一種新的內(nèi)切葡聚糖酶的制作方法

專利名稱：一種新的內(nèi)切葡聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在高溫時(shí)有纖維素分解活性的酶，特別是內(nèi)切葡聚糖酶；編碼有纖維素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供編碼這種酶的基因的方法；生產(chǎn)這種酶的方法；一種含有具纖維素分解活性的酶的酶組合物；以及該酶和酶組合物的多種工業(yè)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素酶或纖維素分解酶是參與纖維素分解過程的酶。天然纖維素的水解中，眾所周知有三類主要的纖維素酶參與這一過程，即纖維素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纖維素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21).
特別是內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)構(gòu)成一組用于上述工業(yè)用途的引人注意的水解酶。內(nèi)切葡聚糖酶催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中1，4-β-D-葡糖苷鍵的內(nèi)切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如谷類β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纖維素部分的其他植物原料的β-1，4鍵的內(nèi)切水解。其權(quán)威命名是內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本說明書使用簡(jiǎn)稱內(nèi)切葡聚糖酶?？梢詤⒖糡.M.Enveri，“微生物纖維素酶”，W.M.Fogarty，微生物酶類與生物技術(shù)，應(yīng)用科學(xué)出版社，183-224頁(1983)；酶學(xué)方法(1988)160卷，200-391頁(Wood，W.A和Kellogg，S.T.編)；Beguin，P.“纖維素降解的分子生物學(xué)”，微生物學(xué)年度綜述(1990)，44卷，219-248頁；Beguin，P.和Aubert，J-P.“纖維素的生物降解”，F(xiàn)EMS微生物學(xué)綜述13(1994)25-58頁；Henrissat，B.“纖維素酶及它們與纖維素的相互作用”，纖維素(1994)，1卷，169-196頁。
纖維素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放線菌，粘細(xì)菌和真細(xì)菌，也能由植物合成。特別是已鑒定到具有各種特性的內(nèi)切葡聚糖酶。許多細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶已被描述(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化學(xué)雜志293781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物學(xué)雜志139187-194)。
梭菌亞門是一組多樣化的厭氧細(xì)菌，包含生理學(xué)上非常不同的各屬。以前，梭菌屬被認(rèn)為是包括所有內(nèi)生芽孢厭氧細(xì)菌的一個(gè)屬。但分子分類學(xué)手段例如16S rDNA測(cè)序的應(yīng)用揭示這組微生物的不同遠(yuǎn)超過了屬以上分類位置。而且，多個(gè)不產(chǎn)芽孢的厭氧菌屬被分類到梭菌中，因此梭菌是作為一個(gè)更上位的分類組，即一個(gè)亞門。這與這些生物的高度不同的生活環(huán)境一致。梭菌亞門，例如，包含最適生長(zhǎng)溫度范圍極寬的多個(gè)種類。
網(wǎng)球菌屬包含系統(tǒng)發(fā)生上位于梭菌亞門內(nèi)的極端嗜熱厭氧細(xì)菌。網(wǎng)球菌是梭菌亞門中最嗜熱的微生物之一。在16S rDNA系統(tǒng)發(fā)生樹中，網(wǎng)球菌屬與其他嗜熱菌屬例如熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)，熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium)和共養(yǎng)單胞菌屬有最近的親源關(guān)系。但是網(wǎng)球菌屬形成了一個(gè)遠(yuǎn)的分支，證明網(wǎng)球菌應(yīng)該被看作一個(gè)獨(dú)立的屬。
網(wǎng)球菌B1菌株分離自一個(gè)漿質(zhì)冷卻池(即一個(gè)人造嗜熱環(huán)境)的污泥和紙漿樣品中。關(guān)于該微生物的木聚糖酶的最適溫度(大約90℃)已有描述。已針對(duì)該木聚糖酶的產(chǎn)量進(jìn)行了研究，以使發(fā)酵最優(yōu)化。網(wǎng)球菌屬的菌種產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶未有報(bào)導(dǎo)。梭菌門中已有描述產(chǎn)纖維素酶的一些種中有幾個(gè)是嗜熱的。少數(shù)例子中測(cè)定過內(nèi)切葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，研究最多的種之一是熱纖維梭菌，已證明它的酶在80℃仍穩(wěn)定。解纖維熱厭氧桿菌(Thermoanaerobactercellulyticus)產(chǎn)生至少兩種80℃穩(wěn)定的內(nèi)切葡聚糖酶。
可以參考Hudson等(1991)一株極端嗜熱菌的纖維素酶活性，應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)35270-273；Mathrani和Ahring(1991)來自來自人工嗜熱環(huán)境的嚴(yán)格降解木聚糖的網(wǎng)球菌的分離和鑒定，微生物學(xué)文獻(xiàn)15713-17；Adamsen等(1995)，連續(xù)培養(yǎng)網(wǎng)球菌B1生產(chǎn)胞外木聚糖酶的優(yōu)化，應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)44327-332；Maidak等(1994)，核糖體數(shù)據(jù)庫計(jì)劃，核酸研究223485-3487；Honda等(1987)編碼耐熱β-葡聚糖酶的解纖維熱厭氧桿菌基因在E.coli中的克隆和表達(dá)，應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)25480-483；Honda等(1988)，從一株嗜熱厭氧菌分離一種新纖維素酶基因及其在E.coli中的表達(dá)，應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)29264-268。
纖維素分解酶一個(gè)重要的工業(yè)用途是處理纖維素紡織品或織物，例如作為洗滌劑組合物或織物柔軟劑組合物的成分，用于新織物的生物拋光(衣物整理)，及獲得含纖維素織物(特別是粗斜紋棉布)的“石洗”外觀，這些處理過程的某些方法已被提及，例如，在GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876，WO91/17243，WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中。纖維素分解酶另一個(gè)重要的工業(yè)用途是用于處理紙漿，如用于改善排水或回收紙張的除墨。
人們還知道，纖維素酶可以含有或不含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。CBD能夠增強(qiáng)酶與含纖維素的纖維的結(jié)合，并提高酶催化活性部位的功效。
需要提供經(jīng)濟(jì)可行的纖維素酶制劑，可以用在那些希望纖維素酶(優(yōu)選是內(nèi)切葡聚糖酶)在高溫保持活性的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供新的酶組合物或重組酶，它們?cè)诟邷貤l件下具有顯著的纖維素分解酶活性，并且在工業(yè)應(yīng)用中，如紙漿加工，紡織品處理，洗衣過程，提取過程或動(dòng)物飼養(yǎng)中，其性能有所改進(jìn)。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)成功克隆和鑒定了一種來自網(wǎng)球菌屬的DNA序列，它編碼的酶在極高溫度下，很寬的pH范圍內(nèi)具有纖維素分解活性，從而有可能用它制備具有所期望特性的單組分纖維素分解酶組合物。
因此，本發(fā)明第一方面涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶制劑，它在85℃以上，優(yōu)選90℃以上，更優(yōu)選95℃以上，特別是100℃以上具有最佳活性。
本發(fā)明第二方面涉及一種酶制劑，相對(duì)于在70℃和最適pH時(shí)的活性，它對(duì)羧甲基纖維素(CMC)的內(nèi)切葡聚糖酶活性在70℃和pH 10時(shí)高于50％，優(yōu)選高于55％，更優(yōu)選高于60％，更優(yōu)選高于65％，特別是高于70％。
本發(fā)明第三方面涉及一種DNA構(gòu)建體，其中含有的DNA序列編碼有內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，其最佳活性在85℃以上，優(yōu)選90℃以上，更優(yōu)選100℃以上，該DNA序列包含a)對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列的內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列，或b)對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列的相似物，它i)與可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分相對(duì)應(yīng)的DNA序列同源，優(yōu)選至少60％同源，或ii)和可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分相對(duì)應(yīng)的DNA序列可雜交的相同寡核苷酸探針能夠雜交，或者iii)編碼一種多肽，該多肽與包含對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列的DNA序列編碼的多肽同源，優(yōu)選至少60％同源，或者iv)編碼一種多肽，該多肽與針對(duì)純化的內(nèi)切葡聚糖酶的抗體具有免疫反應(yīng)性，所述內(nèi)切葡聚糖酶是由對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列編碼的。
發(fā)明的第四、五、六方面是提供帶有本發(fā)明克隆DNA序列的表達(dá)載體；含有克隆DNA序列或表達(dá)載體的細(xì)胞以及生產(chǎn)顯示纖維素分解活性的酶的方法，該方法包括在允許酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，和從培養(yǎng)物中回收酶。
本發(fā)明另一方面提供一種有纖維素分解活性的分離酶，其特征在于(i)不含同源雜質(zhì)，并且(ii)該酶由上述方法產(chǎn)生。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及有纖維素分解活性的分離酶，優(yōu)選是一種內(nèi)切葡聚糖酶，其由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼。
另外，本發(fā)明涉及這種酶或酶制劑在工業(yè)應(yīng)用中的用途，如在紡織業(yè)中用于改善纖維素纖維或織物的特性或者提供粗斜紋棉布的石洗外觀；或者用于工業(yè)清潔程序；或者用在熱壓聚合物材料中；或者用于生物量轉(zhuǎn)化成糖的過程中；或者用于生產(chǎn)乙醇；或者用于預(yù)消化飼料生產(chǎn)中所用的谷物；或者用于生產(chǎn)速溶咖啡或類似的提取過程。
