的分化植物移植到盆中，在溫室中培養。所使用的培養基和參考文獻如下培養基的組成2N6培養基(pH5.8)N6基本培養基(Chu 1978)酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2，4-D2.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlGelrite 2000mg/mlN6液體培養基(pH5.8)N6基本培養基酪蛋白氨基酸 300mg/ml2，4-D1.0mg/ml蔗糖 30000mg/mlR2-1培養基(pH5.8)R2無機鹽培養基(Ohira等人，1973)MS維生素培養基(Murashige和Skoog1962)酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2，4-D 1.0mg/ml
棓酸正丙酯0.05mg/ml蔗糖 68500mg/ml葡萄糖36000mg/mlR2-t培養基(pH5.8)R2無機鹽培養基MS有機組分培養基酪蛋白氨基酸 1000mg/l2，4-D1.0mg/ml蔗糖 20000mg/ml葡萄糖10000mg/mlN6 12培養基(pH5.8)N6基本培養基酪蛋白氨基酸 2000mg/ml2，4-D0.2mg/ml6-BA 0.5mg/mlABA 5.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlD-山梨糖醇30000mg/mlGelrite 2000mg/mlN6S3培養基半濃度的N6主要鹽培養基N6少鹽培養基N6維生素培養基AA氨基酸培養基(Toriyama和Hinata1985)酪蛋白氨基酸 1000mg/mlNAA 0.2mg/ml激動素1.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlgelrite 3000mg/ml參考文獻Chu，C.-C.(1978)N6培養基和其在谷類作物的花藥(an ther)培養中的應用。在植物組織培養物進展論文集。PekingScience Press，第43-50頁，Murashige，T.and Skoog，F.(1962)用于快速生長的修改培養基和用煙草組織培養物進行的生物測定。《生理學植物》(Physiol.Plant.)15第473-497頁.Ohira，K，Ojima，K.和Fujiwara，A.(1973)對大米細胞培養物的營養研究I。用于在懸浮液培養物中快速生長的一種簡單的限定培養基。《植物細胞生理學》141113-1121.Toriyama，K.，Hinata，K.和Sasaki，T.(1986)由大米中花藥(an ther)愈傷組織的原生質體再生單倍體和雙倍體植物。Theor.Genet.7316-19.實施例3通過Southern分析證實引入的基因和通過Western分析證實反義基因的作用用轉化大米的結果5的葉片制備DNAs并進行Southern分析[Hiei Y.，Ohta S.，Komari T.，Kumashiro T.(1994)由農桿菌屬介導的大米(Oryza sativa)的高效轉化和T-DNA的邊界的序列分析，植物(Plant)J.6271-282]。用Eco RI消化DNAs。采用通過pBluescript質粒消化得到的具有大小為984bp的cDNA片段制備探針，所述質粒通過HincII作為模板而含有上面第1部分中所描述的PLD基因。
在得自非轉化植物的DNAs中，只檢測到8.1kb片段，而在得自轉化植物的DNAs中，對于全部的轉化體來說，檢測到新的片段。
用液氮冷凍各轉化體的葉片(0.2g)，用研缽粉磨生成物，接著用0.4ml50mM三羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)(pH7.0)萃取可溶性蛋白質。在10000×g，4℃下離心分離10分鐘后，回收上清液，將其15μl的等分部分進行Western分析[Burnette W.N.(1981)Western blotting將蛋白質由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移到未修飾的硝基纖維素，并用抗體和放射性碘蛋白質A進行的射線照相檢測。《分析生物化學》112l95-203]。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為7.5％。使抗體[Ueki J.，Morioka S.，Komari T.，Kumashiro T.(1995)由大米(Oryza sativa L.)產生的磷脂酶D(PLD)的提純和表征并用于由大米和玉米(Zea may L.)的PLD的cDNA的克隆《植物細胞生理學》36903-914]在8.9ug/ml IgG的濃度下反應。
在這些轉化體中，在一個個體(下文也稱之為“SAP8”)中，未檢測到PLD蛋白質，因此觀察到反義基因的作用。在SAP8的Southern分析中，除了檢測到8.1kb片段外，還檢測到兩個大的片段。實施例4 制備由轉化大米種子的未成熟胚胎所產生的培養細胞的懸浮液隨機選擇16個轉化大米(SAP8)所結的種子，制備用各個種子的未成熟胚胎產生的培養細胞的懸浮液。根據實施例2描述的方法，每周將懸浮液培養物分培到新鮮的N6液體培養基上。
