編碼對n－乙酰基－l－膦絲菌素具有特異性的氨基酸脫乙酰酶的新基因,其分離和應用的制作方法

專利名稱：編碼對n－乙酰基－l－膦絲菌素具有特異性的氨基酸脫乙酰酶的新基因,其分離和應用的制作方法
歐洲專利申請EP 531 716說明了，通過花藥特異性表達一種N-乙酰基-膦絲菌素(N-乙酰基-PPT)特異性的脫乙酰酶，可化學誘導可逆性雄性植物不育的方案。其中所應用來源于綠色產色鏈霉菌的脫乙酰酶基因[N-乙酰基-L-膦絲菌素丙氨酰丙氨酸(N-乙酰基-PPT)脫乙酰酶，dea]，和來源于大腸桿菌的argE(N-乙酰基-L-鳥氨酸脫乙酰酶)編碼對N-乙酰基-L-PPT具有特異性的蛋白質。對于這二種基因來說，在植物內的絨氈層特異性表達時，用N-乙酰基-L-PPT處理單個花蕾后，可以出現雄性不育花朵。為了使該系統的應用富有成果，尤其是在實踐相關條件下用N-乙酰基-PPT處理整個植物時，應用具有較高底物親合力的脫乙酰酶是有利的。因此要尋求對N-乙酰基-PPT具有高度親合力的其它一些脫乙酰酶。
本文說明的申請的目的是提供編碼脫乙酰酶的DNA分子。用這些脫乙酰酶可以制備出其局部可被特異地破壞了的植物。制備雄性或雌性不育植物具有特殊意義。通過在權利要求書中描述的實施方式，達到了該目的。
本發明涉及編碼脫乙酰酶或者具有脫乙酰酶生物學活性的蛋白質的DNA分子。這些蛋白質的酶促特性將在實施例中說明。本發明還涉及編碼生物學活性亞片段或衍生物的DNA分子。按照本發明的分子也包括片段、衍生物或等位基因變體。片段是指仍然還具有脫乙酰酶生物學活性的部分。
本發明此外還涉及被本發明DNA分子轉化了的轉基因植物細胞。轉基因植物細胞可以按照已知的技術方法制備，然后再生成完整的植物。
本發明涉及編碼具有N-乙酰基-PPT脫乙酰酶生物學活性的蛋白質的DNA分子。
本發明尤其涉及選自下列分子組的、編碼具有N-乙酰基-PPT脫乙酰酶生物學活性的蛋白質的DNA分子a)編碼具有SEQ ID No 2中所給定的氨基酸序列的蛋白質及其片段和/或衍生物的DNA分子；b)編碼SEQ ID No 1中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內偏離該序列的一些序列；c)編碼具有SEQ ID No 4中所給定的氨基酸序列的蛋白質或其片段和/或衍生物的DNA分子；和d)編碼SEQ ID No 3中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內偏離該序列的一些序列。
本發明此外還涉及按照本申請說明的方法鑒定和保藏的微生物寡養單胞菌屬種(DSM9734)和食酸叢毛單胞菌(DSM11070)。
本發明尤其涉及含有本發明DNA分子的植物細胞或植物。
具有特別意義的是，通過特異性表達脫乙酰酶基因而制備帶有可特異性破壞部分的植物的方法，以及通過脫乙酰酶基因的特異性表達制備雄性或雌性不育植物的方法。
因此，本申請書還涉及1)具有高N-乙酰基-PPT脫乙酰酶活性的微生物的特異濃縮2)相應脫乙酰酶基因的分離3)由這些基因編碼的、具有高N-乙酰基-PPT脫乙酰酶活性的蛋白質的提純和鑒定4)在植物內表達脫乙酰酶基因。
本申請此外還涉及-編碼具有高N-乙酰基-PPT脫乙酰酶活性的酶的DNA分子-由這些基因編碼的蛋白質-植物內這些脫乙酰酶基因的表達。
在帶有殼多糖作為唯一的碳源的礦質培養基內可以從土壤樣品濃縮能高效切割N-乙酰基-PPT的細菌。以這種方式分離出了二個菌株的純培養物寡養單胞菌屬種(DSM保藏號DSM 9734)和食酸叢毛單胞菌(DSM保藏號11070)。
然而，對于工業制備所需要的條件來說，更為合適的是應用提純的酶。
本申請包括新的L-N-乙酰基-PPT特異性的脫乙酰酶、一種由土壤微生物的濃縮培養物提純和鑒定這些酶的新的有效的方法、以及這種脫乙酰酶的應用。
因此，本發明還涉及1.一種脫乙酰酶，它具有-20,000-100,000道爾頓的分子量-最佳pH值為6.5-10.0-對L-N-乙酰基-膦絲菌素的底物特異性。
2.制備脫乙酰酶的方法，其特征為，在含有蟹殼多糖的培養基中培養不產生孢子的微生物，以及由這種微生物分離脫乙酰酶。
3.在第1項中表征的脫乙酰酶在制備雄性不育植物以及立體選擇性制備L-膦絲菌素中的用途。
本發明尤其涉及最佳溫度位于30-50℃之間的酶。
制備脫乙酰酶的本發明方法，優選用選自本申請中說明的微生物組的微生物進行。