本發(fā)明還涉及含有纖維素酶編碼DNA序列之大腸桿菌菌株DSM11201的一種分離的基本純的生物學(xué)培養(yǎng)物，或所述大腸桿菌菌株的任何突變體。發(fā)明詳述本文中，術(shù)語“20種天然存在的氨基酸殘基”表示常見于蛋白質(zhì)中的20種氨基酸殘基，慣稱丙氨酸(Ala或A)，纈氨酸(Val或V)，亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)，色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)。
本發(fā)明的酶和酶制劑在寬范圍pH都有活性，優(yōu)選在大約pH4-11有活性，更優(yōu)選約在大約5.5--10之間有活性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶或酶制劑來自革蘭氏陽性細(xì)菌門的一個(gè)菌株或者是其內(nèi)源酶，更優(yōu)選梭菌亞門的菌株，還要更優(yōu)選屬于網(wǎng)球菌屬的菌株，特別是網(wǎng)球菌DSM6262。
本文中，表達(dá)術(shù)語“克隆DNA序列”，無論是部分還是完整的，均是指用基因工程中的標(biāo)準(zhǔn)克隆步驟，將一段DNA從它的天然位置重新放置于不同的位點(diǎn)，在該處它將被復(fù)制，由此克隆的DNA序列?？寺∵^程包括切除和分離目標(biāo)DNA片段，將該段DNA插入載體分子以及將重組載體引入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制出多拷貝或多克隆的該DNA片段。
本發(fā)明的“克隆DNA序列”也可稱為“DNA構(gòu)建體”或“分離DNA序列”。
DNA序列可以是基因組、cDNA或合成來源的，或者是它們的任意組合。
克隆到大腸桿菌DSM11201中質(zhì)粒pSJ1678上的DNA序列的纖維素酶編碼部分和/或本發(fā)明的相似DNA序列可以從能產(chǎn)生有纖維素酶(優(yōu)選內(nèi)切葡聚糖酶)活性的酶的網(wǎng)球菌屬菌株克隆得到，優(yōu)選網(wǎng)球菌DSM6262菌株，或者可從以下進(jìn)一步描述的另一種或相關(guān)微生物中克隆得到。
或者，相似序列可以依據(jù)從大腸桿菌DSM11201中質(zhì)粒得到的DNA序列構(gòu)建而成，例如是其亞序列，和/或通過導(dǎo)入核苷酸取代而獲得，這種取代不會(huì)使該DNA序列編碼的纖維素酶氨基酸序列不同，但與用于生產(chǎn)該酶的宿主微生物的密碼子用法一致，或者這種核苷酸取代可以使得產(chǎn)生不同氨基酸序列(即本發(fā)明纖維素酶的變體)。
進(jìn)行核苷酸取代時(shí)，優(yōu)選氨基酸的變化影響較小，即是不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)折疊或酶活性的保守性氨基酸取代，小片段刪除，通常是1到30個(gè)氨基酸長(zhǎng)；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基，不超過大約20-25個(gè)殘基的小連接肽，或者有助于純化的小段延伸，如一段多組氨酸，抗原決定簇或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守性氨基酸取代的例子有堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)各組內(nèi)的取代。核苷酸取代的綜述可見如Ford等，(1991)，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，2，95-107。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，很顯然可以在分子功能的關(guān)鍵區(qū)域之外進(jìn)行這些取代，仍能得到活性多肽。對(duì)本發(fā)明克隆DNA序列編碼的多肽的活性所必需，因此最好不做取代的氨基酸，可以用本領(lǐng)域的已知技術(shù)，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變確定(參見例如Cunningham和Wells，(1989)，科學(xué)2441081-1085)。后一種技術(shù)中將突變引入分子內(nèi)的每一個(gè)殘基處，檢測(cè)產(chǎn)生的突變分子的生物學(xué)(即纖維素分解)活性，以便鑒定出該分子活性所必需的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過分析晶體結(jié)構(gòu)確定，如通過核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)確定(參見例如de Vos等，(1992)，科學(xué)255306-312；Smith等，(1992)，分子生物學(xué)雜志224899-904；Wlodaver等，(1992)，F(xiàn)EBS快報(bào)30959-64)。
本發(fā)明DNA構(gòu)建體的DNA序列所編碼的內(nèi)切葡聚糖酶可以包含一個(gè)作為編碼酶的內(nèi)在部分的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，或者可以向內(nèi)切葡聚糖酶引入其他來源的CBD，形成酶雜合體。本文中，術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”應(yīng)按“不溶性碳水化合物的酶解”，John N.Saddler和Michael H.Penner(編)，ACS研討會(huì)系列，No.618，1996中PeterTomme等“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類和特性”定義的理解。該定義將120多種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分成10族(I-X)，并表明CBD在多種酶如纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和殼多糖酶中都有發(fā)現(xiàn)。CBD還被發(fā)現(xiàn)存在于藻類，如紅藻Porphyrapurpurea中，這是一種非水解性的多糖結(jié)合蛋白質(zhì)，參見Tomme等，(出處同前)。但大多數(shù)CBD來自纖維素酶、木聚糖酶，CBD位于蛋白質(zhì)的N和C末端或者在內(nèi)部。酶雜合體是本領(lǐng)域已知的，參見如WO90/00609和WO95/16782，可以通過將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中制備，其中所述構(gòu)建體含有至少一個(gè)編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA片段，帶有或不帶有接頭而連接到編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列上，并培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因。酶雜合體可以用下列通式描述CBD-MR-X其中CBD是至少對(duì)應(yīng)于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)域；MR是中間區(qū)域(接頭)，可以是一個(gè)鍵，或者是一個(gè)短連接基團(tuán)，優(yōu)選約2到100個(gè)碳原子，更優(yōu)選2到40個(gè)碳原子；或者優(yōu)選是約2到100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選2到40個(gè)氨基酸；X是本發(fā)明DNA序列所編碼的多肽的N-末端或C-末端區(qū)域。
本發(fā)明的DNA序列可以用如Sambrook等((1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南Cold Spring Harbor Lab.Cold Spring Harbor，NY)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，從大腸桿菌DSM11201菌株克隆得到。
本發(fā)明的DNA序列也可以用包含下述的任何一般方法克隆得到，—在合適的載體中克隆來自預(yù)期產(chǎn)生所需內(nèi)切葡聚糖酶的任何微生物(例如網(wǎng)球菌)的DNA文庫，—用所述載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，—在合適的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以表達(dá)由DNA文庫中的克隆編碼的任何目標(biāo)酶，—通過測(cè)定這些克隆產(chǎn)生的酶的任何纖維素分解活性，篩選陽性克隆，以及—從這些克隆中分離編碼該酶的DNA。
或者，可以依照眾所周知的步驟，通過利用依據(jù)可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列制備的合成寡核苷酸探針。方便地從合適的來源(例如以下提到的微生物)克隆得到編碼本發(fā)明纖維素酶的DNA。
DNA序列的同源性上述DNA序列的同源性定義為兩個(gè)序列間的相同程度，表明第一個(gè)序列來自第二個(gè)的派生關(guān)系。同源性可以利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，如GCG程序包提供的GAP程序(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物學(xué)雜志48443-453)合適地確定。利用如下設(shè)置的GAP程序進(jìn)行DNA序列比較GAP產(chǎn)生罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3，該(部分)DNA序列顯示與對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列有至少60％相同，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，還要更優(yōu)選至少97％相同。
雜交上面所提到的雜交是指相似(部分)DNA序列與對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的寡核苷酸探針，在如下所述的某些特定條件下能發(fā)生雜交。
用于確定核苷酸探針與同源DNA或RNA序列間雜交情況的適宜條件包括將含有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜預(yù)先在5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)中浸泡10分鐘，在5×SSC溶液(Sambrook等，1989)，5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml超聲變性的鮭精DNA(Sambrook等，1989)中對(duì)膜進(jìn)行預(yù)雜交，然后在含有隨機(jī)引發(fā)的(Feinberg A.P.和Vogelstein B(1983)分析生物化學(xué)1326-13)、32P-dCTP標(biāo)記(比活＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中于大約45℃雜交12小時(shí)。膜在2×SSC，0.5％SDS中洗滌30分鐘兩次，優(yōu)選洗滌溫度不超過55℃，更優(yōu)選不超過60℃，更優(yōu)選不超過65℃，還要更優(yōu)選不超過70℃，特別是不超過75℃。
用X-光膠片檢測(cè)在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。
氨基酸序列的同源性上面提到的多肽同源性定義為兩個(gè)序列間的相同程度，表明第一個(gè)序列來自第二個(gè)的派生關(guān)系。同源性可以利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，如GCG程序包提供的GAP程序(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物學(xué)雜志48443-453)合適地確定。利用如下設(shè)置的GAP程序進(jìn)行多肽序列比較GAP產(chǎn)生罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1，由相似(部分)DNA序列編碼的多肽顯示與可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分編碼的多肽，相同程度為至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，特別是至少97％。
