截短的血小板激活因子乙酰水解酶的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：451051閱讀：696來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：截短的血小板激活因子乙酰水解酶的制作方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明總的涉及血小板激活因子乙酰水解酶，更具體地涉及新的編碼人血漿血小板激活因子乙酰水解酶的純化的和分離的多核苷酸、涉及由所述多核苷酸編碼的血小板激活因子乙酰水解酶產(chǎn)物、涉及血小板激活因子乙酰水解酶產(chǎn)物的重組生產(chǎn)的材料和方法、涉及對血小板激活因子乙酰水解酶特異性的抗體物質(zhì)。
            
背景技術(shù)：
            血小板激活因子(PAF)是由各種細(xì)胞類型合成的生物學(xué)活性磷脂。體內(nèi)和在10-10至10-9M的正常濃度范圍時(shí)，PAF通過與特異性G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活諸如血小板和嗜中性粒細(xì)胞的靶細(xì)胞[Venable等，J.Lipid Res.，34691-701(1993)]。PAF具有1-O-烷基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿結(jié)構(gòu)。為達(dá)到最佳生物學(xué)活性，PAF甘油主鏈的sn-1位必須是與脂肪族醇的醚鍵，sn-3位必須具有磷酸膽堿首基。
            
PAF在正常生理過程中起作用(例如，炎癥、止血和分娩)，并且與病理炎癥反應(yīng)(例如，哮喘、過敏性反應(yīng)、敗血癥性休克和關(guān)節(jié)炎)[Venable等，見上述，和Lindsberg等，Ann.Neurol.，30117-129(1991)]有關(guān)。PAF涉及病理反應(yīng)的可能性已促使嘗試調(diào)節(jié)PAF的活性，這些嘗試的主要焦點(diǎn)是開發(fā)PAF活性的拮抗劑，所述拮抗劑干擾PAF與細(xì)胞表面受體的結(jié)合。參見，例如，Heuer等，Clin.Exp.Allergy，22980-983(1992)。
            
PAF的合成和分泌及其降解和清除看來受嚴(yán)格控制。PAF調(diào)節(jié)機(jī)制失靈產(chǎn)生的過度產(chǎn)生、不適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生或缺乏降解，導(dǎo)致PAF的病理炎癥作用，在這方面來講，調(diào)節(jié)PAF活性的替代方法將涉及模擬或增大炎癥消退發(fā)生的自然過程。已報(bào)道巨噬細(xì)胞[Stafforini等，J.Biol.Chem.，265(17)9682-9687(1990)]、肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2[Satoh等，J.Clin.Invest，87476-481(1991)和Tarbet等，J.Biol.Chem.，266(25)16667-16673(1991)]釋放鈍化PAF的PAF乙酰水解酶(PAF-AH)酶活性。除了鈍化PAF，PAF-AH亦鈍化氧化片段化的磷脂，諸如介導(dǎo)炎癥的花生四烯酸級(jí)聯(lián)的產(chǎn)物。參見，Stremler等，J.Biol.Chem.，266(17)11095-11103(1991)。PAF-AH對PAF的鈍化主要通過水解PAF的sn-2乙酰基而發(fā)生，PAF-AH通過除去sn-2?；x氧化片段化磷脂。已鑒別二種類型的PAF-AH在各種細(xì)胞類型和組織中(諸如內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞中)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)形式和在血漿和血清中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外形式。血漿PAF-AH不水解完整的磷脂，除了PAF，這種底物特異性允許該酶以完全活性狀態(tài)在體內(nèi)循環(huán)而無不利影響。血漿PAF-AH看來對活體外人血中所有PAF的降解負(fù)責(zé)[Stafforini等，J.Biol.Chem.，262(9)4223-4230(1987)]。
            
雖然PAF-AH的細(xì)胞質(zhì)形式和血漿形式看來具有相同的底物特異性，但血漿PAF-AH具有使其區(qū)別于細(xì)胞質(zhì)PAF-AH和其它已表征的脂酶的生物化學(xué)特征。具體而言，血漿PAF-AH與脂蛋白顆粒相關(guān)聯(lián)，被二異丙基氟磷酸抑制，不受鈣離子影響，對蛋白酶水解相對不敏感，表現(xiàn)分子量為43,000道爾頓。參見，Stafforini等(1987)，見上述。Stafforini等的同一篇文章描述了從人血漿部分純化PAF-AH的程序以及利用該程序得到的血漿材料的氨基酸組成。Stafforini等，J.Biol.Chem.，268(6)3857-3865(1993)報(bào)道已從紅細(xì)胞純化細(xì)胞質(zhì)PAF-AH，在該文章中亦描述了細(xì)胞質(zhì)PAF-AH的10個(gè)氨基末端殘基。Hattori等，J.Biol.Chem.，268(25)18748-18753(1993)描述了從牛腦純化細(xì)胞質(zhì)PAF-AH。其母申請?zhí)峤缓?，Hattori等，J.Biol.Chem.，269(237)23150-23155(1994)發(fā)表了牛腦細(xì)胞質(zhì)PAF-AH的核苷酸序列。1995年1月5日，在其母申請?zhí)峤缓蟮娜齻€(gè)月時(shí)，Smithkline Beecham PLC專利合作條約(PCT)國際公布號(hào)WO95/00649中發(fā)表了脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)的核苷酸序列。與本發(fā)明的PAF-AH的核苷酸序列相比，Lp-PLA2的核苷酸序列在一個(gè)位置上有差異。該核苷酸差異(對應(yīng)于SEQ ID NO7的位置1297)導(dǎo)致由所述多核苷酸編碼的酶之間的氨基酸差異。位于SEQ ID NO8的位置379的氨基酸是纈氨酸，而Lp-PLA2對應(yīng)位置的氨基酸是丙氨酸。另外，本發(fā)明的PAF-AH的核苷酸序列包括在所述Lp-PLA2序列中不存在的5’端的124個(gè)堿基和3’端的20個(gè)堿基。三個(gè)月后，1995年4月10日，一個(gè)Lp-PLA2序列以登記號(hào)U24577貯存于GenBank，該序列與本發(fā)明的PAF-AH的核苷酸序列相比在11個(gè)位置上有區(qū)別。所述的核苷酸差異(對應(yīng)于SEQ ID NO7的位置79、81、84、85、86、121、122、904、905、911、983和1327)導(dǎo)致由所述多核苷酸編碼的酶之間的四個(gè)氨基酸差異。SEQ ID NO8的位置249、250、274和389的氨基酸分別是賴氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸，而所述GenBank序列中對應(yīng)位置的氨基酸分別是異亮氨酸、精氨酸、亮氨酸和絲氨酸。
            
PAF-AH的重組生產(chǎn)將使得可以使用外源PAF-AH模仿或增大體內(nèi)炎癥消退的正常過程。給予PAF-AH提供優(yōu)于給予PAF受體拮抗劑的生理學(xué)優(yōu)勢，因?yàn)镻AF-AH是在血漿中正常發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)物。另外，因?yàn)榕cPAF結(jié)構(gòu)相關(guān)的PAF受體拮抗劑抑制天然PAF-AH活性，由此阻止了所需要的PAF代謝和氧化片段化磷脂的代謝。因此，PAF受體拮抗劑抑制PAF-AH的活性對抗了所述拮抗劑對PAF受體的競爭性阻塞。參見，Stremler等，見上述。另外，在急性炎癥部位，例如，氧化劑的釋放導(dǎo)致天然PAF-AH酶的鈍化，進(jìn)而導(dǎo)致PAF和PAF樣化合物局部水平升高，所述化合物將與任何外源給予的PAF受體拮抗劑競爭與PAF受體的結(jié)合。與之相反，用重組PAF-AH治療將增大內(nèi)源PAF-AH活性并補(bǔ)償任何鈍化的內(nèi)源酶。
            
因此在本領(lǐng)域內(nèi)需要鑒別和分離編碼人血漿PAF-AH的多核苷酸序列、需要開發(fā)可用于PAF-AH重組生產(chǎn)的材料和方法，需要制備檢測血漿中PAF-AH的試劑。
            
發(fā)明概要本發(fā)明提供編碼人血漿PAF-AH或其酶活性片段的新的純化的和分離的多核苷酸(即，有義鏈和反義鏈DNA和RNA)。本發(fā)明的優(yōu)選DNA序列包括基因組序列和cDNA序列以及全部或部分化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明考慮了陳述于SEQID NO7的編碼PAF-AH的DNA序列和在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格條件下與其非編碼鏈雜交的DNA序列或如果不是由于遺傳密碼的豐余性將與其雜交的DNA序列。本發(fā)明亦考慮了本發(fā)明DNA序列的生物復(fù)制物(即，體內(nèi)或體外產(chǎn)生的分離DNA序列的拷貝)。亦提供了諸如加入PAF-AH序列的質(zhì)粒和病毒DNA載體、尤其是其中編碼PAF-AH的DNA可操作地連接至內(nèi)源或外源表達(dá)控制DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止子的載體的自主復(fù)制重組構(gòu)建物。
            