可以按照Shimahara、Kenzo和Takiguchi、Yasuyuki說明的方法(酶學方法(Methods in Enzymology)，161卷，417-423頁，1988年)獲得蟹殼多糖，或者在Sigma公司購得。
為了提純脫乙酰酶，將微生物在適于它們生長的最佳營養培養基中培養。在有氧條件下進行微生物的培養，例如在振搖或攪拌下，在搖瓶中或發酵罐中，適當時注入空氣或氧氣的條件下，進行深層培養。可以在約20-40℃的溫度范圍內，優選在約25-37℃，尤其是在30-37℃的溫度范圍內進行發酵作用。在5-8.5的pH值范圍內，優選在5.5-8.0的pH值范圍內進行培養。
在這些條件下，一般在1-3天以后微生物顯示明顯的酶累積。脫乙酰酶的合成從對數期開始。可以借助于通過HPLC分析或光度測定法的活性試驗監測酶的產量。制備轉氨酶所應用的營養液含有0.2-5％，優選0.5-2％蟹殼多糖以及無機鹽。
營養液中可以含有的無機鹽例如是堿金屬或堿土金屬，鐵，鋅，錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，還可以含有銨鹽和硝酸鹽。
按照本發明，可以應用有效量的游離形式或固定形式的脫乙酰酶進行脫乙酰化作用，優選應用于表達deac基因的植物內。
可以考慮已知的方法進行固定，例如在德國公開說明書32 37 341和32 43 591中說明的方法。
可以按照經典方法通過超聲和法蘭西加壓法、硫酸銨沉淀法、離子交換法、親和色譜法和凝膠滲透法進行分離，可以分離和提純酶。
酶制劑的分子量可以為20,000-100,000道爾頓，優選為30,000-80,000，尤其是40,000-70,000道爾頓。酶產物的最佳pH值在6.0-10.0范圍內，尤其是7.0-8.0范圍內。酶的最佳溫度在30-50℃范圍內，尤其是在35-45℃范圍內。
在大腸桿菌內克隆編碼脫乙酰酶的基因。在寡養單胞菌屬種deac1基因的情況下，對大腸桿菌中的基因組DNA噬菌粒表達庫進行N-乙酰基-PPT特異性脫乙酰酶活性的篩選。通過大腸桿菌-argE突變體的互補作用，利用基因組文庫克隆食酸叢毛單胞菌的deac2基因。
由二種基因的DNA序列衍生的氨基酸序列相互類似，并且還與馬尿酸水解酶具有同源性，正如由蛋白質數據庫已知的那樣。
deac1蛋白質對N-乙酰基-L-PPT具有高底物親和力(Km＝670μM)，這使得轉基因植物組織具有對這種物質的高度敏感性的特征。這樣，組成型表達deac基因時，所獲植物的葉片對0.4mg/ml以下濃度的N-乙酰基-D，L-PPT(＝0.2mg/ml L-對映體)尚有敏感反應。在絨氈層特異性表達時，通過用2mg/ml N-乙酰基-D，L-PPT(＝1mg/ml L-對映體)處理花蕾，可以誘導出雄性不育花朵。所說明的結果針對的是溫室植物。由于物質濃度較低，在露天條件下需要時，完全可以將劑量增加5-10倍。
以下實施例進一步闡述本發明。如果沒有另作說明，則百分數均指重量。本發明在權利要求書中進行了進一步定義。
實施例1具有N-乙酰基-PPT特異性的脫乙酰酶活性的土壤微生物的分離和鑒定用10mM氯化鈉、10mM磷酸鈉緩沖液(pH＝7.0)，將每1g土壤(砂質粘土、Schwanheimer沙丘)在室溫下萃取1小時。為了篩選各組微生物，將土壤上清液接種至以下液體培養基中1)MS1培養基(用于真細菌) 5mM葡萄糖5mM琥珀酸鹽10mM甘油1g/l NH4Cl50ml/l 溶液A25ml/l 溶液B溶液A50g/l K2HPO4溶液B2.5g/l MgSO40.5g/l NaCl25ml/l微量元素2)殼多糖培養基(適于放線菌和鏈霉菌以及殼質細菌)10g/l蟹殼多糖1g/l(NH4)2SO40.5g/l MgSO450ml/l 溶液A1ml/l微量元素3)抗生素培養基(適于較高級真菌)20g/l麥芽提取物10g/l葡萄糖2g/l酵母提取物0.5g/l(NH4)2SO450μg/ml四環素所有的培養基中均含有5mM N-乙酰基-PPT，并且在細菌接種后在28℃下培養3-5天。
然后測試各濃縮培養物對N-乙酰基-PPT的脫乙酰化作用。為此，將細胞在10000rpm下離心，并在氨基酸分析儀(Biotronic LC 5001)中檢測上清液中PPT的形成。結果是僅有殼多糖培養基培養物顯示脫乙酰酶陽性。在殼多糖瓊脂上鋪板后，從這些培養物總共分離出40個菌落，在殼多糖液體培養基中再次培養這些菌落并重新測試脫乙酰酶活性。其間發現6個陽性分離物，由此可以通過在瓊脂平板上重復劃線并繼續培養單個菌落，即可以獲得活性純培養物。具有最高脫乙酰酶活性的菌株被鑒定為寡養單胞菌屬種(DSM保藏號DSM 9734)。