免疫交叉反應(yīng)性用于測(cè)定免疫交叉反應(yīng)性的抗體可以利用提純的纖維素分解酶制備。更具體地說，抗本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的抗血清可以通過免疫兔子(或其他嚙齒類動(dòng)物)得到，步驟參照N.Axelsen等，定量免疫電泳指南，Blackwell科學(xué)出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，實(shí)用免疫化學(xué)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(尤其是27-31頁)。純化的免疫球蛋白可以從抗血清獲得，例如通過鹽析((NH4)2SO4)，然后透析，并在如DEAE-Sephadex上進(jìn)行離子交換層析。蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)鑒定可以利用Outcherlony雙向擴(kuò)散分析(O.Ouchterlony，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D.M.Weir編)，Blackwell科學(xué)出版社，1967，655-706頁)，交叉免疫電泳(N.Axelsen等，出處同前，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進(jìn)行。
菌種以下使用的分類系統(tǒng)與Maidak等，1996(核糖體數(shù)據(jù)庫計(jì)劃，核酸研究2482-85)一致。
本發(fā)明中所使用的與某個(gè)特定來源聯(lián)系的術(shù)語“得自”或“可得自”，表示該酶由或可以由這個(gè)來源菌株或者插入了來自這個(gè)特定來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。
目前估計(jì)本發(fā)明的纖維素酶可以得自細(xì)菌，特別是革蘭氏陽性細(xì)菌，優(yōu)選梭菌亞門，特別是網(wǎng)球菌屬的菌株。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的纖維素酶得自網(wǎng)球菌DSM6262菌株。目前期望編碼與本發(fā)明的酶同源的酶的DNA序列可以得自其他細(xì)菌菌株，特別是網(wǎng)球菌屬的菌株。
能夠從中得到本發(fā)明纖維素酶的網(wǎng)球菌菌株的分離培養(yǎng)物可以從德意志微生物保藏中心，以DSM6262公開得到。
另外，含有編碼本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列的質(zhì)粒pSJ1678已經(jīng)轉(zhuǎn)化到一個(gè)大腸桿菌菌株中，發(fā)明人依照布達(dá)佩斯條約國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏規(guī)定，于1996年10月11日將該菌株保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，F(xiàn)ederalRepublic of Germany，保藏號(hào)DSM11201。
重組表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明所述酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是一種自主復(fù)制的載體，即以染色體外實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制過程，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣一種類型，當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)，它會(huì)部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中，并與其整合入的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選是一種表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操縱地連接了DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加片段。一般來說，表達(dá)載體來源于質(zhì)粒或病毒DNA，或者可以含有兩者的成分。術(shù)語“可操縱地連接”表明各片段的排列方式使其功能與它們的預(yù)期用途一致，例如，使轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子內(nèi)起始并持續(xù)在編碼酶的DNA序列進(jìn)行。
啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞內(nèi)顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可以來自編碼宿主細(xì)胞同源或異源蛋白質(zhì)的基因。
適用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因的啟動(dòng)子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的啟動(dòng)子，或者短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動(dòng)子，或者噬菌體λPR或PL啟動(dòng)子，或大腸桿菌lac，trp或tac啟動(dòng)子。
在必要時(shí)，編碼本發(fā)明酶的DNA序列也可以可操縱地連接合適的終止子。
本發(fā)明的重組載體還可以再含有使載體能在所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體也可以含有一個(gè)選擇性標(biāo)記，例如，一個(gè)其產(chǎn)物可補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，或者編碼抗例如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素的基因，或者重金屬或除草劑的抗性基因。
為了使本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供一個(gè)分泌信號(hào)序列(也稱為前導(dǎo)序列，前體序列或前序列)。分泌信號(hào)序列以正確閱讀框加接在編碼酶的DNA序列中。分泌信號(hào)序列通常置于在編碼酶的DNA序列的5’端。它可以是正常情況下就與該酶相關(guān)聯(lián)的或者可以來自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
將編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選的終止子和/或分泌信號(hào)序列分別連接，或者通過合適的PCR擴(kuò)增方案組合這些序列，并將它們插入含有復(fù)制或整合必需信息的合適載體中的步驟，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見例如，Sambrook等，出處同前)。
宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以是該選定宿主細(xì)胞的同源或異源序列。如果是宿主細(xì)胞的同源序列，即宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的，一般將它可操縱連接另外的啟動(dòng)子序列，或者，如果可行，連接另外的分泌信號(hào)序列和/或終止子序列，而不是其天然的狀態(tài)。術(shù)語“同源”意指包括編碼所選宿主細(xì)胞內(nèi)源的酶的DNA序列。術(shù)語“異源”意指包括天然情況下宿主細(xì)胞不表達(dá)的DNA序列。因此，該DNA序列可以是來源于另一種微生物，或者是合成序列。
本發(fā)明DNA構(gòu)建體或者重組載體導(dǎo)入的宿主細(xì)胞可以是能夠表達(dá)所述酶的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌，酵母，真菌和高等真核細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括原核、古細(xì)菌和絲狀真菌細(xì)胞。
經(jīng)過培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明酶的真菌宿主細(xì)胞的例子是絲狀真菌的細(xì)胞，如屬于曲霉屬、鐮孢屬和木霉屬中任何一個(gè)的菌株，更特指任何屬于黑曲霉，米曲霉，禾谷鐮孢和Trichoderma reesei等種的菌株。
經(jīng)過培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子是革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌屬的菌株，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬的菌株，如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或用感受態(tài)細(xì)胞依照已知方式進(jìn)行(參見Sambrook等，出處同前)。
當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，通常以不溶性顆粒存在(稱為包涵體)，或者可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)空間。前一種情況下，裂解細(xì)胞，收集顆粒，變性，隨后稀釋變性劑使酶重新折疊。后一種情況下，可以在例如超聲破碎或滲透壓休克破碎細(xì)胞以釋放周質(zhì)空間成分后，再回收酶，從而由周質(zhì)空間收集酶。
當(dāng)在如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株等革蘭氏陽性細(xì)菌中表達(dá)酶時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，或者被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。后一種情況下，酶可以按以下描述由培養(yǎng)基回收。
生產(chǎn)纖維素分解酶的方法本發(fā)明提供一種生產(chǎn)本發(fā)明的分離酶的方法，其中，在允許該酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收得到的酶。
如本文中的定義，一種分離的多肽(例如酶)是基本不含其它多肽的多肽，例如經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，至少約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選約60％純，甚至更優(yōu)選約80％純，最優(yōu)選約90％純，最最優(yōu)選約95％純。
術(shù)語“分離多肽”也可稱為“純化多肽”。
當(dāng)將含有編碼該酶的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到異源宿主細(xì)胞中時(shí)，就有可能異源重組生產(chǎn)本發(fā)明的酶。
由此，有可能制備很純或單組分的纖維素分解組合物，其特征在于不含同源雜質(zhì)。
本文中，同源雜質(zhì)是指來源于最初獲得本發(fā)明酶的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如本發(fā)明酶之外的多肽)。