按照本發(fā)明的另一方面，以使需要的PAF-AH在其中表達(dá)的方式，用本發(fā)明的DNA序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細(xì)胞。表達(dá)PAF-AH產(chǎn)物的宿主細(xì)胞可以為各種有用目的服務(wù)。這種細(xì)胞為開發(fā)特異性地與PAF-AH免疫反應(yīng)的抗體物質(zhì)組成了有價(jià)值的免疫原源。本發(fā)明的宿主細(xì)胞在大規(guī)模生產(chǎn)PAF-AH的方法中顯著地有用，其中所述細(xì)胞生長于合適的培養(yǎng)基中，通過例如免疫親和純化從所述細(xì)胞或所述細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分離需要的多肽產(chǎn)物。
            
本發(fā)明考慮的用于從血漿純化PAF-AH的非免疫學(xué)方法包括以下步驟(a)分離低密度脂蛋白顆粒；(b)將所述低密度脂蛋白顆粒溶解于包含10mM CHAPS的緩沖液中，以產(chǎn)生第一個(gè)PAF-AH酶溶液；(c)將所述第一個(gè)PAF-AH酶溶液上DEAE陰離子交換柱；(d)使用包含1mMCHAPS的約pH7.5緩沖液洗滌所述DEAE陰離子交換柱；(e)使用包含0-0.5M NaCl梯度的約pH7.5緩沖液從所述DEAE陰離子交換柱分部洗脫P(yáng)AF-AH酶；(f)將從所述DEAE陰離子交換柱洗脫的具有PAF-AH酶活性的分部收集液合并；(g)調(diào)節(jié)從所述DEAE陰離子交換柱得到的合并活性分部收集液至10mM CHAPS，以產(chǎn)生第二個(gè)PAF-AH酶溶液；(h)將所述第二個(gè)PAF-AH酶溶液上樣至藍(lán)染料配體親和柱；(i)使用包含10mM CHAPS和離液鹽的緩沖液從所述藍(lán)染料配體親和柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；(j)將所述藍(lán)染料配體親和柱的洗脫液上樣至Cu配體親和柱；(k)使用包含10mM CHAPS和咪唑的緩沖液從所述Cu配體親和柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；(l)將所述Cu配體親和柱的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE；和(m)從所述SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離約44kDa PAF-AH酶。優(yōu)選地，步驟(b)的緩沖液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS，pH7.5；步驟(d)的緩沖液是25mM Tris-HCl、1mM CHAPS；步驟(h)的柱是Blue SepharoseFast Flow柱；步驟(i)的緩沖液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、0.5MKSCN，pH7.5；步驟(j)的柱是Cu螯合Sepharose柱；而步驟(k)的緩沖液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、0.5M NaCl、50mM咪唑，pH范圍為約7.5-8.0。
            
本發(fā)明考慮的用于從產(chǎn)生PAF-AH的大腸桿菌純化酶活性PAF-AH的方法包括以下步驟(a)從產(chǎn)生PAF-AH酶的大腸桿菌的溶菌產(chǎn)物制備離心上清液；(b)將所述離心上清液上樣至藍(lán)染料配體親和柱；(c)使用包含10mM CHAPS和離液鹽的緩沖液從所述藍(lán)染料配體親和柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；(d)將所述藍(lán)染料配體親和柱的所述洗脫液上樣至Cu配體親和柱；(e)使用包含10mM CHAPS和咪唑的緩沖液從所述Cu配體親和柱洗脫P(yáng)AF-AH酶。優(yōu)選地，步驟(b)的柱是Blue Sepharose Fast Flow柱；步驟(c)的緩沖液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、0.5M KSCN，pH7.5；步驟(d)的柱是Cu螯合Sepharose柱；步驟(e)的緩沖液是25mMTris-HCl、10mM CHAPS、0.5M NaCl、100mM咪唑，pH7.5。
            
本發(fā)明考慮的用于從產(chǎn)生PAF-AH的大腸桿菌純化酶活性PAF-AH的另一方法包括以下步驟(a)從產(chǎn)生PAF-AH酶的大腸桿菌的溶菌產(chǎn)物制備離心上清液；(b)在包含10mM CHAPS的低pH緩沖液中稀釋所述離心上清液；(c)將所述稀釋的離心上清液上樣至于約pH 7.5平衡的陽離子交換柱；(d)使用1M鹽從所述陽離子交換柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；提高所述陽離子交換柱的所述洗脫液的pH，將所述洗脫液的鹽濃度調(diào)節(jié)至約0.5M鹽；(f)將所述陽離子交換柱的所述調(diào)節(jié)洗脫液上樣至藍(lán)染料配體親和柱；(g)使用包含約2M至約3M鹽的緩沖液從所述藍(lán)染料配體親和柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；和(h)使用包含約0.1％吐溫的緩沖液透析所述藍(lán)染料配體親和柱的所述洗脫液。優(yōu)選地，步驟(b)的緩沖液是25mMMES、10mM CHAPS、1mM EDTA、pH4.9；步驟(c)的柱是在25mMMES、10mM CHAPS、1mM EDTA、50mM NaCl、pH5.5中平衡的Ssepharose柱；步驟(d)中使用1mM NaCl洗脫P(yáng)AF-AH；步驟(e)中洗脫液的pH用2M Tris堿調(diào)節(jié)至pH7.5；步驟(f)中的柱是sepharose柱；步驟(g)的緩沖液是25mM Tris、10mM CHAPS、3M NaCl、1mM EDTA、pH7.5；步驟(h)中的緩沖液是25mM Tris、0.5M NaCl、0.1％吐溫80、pH7.5。
            
本發(fā)明考慮的用于從大腸桿菌純化酶活性PAF-AH的再一方法包括以下步驟(a)制備在含有CHAPS的緩沖液中溶菌后產(chǎn)生溶解的PAF-AH上清液的大腸桿菌提取液；(b)稀釋所述上清液，上樣至于約pH8.0平衡的陰離子交換柱；(c)從所述陰離子交換柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；(d)將所述陰離子交換柱的所述調(diào)節(jié)洗脫液上樣至藍(lán)染料配體親和柱；(e)使用包含3.0M鹽的緩沖液洗脫所述藍(lán)染料配體親和柱；(f)將所述藍(lán)染料洗脫液稀釋入用于進(jìn)行羥基磷灰石(hydroxylapatite)層析的合適緩沖液；(g)進(jìn)行羥基磷灰石層析，其中使用緩沖液(含或不含CHAPS)完成洗滌和洗脫；(h)將所述羥基磷灰石洗脫液稀釋至適當(dāng)鹽濃度以進(jìn)行陽離子交換層析；(i)將所述稀釋的羥基磷灰石洗脫液上樣至pH范圍約6.0-7.0的陽離子交換柱；(j)使用合適的配制緩沖液從所述陽離子交換柱洗脫P(yáng)AF-AH；(k)在低溫進(jìn)行陽離子交換層析；和(l)在缺少CHAPS的情況下以液體或冷凍形式配制PAF-AH。
            
優(yōu)選地，上述步驟(a)中的溶菌緩沖液是25mM Tris、100mMNaCl、1mM EDTA、20mM CHAPS、pH8.0；在步驟(b)中，將用于陰離子交換層析的上清液在25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0中稀釋3-4倍，所述柱是在25mM Tris、1mM EDTA、50mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0中平衡的Q-Sepharose柱；步驟(c)中使用25mMTris、1mM EDTA、350mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0洗脫所述陰離子交換柱；步驟(d)中直接將步驟(c)的洗脫液上樣至藍(lán)染料親和柱；步驟(e)中用3M NaCl、10mM CHAPS、25mM Tris、pH8.0緩沖液洗脫所述柱；步驟(f)中通過在10mM磷酸鈉、100mM NaCl、10mMCHAPS、pH6.2中稀釋，完成用于羥基磷灰石層析的所述藍(lán)染料洗脫液的稀釋；步驟(g)中使用以10mM磷酸鈉、100mM NaCl、10mM CHAPS平衡的羥基磷灰石柱完成羥基磷灰石層析，使用50mM磷酸鈉、100mMNaCl(含或不含)10mM CHAPS、pH7.5完成洗脫；步驟(h)中通過在pH范圍約6.0-7.0、包含磷酸鈉(含或不含CHAPS)的緩沖液中稀釋，完成用于陽離子交換層析的所述羥基磷灰石洗脫液的稀釋；步驟(i)中用50mM磷酸鈉、(含或不含)10mM CHAPS、pH6.8平衡S Sepharose柱；步驟(j)中用諸如含有0.01％吐溫80的50mM磷酸鉀、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl、pH7.5的配制緩沖液完成洗脫；步驟(k)中于2-8℃完成陽離子交換層析。用于步驟(l)中穩(wěn)定PAF-AH的合適的配制緩沖液的實(shí)例包括50mM磷酸鉀、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl pH7.4(大約值，含或不含吐溫80和或Pluronic F68)或25mM磷酸鉀緩沖液，含有(至少)125mM NaCl、25mM精氨酸和0.01％吐溫80(含或不含約0.1和0.5％的Pluronic F68)。
            
