芽孢桿菌屬細(xì)菌和殺蟲蛋白質(zhì)的制作方法

專利名稱：芽孢桿菌屬細(xì)菌和殺蟲蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及消除蟲害有效的蘇云金芽孢桿菌新菌株，由該菌株產(chǎn)生的晶狀蛋白質(zhì)包含體，包含所說的包含體的殺蟲蛋白質(zhì)，和編碼這一蛋白質(zhì)的基因。此外，本發(fā)明還涉及昆蟲消除劑和消除昆蟲的方法。
背景技術(shù)：
與化學(xué)合成殺蟲劑相比，微生物殺蟲劑對天然環(huán)境影響小，而且被認(rèn)為是化學(xué)合成殺蟲劑的一種有效的替代品。事實(shí)上，從19世紀(jì)60年代早期起，含有作為有效成分的蘇云金芽孢桿菌菌體細(xì)胞(下文稱作″Bt菌″)或由這些細(xì)菌產(chǎn)生的晶狀包含體(下文稱作″CIs″)的微生物殺蟲劑(下文稱作″Bt劑″)已被用來防治鱗翅目的各種昆蟲。
Bt菌是革蘭氏-陽性菌，在孢子形成期細(xì)胞中產(chǎn)生CIs(H.Hofte和H.R.Whiteley；微生物評論，53，242，1989)。昆蟲攝食一定的它們敏感的CIs后，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將終止攝食并死去。由于CIs的這種作用對昆蟲是特異性的，Bt劑對其它動物與植物沒有毒性，因此被認(rèn)為是十分安全的殺蟲劑。
包含CIs的殺蟲蛋白質(zhì)由Bt菌的質(zhì)粒或基因組DNA中編碼的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生。迄今為止，已分離了一百種以上編碼殺蟲蛋白質(zhì)的基因，但是已經(jīng)知道所說的編碼蛋白質(zhì)的殺蟲活性不同，是它們的氨基酸序列的函數(shù)(P.A.Kumar等，應(yīng)用微生物進(jìn)展，42，1，1996)。因此認(rèn)為，具有新的殺蟲活性的Bt菌株具有新的殺蟲蛋白質(zhì)基因。
蘇云金芽孢桿菌血清變型Kurstaki HD-1(下文稱作″HD-1″)(害蟲和植物病害的微生物防治，1970-1980，編者H.D.Burges，學(xué)院出版社，pp.35-44，1981)是市售Bt劑中最常用的Bt菌株。
包含作為有效成分的HD-1的Bt劑已經(jīng)在消除對合成農(nóng)業(yè)化學(xué)品已產(chǎn)生顯著抗性的鱗翅目小昆蟲(如小菜蛾)方面有效。然而，最近報(bào)道了小菜蛾田間菌株的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其已產(chǎn)生了對HD-1的抗性，這在害蟲防治中形成一個(gè)嚴(yán)重的問題。
此外，歸類為鱗翅目的夜蛾科斜紋夜蛾大昆蟲，由于對合成殺蟲劑靈敏度低，防治起來困難，而且它們可以對植物造成毀壞性的破壞。事實(shí)上，沒有這類昆蟲(如夜蛾科的斜紋夜蛾)能通過常規(guī)的Bt劑有效地防治，開發(fā)有效的Bt劑是合乎需要的。
夜蛾科的昆蟲，特別是Spodoptera sp對Bt劑極端不靈敏有以下可能的原因(1)Spodoptera sp沒有任何可以結(jié)合到CIs中殺蟲蛋白質(zhì)上的受體(Shuichiro Inagaki，Seibutsu to Kagaku，30，74，1992)(2)CIs中的蛋白質(zhì)被消化，吸收，或者在Spodoptera的消化液中失活，使所說的蛋白質(zhì)不可能達(dá)到靶受體。
同樣，已經(jīng)需要開發(fā)對夜蛾科昆蟲具有殺蟲活性的新CIs。
大多數(shù)由天然環(huán)境分離的Bt菌對鱗翅目昆蟲或任何其它昆蟲沒有殺蟲活性。極少數(shù)菌株顯示出防治目標(biāo)昆蟲的實(shí)用的殺蟲活性，可能是因?yàn)锽t菌產(chǎn)生的CIs通過以下過程殺死所說的昆蟲(1)昆蟲攝食CIs，(2)CIs在消化道中溶解產(chǎn)生前毒素(殺蟲蛋白質(zhì))，(3)前毒素通過酶活化為毒素(加工過程)，(4)活化的毒素(所加工的殺蟲蛋白質(zhì))結(jié)合在昆蟲的中腸(mid-gut)細(xì)胞的受體上，形成微孔，和(5)昆蟲的中腸細(xì)胞分解。
消化道環(huán)境因昆蟲不同各異，并與昆蟲的膳食密切相關(guān)。因此，只有當(dāng)昆蟲將它們和其它食物一起攝入時(shí)，CIs失活或活化成為殺蟲的，不同昆蟲也不同，因此相信，只有步驟(1)到(5)在昆蟲中腸完成，CIs才對該昆蟲具有殺蟲活性。
另一方面，已知孢子(在Bt菌的生活史中的一個(gè)階段)具有對CIs的殺蟲活性的顯著協(xié)同作用。R.Milne等(蘇云金芽孢桿菌的分析化學(xué)，編者L.A.Hickle美國化學(xué)學(xué)會p22，1990)曾報(bào)道由于孢子的存在，兩種CIs的殺蟲活性被反轉(zhuǎn)。W.J.Mear等(應(yīng)用環(huán)境微生物61，2086，1995)曾報(bào)道僅攝食Bt菌產(chǎn)生的CIs的昆蟲比攝食CIs和孢子混合物的昆蟲易變得更有抗性。這些報(bào)道表明由Bt菌產(chǎn)生的兩個(gè)組分，即CIs和孢子，在與昆蟲相互作用中密切相關(guān)。因此，研究者正專心研究孢子在昆蟲中抑制對Bt劑抗性的發(fā)展中的作用。
發(fā)明概要本發(fā)明發(fā)明人現(xiàn)已成功地分離了一種Bt菌株，其可有效防治廣譜昆蟲。這一菌株在防治昆蟲(包括夜蛾科家族的昆蟲)上非常有效。
而且，本發(fā)明發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)所說的Bt菌株產(chǎn)生的CIs與菌株HD-1產(chǎn)生的CIs相比，在堿性條件(pH9至10)下具有更大的可溶性和穩(wěn)定性；單是CIs即對斜紋夜蛾和小菜蛾具有高水平的殺蟲活性；CIs和孢子組合比單純的CIs對斜紋夜蛾具有更高的殺蟲活性；而且加溶的(solubilized)CIs和孢子共存時(shí)，殺蟲活性可以再現(xiàn)。
此外，本發(fā)明發(fā)明人已確定了這一Bt菌株產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且分離了編碼這一氨基酸序列的基因。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供不僅對鱗翅目昆蟲而且對其它昆蟲具有殺蟲活性Bt菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供由所說的Bt菌產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)、編碼所說蛋白質(zhì)的基因、具有所說基因的載體、以及具有所說基因的宿主。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化的植物、消除蟲害的藥劑和消除蟲害的方法。
按照本發(fā)明的新菌株是菌株SSK-10，其以保藏號PERM BP-6162保藏在工業(yè)科學(xué)技術(shù)機(jī)構(gòu)的國立生物科學(xué)和人體技術(shù)研究所。這一菌株被分類為蘇云金芽孢桿菌。
按照本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)具有以下氨基酸序列，(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，或(b)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其具有殺蟲活性，其中在SEQ ID NO2中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代或被缺失，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸被添加或被插入到SEQ ID NO2的氨基酸序列中。微生物的保藏按照本發(fā)明的新菌株SSK-10已于1996年11月12日保藏在工業(yè)科學(xué)技術(shù)機(jī)構(gòu)的國立生物科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba city，Ibaraki，日本)，保藏號為FERM BP-6162。
附圖簡要描述

圖1說明按照本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄分析的結(jié)果。有RT利用有RT的反應(yīng)溶液。沒有RT利用沒有RT的反應(yīng)溶液。
發(fā)明詳述微生物SSK-10菌株是從Sakado市Saitama縣的家庭塵埃中分離的。其特征在表1中顯示。
表1菌落特性典型的Bt菌大菌落，有一個(gè)無色的表面。生長期細(xì)胞形態(tài)典型的Bt菌。形態(tài)特性可變的桿菌(1.0~1.2μ×3.0~5.0μ)。革蘭氏染色陽性。孢子形態(tài)橢圓。觀察不到由孢子造成的孢子囊顯著膨脹。鞭毛的血清型分類為H7(或者血清變型aizawai)*細(xì)胞內(nèi)含物大的雙金字塔形晶狀蛋白質(zhì)包含體(SDS-PAGE測得分子量大約130kDa)。殺蟲蛋白質(zhì)分類為Cry9n。同源性研究顯示即使與同源性最大的Cry9Cal(應(yīng)用環(huán)境微生物，62，p80，1996)也僅有71％的同源性。需氧/厭氧特性兼性厭氧細(xì)菌。生化特性過氧化氫酶反應(yīng)陽性卵磷脂酶反應(yīng) 陽性VP反應(yīng)陽性*H血清的制備和菌株的分類根據(jù)M.Ohba和K.Aizawa，無脊椎動物病理學(xué)雜志，15，139-140，1978進(jìn)行。
有關(guān)本發(fā)明新菌株產(chǎn)生的CIs和孢子的非常特別的特性更具體地解釋如下。
J.D.Tang(應(yīng)用環(huán)境微生物，62，564，1996)曾報(bào)道CryI殺蟲蛋白質(zhì)的特征，已知CryIC對夜蛾科的noctuids特別有效，但是對小夜蛾的昆蟲，它的殺蟲活性大約僅是HD-1菌株產(chǎn)生的CryIA(a)的殺蟲活性1/10。而且，包含CryIC和CryIA的Bt菌，正如日本公開專利出版物509235/1993所揭示的，其殺蟲活性比HD-1菌株的殺蟲活性對Spodoptera fruqiperda而言高三倍，對小夜蛾而言高兩到數(shù)倍。相對而言，由菌株SSK-10的細(xì)胞產(chǎn)生的CIs比由菌株HD-1的細(xì)胞產(chǎn)生的CIs，對斜紋夜蛾的殺蟲活性至少高30倍，對小夜蛾的殺蟲活性至少高五倍。在堿性條件下(pH9～10)，菌株SSK-10的CIs比菌株HD-1的CIs有更特異的溶解性和更高的穩(wěn)定性。
此外，菌株SSK-10的殺蟲蛋白質(zhì)基因堿基序列的同源性檢索(GenBank，EMBL，DDBJ，PDB序列)顯示與已知Bt殺蟲蛋白質(zhì)基因的小的同源性。即使是與同源性最高的Cry9Cal相比，在氨基酸水平僅發(fā)現(xiàn)71％的同源性(B.Lambert等，應(yīng)用環(huán)境微生物，62，80，1996)。Bt殺蟲蛋白質(zhì)以分子量為130kd～140kd的前毒素產(chǎn)生，然后在昆蟲中腸中消化成60kd～70kd的毒素。事實(shí)上，已知這一毒素有殺蟲活性，前毒素的C-末端位點(diǎn)是不需要的(H.Hofte和H.R.Whiteley，微生物回顧，53，242，1989)。這樣，在有限的氨基酸序列(即對殺蟲活性所需的從N-末端位點(diǎn)的第1個(gè)到第700個(gè)氨基酸)上進(jìn)行同源性檢索(GenBank CDS翻譯物，PDB，SwissProt，PIR)。觀察到所說的殺蟲蛋白質(zhì)基因與同源性最高的Cry9Cal只有60％的同源性，清楚地表明這一基因是一個(gè)新基因。
這些研究結(jié)果表明菌株SSK-10是一種新菌株，產(chǎn)生一種新的CI。