本發(fā)明的同源宿主細(xì)胞可以是網(wǎng)球菌菌株。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所選宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的任何常規(guī)培養(yǎng)基。表達(dá)的纖維素分解酶可以方便地分泌到培養(yǎng)基中，并可以通過熟知的程序從中回收，包括通過離心或過濾將細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來，用鹽(例如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，隨后進(jìn)行如離子交換層析、親和層析等層析技術(shù)。
酶組合物更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及含有上述是纖維素分解活性的酶的酶組合物。
本發(fā)明的酶組合物，除包含本發(fā)明的纖維素酶之外，還可以含有一或多種其它酶類，例如半纖維素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶組分，殼多糖酶、脂肪酶、酯酶、果膠酶、角質(zhì)酶、肌醇六磷酸酶、氧化還原酶、蛋白酶或淀粉酶。
酶組合物可以依照本領(lǐng)域已知方法制備，可以是液態(tài)或干性組合物形式。例如，酶組合物可以是顆粒或微粒形式。包含在組合物中的酶可以用本領(lǐng)域已知方法穩(wěn)定化。
耐熱纖維素酶在許多工業(yè)和應(yīng)用領(lǐng)域都有潛在的用途。以下給出了本發(fā)明酶組合物的優(yōu)選用途的例子。本發(fā)明酶組合物的劑量和它的其它使用條件可以依據(jù)本領(lǐng)域已知方法測(cè)定。
依照本發(fā)明的酶組合物可以用于下列目的中的至少一種。
用途在紡織工業(yè)中，纖維素酶被用來處理棉花和其他纖維素材料，以達(dá)到對(duì)纖維的表面處理，從而使得到的紡織品性質(zhì)改變，如減少起球傾向，去除絨毛，軟化織物，改善手感或視覺效果。特別是纖維素酶被用于給粗斜紋棉布帶來石洗外觀。高溫使用纖維素酶就可能使得粗斜紋棉布和非粗斜紋棉布的棉/纖維素織物產(chǎn)生新的外觀。耐熱纖維素酶可以用于在以前不可能進(jìn)行的織物高溫處理中，這樣有可能在80℃以上或在液體比率極低的蒸氣條件下進(jìn)行纖維素酶洗滌，因此有能力提供新外觀。
在工業(yè)清洗過程中，當(dāng)要去除的雜物是纖維素物質(zhì)時(shí)，使用耐熱纖維素酶能夠使清洗過程更容易。實(shí)例是在食品/飼料工業(yè)中清洗超濾膜、管道等。
將熱穩(wěn)定性纖維素酶與纖維素填充劑一起添加至熱壓塑料和聚合物材料中，將使這些材料在自然界有更高的可降解性。
木質(zhì)纖維素材料構(gòu)成了農(nóng)業(yè)和林業(yè)廢物、以及在城市垃圾中占主要的廢紙的一個(gè)大的組成部分。這種廢物通常是被燒掉，從能量角度來看，這是對(duì)資源的極大浪費(fèi)。已經(jīng)進(jìn)行了大量工作，目的在于發(fā)展一種高效、經(jīng)濟(jì)的方法，可以用于將這些生物材料轉(zhuǎn)化為糖，而糖可用來發(fā)酵生產(chǎn)諸如乙醇，以作為燃料。已提出的用于將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成糖的處理方法包括使用纖維素酶，但是所需的劑量極高，使得出于經(jīng)濟(jì)考慮，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用是不現(xiàn)實(shí)的。使用具有液化特性的耐熱纖維素酶令這種生物轉(zhuǎn)化過程更現(xiàn)實(shí)。高溫下的處理能打開許多植物材料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使纖維素更易受到酶的攻擊。
由各種谷物生產(chǎn)乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)中，傳統(tǒng)的加工過程包括在大約80-100℃用α-淀粉酶進(jìn)行液化。在這個(gè)步驟加入纖維素酶將提高可發(fā)酵糖的產(chǎn)量。纖維素的預(yù)液化也使得在隨后的程序中使用常規(guī)纖維素酶變得現(xiàn)實(shí)，因?yàn)榇藭r(shí)水解速率比未預(yù)液化時(shí)要更高。
飼料生產(chǎn)中谷物、黑麥、大麥、玉米等的預(yù)消化是耐熱纖維素酶的另一個(gè)潛在用途，這樣是為了提高飼料在動(dòng)物體內(nèi)的消化性。
生產(chǎn)速溶咖啡時(shí)，咖啡的提取是在85-150℃下，在一套滲透柱中進(jìn)行的。水由最濃縮的室逆流到剛裝入的有新鮮咖啡的室。含有新鮮咖啡的室的操作溫度接近100℃。在這里加入嗜熱纖維素酶將提高柱性能，因?yàn)榧?xì)胞壁被打開后可溶物質(zhì)更容易釋放。
在從天然植物資源中提取油或香料/調(diào)味化合物的其它傳統(tǒng)高溫方法中加入纖維素酶象咖啡提取一樣，能提高生產(chǎn)能力或產(chǎn)量。實(shí)例是提取棕櫚油或棕櫚果油，這就是一個(gè)液態(tài)高溫過程。
材料和方法保藏微生物網(wǎng)球菌DSM6262，其含有本發(fā)明纖維素酶編碼DNA序列。
大腸桿菌DSM11201，其含有在克隆載體pSJ1678中包含本發(fā)明纖維素酶編碼DNA序列的質(zhì)粒。
其它菌株大腸桿菌菌株制備用于電穿孔的大腸桿菌SJ2細(xì)胞(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C(1990)，編碼來源于短芽孢桿菌的一種外切酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB基因的克隆，細(xì)菌學(xué)雜志，172，4315-4321)，交使用BIO-RAD的Gene PulserTM基因脈沖電穿孔儀，依照廠商說明，進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化。
質(zhì)粒pSJ1678如本文中引作參考文獻(xiàn)的國(guó)際申請(qǐng)公開WO94/19454所公開的。
普通分子生物學(xué)方法DNA操作和轉(zhuǎn)化用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行(Sambrook，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor lab.Cold Spring HarborNY；Ausubel，F(xiàn).M.等(編)“現(xiàn)代分子生物學(xué)規(guī)程”，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編)“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”，John Wiley和Sons，1990)。
DNA操作使用的酶依照廠商的說明使用。
編碼本發(fā)明纖維素分解酶的DNA序列的分離編碼本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列，可以從保藏微生物大腸桿菌DSM11201，通過用本領(lǐng)域已知方法(Sambrook，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor NY)提取質(zhì)粒DNA獲得。
內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆基因組DNA制備網(wǎng)球菌DSM6262菌株在1L玻璃瓶中，用下述培養(yǎng)基，在70℃增殖兩天。
DSM6262菌株的嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)基組成1.0g NH4Cl，0.1g NaCl，0.1g MgCl2，0.05g CaCl2，0.4gK2HPO4·3H2O，0.75g酵母提取物，4.0g山毛櫸木聚糖(Lenzing)，0.5mg Resazurin，1.0ml微量金屬元素#，1.0ml維生素溶液，3.0gNaHCO3，加H2O至1升。
#微量金屬溶液2.0g FeCl2.4H2O，0.05g ZnCl2，0.05g MnCl2，0.05g AlCl3，0.05g NiCl2，0.1g Na2SeO3·5H2O，0.05g H3BO3，0.03g CuCl2，0.05g(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.05g CoCl2·6H2O，0.5g EDTA，1.0ml濃鹽酸，加H2O至1升。
在N2/CO2(4∶1)氣體中，每瓶分裝10ml。用不透氧氣的橡膠塞塞住，140℃高壓滅菌20分鐘。在無菌厭氧注射接種之前，現(xiàn)加入0.1ml經(jīng)過濾除菌的厭氧DSM維生素溶液#141和0.2ml 2.5g/lNa2S·9H2O高壓滅菌儲(chǔ)液。
收獲細(xì)胞，用Pitcher等所述方法分離基因組DNA(Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.(1989)。用硫氰酸胍快速提取細(xì)菌基因組DNA。應(yīng)用微生物學(xué)快報(bào)8151-156)。
基因組文庫的構(gòu)建用限制酶Sau3A部分消化基因組DNA，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分級(jí)分離。電泳分離出2到7kb大小的片段，將它們轉(zhuǎn)到DEAE-纖維素膜(Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P.(1981)，從瓊脂糖和丙烯酰胺凝膠回收DNA片段的一種可靠方法，分析生物化學(xué)112，295-298)上。
將分離的DNA片段連接到經(jīng)BamHI消化的pSJ1678質(zhì)粒DNA上，用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
將細(xì)胞鋪在含有0.1％CMC(羧甲基纖維素鈉，Aqualon，F(xiàn)rance)和9μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，達(dá)到500-1000菌落形成單位/板，37℃培養(yǎng)過夜。
通過活性鑒定陽性克隆培養(yǎng)后，將克隆影印到一套LB+CAM瓊脂平板上，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)約20小時(shí)。向影印平板傾注于適當(dāng)緩沖液pH7中的含有0.1％CMC，1％HSB瓊脂糖的頂層，65℃培養(yǎng)約20小時(shí)。用0.1％剛果紅(CongoRed)(SIGMA，USA)水溶液染色，然后在2M NaCl中洗，鑒定出內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆。淺黃色環(huán)出現(xiàn)的位置即為內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆。
來自酶陽性克隆的細(xì)胞在瓊脂板上擴(kuò)展以形成單菌落，從每一個(gè)鑒定到的產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶克隆都挑選出一個(gè)產(chǎn)酶單菌落。
陽性克隆的鑒定從劃線平板得到內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆的單菌落，提取質(zhì)粒。表現(xiàn)型通過再轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2確定，質(zhì)粒通過限制酶切鑒定。
培養(yǎng)基TY和LB瓊脂(如Ausubel F.M.等，(編輯)“現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)”John Wiley和Sons，1995)。