本發(fā)明考慮的用于從大腸桿菌純化酶活性rPAF-AH產(chǎn)物的又一方法包括以下步驟(a)制備在含有Triton X-100的緩沖液中溶菌后產(chǎn)生溶解的rPAF-AH產(chǎn)物上清液的大腸桿菌提取液；(b)稀釋所述上清液，上樣至于約pH8.0平衡的固定化金屬親和交換柱；(c)用包含咪唑的緩沖液從所述固定化金屬親和交換柱洗脫rPAF-AH產(chǎn)物；(d)調(diào)節(jié)鹽濃度，將所述固定化金屬親和交換柱的所述洗脫液上樣至疏水性相互作用柱(HIC#1)；(e)通過降低鹽濃度和/或增加去污劑濃度洗脫所述HIC#1；(f)將所述HIC#1洗脫液滴定至約pH6.4；(g)將所述調(diào)節(jié)的HIC#1洗脫液上樣至于約pH6.4平衡的陽離子交換柱(CEX#1)；(h)用濃度？的氯化鈉洗脫所述CEX#1；(i)用氯化鈉將所述CEX#1洗脫液至約2.0M濃度；(j)將所述調(diào)節(jié)的CEX#1洗脫液上樣至于約pH8.0和約2.0M氯化鈉平衡的疏水性相互作用柱(HIC#2)；(k)通過降低鹽濃度和/或增加去污劑濃度洗脫所述HIC#2；(l)稀釋所述HIC#2洗脫液并調(diào)節(jié)至約pH6.0；(m)將所述調(diào)節(jié)的HIC#2洗脫液上樣至于約pH6.0平衡的陽離子交換柱(CEX#2)；(n)用合適的配制緩沖液從所述CEX#2洗脫所述rPAF-AH產(chǎn)物。
            
優(yōu)選地，上述步驟(a)中的溶菌緩沖液是90mM TRIS、0.125％ TritonX-100、0.6M NaCl、pH8.0，在高壓勻漿器中進(jìn)行溶菌；步驟(b)中將所述上清液在平衡緩沖液(20mM TRIS、0.5M NaCl、0.1％ Triton X-100、pH8.0)中稀釋，將鋅螯合柱(Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia，Uppsala，Sweden)裝柱、用平衡緩沖液平衡、用所述稀釋的上清液上樣、用20mM TRIS、0.5M NaCl、4M尿素、0.1％ Triton X-100、pH8.0洗滌，接著用20mM TRIS、0.5M NaCl、0.02％ Triton X-100、pH8.0洗滌；步驟(c)中使用20mM Tris、50mM咪唑、0.02％ Triton X-100、pH8.0完成洗脫；步驟(d)中將洗脫液調(diào)節(jié)至1mM EDTA和2M NaCl，將Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia)用平衡緩沖液(2.0M NaCl，25mM Tris，0.02％ Triton X-100，pH8.0)平衡、于室溫用步驟(c)的調(diào)節(jié)的洗脫液上樣，用平衡緩沖液洗滌、以30cm/小時(shí)的流速用25mMNaPO4、0.02％ Triton X-100、pH6.5洗滌；步驟(e)中用25mM NaPO4、3％ Triton X-100、pH6.5完成洗脫；步驟(g)中將Macro-Prep High S柱(Bio-Rad Labs，Richmond，CA)用平衡緩沖液(20mM NaPO4、0.02％Triton X-100、pH6.4)平衡、用步驟(f)的調(diào)節(jié)的洗脫液上樣、用平衡緩沖液洗滌、用25mM Tris、0.02％ Triton X-100、pH8.0洗滌；步驟(h)中用25mM Tris、0.02％ Triton X-100、1.3M NaCl、pH8.0完成洗脫；步驟(j)中將Bakerbond Wide Pore Hi-Propyl C3(Baker，Phillipsburg，NJ)用平衡緩沖液(2.0M NaCl、25mM Tris、0.02％ Triton X-100、pH8.0)平衡、用步驟(i)的調(diào)節(jié)洗脫液于室溫上樣、用平衡緩沖液洗滌、以30cm/小時(shí)用25mM Tris、0.02％ Triton X-100、pH8.0洗滌；步驟(k)中用10mMTris、3.0％ Triton X-100、pH8.0完成洗脫；步驟(l)中在平衡緩沖液(20mM琥珀酸鹽、0.1％ PLURONIC F68、pH6.0)中稀釋；步驟(m)中將SP Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱用步驟(l)的平衡緩沖液平衡、用步驟(l)的洗脫液上樣、用平衡緩沖液洗滌；步驟(n)中用50mM NaPO4、0.7M NaCl、0.1％ PLURONIC F68、0.02％吐溫80、pH7.5 。
            
PAF-AH產(chǎn)物可以做為天然細(xì)胞來源的分離物得到或可以化學(xué)合成，但優(yōu)選通過涉及本發(fā)明的原核或真核宿主細(xì)胞的重組程序產(chǎn)生?？紤]了具有陳述于SEQ ID NO8中的氨基酸序列的一部分或全部的PAF-AH產(chǎn)物。特別考慮了缺少陳述于SEQ ID NO8的成熟人PAF-AH氨基酸序列的最多達(dá)前12個(gè)N末端氨基酸的片段，特別是那些具有SEQID NO8的Met46、Ala47或Ala48做為起始N末端氨基酸的片段。亦考慮了其缺少最多達(dá)SEQ ID NO8的氨基酸序列的30個(gè)C末端氨基酸的片段，特別是那些具有Ile429和Leu431做為C末端殘基的片段。再考慮了PAF-AH的變異體或PAF-AH或在SEQ ID NO8的序列中具有選自以下的氨基酸置換的S108A、S273A、D286A、D286N、D296A、D304A、D338A、H351A、H395A、H399A、C67S、C229S、C291S、C334S、C407S、D286A、D286N和D304A。如上所述，本發(fā)明提供了編碼這類片段或變異體片段的多核苷酸(包括DNA)，以及通過使包含這種DNA的宿主細(xì)胞生長而重組產(chǎn)生這類片段或變異體的方法。本文推薦的PAF-AH產(chǎn)物包括編碼SEQ ID NO8的氨基酸殘基Met46至Asn441的DNA的原核多肽表達(dá)產(chǎn)物(命名為rPH.2)和編碼SEQID NO8的氨基酸殘基Met46至Ile429的DNA的原核多肽表達(dá)產(chǎn)物(命名為rPH.9)。例如，與位于翻譯起始密碼子之后的編碼PAF-AH全長成熟序列的DNA的對應(yīng)原核表達(dá)產(chǎn)物相比，rPH.2和rPH.9產(chǎn)物均顯示較小的氨基末端異質(zhì)性。另外，rPH9顯示較高的羧基末端同質(zhì)性(一致性)。預(yù)期使用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞提供可能需要賦予本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物的最佳生物學(xué)活性的翻譯后修飾(例如，豆蔻?；?myristolation)、糖基化、截短、脂化(lipidation)和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)。本發(fā)明的PAF-AH產(chǎn)物可以是全長多肽、片段或變異體。變異體可以包含PAF-AH類似物，其中一個(gè)或多個(gè)規(guī)定的(即，天然編碼的)氨基酸缺失或被置換，或其中添加了一個(gè)或多個(gè)非規(guī)定氨基酸(1)不喪失一種或多種PAF-AH特有的酶活性或免疫學(xué)特性；或(2)特異性地使PAF-AH的特定生物學(xué)活性喪失。可以使用與PAF-AH結(jié)合的蛋白或其它分子以調(diào)節(jié)其活性。
            
本發(fā)明亦考慮對PAF-AH特異性的抗體物質(zhì)(例如，單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR-移植的抗體等等)和其它結(jié)合蛋白。本發(fā)明的具體描述的結(jié)合蛋白是用雜交瘤90G11D和90F2D產(chǎn)生的單克隆抗體，所述雜交瘤分別以保藏號(hào)HB 11724和HB 11725于1994年9月30日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852。本發(fā)明也描述的結(jié)合蛋白是用雜交瘤143A產(chǎn)生的單克隆抗體，該雜交瘤于1995年6月1日保藏于ATCC，保藏號(hào)是HB 11900。使用從血漿分離的PAF-AH、重組PAF-AH、PAF-AH變異體或表達(dá)這種產(chǎn)物的細(xì)胞，可以鑒別特異性地與PAF-AH結(jié)合的蛋白或其它分子(例如，脂類或小分子)。結(jié)合蛋白反過來可以用于免疫組合物以及用于純化PAF-AH，并可以通過已知免疫學(xué)程序用于檢測或定量體液或組織樣本中的PAF-AH。亦考慮了對PAF-AH特異性抗體特異性的抗獨(dú)特型抗體。
            
在本發(fā)明的DNA和氨基酸序列公開內(nèi)容中貢獻(xiàn)的信息的科學(xué)價(jià)值是明顯的。做為實(shí)例的一個(gè)系列，PAF-AH的cDNA序列的知識(shí)使得可以通過DNA/DNA雜交分離編碼PAF-AH和特化(specifying)諸如啟動(dòng)子、操縱基因等等的PAF-AH表達(dá)控制調(diào)節(jié)序列的基因組DNA序列。在本領(lǐng)域嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)條件下使用本發(fā)明的DNA序列進(jìn)行的DNA/DNA雜交程序，有可能預(yù)期使得能夠分離編碼PAF-AH等位變異體、共享PAF-AH的一種或多種生物化學(xué)和/或免疫學(xué)性質(zhì)的其它結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)和與PAF-AH同源的非人類物種蛋白質(zhì)的DNA。本發(fā)明提供的DNA序列信息使得可以通過同源重組或“剔除”策略[參見，例如，Kapecchi，Science，2441288-1292(1989)]，發(fā)展不能表達(dá)功能性PAF-AH酶或表達(dá)變異PAF-AH酶的嚙齒類動(dòng)物。本發(fā)明的多核苷酸當(dāng)適當(dāng)標(biāo)記時(shí)，可以用于檢測細(xì)胞合成PAF-AH的能力的雜交測定中。本發(fā)明的多核苷酸亦可以是用于鑒別PAF-AH基因座中構(gòu)成一種或多種疾病狀態(tài)的基礎(chǔ)的遺傳改變的診斷方法的基礎(chǔ)。本發(fā)明亦使得可以得到與調(diào)節(jié)正常表達(dá)PAF-AH的那些細(xì)胞的PAF-AH表達(dá)相關(guān)的反義多核苷酸。
            