此外，殺蟲活性由將菌株SSK-10細(xì)胞產(chǎn)生的孢子與CIs組合得到提高，殺蟲活性由組合自身沒有任何殺蟲活性的加溶的CIs(下文稱作SCIs)與所說的孢子得到恢復(fù)。而且發(fā)現(xiàn)，這些作用可以以與普通培養(yǎng)中相同的孢子/CIs比，達(dá)到相當(dāng)可觀的程度。因此，利用CIs(或SCIs)和本發(fā)明新菌株SSK-10產(chǎn)生的孢子，可提供一種蟲害防治的高效Bt劑。
本發(fā)明的SSK-10菌株的細(xì)胞可在普通條件下培養(yǎng)。例如，利用包含碳源(如葡萄糖)和氮源(如大豆粉)的培養(yǎng)基，在20到40攝氏度間的一適當(dāng)培養(yǎng)溫度下，可進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)優(yōu)選地在需氧條件下進(jìn)行，同時(shí)通氣攪拌1至4天。殺蟲蛋白質(zhì)及其基因本發(fā)明提供了由菌株SSK-10的細(xì)胞產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。此外，按照本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)可以具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，其具有殺蟲活性，其中一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè)到幾個(gè))氨基酸添加或者插入到SEQ ID NO2的氨基酸序列中，或者SEQ ID NO2中的一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè)到幾個(gè))氨基酸被取代或缺失。應(yīng)當(dāng)清楚，通過參考SEQ ID NO2的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以添加，插入，取代或缺失SEQ ID NO2的氨基酸序列中的氨基酸而沒有任何特殊的困難。
在本發(fā)明中，術(shù)語“具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)”指本領(lǐng)域技術(shù)人員評估為殺蟲的蛋白質(zhì)；例如，在與試驗(yàn)實(shí)施例1～3和5～7相同的條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中評估為殺蟲的蛋白質(zhì)。
如實(shí)施例所示，按照本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)對鱗翅目，鞘翅目和/或雙翅目具有殺蟲活性。尤其對分類為鱗翅目夜蛾科的斜紋夜蛾和小菜蛾具有高的殺蟲活性。
分類為鱗翅目的昆蟲例子包括斜紋夜蛾(Spodoptera litura)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甘藍(lán)夜蛾(Mamesta brassicae)，小菜蛾(Plutella xylostella)，美國白蛾(Hyphantria cunea)，褐帶卷蛾的種(Adoxophyes sp.)，Autographa nigrisigna，及小菜粉蝶(Pieris rapae)。
分類為鞘翅目的昆蟲例子包括Anomala cuprea，日本弧麗金龜(Popillia japonica)，Lissorhoptrus oryzophilus，及Aulacophora femoralis。
分類為雙翅目的昆蟲例子包括埃及伊蚊(Aedea aegypti)和尖音庫蚊(Culex Pipiens)。
按照本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)可以是晶狀蛋白質(zhì)包含體形式的。這種形式的蛋白質(zhì)可以通過在微生物中(尤其是在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中)表達(dá)本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)獲得，或通過培養(yǎng)本發(fā)明新菌株SSK-10的細(xì)胞獲得。在大腸桿菌中表達(dá)的方法將在下文闡述。
按照本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)可以是加溶(solubilized)晶狀蛋白質(zhì)包含體形式的。這種形式的蛋白質(zhì)可以通過在堿性溶劑中溶解本發(fā)明的蛋白質(zhì)獲得。
本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列。這一核苷酸序列的典型序列具有SEQ ID NO1的全部或部分DNA序列。
當(dāng)給出本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列時(shí)，也就容易確定編碼這一蛋白質(zhì)的核苷酸序列，可以選擇編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的各種核苷酸序列。因此，編碼按照本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括，作為SEQ ID NO1的DNA序列的遺傳密碼簡并結(jié)果的DNA序列，相對應(yīng)于所說DNA序列的RNA序列。
本發(fā)明的核苷酸序列可以是天然衍生物，采用部分天然序列全合成或半合成的。
編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的基因可以從菌株SSK-10中分離，例如，按以下方法首先，從菌株SSK-10的細(xì)胞中抽提DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈?，然后用噬菌體載體或質(zhì)粒載體構(gòu)建包含菌株SSK-10的DNA的文庫。從SEQ ID NO1的核苷酸序列合成適當(dāng)?shù)囊?，然后以來自SSK-10的DAN為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增所說基因的DNA片段。以所說的DNA片段作為探針來篩選文庫以分離所說基因的全長DNA。
或者，可以通過制備本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的抗體，然后利用這一抗體篩選基因組文庫或者cDNA文庫來分離所說的基因。
此外，可以通過以來自菌株SSK-10的DNA為模板合成編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的基因的開放讀框的5’末端和3’末端引物，并利用它們進(jìn)行PCR擴(kuò)增來分離新基因全長DNA。
也可以用遺傳工程領(lǐng)域的常規(guī)方法，經(jīng)篩選染色體文庫或cDNA文庫來獲得所說基因的全長DNA；例如，利用基于部分氨基酸序列構(gòu)建的適當(dāng)DNA探針。
突變可以引入到基因中，例如，通過利用市售的誘變試劑盒，或者利用包含突變的引物進(jìn)行PGR(“PCR及其應(yīng)用”，編者YoshiyukiSakakibara等，Yodosha，pp63-67，1990)。
本發(fā)明提供了一種載體，在該載體中本發(fā)明的核苷酸序列以這樣的方式存在在宿主細(xì)胞中其可復(fù)制，該核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)可以表達(dá)。
此外，本發(fā)明提供了一種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這一宿主-載體系統(tǒng)不受特別限制；例如，可以利用與另一蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。
載體的例子包括質(zhì)粒載體，如Ti質(zhì)粒載體。
為了經(jīng)把載體引入宿主細(xì)胞來表達(dá)靶蛋白，除本發(fā)明的核苷酸序列之外，本發(fā)明的載體可以具有控制表達(dá)的序列(例如，啟動子序列，終止子序列，增強(qiáng)子序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和SD序列)，選擇宿主細(xì)胞的基因標(biāo)記(例如，新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因)。而且，載體可以具有重復(fù)形式(例如，一前一后形式)的本發(fā)明的核苷酸序列。所說的序列可用任何普通的方法置入載體，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法用這一載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？梢杂眠z傳工程領(lǐng)域常用的方法和技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的載體。
宿主細(xì)胞的例子包括微生物(例如，革蘭氏-陰性菌如大腸桿菌和假單胞菌屬的種，革蘭氏-陽性菌如芽孢桿菌屬的種，及真菌綱如真菌和酵母)。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)在合適的介質(zhì)中培養(yǎng)，可以從這一培養(yǎng)產(chǎn)物獲得本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了制備本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的方法，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以在與源細(xì)胞實(shí)質(zhì)上相同的條件下培養(yǎng)。而且，用常規(guī)方法回收和純化從培養(yǎng)液得到的本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)穩(wěn)定大量的供給不僅可以在Bt菌中進(jìn)行，而且也可以在其它異種生物體(意即，微生物，植物，等等)中進(jìn)行。本發(fā)明的核苷酸序列插入Bt菌(而不是插入菌株SSK-10)被認(rèn)為提高殺蟲活性，使得構(gòu)建有效防治更廣范圍的昆蟲的轉(zhuǎn)化的Bt菌株成為可能。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚一個(gè)或多個(gè)外源Bt殺蟲蛋白質(zhì)基因可以導(dǎo)入菌株SSK-10以提高殺蟲活性，以便產(chǎn)生可以有效防治或殺死更廣范圍的昆蟲的轉(zhuǎn)化的Bt菌菌株。
按照本發(fā)明，可以選擇植物細(xì)胞或植物作為宿主。因此，本發(fā)明提供了對昆蟲具有抗性的轉(zhuǎn)化的植物。轉(zhuǎn)化的植物的例子包括單子葉植物(例如，稻米，玉米，小麥，蘆筍)和雙子葉植物(例如，土豆，甜菜，胡蘿卜，花椰菜，萵苣，番茄，茄子，煙草，甜瓜，黃瓜，黃豆，蘋果，桔子，草莓，楊樹，棉花，康乃馨，矮牽牛，苜蓿，薄荷)。
基因可以導(dǎo)入植物細(xì)胞或者植物，例如，通過直接基因轉(zhuǎn)移(如粒子槍，PEG，電穿孔法，及顯微注射)，或者利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒載體進(jìn)行間接基因轉(zhuǎn)移。例如，用Vaeck M.等的方法(自然，328，33-37，1987)可以轉(zhuǎn)化雙子葉植物及其細(xì)胞，例如，用Hong Y.等的方法(Scientia Agricultura sinica，22，1-5，1989)可以轉(zhuǎn)化單子葉植物及其細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以再分化以獲得完整的植物。