雜交條件(用于評(píng)價(jià)本發(fā)明DNA構(gòu)建體的特性ii))確定核酸探針和同源DNA或RNA序列間雜交情況的合適檢測(cè)條件包括將含有要雜交的DNA片段或RNA的濾膜預(yù)先在5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)中浸泡10分鐘，濾膜在5×SSC溶液(Sambrook等，1989)，5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)，0.55％SDS和超聲變性的100μg/ml鮭精DNA(Sambrook等，1989)中預(yù)雜交，然后在含有隨機(jī)引發(fā)(Feinberg A.P.和Vogelstein B(1983)Anal.Biochem.1326-13)的32P-dCTP標(biāo)記(比活＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中于約45℃雜交12小時(shí)。然后將膜在2×SSC，0.5％SDS中洗滌30分鐘兩次，洗滌溫度優(yōu)選不超過55℃，更優(yōu)選不超過60℃，更優(yōu)選不超過65℃，還要更優(yōu)選不超過70℃，特別是不超過75℃。
用于雜交的核苷酸探針是可得自大腸桿菌DSM11201中質(zhì)粒的DNA序列的內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分。
免疫交叉反應(yīng)性用于檢測(cè)免疫交叉反應(yīng)性的抗體可以利用純化的內(nèi)切葡聚糖酶制備。更具體地說，抗本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的抗血清可以通過免疫兔子(或其他嚙齒類動(dòng)物)得到，步驟參照N.Axelsen等，定量免疫電泳指南，Blackwell科學(xué)出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，實(shí)用免疫化學(xué)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(尤其是27-31頁)。純化的免疫球蛋白可以從抗血清獲得，例如通過鹽析((NH4)2SO4)，然后透析和如在DEAE-Sephadex進(jìn)行離子交換層析。蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)鑒定可以利用Outcherlony雙向擴(kuò)散分析(O.Ouchterlony，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D.M.Weir編)，Blackwell科學(xué)出版社1967，655-706頁)，交叉免疫電泳(N.Axelsen等，出處同前，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進(jìn)行。
以下非限制性實(shí)施例用于闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1來源于網(wǎng)球菌DSM6262的內(nèi)切葡聚糖酶的克隆和表達(dá)如“材料和方法”的描述，在大腸桿菌中構(gòu)建并篩選了來源于網(wǎng)球菌DSM6262的一個(gè)文庫。分離到的一個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子是DSM11201，它帶有質(zhì)粒pSJ1678，其中含有編碼本發(fā)明纖維素分解酶的DNA序列。
對(duì)分離到的大腸桿菌克隆同時(shí)在含有0.1％AZCL β-葡聚糖，AZCL木糖葡聚糖(xyloglucan)，AZCL HE纖維素，AZCL木聚糖，AZCLcurdlan或AZCL半乳甘露聚糖的LB+CAM瓊脂平板上進(jìn)行測(cè)試。平板在37℃培養(yǎng)約48小時(shí)，然后在65℃培養(yǎng)。酶活性通過菌落周圍的蘭色環(huán)鑒定。發(fā)現(xiàn)該克隆在AZCL β-葡聚糖，AZCL木糖葡聚糖和AZCL HE纖維素上為陽性。由大腸桿菌克隆DSM11201制備酶溶液將DSM11201接種到含有200ml Super肉湯培養(yǎng)基的搖瓶中作為預(yù)培養(yǎng)物，培養(yǎng)基中含有如下成分(每升)胰蛋白胨32g，酵母提取物20g，NaCl 5g，CMC 5g，用1M NaOH調(diào)至pH7.2-7.3。121℃高壓滅菌20分鐘。滅菌后加入氯霉素至終濃度6mg/ml。
搖瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上以280rpm，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。將1ml培養(yǎng)物接種到100個(gè)含有200ml Super肉湯培養(yǎng)基的搖瓶中，以280rpm，在37℃培養(yǎng)16到18小時(shí)。3000rpm離心20升大腸桿菌培養(yǎng)物，將菌體沉淀重新懸浮于800ml 50mM Tris-馬來酸(maleat)緩沖液(pH7.0)中，細(xì)胞用Rannie High Pressure Laboratory勻漿器在800巴破碎。10000rpm離心1小時(shí)，收集澄清的上清液。
實(shí)施例2從網(wǎng)球菌DSM6262克隆的內(nèi)切葡聚糖酶的純化和鑒定將600ml大腸桿菌細(xì)胞提取物首先在70℃熱處理5分鐘，然后在5000rpm離心20分鐘。上清液經(jīng)Whatman濾紙D過濾，得到總量200ml溶液，活性為11CMCU/ml(CMCU的確定，見下文)。
溶液流過用0.05M、pH5.0的乙酸鈉緩沖液平衡過的S-Sepharose柱。結(jié)合的內(nèi)切葡聚糖酶用0.5M氯化鈉洗脫，得到溶液總量300ml，其活性為2CMCU/ml。將溶液調(diào)至pH9.0，用20mM、pH9.0的乙醇胺緩沖液在膜截留分子量為10kD的Amicon超濾室中平衡。然后，當(dāng)傳導(dǎo)率約為250μS/cm時(shí)，將溶液裝入經(jīng)同樣緩沖液平衡的Q-Sepharose柱中。內(nèi)切葡聚糖酶會(huì)發(fā)生結(jié)合，并可以用NaCl梯度洗脫出來。由于第一次實(shí)驗(yàn)的傳導(dǎo)率過高，我們只得到2ml活性為65CMCU/ml的溶液。
最后，將溶液濃縮，并上樣到0.1M乙酸鈉(pH6.0)中的分級(jí)柱Superdex200內(nèi)，純內(nèi)切葡聚糖酶洗脫在22ml的體積內(nèi)，將其用膜截留分子量為6kD的Amicon超濾室濃縮。得到1ml活性為40CMCU/ml的溶液。該樣品在SDS-PAGE中顯示為單一條帶，分子量30kD，pI為6.5。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電印跡，用Applied Biosystems model 473A測(cè)序儀測(cè)N-端序列。蛋白質(zhì)測(cè)序儀依照廠商的使用說明操作，得到如下序列QTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFFNIAAY-純內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)對(duì)硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷(Sigma)，CMC，HE纖維素(Megazyme)和酸溶脹的纖維素有活性。
一個(gè)CMCU單位定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘釋放相當(dāng)于1mmol葡萄糖的酶用量。標(biāo)準(zhǔn)條件在70℃進(jìn)行CMC檢測(cè)將酶在0.1M巴比妥酸鈉緩沖液pH8.5中的0.75％CMC(7L，來自Hercules)溶液中保溫20分鐘。保溫后，使用PHBAH(SIGMA H-988253H7704(對(duì)羥基苯甲酸酰肼))測(cè)定還原性末端基團(tuán)的增加量，并利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每分鐘形成的相當(dāng)于葡萄糖的末端基團(tuán)(Lever，M.(1972)用于比色測(cè)定碳水化合物的新反應(yīng)，分析生物化學(xué)，47卷，273-279頁)。
內(nèi)切葡聚糖酶在70℃和pH8.5下活性為137CMCU/mg og蛋白質(zhì)(50CMCU/A280)。內(nèi)切葡聚糖酶的溫度-活性關(guān)系在pH8.5的CMCU檢測(cè)中，將內(nèi)切葡聚糖酶在不同溫度保溫，保溫20分鐘后如上所述檢測(cè)活性。超過90℃的保溫沒有做，在該溫度得到的還原性糖量最高，用于計(jì)算低于該溫度時(shí)的相對(duì)活性。
溫度相對(duì)活性90℃100％80℃76％70℃40％60℃26％50℃14％40℃7％pH-活性曲線在70℃的CMCU檢測(cè)中，將內(nèi)切葡聚糖酶用pH 4.5到11的不同緩沖液保溫，保溫20分鐘后測(cè)定活性。
緩沖液pH4.5、5.0和5.50.1M乙酸鈉pH6.00.1M Na-MESpH6.5、7.0和7.50.1M Na-MOPSpH8.0和8.50.1M EPPSpH9.0、9.5、10.0、10.5和11.00.1M甘氨酸鈉測(cè)得pH5.5到11的相對(duì)活性高于50％。對(duì)硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷檢測(cè)一個(gè)PNPU單位定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘從對(duì)硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷釋放1mmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。
方法穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)，直接在405nm檢測(cè)黃色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚。活性用吸光度的增加衡量，曲線的線性部分用于確定斜度(AU/sec)?；钚缘挠?jì)算使用對(duì)硝基苯酚在磷酸鹽緩沖液pH7.5中的吸光度在1cm比色杯中的吸光度，在405nm處1mM為0.018(在420nm處1mM為0.014)。
檢測(cè)條件475ml于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的10mM對(duì)硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷25ml酶溶液步驟測(cè)量用恒溫控制在70℃的HP 8452A Diode Array分光光度計(jì)，在1cm厚的0.75ml比色杯中進(jìn)行。
測(cè)量300秒內(nèi)在405nm處的吸光度，每20秒測(cè)一次。
內(nèi)切葡聚糖酶在70℃、pH7.5顯示170PNPU/A280。酸溶脹的纖維素PASC儲(chǔ)液用冰冷丙酮和磷酸如下制備。將5克纖維素(Avice)用水弄濕，加入150ml冰冷的85％正磷酸?；旌先芤褐帽?，緩慢攪拌1小時(shí)。然后邊攪拌邊加入100ml冰冷丙酮。將漿液轉(zhuǎn)移到帶有3號(hào)耐熱燒結(jié)板的Buchner濾器中，用100ml冰冷丙酮洗3次，每次洗后盡量吸干。最后，濾餅用500ml水洗兩次，每次洗后盡量吸干。將PASC混入去離子水中至總量300ml，混合均勻(用Ultra Turrax勻漿儀)，并儲(chǔ)存在冰箱中(可保存不超過1個(gè)月)。
用緩沖液進(jìn)行底物平衡將20克磷酸溶脹的纖維素PASC儲(chǔ)液在5000rpm離心20分鐘，棄上清液，沉淀重懸于30ml緩沖液中，在5000rpm離心20分鐘，棄上清液，沉淀重懸于總量60g相當(dāng)于底物濃度為5g纖維素/升的緩沖液中。
pH8.5檢測(cè)用的緩沖液0.1M巴比妥。
步驟1.稀釋酶樣品酶液用與底物相同的緩沖液稀釋。
2.酶反應(yīng)緩沖液中的底物在80℃預(yù)加熱5分鐘(2ml)。
然后加入0.5ml酶液(稀釋好的)，混合5秒。在酶液之前加入終止劑得到酶空白對(duì)照。80℃保溫20分鐘。加入0.5ml 2％NaOH溶液終止反應(yīng)，混合5秒。
將樣品在5000rpm離心20分鐘，將1ml上清液與0.5ml PHBAH試劑，煮沸10分鐘。試管在冰水浴中冷卻。
3.還原性末端基團(tuán)的檢測(cè)用分光光度計(jì)測(cè)量410nm的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線，其中使用相同緩沖液中的葡萄糖，濃度為5、10、15和25mg/l，并在煮沸前加入PHBAH試劑。釋放的還原性葡萄糖當(dāng)量用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。