考慮了將本發(fā)明的PAF-AH制劑給予哺乳動(dòng)物受治療者特別是人類以減輕病理炎癥病癥。基于PAF涉及病理炎癥病癥，給予PAF-AH適于例如治療哮喘[Miwa等，J.Clin.Invest.，821983-1991(1988)；Hsieh等，J.Allergy Clin.Immunol.，91650-657(1993)；和Yamashita等，Allergy，4960-63(1994)]、過敏性反應(yīng)[Venable等，見上述]、休克[Venable等，見上述]、再灌注損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血[Lindsberg等(1991)，見上述]、抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[Zarco等，Clin.Exp.Immunol.，88318-323(1992)]、動(dòng)脈粥樣化形成[Handley等，Drug Dev.Res.，7361-375(1986)]、局限性回腸炎[Denizot等，Digestive Diseases and Sciences，37(3)432-437(1992)]、局部缺血性腸壞死/壞死性小腸結(jié)腸炎[Denizot等，見上述和Caplan等，Acta Paediatr.，Suppl.39611-17(1994)]、潰瘍性結(jié)腸炎(Denizot等，見上述)、局部缺血性中風(fēng)[Satoh等，Stroke，231090-1092(1992)]、局部缺血性腦損傷[Lindsberg等，Stroke，211452-1457(1990)和Lindsberg等(1991)，見上述]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[Matsuzaki等，Clinica Chimica Acta，210139-144(1992)]、急性胰腺炎[Kald等，Pancreas，8(4)440-442(1993)]、敗血癥(Kald等，見上述)、急性感染后鏈球菌性腎小球腎炎[Mezzano等，J.Am.Soc.Nephrol.，4235-242(1993)]、由IL-2治療法引起的肺水腫[Rabinovici等，J.Clin.Invest.，891669-1673(1992)]、變應(yīng)性炎癥[Watanabe等，Br.J.Pharmacol.，111123-130(1994)]、局部缺血性腎衰竭[Grino等，Annals of InternalMedicine，121(5)345-347(1994)；早產(chǎn)[Hoffman等，Am.J.ObstetGynecol.，162(2)525-528(1990)和Maki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85728-732(1988)]；成人呼吸窘迫綜合癥[Rabinovici等，J.ApplPhysiol.，74(4)1791-1802(1993)；Matsumoto等，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，19509-515(1992)；和Rodriguez-Roisin等，J.Clin.Invest.，93188-194(1994)]。亦考慮了使用PAF-AH制備物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。本文使用的“治療”包括預(yù)防性和治療性治療。
            
本領(lǐng)域中已描述了許多前述病理病癥的動(dòng)物模型。例如，本文的實(shí)施例16中描述了哮喘和鼻炎的小鼠模型；在Zarco等，見上述中描述了關(guān)節(jié)炎的兔子模型；在Furukawa等，Ped.Res.，34，(2)237-241(1993)和Caplan等，見上述中描述了局部缺血性腸壞死/壞死性小腸結(jié)腸炎的兔子模型；在Lindsberg等，(1990)，見上述描述了中風(fēng)的兔子模型；在Matsuzaki等，見上述中描述了狼瘡的小鼠模型；在Kald等，見上述中描述了急性胰腺炎的大鼠模型；在Rabinovici等，見上述中描述了由IL-2治療法引起的肺水腫的大鼠模型；在Watanabe等，見上述)中描述了變應(yīng)性炎癥的大鼠模型；在Watson等，Transplantation，56(4)1047-1049(1993)中描述了腎同種移植的犬模型；分別在Rabinovici等，見上述和Lellouch-Tubiana，Am.Rev.Respir. Dis.，137948-954(1988)中描述了成人呼吸窘迫綜合癥的大鼠和豚鼠模型。
            
本發(fā)明特別考慮了用于治療對PAF-AH介導(dǎo)的病理病癥易感或患有此病癥的哺乳動(dòng)物的方法中的PAF-AH組合物，包含以足以補(bǔ)充內(nèi)源PAF-AH活性和鈍化所述哺乳動(dòng)物中病理量PAF的量將PAF-AH給予所述哺乳動(dòng)物。
            
本發(fā)明考慮的治療/藥學(xué)組合物包括PAF-AH產(chǎn)物和生理可接受的稀釋劑或載體，亦可以包括具有抗炎癥效應(yīng)的其它藥物。標(biāo)明的劑量將足以補(bǔ)充內(nèi)源PAF-AH活性和鈍化病理量的PAF。關(guān)于一般劑量考慮，參見Remmington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990)。劑量將在約0.1-約1000μg PAF-AH/kg體重之間變化。本發(fā)明的治療組合物可以通過不同途徑給予，取決于欲治療的病理病癥。例如，可以通過靜脈內(nèi)、皮下、口服、栓劑和/或肺途徑給予。
            
對于肺臟的病理病癥，特別標(biāo)明了通過肺途徑給予PAF-AH。考慮用于肺給予的是種類繁多的傳遞裝置，包括，例如噴霧器、計(jì)量給藥吸入器和粉末吸入器，均是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的。在以下描述了通過吸入氣溶膠制劑將各種蛋白傳遞至肺臟和循環(huán)系統(tǒng)，Adjei等，Pharm.Res.，7(6)565-569(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等，J.Cardio.Pharm.，13(Supp.5)s.143-146(1989)(內(nèi)皮縮血管肽-1)；Hubbard等，Annals ofInternal Medicine，III(3)，206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.，841145-1146(1989)(α-1-蛋白酶抑制劑)；Debs等，J.Immunol.，1403482-3488(1933)(重組γ干擾素和腫瘤壞死因子α)；于1994年9月15日公開的專利合作條約(PCT)國際公布號(hào)WO94/20069(重組聚乙二醇化粒細(xì)胞集落刺激因子)。
            
附圖簡要說明在考慮以下詳細(xì)描述以及參考其中附圖時(shí)，本發(fā)明的無數(shù)其它方面和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的
            

            
圖1是含有從人血漿純化的PAF-AH的PVDF膜的照片；圖2是顯示重組人血漿PAF-AH酶活性的圖表。
            
圖3是描繪重組PAF-AH片段及其催化活性的圖解圖示。
            
圖4描繪重組PAF-AH產(chǎn)物rPH.2的質(zhì)譜結(jié)果。
            
圖5描繪重組PAF-AH產(chǎn)物rPH.9的質(zhì)譜結(jié)果。
            
圖6是描繪通過局部給予本發(fā)明的重組PAF-AH阻斷PAF誘導(dǎo)的大鼠足水腫的直方圖。
            
圖7是描繪通過靜脈內(nèi)給予PAF-AH阻斷PAF誘導(dǎo)的大鼠足水腫的直方圖。
            
圖8是顯示PAF-AH阻斷PAF誘導(dǎo)的水腫而不阻斷酵母聚糖A誘導(dǎo)的水腫的直方圖。
            
圖9A和9B展示大鼠足水腫中PAF-AH的抗炎活性的劑量反應(yīng)結(jié)果。
            
圖10A和10B展示的結(jié)果表明隨時(shí)間進(jìn)程的單劑量PAF-AH的體內(nèi)效力。
            
圖11是代表PAF-AH在大鼠循環(huán)中的藥物動(dòng)力學(xué)的曲線圖；圖12是顯示大鼠足水腫中PAF-AH的抗炎效果與效果較差的PAF拮抗劑的比較的直方圖。
            
圖13展示的結(jié)果表明，PAF-AH中和來自HIV-1感染和激活的單核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的凋亡效應(yīng)。
            