本發(fā)明提供了具有對昆蟲的抗性的轉(zhuǎn)化的植物的種子。本發(fā)明的種子可以由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再分化獲得的植物、或轉(zhuǎn)化的植物獲得。蟲害消除劑和蟲害消除方法按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有殺蟲活性。因此，本發(fā)明可以提供包含作為有效成分的本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的蟲害消除劑。術(shù)語“用于消除蟲害的藥劑(蟲害消除劑)”如本文所用的包括植物保護(hù)劑，昆蟲防治劑，殺蟲劑，以及蟲害防護(hù)劑。
為了提高本發(fā)明的蟲害消除劑中蛋白質(zhì)的殺蟲活性，優(yōu)選地使用與菌株SSK-10產(chǎn)生的孢子組合的所說蛋白質(zhì)。
如果與孢子組合起來，加溶晶狀蛋白質(zhì)包含體的殺蟲活性將再生(參見實(shí)施例，稍后論述)。因此，如果的晶狀蛋白質(zhì)包含體用作有效成分，優(yōu)選地利用所說的加溶蛋白質(zhì)包含體與孢子的組合。優(yōu)選地使用加溶蛋白質(zhì)包含體消除有少量消化酶的害蟲。
本發(fā)明的新菌株產(chǎn)生如上所述的殺蟲蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了包含本發(fā)明的新菌株的蟲害消除劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了包含如此轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的微生物的蟲害消除劑。
本發(fā)明的蟲害消除劑可以包含本發(fā)明的新菌株的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的微生物，或者殺蟲蛋白質(zhì)，單獨(dú)地或者它們的任意組合體。
本發(fā)明的蟲害消除劑可以用于被蟲害侵染的植物或有可能被侵染的植物，可以用未稀釋的藥劑噴射或用以水或其它合適的稀釋劑稀釋的藥劑噴射。
本發(fā)明的蟲害消除劑可以用來保護(hù)寬范圍的植物，在這些植物上蟲害有可能成倍增加。用本發(fā)明的方法保護(hù)的重要植物的例子包括蔬菜(如甘藍(lán)，椰菜和其它有花的蔬菜)，玉米，棉花，土豆，稻米，柑橘類水果，以及落葉水果樹。也包括非農(nóng)業(yè)樹木(如在街道上，公園中，人造林地和天然森林中的樹木)。
可以用本發(fā)明的方法防治的蟲害是以上所論及的那些。
本發(fā)明的蟲害消除劑可以由例如以下方法得到濃縮(例如，通過離心或者過濾)菌株SSK-10的培養(yǎng)液或轉(zhuǎn)化的微生物(其中導(dǎo)入了編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的基因)的培養(yǎng)液，然后將所說的濃縮物與所需的合適的藥劑(例如，表面活性劑，潤濕劑，固體稀釋劑，分散劑，及UV穩(wěn)定劑)組合，以產(chǎn)生所需的制劑，如可濕性粉劑，粉劑，可流動藥劑等。
如果必要和/或如果需要，當(dāng)制備制劑或者在噴射時(shí)，本發(fā)明的蟲害消除組合物可以與各種殺蟲劑，殺菌劑或殺真菌劑，雜草防治劑，植物生長調(diào)節(jié)劑，增效劑(包括培養(yǎng)上清液中包含的活性增強(qiáng)物質(zhì))，誘導(dǎo)劑，植物營養(yǎng)物，肥料等組合。此外，組合物可以含有不同于本發(fā)明的菌株的Bt菌菌株，以及不同于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的殺蟲蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了用本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)、本發(fā)明的新菌株的細(xì)胞和/或被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的微生物經(jīng)處理植物(這些植物已被或可能被害蟲侵染)來消除蟲害的方法。
本文所使用的術(shù)語“用于消除蟲害的方法”包括保護(hù)植物使之免受蟲害侵害的方法，防治蟲害的方法，殺蟲方法，抗蟲害的方法等。
按照本發(fā)明，在消除蟲害中，本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)，本發(fā)明的新菌株的細(xì)胞，和/或被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的微生物，可以不經(jīng)進(jìn)一步的配制即可噴射，或者在稀釋或不稀釋的情況下噴射。防治的蟲害和保護(hù)的植物與以上有關(guān)蟲害消除劑中的描述是相同的。
實(shí)施例本發(fā)明進(jìn)一步通過下列實(shí)施例加以說明，但它們不用來限制本發(fā)明。實(shí)施例1Bt菌的SSK-10菌株的選擇從日本各處收集土壤和塵埃樣品，并根據(jù)Ohba等描述的方法(無脊椎動物病理學(xué)雜志，47，12，1986)分離Bt菌。將分離的Bt菌培養(yǎng)在常規(guī)的瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基(1.0％肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，2.0％瓊脂，pH值7.2)上，然后到下所形成的孢子和CIs的混合物并懸浮在無菌水中，以制備特定濃度的孢子與CIs的懸液。用該懸浮處理一些甘藍(lán)葉的小片(直徑為5cm)，并喂給各種昆蟲以估價(jià)Bt菌的殺蟲活性。
結(jié)果，選擇到對斜紋夜蛾具有最高殺蟲活性的菌株SSK-10。實(shí)施例2CIs的純化將本發(fā)明的SSK-10菌株的細(xì)胞懸浮在無菌水中，均勻地平板接種在常規(guī)瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基上，并在28℃下培養(yǎng)5天。當(dāng)確認(rèn)已形成孢子及產(chǎn)生CI后，添加無菌蒸餾水至平板培養(yǎng)基中，通過離心回收混合的孢子和CIs的離心沉淀，然后以無菌蒸餾水洗滌3次。接著，將所形成的離心沉淀懸浮在少量的無菌蒸餾水中，根據(jù)R.Milne的方法(無脊椎動物病理學(xué)雜志，29，230，1977)通過urografin密度梯度法(40％至70％)分離CIs，并且用水洗滌3次。再一次用urografin密度梯度法(60％至70％)純化所分離的CIs，然后用水洗滌純化的CIs 5次。用相差顯微鏡鑒定分離的CIs，其至少為99％，然后凍干。結(jié)果，從1g(濕重)孢子-CIs混合物離心沉淀中獲得35mg(干重)的CIs。利用菌株HD-1以相同的方式制備CIs以作為對照。實(shí)施例3菌株SSK-10細(xì)胞的液體培養(yǎng)物將一鉑環(huán)的SSK-10菌株的培養(yǎng)物(其培養(yǎng)在瓊脂培養(yǎng)基上)接種在常規(guī)的液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基(0.3％肉膏，0.5％葡萄糖，0.4％蛋白胨，0.1％NaCl，pH值7.2，5ml/試管)上。將試管放置在往復(fù)運(yùn)動的振蕩器中并在28℃下培養(yǎng)10至24小時(shí)。將這樣獲得的培養(yǎng)液的0.5ml部分接種在位于500ml錐形瓶中的100ml常規(guī)液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基上。將該錐形瓶放置在旋轉(zhuǎn)搖床(250rpm)上并在28℃培養(yǎng)2天，接著離心該培養(yǎng)液20分鐘(15,000rpm)以獲得離心沉淀的固體殘?jiān)Ｓ眠m量的水洗滌離心沉淀3次，再一次以15,000rpm離心20分鐘，然后凍干以獲得每錐形瓶約400mg的凍干產(chǎn)物。稱重這樣獲得的干燥產(chǎn)品，用蒸餾水稀釋，然后進(jìn)行抗各種昆蟲的殺蟲活性的試驗(yàn)。利用菌株HD-1以相同的方式制備干燥產(chǎn)物作為對照。試驗(yàn)實(shí)施例1CI抗斜紋夜蛾的殺蟲活性將通過實(shí)施例2的方法所制備的CIs稀釋至特定的濃度，并添加潤濕劑。用該試驗(yàn)的液體噴射甘藍(lán)葉片，并置于塑料杯子中在空氣中干燥，然后釋放斜紋夜蛾的第三齡幼蟲(每個(gè)杯子5只幼蟲)。然后蓋上杯子放置在溫箱中(25℃)。3天后觀察存活或死亡的情況，用概率值法計(jì)算中值致死濃度(LC50)。結(jié)果見表2。表2CIs抗斜紋夜蛾的殺蟲活性


該試驗(yàn)顯示菌株SSK-10的CIs抗小菜蛾的殺蟲活性比菌株HD-1的殺蟲活性高5倍。試驗(yàn)實(shí)施例3菌株SSK-10對具有Bt-劑抗性能力的小菜蛾的作用在Hyogo縣Iwaoka區(qū)捕獲小菜蛾昆蟲(Iwaoka系)，這種昆蟲對現(xiàn)有的由菌株HD-1的細(xì)胞作為主要組分組成的Bt劑具有抗性。將菌株SSK-10對這些抗性系的昆蟲的功效與對敏感系昆蟲的功效進(jìn)行比較。將通過實(shí)施例3的方法所制備的干產(chǎn)物用補(bǔ)充了潤濕劑的溶液稀釋至特定的濃度。用該試驗(yàn)的液體噴射甘藍(lán)葉片，并置于塑料杯子中在空氣中干燥，然后釋放小菜蛾Iwaoka系的第二齡幼蟲(每個(gè)杯子5只幼蟲)。然后蓋上杯子放置在溫箱中(25℃)。3天后觀察存活或死亡情況。利用Toaro-CT可濕性粉劑(Towagosei Chem.KK)作為對照化學(xué)藥品。用概率值法計(jì)算中值致死濃度(LC50)，抗性比通過Iwaoka系昆蟲的致死濃度值除敏感系昆蟲的致死濃度值進(jìn)行計(jì)算。
致死濃度＝(Bt-劑抗性昆蟲的LC50)/(Bt-劑敏感系昆蟲的LC50)結(jié)果見表4。表4抗Bt-劑抗性小菜蛾的殺蟲活性

Towagosei Chem.KK試驗(yàn)實(shí)施例4菌株SSK-10產(chǎn)生的CIs的溶解性和穩(wěn)定性將用實(shí)施例2的方法制備的菌株SSK-10的CIs和HD-1懸浮在50mM Na2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并保持在37℃。30分鐘后，收取樣品并離心。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析離心前的懸液及離心后的上清液。溶解度通過130kd蛋白質(zhì)在上清液中的量除以離心前的懸液中的130kd蛋白質(zhì)的量進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見表5。表5CIs的溶解度

此外，在規(guī)定的時(shí)間從保持在37℃下的懸液中收取樣品，并用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析130kd蛋白質(zhì)的量。懸浮時(shí)(0小時(shí))蛋白質(zhì)量為100，時(shí)間穩(wěn)定性以剩下蛋白質(zhì)的百分比形式進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果見表6。表6CIs的穩(wěn)定性

試驗(yàn)實(shí)施例5CIs和SCIs抗斜紋夜蛾的殺蟲活性(1)CI溶液的制備添加補(bǔ)充了潤濕劑的溶液至用實(shí)施例2的方法所制備的菌株SSK-10的CIs中，并將混合物稀釋至特定的濃度。
(2)SCI溶液的制備將用實(shí)施例2的方法制備的菌株SSK-10的CIs懸浮在50mMNa2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并將該懸液保持在37℃1小時(shí)。溶解后，離心得到上清液，添加補(bǔ)充了潤濕劑的溶液至該懸液中，并將混合物稀釋至特定的濃度。