Kcat和Km的測(cè)定酸溶脹纖維素的催化活性用上述檢測(cè)方法在80℃和pH8.5的標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)不同底物濃度進(jìn)行測(cè)定。動(dòng)力學(xué)常數(shù)用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)程序Grafit計(jì)算。依據(jù)內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸組成，確定出其摩爾消光系數(shù)為85630。因此得到如下數(shù)據(jù)Kcat＝77/秒Km＝25克酸溶脹纖維素/升實(shí)施例3耐熱內(nèi)切葡聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)如下所述的枯草芽孢桿菌中含有編碼克隆自網(wǎng)球菌DSM6262的耐熱內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)質(zhì)粒，由發(fā)明人依照布達(dá)佩斯條約國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏規(guī)定，于1997年12月16日將該菌株保藏在Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，F(xiàn)ederalRepublic of Germany，保藏號(hào)DSM11903。材料
菌株大腸桿菌SJ2(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)編碼來源于短芽孢桿菌的一種外切酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB基因的克隆，細(xì)菌學(xué)雜志，172，4315-4321)，制備電感受態(tài)細(xì)胞，使用廠商推薦的BIO-RADGenePulserTM進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
枯草芽孢桿菌A164。這個(gè)菌珠是枯草芽孢桿菌ATCC6051a的衍生物，它不能產(chǎn)生芽孢，并且apr和npr基因已被破壞。破壞方法基本如所述進(jìn)行(A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏陽性細(xì)菌，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)，618頁)。制備感受態(tài)細(xì)胞，如Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.((1975)在枯草芽孢桿菌溶源菌株中的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染在感受態(tài)細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)原噬菌體的證據(jù)。細(xì)菌學(xué)雜志，121296-304)描述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
質(zhì)粒pUB110質(zhì)粒描述于McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.Sueoka，N.，pUB110的核苷酸序列與復(fù)制和它的調(diào)控相關(guān)的一些突出特性，質(zhì)粒15(2)，93-103(1986)和(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.Sueoka，N.，更正，修改的pUB110核苷酸序列和功能圖譜，質(zhì)粒17(1)，83-85(1987)。
pMUTIN-4-MCS該質(zhì)?？蓮腖aboratories de GenetiqueMicrobienne，Institut National de la RechercheAgronomique，78352 Jouy en Josas-CEDEX，F(xiàn)rance獲得。
培養(yǎng)基LB瓊脂(如Ausubel，F(xiàn).M.等(編輯)“現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)”，JohnWileySons，1995描述)。
LBPG是補(bǔ)充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀(pH7.0)的LB瓊脂。
AZCL-HE-纖維素加入LBPG瓊脂至1％。AZCL-HE-纖維素來自Megazyme，Australia。
BPX培養(yǎng)基在以WO91/09129公開的國(guó)際申請(qǐng)中有描述。
方法質(zhì)粒的構(gòu)建和克隆的建立基本如下進(jìn)行pMUTIN4MCS是一個(gè)大腸桿菌質(zhì)粒，它帶有一個(gè)雜合啟動(dòng)子SPAC(Yansura等(1984)，用E.coli lac抑制子和操縱子控制枯草芽孢桿菌中的基因表達(dá)，PNAS，181卷，439-443頁)和處于該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的lacZ基因。并且該質(zhì)粒含有在芽孢桿菌penP啟動(dòng)子調(diào)控下的lacI基因。因此，在枯草芽孢桿菌中時(shí)，lacI將被表達(dá)，并結(jié)合SPAC啟動(dòng)子-操縱子中的操縱子，這就會(huì)抑制下游序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子與Yansura等人所用的相同，但操縱子被修飾成了完善的回文結(jié)構(gòu)。正好位于啟動(dòng)子-操縱子區(qū)下游的一個(gè)HindIII位點(diǎn)，使得可以通過插入另一個(gè)基因，如本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶基因，而打斷l(xiāng)acz基因。從而可以讓內(nèi)切葡聚糖酶在SPAC啟動(dòng)子-操縱子的調(diào)控下表達(dá)。
在E.coli質(zhì)粒pMUTIN4MCS中，以HindIII-SacI片段形式克隆了一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和帶有一個(gè)可用于克隆的SacII位點(diǎn)的信號(hào)肽。建立了如下核糖體結(jié)合位點(diǎn)和編碼信號(hào)肽的DNA序列HindIIIRBS5′-AAGCTTGTTACACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGCTTT-ACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCG-NotI SacICGGCA GCGGCCGC GAGCTC-3 ′斜體書寫的是編碼芽孢桿菌屬種信號(hào)肽的DNA序列，它與編碼蛋白質(zhì)成熟部分的另一DNA序列融合時(shí)，能將該蛋白質(zhì)引導(dǎo)到芽孢桿菌細(xì)胞體外。
上述序列編碼pMUTIN4MCS的HindIII位點(diǎn)，其后緊跟枯草芽孢桿菌RBS和編碼芽孢桿菌信號(hào)肽的一段DNA序列，該DNA序列末端是一個(gè)人工引入的SacII位點(diǎn)，其后接著NotI和SacI限制酶切位點(diǎn)。通過電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli SJ2，鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)細(xì)胞過夜，獲得了質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒命名為pMUTIN-4-信號(hào)SacII-NotI。
耐熱葡聚糖酶基因以SacII-EagI消化的PCR片段進(jìn)行克隆。
用Boehringer Mannheim的HiFi Expand PCR試劑盒獲得該P(yáng)CR片段，反應(yīng)按照廠商建議進(jìn)行。從質(zhì)粒pDSM11201擴(kuò)增該DNA片段。耐熱內(nèi)切葡聚糖酶基因起初是從網(wǎng)球菌DSM6262克隆來的，并作為包含帶有內(nèi)切葡聚糖酶基因的質(zhì)粒的E.coli克隆(DSM11201)保藏。
#305195′-CATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGC-3′#306375′-CATGACACGGCCGATTATTTAAGCTCAATATCAAAATTTGAG-3′該P(yáng)CR片段和pMUTIN4-信號(hào)SacII-NotI用SacII-EagI消化，連接在一起，通過電穿孔轉(zhuǎn)化E.coli SJ2，鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，并在37℃培養(yǎng)細(xì)胞過夜。得到的SJ2中的質(zhì)粒命名為pMB447A。
克隆融合了上述信號(hào)肽(在SacII-NotI/EagI位點(diǎn))的內(nèi)切葡聚糖酶基因后，得到下面的由SPAC啟動(dòng)子-操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的開放閱讀框ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGCATTTATACTTAAAGCACCTTCCTCAGGCGATGTCACAACTAAAAATCTTCCTCTCACCTTAGAACTCAACTTTTGGAATATTGCAAACTATGAAGGAAATACATGGATGGCATTTTATAAAGAAGAAGATACTGTTGAATATTATGCCGACATAAAAAACATAGTACTTAAGGATAAAAATTCATGGGTACATGGATATCCTGAAGTCTACTATGGGTACAAACCATGGGCTGGCCATGGGAATTCCATTGAGAAATTAGCTCTTCCTAAAAAGGTATCAGAATTTCCAGACGTTCTCTTCAATCTAAAATACAACATATGGTACGAGAAGAATCTTCCTATAAATTTTGCTATGGAAACATGGATAACAAAAGAACCCTATCAGAAAACCGTTACTTCAGGGGATATAGAGATGATGGTATGGCTATATGCTAATAGACTTTCTCCTGCAGGGCGAAAGGTAGGAGAAGTAAAAATACCTATCATCCTAAACGGTAATCAAAAAGACATTATCTGGGAAGTATATCTTTCCCCTATGAGCTGGGACTACGTGGCCTATAAATCAAAAGAAAATATTCTTCAAGGACAGGTAAAAATACCAATAAATGAATTTTTGAAACACCTAAGAACAATTTTAGCCAACAATCCAAGTAGAATAACCCCAGAGAAATTTGATCAGATGTATGTGACAGTCTGGGAAATTGGAACAGAATTTGGCGATCCATATACTACTGAGGCAAAATTTGGATGGACTTTCTCAAATTTTGATATTGAGCTTAAATAA以及衍生的蛋白質(zhì)MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAQTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFWNIANYEGNTWMAFYKEEDTVEYYADIKNIVLKDKNSWVHGYPEVYYGYKPWAGHGNSIEKLALPKKVSEFPDVLFNLKYNIWYEKNLPINFAMETWITKEPYQKTVTSGDIEMMVWLYANRLSPAGRKVGEVKIPIILNGNQKDIIWEVYLSPMSWDYVAYKSKENILQGQVKIPINEFLKHLRTILANNPSRITPEKFDQMYVTVWEIGTEFGDPYTTEAKFGWTFSNFDIELK.