發(fā)明詳述以下實(shí)施例描繪了本發(fā)明。實(shí)施例1展示了從人血漿純化PAF-AH的新方法。實(shí)施例2描述了純化的人血漿PAF-AH的氨基酸微序列。在實(shí)施例3中描述了編碼人血漿PAF-AH的全長cDNA的克隆。在實(shí)施例4中描述了鑒別人血漿PAF-AH基因的推測剪接變異體。在實(shí)施例5中描述了編碼人血漿PAF-AH的基因組序列的克隆。實(shí)施例6描述了與人血漿PAF-AH cDNA同源的犬、鼠、牛、雞、嚙齒類動(dòng)物和獼猴cDNA的克隆。實(shí)施例7展示了檢測的結(jié)果，該結(jié)果證明在COS7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的重組PAF-AH的酶活性。實(shí)施例8描述了在大腸桿菌、啤酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)全長、截短和嵌合的人PAF-AHDNA。實(shí)施例9展示了從大腸桿菌純化重組PAF-AH的方案和確認(rèn)其酶活性的測定。實(shí)施例10描述了各種重組PAF-AH產(chǎn)物，包括氨基酸置換類似物和氨基和羧基截短產(chǎn)物，并且描述了證明從血漿分離的天然PAF-AH是糖基化的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)施例11中展示了用于人血漿PAF-AHRNA在各種組織和細(xì)胞系中表達(dá)的RNA印跡測定的結(jié)果，在實(shí)施例12中展示了原位雜交的結(jié)果。實(shí)施例13描述了開發(fā)對人血漿PAF-AH特異性的單克隆和多克隆抗體。實(shí)施例14、15、16、17、18和19分別描述了給予本發(fā)明的重組PAF-AH產(chǎn)物對動(dòng)物模型中的急性炎癥、胸膜炎、哮喘、壞死性小腸結(jié)腸炎、成人呼吸窘迫綜合癥和胰腺炎的體內(nèi)治療效果。實(shí)施例20描述了重組PAF-AH產(chǎn)物對與HIV感染相關(guān)的神經(jīng)毒性的體外影響。實(shí)施例21展示了表現(xiàn)出缺乏PAF-AH活性的人類患者血清免疫測定的結(jié)果，描述了鑒別明顯地對所述缺乏負(fù)責(zé)的患者中的基因損傷。
            
實(shí)施例1為提供氨基酸測序的材料，從人血漿純化PAF-AH。A.優(yōu)化純化條件起初，使用磷鎢酸鹽從血漿沉淀低密度脂蛋白(LDL)顆粒，溶解于0.1％吐溫20中，按照Stafforini等(1987)，見上述的方法在DEAE柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行層析，但是所述DEAE柱PAF-AH活性的不一致的洗脫，需要再評(píng)價(jià)溶解和后續(xù)純化條件。
            
通過離心和凝膠過濾層析，評(píng)價(jià)吐溫20、CHAPS(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL)辛基葡糖苷溶解LDL顆粒的能力。CHAPS比吐溫20多提供了25％溶解活性的回收，比辛基葡糖苷多提供了300％的回收。然后將用10mM CHAPS溶解的LDL沉淀使用含有1mM CHAPS的緩沖液在DEAE Sepharose Fast Flow柱(陰離子交換柱；Pharmacia)上進(jìn)行分級(jí)分離，以提供部分純化的PAF-AH的大合并液(“DEAE合并液”)以評(píng)價(jià)其它的柱。
            
將DEAE合并液做為原材料以測試用于進(jìn)一步純化PAF-AH活性的各種層析柱。測試的柱包括Blue Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，染料配體親和柱；S-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，陽離子交換柱；銅螯合Sepharose(Pharmacia)，金屬配體親和柱； Fractogel S(EMSeparations，Gibbstown，NJ)，陽離子交換柱；和Sephacryl-200(Pharmacia)，凝膠過濾柱。當(dāng)在1mM CHAPS中操作時(shí)，這些層析程序產(chǎn)生了低、不能令人滿意的純化水平。后續(xù)在1mM CHAPS中的Sephacryl S-200凝膠過濾層析產(chǎn)生了在很寬大小范圍、而不是預(yù)期的44kDa大致大小洗脫的酶活性分部收集液。綜合考慮，這些結(jié)果表明LDL蛋白質(zhì)在溶液中凝聚。
            
因此通過分析型凝膠過濾層析，評(píng)價(jià)不同的LDL樣品的PAF-AF活性的凝聚。在用含有1mM CHAPS的緩沖液平衡的Superose 12(Pharmacia)上分析源自DEAE合并液和新鮮溶解的LDL沉淀的樣品。這二種樣品均在非常寬闊的分子量范圍內(nèi)洗脫，洗脫的絕大多數(shù)活性超過150kDa。當(dāng)在用10mM CHAPS平衡的Superose 12上分析所述樣品時(shí)，大量的活性在接近44kDa洗脫，與對PAF-AH活性預(yù)期的一樣。但是，所述樣品含有一些高分子量區(qū)的PAF-AH活性，對應(yīng)于凝聚物。
            
其它樣品當(dāng)接著通過凝膠過濾檢測時(shí)僅僅在約44kDa范圍洗脫P(yáng)AF-AH活性。這些樣品是在存在0.5M NaCl下溶解于10mM CHAPS中的LDL沉淀和在從DEAE柱洗脫后調(diào)整至10mM CHAPS的新鮮DEAE合并液。這些數(shù)據(jù)表明，至少需要10mM CHAPS以保持非凝聚的PAF-AH。在DEAE上層析后但在后續(xù)層析步驟之前，將CHAPS濃度從1mM增加至10mM導(dǎo)致純化的顯著差異。例如，PAF-AH在S-SepharoseFast Flow上的純化程度從2倍增加至10倍。在1mM CHAPS中PAF-AH活性與Blue Sepharose Fast Flow柱不可逆地結(jié)合，但是該柱在10mMCHAPS中提供了最高純化水平。預(yù)先加入10mM CHAPS未改善DEAE層析。
            
在Blue Sepharose Fast Flow柱之后在銅螯合Sepharose上的層析將PAF-AH活性濃縮15倍。亦確定了可以從還原性SDS聚丙烯酰胺凝膠回收PAF-AH活性，只要不將樣品煮沸。從銅螯合Sepharose柱洗脫的材料的活性當(dāng)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，與該凝膠銀染時(shí)的主蛋白帶一致。B.PAF-AH純化程序用于純化PAF-AH以進(jìn)行氨基酸測序的新方法因此包括以下在4℃進(jìn)行的步驟。將人血漿分成在Nalgene瓶中的900ml等分樣品，調(diào)整至pH8.6。然后通過加入90ml 3.85％磷鎢酸鈉，然后加入23ml 2MMgCl2沉淀LDL顆粒。然后于3600g將血漿離心15分鐘。將沉淀再懸浮于800ml 0.2％檸檬酸鈉中。通過加入10g NaCl和24ml 2M MgCl2再次沉淀LDL。通過于3600g離心15分鐘沉淀LDL顆粒。重復(fù)這種洗滌二次。然后將沉淀冷凍于-20C°。將源自5升血漿的LDL顆粒再懸浮于5升緩沖液A(25mM Tris-HCl，10mM CHAPS，pH7.5)中并攪拌過夜。將溶解的LDL顆粒于3600g離心1.5小時(shí)。合并上清液，用Whatman 113濾紙過濾除去任何殘留的固體。將溶解的LDL上清液上樣至用緩沖液B(25mM Tris-HCl，1mM CHAPS，pH7.5)平衡的DEAE Sepharose FastFlow柱(11cm×10cm；1升樹脂體積；80ml/分鐘)。用緩沖液B洗滌該柱直至吸收回至基線。用8升0-0.5M NaCl梯度洗脫蛋白，收集480ml分部收集液。該步驟對于得到與以下的Blue Sepharose Fast Flow柱的結(jié)合是必需的。基本上通過實(shí)施例4中描述的方法檢測分部收集液的乙酰水解酶活性。
            
合并活性分部收集液，加入足量的CHAPS使合并液為約10mMCHAPS。以4ml/分鐘將該DEAE合并液過夜上樣至用含有0.5M NaCl的緩沖液A平衡的Blue Sepharose Fast Flow柱(5cm×10cm；200ml床體積)。用平衡緩沖液以16ml/分鐘洗滌該柱，直至吸收回至基線。用含有0.5M KSCN(離液鹽)的緩沖液A以16ml/分鐘臺(tái)階洗脫(step elute)PAF-AH活性，收集于50ml分部收集液。該步驟產(chǎn)生了超過1000倍的純化。合并活性分部收集液，使用1M Tris-HCl pH8.0將合并液調(diào)整至pH8.0。將Blue Sepharose Fast Flow層析的活性合并液上樣至在緩沖液C[25mM Tris-HCl，10mM CHAPS，0.5M NaCl，pH8.0(pH7.5亦可以)]中平衡的銅螯合Sepharose柱(2.5cm×2cm；10ml床體積；4ml/分鐘)，用50ml緩沖液C洗滌該柱。用100ml緩沖液C中的50mM咪唑洗脫P(yáng)AF-AH活性，收集于10ml分部收集液中。合并含有PAF-AH活性的分部收集液，對緩沖液A透析。除了提供15倍PAF-AH活性濃縮之外，銅螯合Sepharose柱純化效果很小。于37℃在50mM DTT中將銅螯合Sepharose合并液還原15分鐘，上樣至0.75mm、7.5％聚丙烯酰胺凝膠。每隔0.5cm切割膠條，將膠條置于含有200μl 25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、150mM NaCl的一次性微量離心管中。將膠條磨碎，于4℃溫育過夜。然后檢測每個(gè)膠條的上清液的PAF-AH活性，以確定SDS-PAGE上的哪個(gè)蛋白條帶具有PAF-AH活性。在約44kDa條帶中發(fā)現(xiàn)PAF-AH活性。將另一重復(fù)凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)，用考馬斯藍(lán)染色。PVDF膜的照片展示于圖1中。
            
如以下表1中所展示的，從5升人血漿純化2×106倍產(chǎn)生約200μgPAF-AH。與之對照，Stafforini等(1987)，見上述描述了PAF-AH活性純化了3×104倍。
            