實施例2寡養單胞菌屬種的N-乙酰基-PPT脫乙酰酶基因的克隆和測序該工作所應用的分子生物學標準方法，已經由Maniatis等，1982年，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港(MolecularCloninga laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)，N.Y.進行了描述。
按照Meade等，1982年，細菌學雜志(J.Bacteriol.)，149期，114-122頁中的方法，制備寡養單胞菌屬種的基因組DNA。用Sau3A部分消化后，分離出5-10kb大小的部分，連接到已用BamHI切割的來自Stratagene的λ-ZAP表達載體中，(ZAP表達載體試劑盒，索引號239201，指導手冊(Instruction Manual))連接。用包裝好的連接物制備原代λ噬菌體文庫，然后擴增。借助于Stratagene的pBK-CMV噬菌粒系統(索引號212209，指導手冊)，由此制備大腸桿菌中的噬菌粒表達文庫。用[14C]-N-乙酰基-L-PPT作為底物，通過活性篩選檢測該基因文庫中脫乙酰酶基因的存在。為此，將2000個單克隆接種至微滴定板中，并且在含有0.2mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作為誘導物和50μg/ml卡那霉素作為抗性標記的LB-培養基中在37℃下培養過夜。將細胞離心，28℃下在10μl 1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT中培養過夜。接著分成8群，通過薄層層析和放射自顯影分析各批將N-乙酰基-PPT轉變成PPT的情況(參見EP 531 716，實施例8)，在陽性結果時再次測定各個克隆。用這種方法，可以從1920個轉化子選擇出帶有6kb插入物的一個陽性克隆。通過限制性作圖更詳細鑒定這一DNA片段。通過將插入物的限制性片段亞克隆至pUC18/19中，并將重組質粒轉化至大腸桿菌內，就可以借助于以上說明的活性試驗，將deac結構基因定位于2.5kb(2487個堿基對)Sall/Smal片段上(

圖1)。其活性取決于該片段相對于載體的lac啟動子的方向。
用Sanger方法(Sanger等，1977年，美國國家科學院學報，74期，5463-5468頁)對該2.5kb片段在兩條鏈上測序。整個片段長為2487個核苷酸(見SEQ ID NO.1)。長為1494個核苷酸的開放閱讀框開始于第367位核苷酸，終止于第1860位核苷酸。
此范圍內的PCR亞片段在大腸桿菌內的表達研究表明，活性脫乙酰酶蛋白質由具有1365個核苷酸的一個區域所編碼，該區始于496位的ATG起始密碼子，終于1860位的TGA終止密碼子。由該DNA序列衍生的氨基酸序列為具有454個氨基酸(SEQ ID NO 2)的多肽，其計算分子量為48.1kDa。
在EMBL、DNA和蛋白質數據庫內進行的同源性檢索顯示與以下物質有相似性本申請中首次說明的來源于食酸叢毛單胞菌的N-乙酰基-PPT脫乙酰酶(37.4％的氨基酸相同)、來源于空腸彎曲桿菌的馬尿酸水解酶(33.9％)和來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的N-酰基-L-酰氨基水解酶(33.7％)。下面將由寡養單胞菌分離出來的基因稱為deac1。相應的蛋白質稱為Deac1。由于具有同源性，所以可以推測，可以將所列舉的馬尿酸水解酶和酰氨基水解酶與組織特異性的啟動子聯合，接著進行處理以制備具有可選擇性破壞的組織的植物，尤其是雄性和/或雌性不育植物。
實施例3Deac1蛋白質的鑒定為了過表達和提純來源于寡養單胞菌屬種的脫乙酰酶(deac1)，應用Pharmacia(目錄號27-4581-01、目錄號27-4570-01)的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因融合載體系統。方法已經在Smith和Johnson，1988年，基因(Gene)6731中說明。通過用谷胱甘肽-Sepharose 4B進行親和層析，將融合蛋白提純。