按照實施例3描述的方法，在開始分培的第6天從培養細胞中萃取蛋白質，并對萃取的蛋白質進行Western分析。結果有被檢測到PLD的培養細胞和未被檢測到PLD的培養細胞存在。這些類型的細胞的比例為1∶3。在檢測到PLD的培養細胞中，僅檢測到8.1kb片段，而在未檢測到PLD的培養細胞中，除了檢測到8.1kb片段，還檢測到兩個大的片段。這些結果表明引入的基因是兩個復制品，這兩個復制品的基因是以彼此接近的位點存在，所述基因在其后的SAP8產生中被分離。在檢測到PLD的培養細胞和未檢測到PLD的培養細胞之間觀察到其增殖速率和外觀都沒有差別。實施例5 萃取磷脂并分析其組成根據參考文獻描述的方法[Satou N.，Okuyama H.(1987)植物膜脂質、蛋白質，核酸和酶的分析，Extra Edition，No.30163-170]，將開始進行分培第6天的培養細胞(0.5g)放置在內部體積為1.5ml的聚丙烯管中，并緊密地蓋好管子。將管子浸漬在沸水中熱處理5分鐘，然后用溶劑萃取脂質。從回收的脂質中蒸發掉溶劑，并將脂質溶解在0.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)中。在用于薄層色譜的硅膠60色譜板(Merck)上，點滴20μl的等分溶液，并用氯仿∶甲醇∶乙酸∶水(25∶15∶4∶2)展開斑點。將茚三酮(由Wako Pure化學有限公司購得)噴霧到干燥板上，將制成的板在120℃下加熱5分鐘。根據試驗盒中的標準磷脂(從Funakoshi購得)的遷移率，鑒定各斑點的磷脂。注意用茚三酮檢測的磷脂PE和PS，確定各培養細胞中PE和PS含量的比例。采用光密度計(型號GS670，Bio Rad)進行定量分析，用上述標準的磷脂繪制校正曲線。
對于檢測到PLD的培養細胞而言，PS/PE比為3.5+/-0.2％，而對于未檢測到PLD的培養細胞而言，PS/PE比為5.3+/-0.3％。這些結果表明在培養細胞中引入反義基因可以改變PS含量與PE含量的相對比例。序列表序列ID號1序列長度3040序列類型核酸分子類型cDNA-mRNA起始源生物體Orysa sativa鏈型雙鍵拓撲結構線型序列描述AGTCTCTCTT CTCCCGCAAT TTTATAATCT CGATCGATCC AATCTGCTCC CCTTCTTCTT 60CTACTCTCCC CATCTCGGCT CTCGCCATCG CCATCCTCCT CTCCCTTCCC GGAGAAGACG 120CCTCCCTCCG CCGATCACCA CCCGGTAGGG CGAGGAGGGA GCCAAATCCA AATCAGCAGC 180C ATG GCG CAG ATG CTG CTC CAT GGG ACG CTG CAC GCC ACC ATC TTC GAG 229Met Ala Gln Met Leu Leu His Gly Thr Leu His Ala Thr Ile Phe Glu1 5 10 15GCG GCG TCG CTC TCC AAC CCG CAC CGC GCC AGC GGA AGC GCC CCC AAG277Ala Ala Ser Leu Ser Asn Pro His Arg Ala Ser Gly Ser Ala Pro Lys20 25 30TTC ATC CGC AAG TTT GTG GAG GGG ATT GAG GAC ACT GTG GGT GTC GGC325Phe Ile Arg Lys Phe Val Glu Gly Ile Glu Asp Thr Val Gly Val Gly35 40 45AAA GGC GCC ACC AAG GTG TAT TCT ACC ATT GAT CTG GAG AAA GCT CGT373Lys Gly Ala Thr Lys Val Tyr Ser Thr Ile Asp Leu Glu Lys Ala Arg50 55 60GTA GGG CGA ACT AGG ATG ATA ACC AAT GAG CCC ATC AAC CCT CGC TGG421Val Gly Arg Thr Arg Met Ile Thr Asn Glu Pro Ile Asn Pro Arg Trp65 70 75 80TAT GAG TCG TTC CAC ATC TAT TGC GCT CAT ATG GCT TCC AAT GTG ATC469Tyr Glu Ser Phe His Ile Tyr Cys Ala His Met Ala Ser Asn Val Ile85 90 95TTC ACT GTC AAG ATT GAT AAC CCT ATT GGG GCA ACG AAT ATT GGG AGG517Phe Thr Val Lys Ile Asp Asn Pro Ile Gly Ala Thr Asn Ile Gly Arg100 105 110GCT TAC CTG CCT GTC CAA GAG CTT CTC AAT GGA GAG GAG ATT GAC AGA565Ala Tyr Leu Pro Val Gln Glu Leu Leu Asn Gly Glu Glu Ile Asp Arg115 120 125TGG CTC GAT ATC TGT GAT AAT AAC CGC GAG TCT GTT GGT GAG AGC AAG613Trp Leu Asp Ile Cys Asp Asn Asn Arg Glu Ser Val Gly Glu Ser Lys130 135 140ATC CAT GTG AAG CTT CAG TAC TTC GAT GTT TCC