表1樣品體積   活性總   蛋白 比活 活性回收％  純化倍數(shù)(ml)  (cpm×   活性 濃度 (cpm×106)   (cmp×  (mg/ml)106)109)臺(tái)階   累計(jì)臺(tái)階累計(jì)血漿500023  116   62  0.37   100100  1   1LDL 450022  971.7612 84 84   33  33DEAE420049  207   1.0846 212178  3.7 124藍(lán)  165 881 140.0254200  70 126  11901.5×105銅  12  12700   152   0.1582200  104131  1.5 2.2×105SDS---- --- ---   --- ---------  ～102.2×106PAGE總之，以下步驟對用于微量測序的血漿PAF-AH的成功純化是獨(dú)特和關(guān)鍵的(1)在10mM CHAPS中溶解和層析，(2)在諸如BlueSepharose Fast Flow的藍(lán)配體親和柱上層析；(3)在諸如銅螯合Sepharose的銅配體親和柱上層析，和(4)從SDS-PAGE洗脫P(yáng)AF-AH。
            
實(shí)施例2對于氨基酸測序，從實(shí)施例1中描述的含有PAF-AH的PVDF膜上切下約44kDa蛋白條帶，使用Applied Biosystems 473A蛋白測序儀測序。對應(yīng)于PAF-AH活性的約44kDa蛋白條帶的N末端序列分析表明，該條帶含有二個(gè)主序列和二個(gè)次序列。二個(gè)主序列的比例是1∶1，因此難以解釋測序數(shù)據(jù)。
            
為區(qū)分已在SDS凝膠上分離的二個(gè)主蛋白的序列，將另一重復(fù)的含有約44kDa條帶的PVDF膜切為二半，分別將膜的上半部分和下半部分進(jìn)行測序。
            
膜的下半部分得到的N末端序列是SEQ ID NO1FKDLGEENFKALVLIAF對蛋白數(shù)據(jù)庫的檢索揭示該序列是人血清白蛋白的片段。亦對同一PVDF膜的上半部分進(jìn)行了測序，確定的N末端氨基酸序列是SEQ ID NO2IQVLMAAASFGQTKIP該序列與檢索的數(shù)據(jù)庫中的任何蛋白都不相同，并且不同于以下N末端氨基酸序列SEQ ID NO3MKPLVVFVLGG該序列是在Stafforini等(1993)，見上述中報(bào)道的紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)PAF-AH的序列。如以下實(shí)施例3中所述，利用該新序列(SEQ ID NO2)進(jìn)行人血漿PAF-AH的cDNA克隆。
            
實(shí)施例3從巨噬細(xì)胞cDNA文庫分離編碼人血漿PAF-AH的全長克隆。A.構(gòu)建巨噬細(xì)胞cDNA文庫從外周血單核細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞收獲Poly A+RNA。使用InvitrogenCopy試劑盒(San Diego，CA)產(chǎn)生雙鏈、平端cDNA，在插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen)之前將BstXI接頭連接至該cDNA。通過電穿孔將產(chǎn)生的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌菌株XL-1藍(lán)。以約3000菌落/瓊脂糖平板的密度將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在總共978個(gè)平板上鋪平板。將獨(dú)立從每個(gè)平板分離的質(zhì)粒DNA保持于單獨(dú)的庫中，亦將它們合并為代表300,000克隆的較大的庫。B.通過PCR篩選文庫通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，利用基于在實(shí)施例2中描述的新N末端氨基酸序列的簡并反義寡核苷酸PRC引物，篩選巨噬細(xì)胞文庫。該引物的序列以IUPAC命名陳述于下，其中“I”是肌苷。
            
SEQ ID NO45’ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA3’使用Wada等，Nuc.Acids Res.，19S1981-1986(1991)的密碼子選擇表，選擇位于該引物每個(gè)密碼子的第三個(gè)位置的核苷酸。將此引物與對位于pRc/CMV克隆位點(diǎn)側(cè)翼的或者SP6或者T7啟動(dòng)子序列特異性的引物聯(lián)合使用，以篩選300,000個(gè)克隆的巨噬細(xì)胞文庫庫。所有的PCR反應(yīng)均含有100ng模板cDNA、每種引物各1μg、每種dNTP各0.125mM、10mM Tris-HCl pH8.4、50mM MgCl2和2.5單位Taq聚合酶。起始變性步驟為94℃ 4分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)周期的擴(kuò)增94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘和72℃ 2分鐘。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物克隆入pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)，通過雙脫氧鏈終止法測定其核苷酸序列。該P(yáng)CR產(chǎn)物具有由新肽鏈預(yù)測的序列，對應(yīng)于SEQ ID NO7的核苷酸1-331。
            
然后為鑒別全長克隆，設(shè)計(jì)陳述于以下的對上述克隆的PCR片段特異性的PCR引物。
            
有義引物(SEQ ID NO5)5’TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG3’反義引物(SEQ ID NO6)5’CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC3’如上述進(jìn)行利用所述引物的PCR反應(yīng)，以首先篩選300,000個(gè)克隆的cDNA庫，然后篩選約3000個(gè)克隆的較小庫的適當(dāng)亞組。然后使用產(chǎn)生預(yù)期大小PCR產(chǎn)物的三個(gè)3000個(gè)克隆的庫轉(zhuǎn)化細(xì)菌。C.通過雜交篩選文庫使用原始克隆的PCR片段做為探針，通過雜交接著篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的DNA。將菌落印跡至硝酸纖維素上，在50％甲酰胺、0.75M氯化鈉、0.075M檸檬酸鈉、0.05M磷酸鈉pH6.5、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％Ficoll、1％牛血清白蛋白和50ng/ml超聲處理鮭精DNA中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。通過隨機(jī)六聚物引發(fā)標(biāo)記雜交探針。于42℃雜交過夜后，于42℃在0.03M氯化鈉、3mM檸檬酸鈉、0.1％ SDS中徹底洗滌印跡。測定10個(gè)雜交克隆的核苷酸序列。其中一個(gè)克隆sAH406-3具有由從人血漿純化的PAF-AH活性的原始肽序列預(yù)測的序列。人血漿PAF-AH的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別陳述于SEQ ID NO7和8。
            
克隆sAH406-3含有具有編碼預(yù)測的441個(gè)氨基酸的蛋白的可讀框的1.52kb插入片段。在氨基末端，通過蛋白微測序鑒別了在N末端氨基酸(SEQ ID NO8的位置42的異亮氨酸)之前的41個(gè)殘基的相對疏水性區(qū)段。因此該被編碼的蛋白或者具有長信號(hào)序列或信號(hào)序列加上被酶切產(chǎn)生成熟功能性酶的另一個(gè)肽。存在信號(hào)肽是分泌蛋白的一個(gè)特征。另外，由克隆sAH406-3編碼的蛋白質(zhì)包括共有GxSxG基元(SEQ IDNO8的氨基酸271-275)，據(jù)信該基元含有所有已知的哺乳動(dòng)物脂酶、微生物脂酶和絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)絲氨酸。參見Chapus等，Biochimie，701223-1224(1988)和Brenner，Nature，334528-530(1988)。
            
以下表2是從SEQ ID NO8推測的本發(fā)明的人血漿PAF-AH氨基酸組成與Stafforini等(1987)，見上述號(hào)稱純化的材料的氨基酸組成的比較。
            
表2克隆sAH406-3Stafforini等Ala26  24Asp和Asn   48  37Cys5   14Glu和Gln   36  42Phe22  12Gly29  58His13  24Ile31  17Lys26  50Leu40  26Met10  7Pro15  11Arg18  16Ser27  36Thr20  15Val13  14Trp7   未確定Tyr14  13本發(fā)明的人血漿PAF-AH成熟形式的氨基酸組成與號(hào)稱為人血漿PAF-AH的先前純化的材料的氨基酸組成區(qū)別明顯。
            
當(dāng)嘗試將Hattori等(見上述)的牛腦細(xì)胞質(zhì)PAF-AH的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列與本發(fā)明的人血漿PAF-AH的核苷酸和氨基酸序列對比時(shí)，未觀察到序列中有顯著的結(jié)構(gòu)類似性。
            
實(shí)施例4當(dāng)使用與PAF-AH cDNA的5’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO7的核苷酸31-52)和跨越位于PAF-AH cDNA的3’端的翻譯終止密碼子的區(qū)(SEQID NO7的核苷酸1465-1487)雜交的引物、對巨噬細(xì)胞和受刺激的PBMC的cDNA進(jìn)行PCR時(shí)，檢測到人PAF-AH基因的推測剪接變異體。所述PCR反應(yīng)在凝膠上產(chǎn)生了二個(gè)條帶，一個(gè)條帶對應(yīng)于實(shí)施例3的PAF-AH cDNA的預(yù)期大小，另一條帶則短約100bp。對這二個(gè)條帶的測序揭示，較大的條帶是實(shí)施例3的PAF-AH cDNA，而較短的條帶缺少編碼血漿PAF-AH推測信號(hào)和原肽序列的PAF-AH序列的外顯子2(下述實(shí)施例5)。在較短的克隆中存在預(yù)期的催化三聯(lián)體和所有的半胱氨酸，因此由該克隆編碼的蛋白質(zhì)的生化活性有可能與血漿酶的生化活性相當(dāng)。
            