為了能在枯草芽孢桿菌中增殖pMB447A，將該E.coli質(zhì)粒與pUB110的衍生質(zhì)粒(能在枯草芽孢桿菌中增殖的一種質(zhì)粒)融合在pUB110的NciI位點(diǎn)用多接頭引入SacI和NotI位點(diǎn)，得到的插入片段有如下序列CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG下劃線的是兩個(gè)NciI位點(diǎn)，其間是SacI和EagI(NotI)位點(diǎn)。
質(zhì)粒隨后用SacI和EagI消化，連接到經(jīng)SacI和EagI消化的pMB447A中，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌A164。建立克隆，并在LBPG-10 Kana AZCL-HE-纖維素平板上過夜生長(zhǎng)。第二天，將平板在70℃保溫5小時(shí)，藍(lán)色環(huán)的出現(xiàn)指示耐熱內(nèi)切葡聚糖酶的陽性表達(dá)。
分析從克隆MB505分離得到的質(zhì)粒DNA(DSM11903)時(shí)，顯然質(zhì)粒發(fā)生了重組，產(chǎn)生的質(zhì)粒小于預(yù)料中的12.5kb大小。因此，看來質(zhì)粒丟失了E.coli質(zhì)粒pMUTIN4-信號(hào)SacII-NotI的大部分，得到大小約為5.5kb的一個(gè)質(zhì)粒。
得到的質(zhì)粒具有如下基本特點(diǎn)質(zhì)粒DSM11903上編碼的內(nèi)切葡聚糖酶不需加入IPTG即可陽性表達(dá)，并且該質(zhì)粒賦予對(duì)10μg/ml卡那霉素的抗性。
MB505在帶有兩個(gè)擋板的500ml搖瓶中，于100ml BPX培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃，300rpm培養(yǎng)5天。純化和鑒定從帶有克隆MB505的芽孢桿菌收獲5000ml搖瓶培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物加熱到70℃，攪拌下保持該溫度5分鐘，從而熱處理培養(yǎng)物。然后冷卻，并在9000rpm離心20分鐘。獲得含有2.4CMCU/ml的清亮上清液4000ml。
在70℃和pH8.5測(cè)定CMCU。
將6000CMCU上樣到用pH6.2的50mM Mes緩沖液平衡過的3000mlDEAE A-50 Sephadex柱中。未結(jié)合的物質(zhì)共含有5700CMCU。
將未結(jié)合的物質(zhì)上樣到用pH9.5的20mM乙醇胺緩沖液平衡過的1000ml Q-Sepharose柱中。結(jié)合的酶用NaCl梯度洗脫下來。
部分純化的產(chǎn)物用amicon超濾池濃縮，其中膜截留分子量為6KDa。
濃縮組分用40％nonopropyleneglycol配制。
獲得總量為250ml，濃度為9.7CMCU/ml的濃縮液(總共2425CMCU)，用于應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。
免疫學(xué)方法利用來自網(wǎng)球菌的高度純化的纖維素酶(實(shí)施例2)生產(chǎn)抗血清。
免疫過程用兔子在DAKO進(jìn)行。每只兔子用與100μl佐劑混合的100μl纖維素酶(0.4mg蛋白質(zhì)/ml)免疫。每只兔子每隔1周免疫一次，共免疫15次。收集兔血清，從血清中純化γ球蛋白。
例如在含有25ml 1％瓊脂糖凝膠(15*10cm)與50μl γ球蛋白(A280＝106.5)的Mancini平板上制備4mm的小孔，孔中加入10μl樣品，在濕室中室溫培養(yǎng)1天。
平板在0.95NaCl水中洗幾次，依照標(biāo)準(zhǔn)程序用考馬斯藍(lán)染色。
從高度純化的網(wǎng)球菌纖維素酶或部分純化的MB505制劑分別得到下列直徑高度純化的網(wǎng)球菌纖維素酶40CMCU給出的直徑為11.5mm20CMCU給出的直徑為9.5mm10CMCU給出的直徑為7mmMB505制劑10CMCU給出的直徑為8mm其它族的12種纖維素酶(例如來自真菌木霉屬、腐質(zhì)霉屬、曲霉屬)在這些條件下不形成免疫沉淀。
實(shí)施例490℃下網(wǎng)球菌纖維素酶的生物拋光實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備裝置Mathis Pad-steam Range，型號(hào)PSA-HTF織物漂白的雙羅紋針織棉織物(Test fabrics Inc.)N.O.白色，100％棉，樣式460。將織物剪成20×30cm大小的布片(每片約12.5g)。
酶網(wǎng)球菌，批號(hào)MB505，9.7CMCU/ml緩沖液15mM磷酸鹽緩沖液，pH6.015mM磷酸鹽緩沖液，pH8.1軋染(padding)程序棉布樣品在標(biāo)準(zhǔn)AATCC(美國(guó)紡織化學(xué)家和染色家學(xué)會(huì))氣候室(相對(duì)濕度65±2％和溫度70±3°F)中調(diào)濕至少24小時(shí)。稱取重量。
酶溶液由混合酶和緩沖液制得。調(diào)節(jié)pH，溶液中的酶活性如下表1所示。將樣品浸入酶溶液中45秒以下，然后軋染。軋染后，樣品稱重，立即掛在Mathis蒸汽發(fā)生器中。織物上的溶液百分比以織物樣品濕重增量表示，也示于表1中。表1
在蒸汽發(fā)生器中生物拋光織物樣品在下列條件下在蒸汽發(fā)生器中處理溫度90℃時(shí)間90分鐘相對(duì)濕度100％取出所有樣品，并浸在去離子水中至少5分鐘。風(fēng)干，然后在評(píng)估前在AATCC氣候室中調(diào)濕至少24小時(shí)。
評(píng)估強(qiáng)度損失織物強(qiáng)度依照ASTM D3786-87，在Mullen Bursttester model C上測(cè)量。數(shù)據(jù)是至少8次測(cè)量的平均值。
起球指數(shù)依照ASTM D 4970-89用Matindale Pilling Tester在500轉(zhuǎn)測(cè)量。目測(cè)評(píng)估織物的起球情況，分為1-5級(jí)，1級(jí)表示起球情況嚴(yán)重，5級(jí)表示不起球。數(shù)據(jù)是至少2次測(cè)量的平均值。
結(jié)果與結(jié)論結(jié)果總結(jié)如下，數(shù)據(jù)見表2和3。
1.隨酶液濃度增加，起球指數(shù)增加(表3)。
2.網(wǎng)球菌纖維素酶在pH8.1比pH6.0有更好的起球指數(shù)(表3)。
3.在目前條件下，在pH6.0進(jìn)行生物拋光，棉布強(qiáng)度損失較小(低于5％)，而在pH8.1沒有檢測(cè)到強(qiáng)度損失。
概括起來，用網(wǎng)球菌纖維素酶對(duì)棉布的生物拋光顯著提高布在本研究中條件下的起球抗性。在優(yōu)選的條件下，如pH約為8，可達(dá)到良好的起球抗性，同時(shí)并沒有可以覺察的強(qiáng)度損失。
表2
表3
<p>序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發(fā)明題目一種新的內(nèi)切葡聚糖酶(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度867個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAAAAAAT CTTTACTTTC TCTTATCCTC ATACTTCTTC TTATTACTCT CTCCTTCAGT 60CAAACTCCAA AATACAAAGA CGCATTTATA CTTAAAGCAC CTTCCTCAGG CGATGTCACA 120ACTAAAAATC TTCCTCTCAC CTTAGAACTC AACTTTTGGA ATATTGCAAA CTATGAAGGA 180AATACATGGA TGGCATTTTA TAAAGAAGAA GATACTGTTG AATATTATGC CGACATAAAA 240AACATAGTAC TTAAGGATAA AAATTCATGG GTACATGGAT ATCCTGAAGT CTACTATGGG 300TACAAACCAT GGGCTGGCCA TGGGAATTCC ATTGAGAAAT TAGCTCTTCC TAAAAAGGTA 360TCAGAATTTC CAGACGTTCT CTTCAATCTA AAATACAACA TATGGTACGA GAAGAATCTT 420CCTATAAATT TTGCTATGGA AACATGGATA ACAAAAGAAC CCTATCAGAA AACCGTTACT 480TCAGGGGATA TAGAGATGAT GGTATGGCTA TATGCTAATA GACTTTCTCC TGCAGGGCGA 540AAGGTAGGAG AAGTAAAAAT ACCTATCATC CTAAACGGTA ATCAAAAAGA CATTATCTGG 600GAAGTATATC TTTCCCCTAT GAGCTGGGAC TACGTGGCCT ATAAATCAAA AGAAAATATT 660CTTCAAGGAC AGGTAAAAAT ACCAATAAAT GAATTTTTGA AACACCTAAG AACAATTTTA 720GCCAACAATC CAAGTAGAAT AACCCCAGAG AAATTTGATC AGATGTATGT GACAGTCTGG 780GAAATTGGAA CAGAATTTGG CGATCCATAT ACTACTGAGG CAAAATTTGG ATGGACTTTC 840TCAAATTTTG ATATTGAGCT TAAATAA867(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度288個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Lys Ser Leu Leu Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Ile Thr1 5 10 15Leu Ser Phe Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Lys Asp Ala Phe Ile Leu Lys20 25 30Ala Pro Ser Ser Gly Asp Val Thr Thr Lys Asn Leu Pro Leu Thr Leu35 40 45Glu Leu Asn Phe Trp Asn Ile Ala Asn Tyr Glu Gly Asn Thr Trp Met50 55 60Ala Phe Tyr Lys Glu Glu Asp Thr Val Glu Tyr Tyr Ala Asp Ile Lys65 70 75 80Asn Ile Val Leu Lys Asp Lys Asn Ser Trp Val His Gly Tyr Pro Glu85 90 95Val Tyr Tyr Gly Tyr Lys Pro Trp Ala Gly His Gly Asn Ser Ile Glu100105 110Lys Leu Ala Leu Pro Lys Lys Val Ser Glu Phe Pro Asp Val Leu Phe115 120 125Asn Leu Lys Tyr Asn Ile Trp Tyr Glu Lys Asn Leu Pro Ile Asn Phe130 135 140Ala Met Glu Thr Trp Ile Thr Ly5 Glu Pro Tyr Gln Lys Thr Val Thr145 150 155 160Ser Gly Asp Ile Glu Met Met Val Trp Leu Tyr Ala Asn Arg Leu Ser165 170 175Pro Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Val Lys Ile Pro Ile Ile Leu Asn180 185 190Gly Asn Gln Lys Asp Ile Ile Trp Glu Val Tyr Leu Ser Pro Met Ser195200 205Trp Asp Tyr Val Ala Tyr Lys Ser Lys Glu Asn Ile Leu Gln Gly Gln210 215 220Val Lys Ile Pro Ile Asn Glu Phe Leu Lys His Leu Arg Thr Ile Leu225 230 235 240Ala Ash Asn Pro Ser Arg Ile Thr Pro Glu Lys Phe Asp Gln Met Tyr245 250 255Val Thr Val Trp Glu Ile Gly Thr Glu Phe Gly Asp Pro Tyr Thr Thr260 265 270Glu Ala Lys Phe Gly Trp Thr Phe Ser Asn Phe Asp Ile Glu Leu Lys275 280 28權(quán)利要求