將功能性deac基因作為1.4kb BamHI/Sall-PCR片段，重新克隆至GST融合載體pGEX-4T-2中，處于lac啟動子的控制下。通過添加0.1mMIPTG誘導重組融合蛋白質的表達。通過對大腸桿菌轉化體的粗提取物進行SDS/聚丙烯酰胺電泳，可以檢測到融合蛋白質，這是一條74kDa條帶。
為了提純蛋白質，用超聲，將經誘導的表達陽性的大腸桿菌轉化體的2升培養物的細胞分解，接著通過添加1％Triton X-100使提取液溶解。將上清液與谷胱甘肽-Sepharose 4B結合。用PBS緩沖液(140mMNaCl，3mM KCL，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH＝7.3)多次洗滌后，用凝血酶切割結合于Sepharose基質的融合蛋白質。洗脫液含有48kDa切割產物這條唯一的蛋白質帶(變性SDS/聚丙烯酰胺電泳后)，它在酶測定法(見下文)中被證實為N-乙酰基-PPT脫乙酰酶。按照說明的方法，由2升細菌培養物可以提純出200μg均質的脫乙酰酶蛋白質。
用以下二種測定法測定脫乙酰酶蛋白質的活性1)放射活性試驗將2.5μg各提純酶在PBS緩沖液中的10μl溶液內與0.1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT在37℃下溫育15分鐘。接著將樣品按1∶6在5mM KH2PO4、10％甲醇，pH＝1.92中稀釋，并在HPLC中用放射活性檢測儀分析(分離柱Spherisorb SAX，洗脫劑5mM KH2PO4，10％甲醇，pH＝1.92，流速0.5毫升/分鐘)。在此條件下，[14C]-L-PPT在4.5分鐘洗脫下來，[14C]-N-乙酰基-L-PPT在6.5分鐘洗脫下來。以[納摩爾[14C]-L-PPT/分鐘/毫克蛋白質]測定脫乙酰酶比活性。為了測得最佳pH值，將各份溶液在pH6-9范圍之間的40mMbis-tris，tris和Caps緩沖液系統中溫育。為了測定Km值，在imM CoCl2存在的條件下，用濃度在0.01mM-1mM之間的[14C]-N-乙酰基-L-PPT，在pH8.0進行3次測定。
2)非放射活性試驗為了檢測底物特異性，將各5μg提純酶，在20μl含25mM某種N-乙酰基-氨基酸或N-酰基-氨基酸的PBS緩沖液的體積中，在28℃下溫育60分鐘。接著將樣品在氨基酸分析儀(Biotronic LC5001)中測定游離氨基酸的產生。以[納摩爾氨基酸/分鐘/毫克蛋白質]測定比活性。對于N-乙酰基-PPT脫乙酰酶，測得其最佳pH值為8(參見表1)，最佳溫度為37℃(參見表2)。動力學測定得出Km值為670μM。通過添加1mM CoCl2，酶活性可以提高約20％。
表1N-乙酰基-PPT脫乙酰酶的最佳pH值pH值 比活性[摩爾/分鐘/毫克蛋白質]6 2.47 7.28 12.09 8.5表2N-乙酰基-PPT脫乙酰酶的最佳溫度溫度[℃] 比活性[納摩爾/分鐘/毫克蛋白質]289.63716.85014.9604.3底物特異性的測定結果見于表3。
該酶具有相對較寬的底物范圍。對馬尿酸(N-苯甲酰基甘氨酸)和N-乙酰基-L-谷氨酸獲得最高轉化。對N-乙酰基-L-PPT的親和力約低于對上述兩種底物親和力的50％。該脫乙酰酶對N-乙酰基-L-氨基酸具有唯一的特異性。用相應的D-對映體則觀察不到反應。
表3N-乙酰基-PPT脫乙酰酶的底物特異性底物1相對活性2[％]馬尿酸(N-苯甲酰基-甘氨酸) 100N-乙酰基-膦絲菌素 43N-乙酰基-鳥氨酸37N-乙酰基-甲硫氨酸 0N-乙酰基-色氨酸0.4N-乙酰基-苯丙氨酸 24N-乙酰基-酪氨酸11N-乙酰基-谷氨酸100N-乙酰基-谷氨酰胺 30N-乙酰基-甘氨酸59N-乙酰基-組氨酸43N-乙酰基-亮氨酸33N-乙酰基-纈氨酸2N-乙酰基-絲氨酸4N-乙酰基-脯氨酸01所有的化合物均為L-對映體。
2用馬尿酸測定的比活性假設為100％，其它數值為其相對值。