為開始評(píng)價(jià)預(yù)期編碼細(xì)胞質(zhì)活性酶的PAF-AH剪接變異體的生物學(xué)相關(guān)性，通過RNA酶保護(hù)檢測這二種形式在血液單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞中的相對豐度。在新鮮分離的單核細(xì)胞中這二種信息均不存在，但在單核細(xì)胞體外分化成為巨噬細(xì)胞的第2天發(fā)現(xiàn)這二種信息，在培養(yǎng)的6天持續(xù)存在。在分化期中這二種信息的數(shù)量大致相同。與之相反，神經(jīng)組織的類似分析揭示，僅表達(dá)預(yù)期編碼全長胞外形式PAF-AH的全長信息。
            
實(shí)施例5亦分離了基因組人血漿PAF-AH序列。通過在嚴(yán)格條件下由DNA雜交分離含有人基因組DNA的λ和P1噬菌體克隆，測定了該P(yáng)AF-AH基因的結(jié)構(gòu)。使用設(shè)計(jì)在cDNA克隆sAH406-3中以規(guī)則間隔退火的引物，亞克隆噬菌體克隆的片段并測序。另外，使用設(shè)計(jì)退火至外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子的新測序引物，對跨越外顯子-內(nèi)含子邊界倒退測序以確認(rèn)所述序列。外顯子/內(nèi)含子邊界定義為基因組和cDNA序列分岐的點(diǎn)。這些分析揭示，人PAF-AH由12個(gè)外顯子組成。
            
從在λFIX(Stratagene)中構(gòu)建的男性胎兒胎盤文庫分離外顯子1、2、3、4、5、6以及外顯示7的一部分。將噬斑印跡至硝酸纖維素上，在50％甲酰胺、0.75M氯化鈉、75mM檸檬酸鈉、50mM磷酸鈉(pH6.5)、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％ Ficoll、1％牛血清白蛋白和50ng/ml超聲處理鮭精DNA中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。用于鑒別含有外顯子2-6和7的一部分的噬菌體克隆的雜交探針由整個(gè)cDNA克隆sAH 406-3組成。使用源自所述cDNA克隆的5’端片段(SEQ ID NO7的核苷酸1-312)鑒別含有外顯子1的克隆。這二種探針均用32P通過六聚物隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記。于42℃雜交過夜后，在30mM氯化鈉、3mM檸檬酸鈉、0.1％ SDS中于42℃徹底洗滌印跡。外顯子1、2、3、4、5和6的DNA序列以及部分周圍內(nèi)含子序列分別陳述于SEQ ID NO9、10、11、12、13和14中。
            
從人P1基因組文庫分離的P1克隆，亞克隆外顯子7的剩余部分以及外顯子8、9、10、11和12。將P1噬斑印跡至硝酸纖維素上，在0.75M氯化鈉、50mM磷酸鈉(pH7.4)、5mM EDTA、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％Ficoll、1％牛血清白蛋白、0.5％ SDS和0.1mg/ml總?cè)薉NA中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。用32P通過六聚物隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記的雜交探針，由源自上述分離的λ克隆的3’端的基因組DNA的2.6kb EcoRI片段組成。該片段含有存在于所述噬菌體克隆上的外顯子6和的外顯子7的一部分。于65℃雜交過夜后，如上述洗滌印跡。外顯子7、8、9、10、11和12的DNA序列以及部分周圍內(nèi)含子序列分別陳述于SEQ ID NO15、16、17、18、19和20中。
            
實(shí)施例6從小鼠、犬、牛和雞脾臟cDNA文庫分離全長血漿PAF-AH cDNA克隆，從大鼠胸腺cDNA文庫分離一個(gè)部分嚙齒類克隆。通過與人cDNA低嚴(yán)格性雜交鑒別所述克隆(雜交條件與上述實(shí)施例5中對外顯子1-6描述的相同，除了使用了20％甲酰胺而不是50％甲酰胺)。使用人PAF-AH sAH406-3cDNA克隆的1kb HindIII片段(SEQ ID NO7的核苷酸309-1322)做為探針。另外，使用基于SEQ ID NO7的核苷酸285-303和851-867的引物，通過PCR從獼猴腦cDNA分離一個(gè)部分猴克隆。小鼠、犬、牛、雞、大鼠和獼猴cDNA克隆的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別陳述于SEQ ID NO21、22、23、24、25和26。
            
所述cDNA克隆的推導(dǎo)的氨基酸序列與人cDNA克隆的比較產(chǎn)生了氨基酸相同性百分比，陳述于以下表3中。
            
表3人狗小鼠牛雞狗8010064 8250小鼠  6664 1006447猴9282 69 8052大鼠  7469 82 6955牛8282 64 100   50雞5050 47 50100在所有的序列中約38％的殘基是完全保守的。差異最大的區(qū)域位于氨基末端(含有信號(hào)序列)和在實(shí)施例10中顯示為對酶活性不關(guān)鍵的羧基末端。在神經(jīng)脂酶和其它酯酶中發(fā)現(xiàn)的Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly基元(SEQ ID NO27)在牛、犬、小鼠、大鼠和雞PAF-AH中是保守的。該基元中心的絲氨酸做為這些酶的活性位點(diǎn)親核體起作用?；钚晕稽c(diǎn)(實(shí)施例10A)的推測的夭冬氨酸和組氨酸組分亦是保守的。本發(fā)明的人血漿PAF-AH因此看起來利用了催化三聯(lián)體，可能采取了神經(jīng)脂酶的α/β水解酶構(gòu)象，盡管它不表現(xiàn)與所述脂酶的其它序列同源性。
            
另外，預(yù)期人血漿PAF-AH具有一個(gè)介導(dǎo)其與血漿的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白顆粒特異性相互作用的區(qū)。與這些顆粒的相互作用可以由所述分子的N末端一半介導(dǎo)，這一半具有一大段種間高度保守的氨基酸，但不具有所述酶的催化三聯(lián)體。
            
實(shí)施例7為確定人血漿PAF-AH cDNA克隆sAH406-3(實(shí)施例3)是否編碼具有PAF-AH活性的蛋白質(zhì)，在COS7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)pRc/CMV表達(dá)構(gòu)建物。通過DEAE葡聚糖方法轉(zhuǎn)染3天后，檢測COS細(xì)胞培養(yǎng)基的PAF-AH活性。
            
以每60mm組織培養(yǎng)平皿300,000細(xì)胞的密度接種細(xì)胞。次日，將所述細(xì)胞在含有0.5mg/ml DEAE葡聚糖、0.1mM氯喹和5-10μg質(zhì)粒DNA的DMEM中培養(yǎng)2小時(shí)。然后將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水中的10％DMSO處理1分鐘，用培養(yǎng)基洗滌，在含有10％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，所述胎牛血清預(yù)先用二異丙基氟磷酸(DFP)處理以鈍化內(nèi)源牛血清PAF-AH。培養(yǎng)3天后，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基的PAF-AH活性。在存在或不存在或者10mM EDTA或者1mM DFP的情況下進(jìn)行檢測，以確定所述重組酶是否是鈣依賴性的、是否被Stafforini等(1987)(見上述)對血漿PAF-AH先前描述的絲氨酸酯酶抑制劑DFP抑制。陰性對照包括用或者缺少插入片段或者具有反向的sAH406-3插入片段的pRc/CMV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
            
采用以下改良，通過Stafforini等(1990)(見上述)的方法測定轉(zhuǎn)染上清液中的PAF-AH活性。簡言之，通過測定3H-乙酸從[乙酰-3H]PAF(NewEngland Nuclear，Boston，MA)的水解測定PAF-AH的活性。通過在十八烷基硅膠柱體(Baker Research Products，Phillipsburg，PA)上的反相柱層析，從標(biāo)記的底物分離水溶性游離的3H-乙酸。使用10μl 0.1M Hepes緩沖液中的轉(zhuǎn)染上清液、pH7.2，在50μl的反應(yīng)體積內(nèi)進(jìn)行檢測。每次反應(yīng)使用總共50皮摩爾的底物，比例為1∶5標(biāo)記非標(biāo)記PAF。于37℃使反應(yīng)物溫育30分鐘，通過加入40μl 10M乙酸終止反應(yīng)。然后通過所述十八烷基硅膠柱洗滌該溶液，該柱然后用0.1M乙酸鈉清洗。然后收集每個(gè)樣品的水性洗脫液，在液閃計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)1分鐘。以計(jì)數(shù)/分鐘表示酶活性。
            
如圖2中所示，用sAH406-3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基具有比本底高4倍的PAF-AH活性。該活性不受存在EDTA的影響，但被1mM DFP消除。這些觀察證實(shí)克隆sAH406-3編碼與人血漿酶PAF-AH一致的活性。
            