(3)殺蟲活性的測量及結(jié)果用上述(1)和(2)制備的CI溶液和SCI溶液噴射甘藍(lán)葉片，并置于塑料杯子中在空氣中干燥，然后釋放斜紋夜蛾的第三齡幼蟲(每個(gè)杯子5只幼蟲)。然后蓋上杯子放置在溫箱中(25℃)。3天后觀察存活或死亡情況。
結(jié)果見表7。表7CIs和SCIs抗斜紋夜蛾的殺蟲活性

試驗(yàn)實(shí)施例6孢子對抗斜紋夜蛾的殺蟲活性的作用將用實(shí)施例3的方法制備的菌株SSK-10的細(xì)胞的干產(chǎn)物(其含有CIs和孢子)懸浮在50mM Na2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并將該懸液保持在37℃下1小時(shí)。在用顯微鏡下確認(rèn)CIs完全溶解后，通過離心獲得上清液(該組分含有SCIs)及沉淀(該組分含有孢子)。單獨(dú)地，將用實(shí)施例2的方法獲得的CIs制備成與菌株SSK-10的干產(chǎn)物的濃度相同的濃度，并進(jìn)行試驗(yàn)。用補(bǔ)充了潤濕劑的溶液稀釋每個(gè)樣品至特定的濃度，用該樣品溶液噴射甘藍(lán)葉片，并置于塑料杯子中在空氣中干燥，然后釋放斜紋夜蛾的第三齡幼蟲(每個(gè)杯子5只幼蟲)。然后蓋上杯子放置在溫箱中(25℃)。3天后觀察存活或死亡情況。
結(jié)果見表8。表8孢子對抗斜紋夜蛾的殺蟲活性的協(xié)同作用

試驗(yàn)實(shí)施例7抗尖音庫蚊的殺蟲活性用去離子水稀釋通過實(shí)施例3的方法制備的菌株SSK-10細(xì)胞的干產(chǎn)物至特定濃度，并放置在陪替氏培養(yǎng)皿中。將孵育了4天的20只尖音庫蚊幼蟲釋放在平皿中，將平皿放置在溫箱中25℃。
24小時(shí)后觀察存活或死亡情況，用概率值法計(jì)算中位值致死濃度(LC50)為37.2ppm。這樣，該試驗(yàn)表明菌株SSK-10細(xì)胞的干產(chǎn)物也具有抗分類為雙翅目的昆蟲的殺蟲活性。實(shí)施例4菌株SSK-10產(chǎn)生的新殺蟲蛋白質(zhì)的基因的克隆(1)菌株SSK-10的基因組文庫的構(gòu)建28℃下在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)菌株SSK-10(FERM BP-6162)的細(xì)胞。通過離心收集細(xì)胞，利用ISOPLANT(Nippon基因)按照所附手冊分離DNA。利用Sau3部分消化分離的DNA，并用堿性磷酸酶進(jìn)行處理，則所產(chǎn)生的DNA片段的5′端被去磷酸化。將該DNA片段插入到噬菌體載體中，λDASH II(Stratagene)。按照所附的手冊利用Gigapack III Gold包裝物(Stratagene)對這樣獲得的重組噬菌體載體進(jìn)行體外包裝。接著，用所說的重組噬菌體感染大腸桿菌XL1-Blue MRA(P2)菌株的細(xì)胞，然后在平板上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得噬菌斑。
(2)探針的構(gòu)建也假定菌株SSK-10的殺蟲蛋白質(zhì)基因具有在已知Bt殺蟲蛋白質(zhì)基因中的完全保守區(qū)。因此，分析已知Bt的殺蟲蛋白質(zhì)基因中的堿基序列，并合成與2個(gè)完全保守區(qū)(SEQ ID NO3和4)對應(yīng)的引物。利用這些引物和從SSK-10分離的DNA作為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增了約1kb的DNA片段。這證明利用這些引物可擴(kuò)增菌株SSK-10的殺蟲蛋白質(zhì)基因。在下述(3)描述的篩選中，將熒光素-標(biāo)記的DNA片段(其通過反應(yīng)溶液中混合了熒光素-11-dUTP(Amersham)的PCR進(jìn)行擴(kuò)增)作為探針。
(3)新殺蟲蛋白質(zhì)基因的篩選將Hybond-N＋膜(Amersham)放置在平板上，上述(1)的噬斑在該膜上形成，并且噬斑粘附在該膜上。用堿處理膜，使膜上的重組噬菌體DNA變性成單鏈，變性的DNA吸附在膜上。將具有吸附的噬菌體DNA的膜放置在聚乙烯袋子中，添加利用雜交緩沖液片劑制備的緩沖液(Amersham)，然后密封袋子，并在65℃溫育1小時(shí)。在添加熒光素-標(biāo)記的探針(其通過加熱已變性)后，65℃下雜交過夜。然后，洗滌膜，并用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗熒光素抗體標(biāo)記熒光素標(biāo)記的噬斑。利用氮藍(lán)四唑氯化物和X-磷酸處理這些以堿性磷酸酶標(biāo)記的噬斑以顯色，其中這些與探針牢固雜交的噬斑是可視的，從這些中選擇陽性克隆。利用限制酶從陽性克隆上切割下包含與探針同源的5′上游和3′下游區(qū)的DNA片段并亞克隆到pBluescript II(Stratagene)中。
(4)堿基序列的測序由上述(3)構(gòu)建的重組pBluescript II，利用Kilo-序列(Takara)的缺失試劑盒按照所附手冊制備缺失克隆，這些缺失克隆每個(gè)均缺失一段已摻入的DNA片段的約300bp的序列。用染色終止循環(huán)測序制備反應(yīng)儀(Perkin Elmer)按照所附手冊對這些缺失克隆的序列進(jìn)行測序，接著用373A DNA測序儀(Perkin Elmer)進(jìn)行分析。這樣測定的3867bp的DNA片段的堿基序列(其含有菌株SSK-1的新殺蟲蛋白質(zhì)基因)見SEQID NO1。該堿基序列有3453bp的ORF，其編碼129.9kd，pI4.79，并具有1150個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列見SEQ ID NO2。
(5)同源性檢索利用數(shù)據(jù)庫(GenBank，EMBL，DDBJ。PDB序列)的同源性檢索的結(jié)果表明從菌株SSK-10獲得的新殺蟲蛋白質(zhì)基因的堿基序列與已知的Bt殺蟲蛋白質(zhì)的基因幾乎無同源性，并且在氨基酸水平上，與即使是最同源的Cry9Cal也僅僅為71％的同源性(B.Lambert等，環(huán)境微生物應(yīng)用，62，80，1996)。Bt殺蟲蛋白質(zhì)先以130kd至140kd的毒素前體產(chǎn)生，然后其在昆蟲的中腸內(nèi)被消化成60kd至70kd的毒素。實(shí)際上已知，該毒素有殺蟲活性，并且毒素前體的C端位點(diǎn)不為活性所需(H.Hofte和H.R.Whiteley，微生物回顧，53，242，1989)。因此，對一段有限的氨基酸序列上進(jìn)行同源性檢索(GenBank CDS翻譯物，PDB，SwissProt，PIR)，即在殺蟲性所需的從N端位點(diǎn)的第1個(gè)至第700個(gè)氨基酸的序列上進(jìn)行同源性檢索。即使是與最同源的Cry9Cal也只發(fā)現(xiàn)60％的同源性，這清楚地表明該基因是一個(gè)新基因。實(shí)施例5新殺蟲蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄(1)從菌株SSK-10中分離RNA將一環(huán)SSK-10菌株的細(xì)胞接種在20ml的LB培養(yǎng)基上，并在28℃下培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后，在13.0，16.5，20.0，23.5小時(shí)分別取樣0.5ml的培養(yǎng)物。開始培養(yǎng)后，16.5小時(shí)時(shí)用相差顯微鏡觀察CIs。立即離心取樣的培養(yǎng)液以收集細(xì)胞，利用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)按照所附手冊分離RNA。用脫氧核糖核酸酶處理這樣分離的RNA以分解任何DNA污染物，然后用于如下述通過反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR進(jìn)行的分析。
(2)通過RT-PCR的轉(zhuǎn)錄分析利用SEQ ID NO5(與SEQ ID NO1的461至480位氨基酸相對應(yīng))和SEQ ID NO6(與SEQ ID NO1的1021至1040位氨基酸相對應(yīng))作為PCR引物。通過RT-PCR利用RNA PCR試劑盒(AMV)Ver.2.1(Takara)分析轉(zhuǎn)錄。按照所附手冊利用隨機(jī)九-核苷酸作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物并利用上述的引物作為PCR的引物進(jìn)行該反應(yīng)。以相同的方式但無轉(zhuǎn)錄酶處理樣品以確認(rèn)RNA樣品沒有被DNA污染。在反應(yīng)之后，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，之后在溴化乙錠溶液中培養(yǎng)凝膠，然后在紫外線燈下拍下所形成凝膠的照片。結(jié)果見圖1。該分析結(jié)果表明菌株SSK-10的新殺蟲蛋白質(zhì)基因明顯與CI產(chǎn)生協(xié)同轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例6新殺蟲蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)及該蛋白質(zhì)的殺蟲活性(1)蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建用CAT取代新基因中緊挨著翻譯起始密碼子(ATG，SEQ ID NO1的211)上游的三個(gè)堿基(AGT)以將該位點(diǎn)改變成NdeI的識別序列(CATATG)。將從NdeI位點(diǎn)至位于新基因終止密碼子的7個(gè)堿基下游的BamHI位點(diǎn)(GGATCC，SEQ ID NO1的3670)的片段插入到pET-lla(一種蛋白質(zhì)表達(dá)(Stratagene)的載體)的NdeI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)之間。這樣構(gòu)建了在大腸桿菌中產(chǎn)生新殺蟲蛋白質(zhì)的載體。
(2)新殺蟲蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)及該蛋白質(zhì)的純化將上述(1)構(gòu)建的載體引入至大腸桿菌菌株BL21(DE3)內(nèi)以表達(dá)蛋白質(zhì)。按照所附手冊以異丙基-β-D-巰基-吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)從而使新殺蟲蛋白質(zhì)得以表達(dá)。通過SDS-聚丙烯酰胺蛋白凝膠電泳確認(rèn)在IPTG存在下培養(yǎng)的大腸桿菌菌體已產(chǎn)生約130kd的新殺蟲蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在大腸桿菌中以包含體的形式產(chǎn)生。利用溶菌酶和脫氧核糖核酸酶I處理大腸桿菌菌體，然后離心，純化為沉淀的包含體。
(3)新殺蟲蛋白質(zhì)的殺蟲活性a)新殺蟲蛋白質(zhì)對斜紋夜蛾的殺蟲活性將上述(2)中純化的新殺蟲蛋白質(zhì)作為試驗(yàn)樣品，添加試驗(yàn)實(shí)施例6中制備的孢子直至最后的孢子濃度為100mg/L。用補(bǔ)充了潤濕劑的溶液稀釋每個(gè)樣品至特定的濃度，用該樣品溶液噴射甘藍(lán)葉片，并置于塑料杯子中在空氣中干燥，然后釋放斜紋夜蛾的第三齡幼蟲(每個(gè)杯子5只幼蟲)。然后蓋上杯子放置在溫箱中(25℃)。3天后觀察存活或死亡情況。結(jié)果見表9。表9新殺蟲蛋白質(zhì)對斜紋夜蛾的殺蟲活性