實施例4煙草內deac1基因的組成型表達將deac1結構基因作為1.4kb BamHI/Sall PCT片段，重新克隆至二元載體pPCV801(Koncz和Schell，1986年，分子普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)，204期，383-396頁)內，處于35S啟動子的控制之下。將所形成的帶有表達載體35S啟動子-deac1結構基因-35S終止子的質粒pPCVKDEAC1(附圖2)通過標準方法轉化至根瘤土壤桿菌(ATHV菌株)中。將煙草(Nicotiana tabacum)的葉片按照Horsch等，1985年，科學(Science)，227期，1229-1231頁中的方法用重組土壤桿菌轉化，然后在卡那霉素培養基上選擇，再生18個獨立的煙草轉化體，測定葉片內的脫乙酰酶表達。在轉基因植物內蛋白質有活性的情況下，預期葉片對N-乙酰基-PPT具有敏感性，這是因為，由于脫乙酰酶的酶催活性，在植物內該物質被轉化成除草劑活性物質膦絲菌素。
在點滴試驗中，分別用5μl以下濃度的N-乙酰基-D，L-PPT處理轉基因植物以及多種非轉基因的對照植物的葉片4mg/ml(＝15mM)、1mg/ml(＝3.75mM)、0.4mg/ml(＝1.5mM)、0.1mg/ml(＝0.38mM)。1-2周后在處理部位檢查是否顏色變淺或有壞死。同時在粗提取液中測定轉化體以及對照植物的N-乙酰基-PPT特異性脫乙酰酶活性。為此，分別將100mg葉片材料在200μlPBS緩沖液中勻漿，將細胞碎片離心除去，將含有蛋白質的上清液在4℃下對相同的緩沖液透析過夜。將10μl每一樣品與0.1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT在37℃溫育過夜。接著在如上說明的HPLC中分析[14C]-L-PPT的產生。
所選擇植物的點滴試驗和活性試驗的結果列于表4中。結果表明，約60％轉化體表達功能性脫乙酰酶蛋白質，并顯示相應的表型。
表4pPCVKDEAC1植物對N-乙酰基-PPT的敏感性，以及粗提取液中的脫乙酰酶活性
1相對于所應用的放射活性([14C]-N-乙酰基-L-PPT)+++嚴重壞死
++明顯損傷+顏色稍變淺-沒有癥狀實施例5煙草中deac1基因的絨氈層特異性表達應用標準方法，將金魚草(Antirrhinum majus)tap1基因的絨氈層特異性啟動子作為2.2kb EcoRI/BamHI片段，與deac1結構基因(1.4kb BamHI/Sall PCR片段)和35S終止子融合于載體pUC18中。將這樣形成的表達盒tap1啟動子-deac結構基因-35S終止子作為3.8kb EcoRI片段代替35S啟動子/終止子區域而克隆入二元載體pPCV801中(質粒pPCVTDEAC1，附圖3)。按照實施例4說明的方法轉化煙草。
在脫乙酰酶的絨氈層特異性表達情況下，通過用N-乙酰基-PPT處理花蕾應可以誘發雄性不育花朵。PPT衍生物轉化成除草活性物質膦絲菌素，導致選擇性破壞絨氈層組織，由此抑制功能性花粉的產生。
每種情形下，將每個花序(生長花蕾的整個區)的僅僅一面用N-乙酰基-PPT處理，花序的另一面不作處理，以確保所觀察到的現象不是因為植物的畸形發育所引起的。處理是在各個花蕾不大于5mm(絨氈層啟動子活性期)時進行的。將煙草轉化株以及多個NT Sam NN對照植物在1周內用0.2％N-乙酰基-D，L-PPT(＝7.5mM)/0.1％Genapol(潤濕劑)處理3次。花蕾開花以后(處理結束后約9-11天)，檢查植物出現雄性不育花朵的情況。
同時測定轉化株以及對照植物未成熟花藥內的N-乙酰基-PPT特異性脫乙酰酶活性。為此，將約5mm大小的花蕾的未成熟花藥剝離下來，并且在室溫下分別在50μM[14C]-N-乙酰基-L-PPT溶液內溫育過夜。接著將花藥在500μl PBS緩沖液中洗滌一次，然后在50μl PBS緩沖液中勻漿。細胞碎屑離心除去后，將上清液在Speed-Vac中濃縮，將沉淀各溶解于30μl HPLC緩沖液(5mM KH2PO4，10％甲醇，pH1.92)中。正如上面說明過的，在HPLC中分析各樣品中[14C]-L-PPT的產生。
對所選擇出來的植物進行花朵處理和活性試驗的結果列于表5。幾乎在所有的轉化株中，可以證實有花藥特異性脫乙酰酶活性。在3個轉化株中，在花序的用N-乙酰基-PPT處理過的一面上，觀察到雄性不育花朵(也即沒有形成花粉)，或者花粉明顯減少的花朵。對新的成熟花蕾的作用持續約3周的時間。轉化株的未處理花朵、以及對照植物的處理花朵全部可育。在雄性不育花朵中未測得種子生成。然而，可以對雄性不育花朵進行異花授粉，由此已證實，其雌性花朵部分保存了完整的功能(Nacken等，1991年，分子普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)，229期，129-136頁)。