AAG GAT CGC AAT TGG661Ile His Val Lys Leu Gln Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asp Arg Asn Trp145 150 155 160GCG AGG GGT GTC CGC AGT ACC AAG TAT CCA GGT GTT CCT TAC ACC TTC709Ala Arg Gly Val Arg Ser Thr Lys Tyr Pro Gly Val Pro Tyr Thr Phe165 170 175TTC TCT CAG AGG CAA GGG TGC AAA GTT ACC TTG TAC CAA GAT GCT CAT757Phe Ser Gln Arg Gln Gly Cys Lys Val Thr Leu Tyr Gln Asp Ala His180 185 190GTC CCA GAC AAC TTC ATT CCA AAG ATT CCG CTT GCC GAT GGC AAG AAT805Val Pro Asp Asn Phe Ile Pro Lys Ile Pro Leu Ala Asp Gly Lys Asn195 200 205TAT GAA CCC CAC AGA TGC TGG GAG GAT ATC TTT GAT GCT ATA AGC AAT853Tyr Glu Pro His Arg Cys Trp Glu Asp Ile Phe Asp Ala Ile Ser Asn
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355 360 365TAT GAC ACT CAG TAC CAT TCT TTG TTT AGG ACA CTC GAC AGT ACC CAT 1333Tyr Asp Thr Gln Tyr His Ser Leu Phe Arg Thr Leu Asp Ser Thr His370 375 380CAT GAT GAC TTC CAC CAG CCA AAC TTT GCC ACT GCA TCA ATC AAA AAG 1381His Asp Asp Phe His Gln Pro Asn Phe Ala Thr Ala Ser Ile Lys Lys385 390 395 400GGT GGA CCT AGA GAG CCA TGG CAT GAT ATT CAC TCA CGG CTG GAA GGG 1429Gly Gly Pro Arg Glu Pro Trp His Asp Ile His Ser Arg Leu Glu Gly405 410 415CCA ATC GCA TGG GAT GTT CTT TAC AAT TTC GAG CAG AGA TGG AGA AAG 1477Pro Ile Ala Trp Asp Val Leu Tyr Asn Phe Glu Gln Arg Trp Arg Lys420 425 430CAG GGT GGT AAG GAT CTC CTT CTG CAG CTC AGG GAT CTG TCT GAC ACT 1525Gln Gly Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Leu Arg Asp Leu Ser Asp Thr435 440 445ATT ATT CCA CCT TCT CCT GTT ATG TTT CCA GAG GAC AGA GAA ACA TGG 1573Ile Ile Pro Pro Ser Pro Val Met Phe Pro Glu Asp Arg Glu Thr Trp450 455460AAT GTT CAG CTA TTT AGA TCC ATT GAT GGT GGT GCT GCT TTT GGG TTC 1621Asn Val Gln Leu Phe Arg Ser Ile Asp Gly Gly Ala Ala Phe Gly Phe465 470 475 480CCT GAT ACC CCT GAG GAG GCT GCA AAA GCT GGG CTT GTA AGC GGA AAG 1669Pro Asp Thr Pro Glu Glu Ala Ala Lys Ala Gly Leu Val Ser Gly Lys485 490 495GAT CAA ATC ATT GAC AGG AGC ATC CAG GAT GCA TAC ATA CAT GCC ATC 1717Asp Gln Ile Ile Asp Arg Ser Ile Gln Asp Ala Tyr Ile His Ala Ile