已知由于夜蛾的消化液的強(qiáng)蛋白酶活性，加溶的CIs對Spodoptera sp.的殺蟲活性通常比其在溶解前的活性更低。同樣，已知Bt殺蟲蛋白質(zhì)(其由大腸桿菌產(chǎn)生，并且不具有晶狀結(jié)構(gòu))與來源于Bt菌所產(chǎn)生的相同基因的CIs相比具有更低的抗夜蛾的殺蟲活性(M.Keller等，昆蟲生物，分子生物學(xué)，26，365，1996)。用菌株SSK-10的CIs也觀察到了該現(xiàn)象，如表7所示，但是因溶解度而減少的活性通過添加孢子得到恢復(fù)。大腸桿菌菌體產(chǎn)生的新殺蟲蛋白質(zhì)單獨(dú)無殺蟲活性，如表9所示；然而，通過添加菌株SSK-10的孢子恢復(fù)了殺蟲活性。這樣，得出結(jié)論新殺蟲蛋白質(zhì)再現(xiàn)菌株SSK-10的CIs的活性。
b)新殺蟲蛋白質(zhì)對Bt-劑抗性的小菜蛾的作用將新殺蟲蛋白質(zhì)抗Osaka區(qū)捕獲的小菜蛾(抗性系)的作用與抗敏感系的作用進(jìn)行比較。將通過實(shí)施例3的方法所制備的干產(chǎn)物用作為菌株SSK-10的試驗(yàn)樣品。每個(gè)樣品用補(bǔ)充了潤濕劑的溶液稀釋至特定的濃度。用該試驗(yàn)的液體噴射甘藍(lán)葉片，并置于塑料杯子中在空氣中干燥，然后釋放小菜蛾的抗性系或敏感系的第三齡幼蟲(每個(gè)杯子5只幼蟲)。然后蓋上杯子放置在溫箱中(25℃)，3天后觀察存活或死亡情況。利用Toaro-CT可濕性粉劑(Towagosei Chem.K)作為對照化學(xué)藥品。用概率值法計(jì)算中值致死濃度(LC50)，抗性比通過抗性系昆蟲的致死濃度值除敏感系昆蟲的致死濃度值進(jìn)行計(jì)算。
結(jié)果見表10。表10新殺蟲蛋白質(zhì)對Bt-劑抗性的小菜蛾的殺蟲活性

>*Towagosei Chem.KK這表明，新殺蟲蛋白質(zhì)具有對Bt-劑抗性小菜蛾更高的殺蟲活性。
如下給出了本發(fā)明各種制劑的組合物的例子制劑實(shí)施例1可濕性粉劑本發(fā)明的含有CI和孢子的物質(zhì)50％Sorpol 807010％(陰離子型表面活性劑，商品名，Toho化學(xué) 10％工業(yè)有限公司)Newkalgen WG-2(陰離子型表面活性劑，商品名，Takemoto 5％Oil及Fat有限公司)Cellogen(羰甲基纖維素，商品名，Daiichi-Kogyo Seiyaku 3％有限公司中性無水硫酸鈉16％鈉沸石#20016％將上述組分粉碎，并均勻地混合成可濕性粉劑。
應(yīng)用時(shí)，將該可濕性粉劑稀釋500至4000倍，然后噴射。制劑實(shí)施例2粉劑本發(fā)明的含有CI和孢子的物質(zhì)3％Carplex#80(碳黑，商品名，Shionogi有限公司)1％二異丙基磷酸 2％滑石 94％將上述組分粉碎，并均勻地混合成粉劑。制劑實(shí)施例3可流動的藥劑本發(fā)明的含有CI和孢子的物質(zhì) 30％聚乙二醇 5％黃原膠 0.2％Newkalgen FS-1(陰離子型表面活性劑，商品名，Takemoto 3％Oil及Fat有限公司)Newkalgen FS-4(陰離子型表面活性劑，商品名，Takemoto 5％Oil及Fat有限公司)聚硅氧烷 0.1％水 6.7％除了本發(fā)明的含有CI和孢子的物質(zhì)外，將上述組分均勻地溶解，添加本發(fā)明的含有CI和孢子的物質(zhì)，然后充分振蕩所形成的混合物，并在潮濕條件下粉碎以得到可流動的制劑。應(yīng)用時(shí)，稀釋可流動的藥劑25至2000倍，并噴射。
序列表SEQ ID NO1序列長度3867序列類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型基因組DNA假設(shè)否反義否原始來源有機(jī)體蘇云金芽孢桿菌菌株名稱SSK-10特征名稱/關(guān)鍵詞CDS位置211..3663特征P名稱/關(guān)鍵詞mat肽位置211..3660特征P序列描述GAACCGAAGG TTTGTAAAAA AGAAATTGGA ATAAATACCA TCCATTTTTT CAAGAAAGAT 60TTTTTTATTA GAAAGGAATC TTTCTTACAC AGGAGAATAC TAAGATTGAG AGTAGAGATA 120TATAGATGTC AATACAATAA AGAGTCTGTC AGGTTTTTTG AAAGATATGA TTTGAACATG 180TAATAGATTT ATAGTATAGG AGGAAAAAGT ATG AAT CGA AAT AAT CCA AAT GAA 234Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu1 5TAT GAA ATT ATT GAT GCC CCC TAT TGT GGG TGT CCG TCA GAT GAT GAT282Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp10 15 20GTG AGG TAT CCT TTG GCA AGT GAC CCA AAT GCA GCG TTC CAA AAT ATG330Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met25 30 35 40AAC TAT AAA GAG TAT TTA CAA ACG TAT GAT GGA GAC TAC ACA GGT TCT378Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser45 50 55CTT ATC AAT CCT AAC TTA TCT ATT AAT CCT AGA GAT GTA CTA CAA ACA426Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr60 65 70GGT ATT AAT ATT GTG GGA AGA ATA CTA GGG TTT TTA GGT GTT CCA TTT 474Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe75 80 85GCG GGT CAA CTA GTT ACT TTC TAT ACC TTT CTC TTA AAT CAG TTG TGG 522Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp90 95 100CCA ACT AAT GAT AAT GCA GTA TGG GAA GCT TTT ATG GCG CAA ATA GAA 570Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu105 110 115 120GAG CTA ATC GAT CAA AAA ATA TCG GCG CAA GTA GTA AGG AAT GCA CTC 618Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu125130 135GAT GAC TTA ACT GGA TTA CAC GAT TAT TAT GAG GAG TAT TTA GCA GCA 666Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala140 145 150TTA GAG GAG TGG CTG GAA AGA CCG AAC GGA GCA AGA GCT AAC TTA GTT714Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val155 160 165ACA CAG AGG TTT GAA AAC CTG CAT ACT GCA TTT GTA ACT AGA ATG CCA762Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro170 175 180AGC TTT GGT ACG GGT CCT GGT AGT CAA AGA GAT GCG GTA GCG TTG TTG810Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu185 190 195 200ACG GTA TAT GCA CAA GCA GCG AAT TTG CAT TTG TTA TTA TTA AAA GAT858Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp205 210 215GCA GAA ATC TAT GGG GCA AGA TGG GGA CTT CAA CAA GGG CAA ATT AAC906Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn220 225 230TTA TAT TTT AAT GCT CAA CAA GAA CGT ACT CGA ATT TAT ACC AAT CAT954Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His235 240 245TGC GTG GAA ACA TAT AAT AGA GGA TTA GAA GAT GTA AGA GGA ACA AAT 1002Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn
250 255 260ACA GAA AGT TGG TTA AAT TAC CAT CGA TTC CGT AGA GAG ATG ACA TTA 1050Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu265 270 275 280ATG GCA ATG GAT TTA GTG GCC CTA TTC CCA TTC TAT AAT GTG CGA CAA 1098Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro Phe Tyr Asn Val Arg Gln285 290 295TAT CCA AAT GGG GCA AAT CCA CAG CTT ACA CGT GAA ATA TAT ACA GAT 1146Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp300 305 310CCA ATC GTA TAT AAT CCA CCA GCT AAT CAG GGA ATT TGC CGA CGT TGG 1194Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp315 320 325GGG AAT AAT CCG TAT AAT ACA TTT TCT GAA CTT GAA AAT GCT TTT ATT 1242Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile330 335 340CGC CCG CCA CAT CTT TTT GAA AGG TTG AAC AGA TTA ACT ATT TCT AGA 1290Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg345 350 355 360AAC CGA TAT ACA GCT CCA ACA ACT AAT AGC TTC CTA GAC TAT TGG TCA 1338Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr Asn Ser Phe Leu Asp Tyr Trp Ser365 370 375GGT CAT ACT TTA CAA AGC CAA CAT GCA AAT AAC CCG ACG ACA TAT GAA 1386Gly His Thr Leu Gln Ser Gln His Ala Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Glu380 385 390ACT AGT TAC GGT CAG ATT ACC TCT AAC ACA CGT TTA TTC AAT ACG ACT 1434Thr Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ser Asn