表5通過用N-乙酰基-PPT處理pPCVTDEAC1植物花朵后誘導的雄性不育，和花藥的脫乙酰酶活性<
1基于所應用的放射活性([14C]-N-乙酰基-L-PPT)實施例6從食酸叢毛單胞菌中分離對N-乙酰基-膦絲菌素具有特異性的脫乙酰酶并進行鑒定將來源于曼谷的土壤樣品懸浮于含有殼多糖(2g/l)作為唯一碳源的礦質鹽培養基(0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4，2g (NH4)2SO4、0.01g FeSO4，于980ml H2O中)中，接著在30℃下培養48小時。然后將細菌接種至新鮮的礦質鹽培養基中，繼續培養48小時后，將各稀釋度鋪板于LB培養基上(Miller，分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室出版社(Experimentsin molecular genetics，Cold Spring Harbour LaboratoryPress))。
在長成的菌落中有一種細菌菌株，其特征為，在純培養基中能充分利用作為唯一碳源的N-乙酰基-谷氨酸(在含有N-乙酰基-谷氨酸(2g/l，作為無菌過濾溶液加至含有14g/l瓊脂的經高壓滅菌的礦質鹽培養基中)的礦質鹽培養基上劃線，在30℃下培養12小時，產生明顯可見的菌落)。如上述檢測N-乙酰基-PPT的去乙酰化作用。實驗室描述為B6的細菌菌株由DSM鑒定為食酸叢毛單胞菌(DSM11070)。
實施例7對來源于食酸叢毛單胞菌的脫乙酰酶基因進行克隆由食酸叢毛單胞菌分離出總DNA，用EcoRI消化，然后與載體pACYC184(Cang和Cohen，1978年，細菌學雜志(J.Bacteriol)，134期，1141-1156頁)的同樣經EcoRI消化過的DNA連接。連接液用于電穿孔轉化大腸桿菌argE突變體XSID2(Mountain等，1984年，分子普通遺傳學，197期，82-89頁)。通過對精氨酸營養缺陷型的互補作用進行篩選，可以由食酸叢毛單胞菌基因組分離出8.9kb大小的EcoRI片段，它對互補作用已經足夠。通過亞克隆，可以將互補區域限定于1.4kb大小的片段。它存在于測序載體pSVB30(Arnold和Puehler，1988年，基因(Gene)，70期，172-178頁)的被稱為pGK83的衍生物中。
實施例8對來源于食酸叢毛單胞菌的脫乙酰酶基因進行測序按照已知的方法對起互補作用的該1.4kb(1387個堿基對)片段通過雙鏈完整測序。
實施例9對測序區域進行編碼區分析和同源性比較編碼區域分析顯示有一個從位置1至1206(SEQ ID NO.3)的開放閱讀框，其編碼一種402個氨基酸大小的蛋白質(SEQ ID NO.4)。
與數據庫內的已知基因進行同源性比較，結果顯示與嗜熱脂肪芽孢桿菌的N-酰基-L-酰氨基水解酶(ama，Sakanyan等，1993年，應用環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)，59期，3878-3888頁)明顯同源，與來源于空腸彎曲桿菌的馬尿酸水解酶(迄今尚無公開)明顯同源。在蛋白質比較中，馬尿酸水解酶具有43％的相同氨基酸(見表6)。此外，該基因在DNA水平和蛋白質水平與由寡養單胞菌屬種分離的脫乙酰酶基因具有非常明顯的同源性。根據由寡養單胞菌屬種分離的該基因的命名，將來自食酸叢毛單胞菌的鑒定的所述基因稱為deac2。
表6與已知序列的同源性比較
實施例10食酸叢毛單胞菌deac2基因的植物構建體的過量表達為了分析來源于食酸叢毛單胞菌的deac2基因產物的底物特異性，將它過量表達。為此，將此基因克隆至高拷貝數載體中處于lacZ啟動子的控制下。但是表達效率卻因為在另外一種閱讀框中同時進行的lacZ-α翻譯而受到限制。因此，通過導入一個終止密碼子而中斷該過程，使載體pGK81能夠進行不被lacZ基因破壞的deac2基因的過量表達。還可以根據表型進行檢測，因為這種構建體對大腸桿菌argE突變體的互補作用更為顯著。
為了轉化植物，利用二元載體pROK1(Baulcombe等，1986年，自然，321期，446-449頁)，將deac2結構基因重新克隆，處于組成型35S啟動子或絨氈層特異性啟動子TA-29之后。所獲得的表達質粒pGK83和pMF9顯示于附圖中。