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645 650 655AGG TTC ATG ATC TAT GTC CAC ACC AAA ATG ATG ATA GTT GAC GAT GAG 2197Arg Phe Met Ile Tyr Val His Thr Lys Met Met Ile Val Asp Asp Glu660 665 670TAC ATC ATC ATC GGT TCT GCA AAC ATC AAC CAG AGG TCG ATG GAC GGC 2245Tyr Ile Ile Ile Gly Ser Ala Asn Ile Asn Gln Arg Ser Met Asp Gly675 680 685GCT AGG GAC TCT GAG ATC GCC ATG GGC GGG TAC CAG CCA TAC CAT CTG 2293Ala Arg Asp Ser Glu Ile Ala Met Gly Gly Tyr Gln Pro Tyr His Leu690 695 700GCG ACC AGG CAA CCA GCC CGT GGC CAG ATC CAT GGC TTC CGG ATG GCG 2341Ala Thr Arg Gln Pro Ala Arg Gly Gln Ile His Gly Phe Arg Met Ala705 710 715 720CTG TGG TAC GAG CAC CTG GGA ATG CTG GAT GAT GTG TTC CAG CGC CCC 2389Leu Trp Tyr Glu His Leu Gly Met Leu Asp Asp Val Phe Gln Arg Pro725 730 735GAG AGC CTG GAG TGT GTG CAG AAG GTG AAC AGG ATC GCG GAG AAG TAC 2437Glu Ser Leu Glu Cys Val Gln Lys Val Asn Arg Ile Ala Glu Lys Tyr740 745 750TGG GAC ATG TAC TCC AGC GAC GAC CTC CAG CAG GAC CTC CCT GGC CAC 2485Trp Asp Met Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Gln Gln Asp Leu Pro Gly His755 760 765CTC CTC AGC TAC CCC ATT GGC GTC GCC AGC GAT GGT GTG GTG ACT GAG 2533Leu Leu Ser Tyr Pro Ile Gly Val Ala Ser Asp Gly Val Val Thr Glu770 775 780CTG CCC GGG ATG GAG TAC TTT CCT GAC ACA CGG GCC CGC GTC CTC GGC 2581Leu Pro Gly Met Glu Tyr Phe Pro Asp Thr Arg Ala Arg Val Leu Gly785 790 795 800GCC AAG TCG GAT TAC ATG CCC CCC ATC CTC ACC TCA TAGACGAGGA AGCACT 2633Ala Lys Ser Asp Tyr Met Pro Pro Ile Leu Thr Ser805 810ACACTACAAT CTGCTGGCTT CTCCTGTCAG TCCTTCTGTA CTTCTTCAGT TTGGTGGCGA 2693GATGGTATGG CCGTTGTTCA GAATTTCTTC AGAATAGCAG TTGTTACAGT TGTGAATCAT 2753AAAGTAATAA GTGCAGTATC TGTGCATGGT TGAGTTGGGA AGAAGATCGG GGATGCAATG 2813ATGCTTGTGA AGTTGTGATG CCGTTTGTAA GATGGGAAGT TGGGAACTAC TAAGTAATTG 2873GCATGATTGT ACTTTGCACT ACTGTTTAGC GTTGTTGATA CTGGTTAACC GTGTGTTCAT 2933CTGAACTTGA TTCTTGATGC AGTTTGTGGC ATTACCAGTT TATCATCGTT CTTCAGGAAA 2993AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 3040
權利要求
1.改變由寄主細胞所產生的磷脂組成的方法，包括用重組體DNA轉化所述的寄主細胞，所述重組體DNA具有磷脂酶D基因的反義基因，它在所述寄主細胞中表達反義基因，以產生在所述寄主細胞中和磷脂酶D基因的mRNA雜交的mRNA，由此抑制所述磷脂D基因的表達。
2.根據權利要求1的方法，其中，所述的寄主細胞是植物細胞。
3.根據權利要求2的方法，其中，所述的植物細胞是種子植物的細胞。
4.根據權利要求3的方法，其中，所述的種子植物細胞是單子葉植物的細胞。
5.根據權利要求4的方法，其中，所述的單子葉植物細胞是大米細胞。
6.根據權利要求1-5任一項的方法，其中，所述的磷脂酶D基因的反義基因是在寄主細胞內的磷脂酶D基因的反義基因。
7.具有磷脂酶D基因的反義基因的重組體DNA，其中，它在寄主細胞內表達反義基因，以產生在所述寄主細胞中和磷脂酶D基因的mRNA雜交的mRNA，由此抑制所述磷脂D基因的表達。
8.根據權利要求7的重組體DNA，其中，所述的寄主細胞是植物細胞。
9.根據權利要求8的方法，其中所述的植物細胞是種子植物的細胞。
全文摘要
本發明公開了人工改變由細胞產生的磷脂組成的方法。根據本發明的方法,用重組體DNA轉化所述的寄主細胞,所述重組體DNA具有磷脂酶D基因的反義基因,它在所述寄主細胞中表達反義基因,以產生在所述寄主細胞中和磷脂酶D基因的mRNA雜交的mRNA,由此抑制所述磷脂D基因的表達。
文檔編號C12N9/16GK1188507SQ9719033
公開日1998年7月22日 申請日期1997年2月20日 優先權日1997年2月20日
發明者植木潤, 森岡真二 申請人:日本煙草產業株式會社