1.一種有內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶活性的酶制劑，它在高于85℃的溫度下有最佳活性。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中所述溫度高于90℃，優(yōu)選高于95℃，更優(yōu)選高于100℃。
3.權(quán)利要求1或2的制劑，其中所述酶制劑可得自革蘭氏陽性細(xì)菌門的一個(gè)菌株，或是它的內(nèi)源酶。
4.權(quán)利要求3的制劑，其中所述菌株屬于梭菌亞門。
5.權(quán)利要求4的制劑，其中所述菌株屬于網(wǎng)球菌屬，優(yōu)選是網(wǎng)球菌DSM6262。
6.權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的制劑，它在約pH4到11有活性，優(yōu)選在大約pH5.5-10有活性。
7.一種有內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶制劑，該酶制劑在70℃，pH10時(shí)對(duì)羧甲基纖維素(CMC測(cè)定)的相對(duì)活性是在70℃，最適pH時(shí)活性的50％以上。
8.權(quán)利要求7的制劑，其中相對(duì)活性高于55％，優(yōu)選高于60％，更優(yōu)選高于65％，特別是高于70％。
9.權(quán)利要求7或8的制劑，其中所述酶制劑可得自革蘭氏陽性細(xì)菌門的一個(gè)菌株，或是它的內(nèi)源酶。
10.權(quán)利要求9的制劑，其中所述菌株屬于梭菌亞門。
11.權(quán)利要求10的制劑，其中所述菌株屬于網(wǎng)球菌屬，優(yōu)選是網(wǎng)球菌DSM6262。
12.一種DNA構(gòu)建體，它含有編碼有內(nèi)切葡聚糖酶活性的一種酶的一段DNA序列，該酶最佳活性在85℃以上，優(yōu)選在90℃以上，更優(yōu)選在100℃以上，所述DNA序列含有a)對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列，或b)對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列的相似物，該相似物i)與對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列同源，優(yōu)選至少60％同源，或ii)和可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分相對(duì)應(yīng)的DNA序列可雜交的相同寡核苷酸探針能夠雜交，或者iii)編碼一種多肽，該多肽與包含可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分相對(duì)應(yīng)之DNA序列的DNA序列編碼的多肽同源，優(yōu)選至少60％同源，或者iv)編碼一種多肽，該多肽與針對(duì)純化的內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生的抗體具有免疫反應(yīng)性，所述內(nèi)切葡聚糖酶是由對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列編碼的。
13.權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA序列分離自基于原核微生物或真細(xì)菌，優(yōu)選細(xì)菌的DNA文庫，或是由它產(chǎn)生的。
14.權(quán)利要求13的DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列分離自基于革蘭氏陽性細(xì)菌門菌株的DNA文庫，或是由它產(chǎn)生的，優(yōu)選該菌株屬于梭菌亞門，特別是網(wǎng)球菌屬菌株，尤其是網(wǎng)球菌DSM6262。
15.權(quán)利要求12-14中任何一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA序列分離自大腸桿菌DSM11201。
16.權(quán)利要求12-15中任何一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體，其中還含有編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的DNA序列。
17.權(quán)利要求16的DNA構(gòu)建體，其中還含有編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的DNA序列，由該DNA構(gòu)建體的DNA序列所編碼的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶反應(yīng)中心(催化活性結(jié)構(gòu)域)被可操縱地連接在一起。
18.一種含有權(quán)利要求12-17中任何一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
19.一種含有權(quán)利要求12-17中任何一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求18的重組表達(dá)載體的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞，它是原核細(xì)胞，特別是細(xì)菌細(xì)胞，或者是編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列最初來源的內(nèi)源細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于芽孢桿菌的菌株，優(yōu)選屬于枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、液化芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之組的菌株。
22.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于絲狀真菌的菌株，優(yōu)選屬于曲霉屬、鐮孢屬和木霉屬之組的菌株，更優(yōu)選屬于黑曲霉，米曲霉，禾谷鐮孢和Trichoderma reesei等種組成之組的菌株。
23.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于網(wǎng)球菌屬菌株，優(yōu)選網(wǎng)球菌DSM6262。
24.權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于酵母屬的菌株，優(yōu)選釀酒酵母的菌株。
25.產(chǎn)生有內(nèi)切葡聚糖酶活性、且最佳活性在高于85℃，優(yōu)選高于90℃，更優(yōu)選高于100℃的酶的一種方法，該方法包括在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求19-24中任何一項(xiàng)所述細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收該酶。
26.一種有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離酶，其中該酶i)不含同源雜質(zhì)，和ii)依照權(quán)利要求25的方法產(chǎn)生。
27.一種有內(nèi)切葡聚糖酶活性、且最佳活性在高于85℃，優(yōu)選高于90℃，更優(yōu)選高于100℃的酶，該酶a)由權(quán)利要求12-17中任何一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體編碼，或b)通過權(quán)利要求25的方法產(chǎn)生，或c)是網(wǎng)球菌DSM6262產(chǎn)生的一種多肽，可以由可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分所編碼，或d)與針對(duì)純化的內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)性，該純化的內(nèi)切葡聚糖酶由對(duì)應(yīng)于可得自大腸桿菌DSM11201內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列中內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列編碼。
28.一種富含權(quán)利要求26或27的酶的酶制劑。
29.權(quán)利要求1-11和28中任何一項(xiàng)的酶制劑，其中還含有選自下述的一或多種酶甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖、阿拉伯聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶、果膠甲酯酶、內(nèi)切葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、角質(zhì)酶、過氧化物酶、漆酶、纖維素二糖水解酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
30.大腸桿菌DSM11201菌株基本純的分離的生物學(xué)培養(yǎng)物。
31.權(quán)利要求26或27的酶或者權(quán)利要求1-11、28和29中任何一項(xiàng)的酶制劑在紡織工業(yè)中，用于改善纖維素纖維或織物品性，或者使其具有粗斜紋棉布的石洗外觀；或者用于工業(yè)清潔程序；或者用于熱壓聚合物材料；或者用于將生物量轉(zhuǎn)化成糖；或者用于生產(chǎn)乙醇；或者用于預(yù)消化例如飼料生產(chǎn)中所用的谷物；或者用于生產(chǎn)速溶咖啡或相似提取過程的用途。
全文摘要
一種酶制劑,其中包含在溫度85℃以上時(shí)具有最佳酶活性的一種內(nèi)切－1,4－β－葡聚糖酶,它是屬于革蘭氏陽性細(xì)菌門的菌株(例如網(wǎng)球菌DSM6262菌株)的內(nèi)源酶,或者在70℃,pH10時(shí)該酶顯示的對(duì)羧甲基纖維素(CMC測(cè)定)的相對(duì)活性是在70℃,最適pH時(shí)的50%以上;一種DNA構(gòu)建體,它含有編碼內(nèi)切－1,4－β－葡聚糖酶的一段DNA序列;該酶可以應(yīng)用于例如紡織工業(yè)中,以提高纖維素纖維或織物的品質(zhì),或使其具有粗斜紋棉布的石洗外觀;或者用于工業(yè)清潔程序;或者用于熱壓聚合物材料;或者用于將生物量轉(zhuǎn)化成糖;或者用于生產(chǎn)乙醇;或者用于預(yù)消化例如飼料生產(chǎn)中所用的谷物;或者用于生產(chǎn)速溶咖啡或相似的提取過程。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1240478SQ97180775
公開日2000年1月5日 申請(qǐng)日期1997年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月19日
發(fā)明者M·舒萊恩, M·E·別恩瓦德, I·A·諾萊旺 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司