Thr Arg Leu Phe Asn Thr Thr395 400 405AAT GGA GCC CGT GCA ATA GAT TCA AGG GCA AGA AAT TTT GGT AAC TTA 1482Asn Gly Ala Arg Ala Ile Asp Ser Arg Ala Arg Asn Phe Gly Asn Leu410 415 420TAC GCT AAT TTG TAT GGC GTT AGC AGC TTG AAC ATT TTC CCA ACA GGT 1530Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser Ser Leu Asn Ile Phe Pro Thr Gly425 430 435 440GTG ATG AGT GAA ATC ACC AAT GCA GCT AAT ACG TGT CGG CAA GAC CTT 1578Val Met Ser Glu Ile Thr Asn Ala Ala Asn Thr Cys Arg Gln Asp Leu445 450 455ACT ACA ACT GAA GAA CTA CCA CTA GAG AAT AAT AAT TTT AAT CTT TTA 1626Thr Thr Thr Glu Glu Leu Pro Leu Glu Asn Asn Asn Phe Asn Leu Leu460 465 470TCT CAT GTT ACT TTC TTA CGC TTC AAT ACT ACT CAG GGT GGC CCC CTT 1674Ser His Val Thr Phe Leu Arg Phe Asn Thr Thr Gln Gly Gly Pro Leu475 480 485GCA ACT CTA GGG TTT GTA CCC ACA TAT GTG TGG ACA CGT GAA GAT GTA 1722Ala Thr Leu Gly Phe Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr Arg Glu Asp Val490 495 500GAT TTT ACG AAC ACA ATT ACT GCG GAT AGA ATT ACA CAA CTA CCA TGG 1770Asp Phe Thr Asn Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ile Thr Gln Leu Pro Trp505 510 515 520GTA AAG GCA TCT GAA ATA GGT GGG GGT ACT ACT GTC GTG AAA GGT CCA 1818Val Lys Ala Ser Glu Ile Gly Gly Gly Thr Thr Val Val Lys Gly Pro525 530 535GGA TTT ACA GGA GGG GAT ATA CTT CGA AGA ACG GAC GGT GGT GCA GTT 1866Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asp Gly Gly Ala Val540 545 550GGA ACG ATT AGA GCT AAT GTT AAT GCC CCA TTA ACA CAA CAA TAT CGT 1914Gly Thr Ile Arg Ala Asn Val Asn Ala Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg555 560 565ATA AGA TTA CGC TAT GCT TCG ACA ACA AGT TTT GTT GTT AAT TTA TTT 1962Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Ser Phe Val Val Asn Leu Phe570 575 580GTT AAT AAT AGT GCG GCT GGC TTT ACT TTA CCG AGT ACA ATG GCT CAA 2010Val Asn Asn Ser Ala Ala Gly Phe Thr Leu Pro Ser Thr Met Ala Gln585 590 595 600AAT GGT TCT TTA ACA TAC GAG TCG TTT AAT ACC TTA GAG GTA ACT CAT 2058Asn Gly Ser Leu Thr Tyr Glu Ser Phe Asn Thr Leu Glu Val Thr His605 610 615ACT ATT AGA TTT TCA CAG TCA GAT ACT ACA CTT AGG TTG AAT ATA TTC 2106Thr Ile Arg Phe Ser Gln Ser Asp Thr Thr Leu Arg Leu Asn Ile Phe620 625 630CCG TCT ATC TCT GGT CAA GAA GTG TAT GTA GAT AAA CTT GAA ATC GTT 2154Pro Ser Ile Ser Gly Gln Glu Val Tyr Val Asp Lys Leu Glu Ile Val635 640 645CCA ATT AAC CCG ACA CGA GAA GCG GAA GAA GAT TTA GAA GAT GCA AAG 2202Pro Ile Asn Pro Thr Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Asp Ala Lys650 655 660AAA GCG GTG GCG AGC TTG TTT ACA CGT ACA AGG GAT GGA TTA CAG GTA 2250Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe Thr Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val665 670 675 680AAT GTG ACA GAT TAC CAA GTC GAT CAG GCG GCA AAT TTA GTG TCG TGC 2298Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys685 690 695TTA TCA GAT GAA CAA TAT GGG CAT GAT AAA AAG ATG TTA TTG GAA GCC 2346Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Gly His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala700 705 710GTA CGC GCA GCA AAA CGC CTC AGC CGC GAA CGC AAC TTA CTT CAA GAT 2394Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp715 720 725CCA GAT TTT AAT GAA ATA AAT AGC ACA GAA GAA AAT GGC TGG AAG GCA 2442Pro Asp Phe Asn Glu Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala730 735 740AGT AAC GGT GTT ACT ATT AGC GAG GGC GGT CCA TTC TTT AAA GGT CGT 2490Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Phe Lys Gly Arg745 750 755 760GCA CTT CAG TTA GCA AGC GCA CGT GAA AAT TAC CCA ACA TAC ATC TAT 2538Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr765 770 775CAA AAG GTA GAT GCA TCG ACG TTA AAA CCT TAT ACA CGA TAT AAA CTA 2586Gln Lys Val Asp Ala Ser Thr Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu780 785 790GAT GGA TTT GTG CAA AGT AGT CAA GAT TTA GAA ATT GAC CTC ATT CAT 2634Asp Gly Phe Val Gln Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His795 800 805CAT CAT AAA GTC CAC CTC GTG AAA AAT GTA CCA GAT AAT TTA GTA TCT 2682His His Lys Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser810 815 820GAT ACT TAT TCT GAT GGC TCA TGT AGT GGA ATT AAC CGT TGT GAG GAA 2730Asp Thr Tyr Ser Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Asn Arg Cys Glu Glu825 830 835 840CAA CAT CAG GTA GAT GTG CAG CTA GAT GCG GAG GAT CAT CCA AAG GAT 2778Gln His Gln Val Asp Val Gln Leu Asp Ala Glu Asp His Pro Lys Asp
845 850 855TGT TGT GAA GCG GCT CAA ACA CAT GAG TTT TCT TCC TAT ATT CAT ACA 2826Cys Cys Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe Ser Ser Tyr Ile His Thr860 865 870GGT GAT CTA AAT GCA AGT GTA GAT CAA GGC ATT TGG GTT GTA TTG CAG 2874Gly Asp Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Gln875 880 885GTT CGA ACA ACA GAT GGT TAT GCG ACG TTA GGA AAT CTT GAA TTG GTA 2922Val Arg Thr Thr Asp Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val890 895 900GAG GTT GGT CCA TTA TCG GGT GAA TCT TTA GAA CGA GAA CAA AGA GAT 2970Glu Val Gly Pro Leu Ser Gly Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp905 910 915 920AAT GCG AAA TGG AAT GAA GAG GTA GGA AGA AAG CGT GCA GAA ACA GAT 3018Asn Ala Lys Trp Asn Glu Glu Val Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp925 930 935CGC ATA TAT CAA GAT GCG AAA CAA GCA ATT AAC CAT CTA TTT GTA GAC 3066Arg Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Gln Ala Ile Asn His Leu Phe Val Asp940 945 950TAT CAA GAT CAA CAA TTA AGT CCA GAG GTA GGG ATG GCG GAT ATT ATT 3114Tyr