實施例11來源于食酸叢毛單胞菌的deac2基因產物的底物特異性分析為了分析來源于食酸叢毛單胞菌的deac2基因產物的底物特異性，應用經過甲苯/乙醇透化處理后帶有或不帶有載體pGK81的大腸桿菌菌株XL1 Blue細胞。通過IPTG處理，可以對受到該菌株中存在的Laci阻遏物阻遏的deac2基因進行誘導。將透化處理過的細胞與各種不同的N-乙酰化氨基酸(終濃度25mM)在30℃下溫育3小時，然后借助于氨基酸分析儀分析上清液。結果表明20％以上所應用的N-乙酰基-鳥氨酸被轉化。對于N-乙酰基-膦絲菌素，同樣發現，相應于所應用的N-乙酰基-膦絲菌素濃度，有增加的脫乙酰化作用生成膦絲菌素(表7)。
表7通過deac2基因產物進行的N-乙酰化氨基酸的轉化
其中給出了所應用的N-乙酰化氨基酸的濃度和由脫乙酰化作用形成的氨基酸。
附圖1介導N-乙酰基-PPT特異性脫乙酰酶活性的2.5kbSall/BamHI片段的限制性圖譜。deac1結構基因的位置和方向以箭頭標示(BP＝堿基對)。
附圖2用于deac基因在植物內組成型表達的質粒pPVCKDEAC1的圖譜。
附圖3用于deac基因在植物內的絨氈層特異性表達的質粒pPCVTDEAC1的圖譜。
附圖4質粒pGK83的圖譜。
附圖5質粒pMF9的圖譜。
用于專利程序的微生物保藏的國際承認的布達佩斯條約國際表格赫徹斯特-舍林農業發展有限公司 由本頁底部所注明的國際保藏機生化研究，H 872 N 構根據7.1條款所簽發的原始保藏65926法蘭克福/Main 收據
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序列表1)一般資料(i)申請人(A)名稱赫徹斯特-舍林農業發展有限公司(B)街道-(C)城市法蘭克福(D)州名-(E)國家德國(F)郵政編碼65926(G)電話069-305-5596(E)傳真(+69)357175(F)電傳-(ii)申請名稱編碼對N-乙酰基-L-膦絲菌素具有特異性的氨基酸脫乙酰酶的新基因，其分離和應用(iii)序列數4(iv)計算機可讀形式(A)數據載體軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)2)關于SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1365個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置1..1365(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGATCCGCA AGACCGTTCT GTTGACTGCG CTGTCCTGCG CCCTGGCCTC CGCGACAGCC60ACCGCCGCCG AAGGCCAGCG GCCCGAGGTG GAGGCCGCCG CCGCGCGCCT GCAGCGGCAG 120GTGGTGGAGT GGCGCCGCGA TTTCCACCAG CATCCGGAGC TGTCCAACCG CGAGGTGCGC 180ACCGCCGCCA AGGTGGCCGA GCGCCTGCGC GCGATGGGCC TGCAACCGCA GACCGGCGTC 240GCCGTGCACG GCGTGGTGGC GATCATCAAG GGCGCCCTGC CGGGGCCGAA GATCGCCCTG 300CGCGCGGACA TGGACGCGCT GCCGGTGACC GAACAGACCG GGCTGCCGTT CGCCTCCACC 360GCCACGGCCG AGTACCGCGG CGAGAAGGTC GGGGTGATGC ATGCCTGCGG CCACGACGCC 420CATACCGCCA CCCTGCTCGG CGTGGCCGAC GCGCTGGTGG CCATGCGCGA CACGCTGCCC 480GGCGAAGTAA TGCTGATCTT CCAGCCGGCC GAGGAAGGCG CGCCGCCGCC 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NO2的資料(i)序列特征(A)長度454個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵詞蛋白質(B)位置1..454(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ile