Gln Asp Gln Gln Leu Ser Pro Glu Val Gly Met Ala Asp Ile Ile955 960 965GAT GCT CAA AAT CTT ATC GCA TCA ATT TCA GAT GTA TAT AGC GAT GCA 3162Asp Ala Gln Asn Leu Ile Ala Ser Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala970 975 980GTA CTG CAA ATC CCT GGG ATT AAC TAC GAG ATG TAT ACA GAG TTA TCC 3210Val Leu Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu Met Tyr Thr Glu Leu Ser985 990 9951000AAT CGA TTA CAA CAA GCA TCG TAT CTG TAT ACG TCT CGA AAT GTC GTG 3258Asn Arg Leu Gln Gln Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Ser Arg Asn Val Val100510101015CAA AAT GGG GAC TTT AAC AGT GGT TTA GAT AGT TGG AAT GCA ACA ACT 3306Gln Asn Gly Asp Phe Asn Ser Gly Leu Asp Ser Trp Asn Ala Thr Thr102010251030GAT ACA GCT GTT CAG CAG GAT GGC AAT ATG CAT TTC TTA GTT CTT TCC 3354Asp Thr Ala Val Gln Gln Asp Gly Asn Met His Phe Leu Val Leu Ser103510401045CAT TGG GAT GCA CAA GTT TCT CAA CAA TTT AGA GTA CAG CCG AAT TGT 3402His Trp Asp Ala Gln Val Ser Gln Gln Phe Arg Val Gln Pro Asn Cys105010551060AAA TAT GTG TTA CGT GTG ACA GCG AAG AAA GTA GGG AAC GGA GAT GGA3450Lys Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala Lys Lys Val Gly Asn Gly Asp Gly1065 107010751080TAT GTT ACG ATC CAA GAT GGC GCT CAT CAC CGA GAA ACA CTG ACA TTC3498Tyr Val Thr Ile Gln Asp Gly Ala His His Arg Glu Thr Leu Thr Phe108510901095AAT GCA TGT GAC TAC GAT GTA AAT GGT ACG CAT GTA AAT GAT AAT TCG3546Asn Ala Cys Asp Tyr Asp Val Asn Gly Thr His Val Asn Asp Asn Ser110011051110TAT ATT ACA AAA GAA TTG GTG TTC TAT CCA AAG ACG GAA CAT ATG TGG3594Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Val Phe Tyr Pro Lys Thr Glu His Met Trp111511201125GTA GAG GTA AGT GAA ACA GAA GGT ACC TTC TAT ATA GAC AGC ATT GAG3642Val Glu Val Ser Glu Thr Glu Gly Thr Phe Tyr Ile Asp Ser Ile Glu1130 11351140TTC ATT GAA ACA CAA GAG TAGAAGAGGG GATCCTAACG TATAGCAACT 3690Phe Ile Glu Thr Gln Glu1145 1150ATGAGGGGAC ACTCTGTATA AATAAAGATT AAAAAGAATA GAAAATGAAT AGAACCCCCT 3750ACTGGTCTTT TTACCAGTAG GGGGTTTTTC ACATAAAAAA ATGGATTTGT TTACTAAGGT 3810GTATAAAAAA CGGAATACCT GATAGAAAAA AGGGAGTACC TTATAAAGAA AGAATTC 3867SEQ ID NO2序列長度1150序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型蛋白質(zhì)原始來源有機(jī)體蘇云金芽孢桿菌菌株名稱SSK-10序列描述Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr1 5 10 15Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr35 40 45Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile50 55 60Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile65 70 75 80Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr85 90 95Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp100 105 110Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser115 120 125Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp130 135 140Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro145 150 155 160Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His165 170 175Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser180 185 190Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn195 200 205Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp210 215 220Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu225 230 235 240Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly245 250 255Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His260 265 270Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu275 280 285Phe Pro Phe Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln290 295 300Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala305 310 315 320Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe325 330 335Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg340 345 350Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr355 360 365Asn Ser Phe Leu Asp Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Gln Ser Gln His370 375 380Ala Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Glu Thr Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Ser385 390 395 400Asn Thr Arg Leu Phe Asn Thr Thr Asn Gly Ala Arg Ala Ile Asp Ser405 410 415Arg Ala Arg Asn Phe Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser420 425 430Ser Leu Asn Ile Phe Pro Thr Gly Val Met Ser Glu Ile Thr Asn Ala435 440 445Ala Asn Thr Cys Arg Gln Asp Leu Thr Thr Thr Glu Glu Leu Pro Leu450 455 460Glu Asn Asn Asn Phe Asn Leu Leu Ser His Val Thr Phe Leu Arg Phe465 470 475 480Asn Thr Thr Gln Gly Gly Pro Leu Ala Thr Leu Gly Phe Val Pro Thr485 490 495Tyr Val Trp Thr Arg Glu Asp Val Asp Phe Thr Asn Thr Ile Thr Ala500 505 510Asp Arg Ile Thr Gln Leu Pro Trp Val Lys Ala Ser Glu Ile Gly Gly
515 520 525Gly Thr Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu530 535 540Arg Arg Thr Asp Gly Gly Ala Val Gly Thr Ile Arg Ala Asn Val Asn545 550 555 560Ala Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Ser Thr565 570 575Thr Ser Phe Val Val Asn Leu Phe Val Asn Asn Ser Ala Ala Gly Phe580 585 590Thr Leu Pro Ser Thr Met Ala Gln Asn Gly Ser Leu Thr Tyr Glu Ser595 600 605Phe Asn Thr Leu Glu Val Thr His Thr Ile Arg Phe Ser Gln Ser Asp610 615 620Thr Thr Leu Arg Leu Asn Ile Phe Pro Ser Ile Ser Gly Gln Glu Val625 630 635 640Tyr Val Asp Lys Leu Glu Ile Val Pro Ile Asn Pro Thr Arg Glu Ala645 650 655Glu Glu Asp Leu Glu Asp Ala Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Phe Thr660 665 670Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val Asp675 680 685Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr Gly His690 695 700Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys Arg Leu Ser705 710 715 720Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn Glu Ile Asn Ser725 730 735Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser Glu740745 750Gly Gly Pro Phe Phe Lys Gly Arg Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ala Arg755 760 765Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln Lys Val Asp Ala Ser Thr Leu770 775 780Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu Asp Gly Phe Val Gln Ser Ser Gln785 790 795 800Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile His His His Lys Val His Leu Val Lys805 810 815Asn Val Pro Asp Asn Leu Val Ser Asp Thr Tyr Ser Asp Gly Ser Cys820 825 830Ser Gly Ile Asn Arg Cys Glu Glu Gln His Gln Val Asp Val Gln Leu835 840 845Asp Ala Glu Asp His Pro Lys Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln Thr His850 855 860Glu Phe Ser Ser Tyr Ile His Thr Gly Asp Leu Asn Ala Ser Val Asp865 870 875 880Gln Gly Ile Trp Val Val Leu Gln Val Arg Thr Thr Asp Gly Tyr Ala885 890 895Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Ser Gly Glu900 905 910Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala Lys Trp Asn Glu Glu Val915 920 925Gly Arg Lys Arg Ala Glu Thr Asp Arg Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Gln930 935 940Ala Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu Ser Pro945 950 955 960Glu Val Gly Met Ala Asp Ile Ile Asp Ala Gln Asn Leu Ile Ala Ser965 970 975Ile Ser Asp Val Tyr Ser Asp Ala Val Leu Gln Ile Pro Gly Ile Asn980 985 990Tyr Glu Met Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Arg Leu Gln Gln Ala Ser Tyr99510001005Leu Tyr Thr Ser Arg Asn Val Val Gln Asn Gly Asp Phe Asn Ser Gly101010151020Leu Asp Ser Trp Asn Ala Thr Thr Asp Thr Ala Val Gln Gln Asp Gly1025 103010351040Asn Met His Phe Leu Val Leu Ser His Trp Asp Ala Gln Val Ser Gln104510501055Gln Phe Arg Val Gln Pro Asn Cys Lys Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala106010651070Lys Lys Val Gly Asn Gly Asp Gly Tyr Val Thr Ile Gln Asp Gly Ala107510801085His His Arg Glu Thr Leu Thr Phe Asn Ala Cys Asp Tyr Asp Val Asn109010951100Gly Thr His Val Asn Asp Asn Ser Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Val Phe1105 111011151120Tyr Pro Lys Thr Glu His Met Trp Val Glu Val Ser Glu Thr Glu Gly112511301135Thr Phe Tyr Ile Asp Ser Ile Glu Phe Ile Glu Thr Gln Glu114011451150SEQ ID NO3序列長度21序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸/合成DNA序列描述AGRWCCAGGA TTTAYAGGAG GSEQ ID NO4序列長度20序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸/合成DNA序列描述CCCCTGTATC AATATAGRAASEQ ID NO5序列長度20序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸/合成DNA序列描述TAGGTGTTCC ATTTGCGGGTSEQ ID NO6序列長度20序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸/合成DNA序列描述TCTCTACGGA ATCGATGGTA
權(quán)利要求
1.一種菌株SSK-10，其以保藏號FERM-6162保藏。
2.一種蛋白質(zhì)，其包含下列氨基酸序列(a)或者(b)(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者(b)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其具有殺蟲活性，其中在SEQ ID NO2中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代或被缺失，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸被添加或被插入到SEQ ID NO2的氨基酸序列中。
3.一種核苷酸序列，其編碼按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3的核苷酸序列，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
5.一種載體，其包含按照權(quán)利要求3的核苷酸序列。
6.一種宿主細(xì)胞，其包含按照權(quán)利要求3的核苷酸序列或按照權(quán)利要求5的載體。
7.按照權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其是微生物。
8.按照權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。
9.按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其是晶狀蛋白質(zhì)包含體形式的。
10.按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其是加溶晶狀蛋白質(zhì)包含體形式的。
11.按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其是由按照權(quán)利要求1的菌株或者按照權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的。
12.一種用于消除蟲害的藥劑，其包含作為有效成分的按照權(quán)利要求1的菌株、按照權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞和/或按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)。
13.一種用于消除蟲害的藥劑，其包含作為有效成分的按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)和按照權(quán)利要求1的菌株的孢子。
14.一種用于消除蟲害的藥劑，其包含作為有效成分的按照權(quán)利要求9的晶狀蛋白質(zhì)包含體和按照權(quán)利要求1的菌株的孢子。
15.一種用于消除蟲害的藥劑，其包含作為有效成分的按照權(quán)利要求10的加溶晶狀蛋白質(zhì)包含體和按照權(quán)利要求1的菌株的孢子。
16.一種用于消除蟲害的方法，該方法包括用按照權(quán)利要求1的菌株、按照權(quán)利要求7的微生物和/或按照權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)處理已經(jīng)受到或者可能受到所說的蟲害損害的植物。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中所說的蟲害屬于鱗翅目，鞘翅目或者雙翅目。
18.按照權(quán)利要求16的方法，其中所說的昆蟲是選自由斜紋夜蛾(Spodoptera litura)，小菜蛾(Plutella xylostella)和尖音庫蚊(Culex Pipiens)組成的組的昆蟲。
19.一種植物細(xì)胞，其包含按照權(quán)利要求3的核苷酸序列或按照權(quán)利要求5的載體。
20.按照權(quán)利要求19的植物細(xì)胞，其再生為能夠產(chǎn)生種子的植物。
21.一種種子，其包含按照權(quán)利要求3的核苷酸序列或按照權(quán)利要求5的載體。
22.按照權(quán)利要求21的種子，其可以被培育成能夠產(chǎn)生種子的植物。
23.一種植物，其包含按照權(quán)利要求3的核苷酸序列或按照權(quán)利要求5的載體。
24.按照權(quán)利要求23的植物，其能夠產(chǎn)生種子。
25.一種植物，其可以通過使權(quán)利要求21的種子發(fā)芽獲得。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供不僅具有針對鱗翅目昆蟲，而且具有針對其它昆蟲的殺蟲活性的Bt菌，由所說的Bt菌產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)，編碼所說的蛋白質(zhì)的基因，產(chǎn)生所說的殺蟲蛋白質(zhì)的宿主，以及蟲害消除劑。根據(jù)本發(fā)明的新菌株是菌株SSK－10，其被分類為蘇云金芽孢桿菌，以保藏號FERM BP－6162保藏。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含(a)在SEQ ID NO1中所描述的氨基酸序列，或者(b)SEQ ID NO2中所描述的氨基酸序列，其具有殺蟲活性，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加或插入。
文檔編號C12N15/32GK1240002SQ97180416
公開日1999年12月29日 申請日期1997年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月10日
發(fā)明者尾山和彥, 今村圭一, 御堂直樹, 谷野茂樹, 加藤明子, 巖田道顯 申請人:明治制果株式會社