Arg Lys Thr Val Leu Leu Thr Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala1 5 10 15Ser Ala Thr Ala Thr Ala Ala Glu Gly Gln Arg Pro Glu Val Glu Ala20 25 30Ala Ala Ala Arg Leu Gln Arg Gln Val Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe35 40 45His Gln His Pro Glu Leu Ser Asn Arg Glu Val Arg Thr Ala Ala Lys50 55 60Val Ala Glu Arg Leu Arg Ala Met Gly Leu Gln Pro Gln Thr Gly Val65 70 75 80Ala Val His Gly Val Val Ala Ile Ile Lys Gly Ala Leu Pro Gly Pro85 90 95Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gln100 105 110Thr Gly Leu Pro Phe Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Tyr Arg Gly Glu115 120 125Lys Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr130 135 140Leu Leu Gly Val Ala Asp Ala Leu Val Ala Met Arg Asp Thr Leu Pro145 150 155 160Gly Glu Val Met Leu Ile Phe Gln Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro165 170 175Pro Glu Gln Gly Gly Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Lys180 185 190Glu Phe Lys Pro 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權利要求
1.編碼具有N-乙酰基-膦絲菌素脫乙酰酶生物學活性的蛋白質的DNA分子。
2.選自下列分子組的、編碼具有N-乙酰基-膦絲菌素脫乙酰酶生物學活性的蛋白質的DNA分子a)編碼具有SEQ ID No 2中所給定的氨基酸序列的蛋白質及其片段和/或衍生物的DNA分子；b)編碼SEQ ID No 1中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內偏離該序列的一些序列；c)編碼具有SEQ ID No 4中所給定的氨基酸序列的蛋白質及其片段和/或衍生物的DNA分子；d)編碼SEQ ID No 3中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內偏離該序列的一些序列。
3.具有高度N-乙酰基-膦絲菌素脫乙酰酶活性的微生物的分離方法。
4.寡養單胞菌屬種(DSM9734)和食酸叢毛單胞菌(DSM11070).
5.含有按照權利要求1的DNA分子的植物細胞或植物。
6.通過脫乙酰酶基因的特異性表達，制備其局部可被有目的地破壞了的植物的方法。
7.通過脫乙酰酶基因的特異性表達，制備雄性或雌性不育植物的方法。
全文摘要
本發明涉及編碼脫乙酰酶、或具有脫乙酰酶生物學活性的蛋白質的DNA分子,被本發明DNA分子轉化了的轉基因植物細胞。這些分子可以用于通過脫乙酰酶基因的特異性表達,制備局部可被有目的性破壞的植物,也即雄性或雌性不育植物。
文檔編號C12N1/20GK1240476SQ97180605
公開日2000年1月5日 申請日期1997年12月3日 優先權日1996年12月16日
發明者K·巴特施, G·克里特, I·布羅爾, A·普勒 申請人:赫徹斯特-舍林農業發展有限公司