實(shí)施例8通過重組方法，在大腸桿菌和酵母中表達(dá)并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)全長和各種截短的人血漿PAF-AH DNA和嵌合小鼠-人PAF-AH DNA。A.在大腸桿菌中表達(dá)使用PCR從克隆sAH406-3產(chǎn)生人血漿PAF-AH cDNA的蛋白質(zhì)編碼片段，其易于亞克隆入大腸桿菌表達(dá)載體。該亞克隆的區(qū)段開始于所述人基因的5’端編碼Ile42的密碼子(SEQ ID NO8)，該殘基是從人血漿純化的酶的N末端殘基。在該構(gòu)建物中包括了該基因直至天然終止密碼子的剩余部分。使用的5’有義PCR引物是SEQ ID NO285’TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG3’，具有一個(gè)XbaI克隆位點(diǎn)和一個(gè)翻譯起始密碼子(下劃線)。使用的3’反義引物是SEQ ID NO295’ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG3’并且包含sAH406-3的終止密碼子，具有一個(gè)EcoRV克隆位點(diǎn)。基本上如實(shí)施例3中所述進(jìn)行PCR反應(yīng)。用XbaI和EcoRV消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，亞克隆入在緊靠克隆位點(diǎn)上游具有Trp啟動(dòng)子的pBR322載體[deBoer等，PNAS，8021-25(1983)]。用該表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL-1藍(lán)，在含有100μg/ml羧芐青霉素的L培養(yǎng)液中培養(yǎng)。沉淀過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體，再懸浮于含有50mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl、10mM CHAPS、1mMEDTA、100μg/ml溶菌酶和0.05胰蛋白酶抑制單位(TIU)/ml的抑酶肽的溶菌緩沖液中。在冰上溫育1小時(shí)和超聲處理2分鐘后，通過實(shí)施例4中描述的方法檢測溶菌液的PAF-AH活性。用該表達(dá)構(gòu)建物(命名為trpAH)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生了具有PAF-AH活性的產(chǎn)物。參見實(shí)施例9中的表6。
            
亦使用了包括其它三種啟動(dòng)子即tacII啟動(dòng)子(deBoer，見上述)、源自鼠傷寒沙門氏菌的阿拉伯糖(ara)B啟動(dòng)子[Horwitz等，Gene，14309-319(1981)]、噬菌體T7啟動(dòng)子的構(gòu)建物，驅(qū)動(dòng)人PAF-AH序列在大腸桿菌中表達(dá)。在質(zhì)粒pUC19(New England Biolabs，MA)中組裝包含Trp啟動(dòng)子(pUC trp AH)、tacII啟動(dòng)子(pUC tac AH)和araB啟動(dòng)子(pUCara AH)的構(gòu)建物，在質(zhì)粒pET15B(Novagen，Madison，WI)中組裝包含T7啟動(dòng)子(pET AH)的構(gòu)建物。亦在pET15B中組裝由融合至T7啟動(dòng)子區(qū)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的araB啟動(dòng)子組成的含有雜種啟動(dòng)子的構(gòu)建物pHAB/PH。所有的大腸桿菌構(gòu)建物均產(chǎn)生了在20-50U/ml/OD600范圍內(nèi)的PAF-AH活性。這種活性對應(yīng)于≥1％總細(xì)胞蛋白的總重組蛋白量。
            
亦評(píng)價(jià)了產(chǎn)生具有延伸的氨基末端的PAF-AH的幾種大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建物。通過氨基酸測序，天然血漿PAF-AH的N末端鑒別為Ile42(實(shí)施例2)。但是，Ile42上游緊接的序列與在信號(hào)序列切割位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的氨基酸不符合[即未遵循“-3-1-原則”，因?yàn)樵谖恢?1未發(fā)現(xiàn)賴氨酸；參見von Heijne，Nuc.Acids Res.，144683-4690(1986)]。推定由細(xì)胞分泌系統(tǒng)識(shí)別一個(gè)更加經(jīng)典的信號(hào)序列(M1-A17或M1-P21)，然后進(jìn)行內(nèi)切蛋白酶切割。改造起始于起始甲硫氨酸的整個(gè)PAF-AH編碼序列(SEQ IDNO7的核苷酸162-1487)，以使用trp啟動(dòng)子在大腸桿菌中表達(dá)。如表4中所示，該構(gòu)建物產(chǎn)生活性PAF-AH，但是表達(dá)僅為起始于Ile42的原始構(gòu)建物水平的約1/50。另一起始于Val18的表達(dá)構(gòu)建物(SEQ ID NO7的核苷酸213-1487)產(chǎn)生了原始構(gòu)建物水平的1/3的活性PAF-AH。這些結(jié)果暗示，氨基末端延伸對大腸桿菌中產(chǎn)生的重組PAF-AH活性不是關(guān)鍵的或必需的。
            
表4PAF-AH活性(U/ml/OD600)構(gòu)建物   溶菌液   培養(yǎng)基pUC trp AH(Ile42N末端)   177.70.030pUC trp AH Met13.1  0.003pUC tp AH Val1854.6 0.033使用低拷貝數(shù)質(zhì)粒和可以通過將阿拉伯糖加入培養(yǎng)基誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，亦在大腸桿菌中產(chǎn)生了截短的重組人PAF-AH產(chǎn)物。一種這種N末端截短的PAF-AH產(chǎn)物是編碼由全長PAF-AH cDNA編碼的多肽的氨基酸殘基Met46-Asn441的DNA的重組表達(dá)產(chǎn)物，命名為rPH.2。用于在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)rPH.2的質(zhì)粒是pBAR2/PH.2，是基于pBR322的質(zhì)粒，攜帶(1)編碼起始于位置46的甲硫氨酸密碼子的人PAF-AH的SEQ IDNO7的核苷酸297-1487，(2)源自鼠傷寒沙門氏菌的阿拉伯糖操縱子的araB-C啟動(dòng)子和araC基因，(3)源自噬菌體T7的轉(zhuǎn)錄終止序列，和(4)源自噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)。
            
具體地說，pBAR2/PH.2包括以下DNA區(qū)段(1)從位置1994的破壞的AatII位點(diǎn)至位于核苷酸6274的EcoRI位點(diǎn)，含有復(fù)制起點(diǎn)和源自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322編碼或者氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因的載體序列；(2)從位于位置6274的EcoRI位點(diǎn)至位于位置131的XbaI位點(diǎn)，源自鼠傷寒沙門氏菌阿拉伯糖操縱子(Genbank保藏號(hào)M11045，M11046，M11047，J01797)的DNA；(3)從位于位置131的XbaI位點(diǎn)至位于位置170的NcoI位點(diǎn)，含有源自pET-21b(Novagen，Madison，WI)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的DNA；(4)從位于位置170的NcoI位點(diǎn)至位于位置1363的XhoI位點(diǎn)，人PAF-AH cDNA序列；和(5)從位于位置1363的XhoI位點(diǎn)至位于位置1993的破壞的AatII位點(diǎn)，源自pET-21b(Novagen)、含有源自噬菌體T7的轉(zhuǎn)錄終止序列和源自噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。
            
另一命名為rPH.9的PAF-AH產(chǎn)物是編碼由全長PAF-AH cDNA(SEQ ID NO8)編碼的多肽的氨基酸殘基Met46至Ile429的DNA的表達(dá)產(chǎn)物。將編碼rPH.9的DNA插入用于在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)rPH.2的同一載體。該質(zhì)粒命名為pBAR2/PH.9，具體地包括以下DNA區(qū)段(1)從載體序列的位于位置1958的破壞的AatII位點(diǎn)至位于核苷酸6239的EcoRI位點(diǎn)，含有復(fù)制起點(diǎn)和源自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322編碼或者氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因；(2)從位于位置6239的EcoRI位點(diǎn)至位于位置131的XbaI位點(diǎn)，源自鼠傷寒沙門氏菌阿拉伯糖操縱子(Genbank保藏號(hào)M11045，M11046，M11047，J01797)的DNA；(3)從位于位置131的XbaI位點(diǎn)至位于位置170的NcoI位點(diǎn)，含有源自pET-21b(Novagen，Madison，WI)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的DNA；(4)從位于位置170的NcoI位點(diǎn)至位于位置1328的XhoI位點(diǎn)，人PAF-AH cDNA序列；(5)從位于位置1328的XhoI位點(diǎn)至位于位置1958的破壞的AatII位點(diǎn)，源自pET-21b(Novagen，Madison，WI)、含有源自噬菌體T7的轉(zhuǎn)錄終止序列和源自噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。
            
pBAR2/PH.2和pBAR2/PH 9中PAF-AH產(chǎn)物的表達(dá)在araB啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子在存在葡萄糖和缺乏阿拉伯糖時(shí)被嚴(yán)格阻抑，但當(dāng)將L-阿拉伯糖加入已消耗完葡萄糖的培養(yǎng)基中時(shí)做為強(qiáng)啟動(dòng)子起作用。通過向培養(yǎng)基加入或者氨芐青霉素(或相關(guān)抗生素)或者四環(huán)素可以完成含有該質(zhì)粒的細(xì)胞的篩選。可以使用各種大腸桿菌菌株做為重組表達(dá)PAF-AH產(chǎn)物的宿主，包括但不限于對阿拉伯糖代謝原養(yǎng)型的菌株諸如W3110、DH5α、BL21、C600、JM101和其衍生物，具有降低蛋白水解的突變的菌株例如CAG629、KY1429和降解阿拉伯糖能力缺陷的菌株諸如SB7219和MC1061。使用不能分解阿拉伯糖的菌株的優(yōu)點(diǎn)是在誘導(dǎo)期間產(chǎn)生PAF-AH的誘導(dǎo)物(阿拉伯糖)不從培養(yǎng)基中排除，與使用可以代謝阿拉伯糖的菌株得到的相比產(chǎn)生較高水平的PAF-AH。可以使用任何合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件在各種大腸桿菌菌株中表達(dá)活性PAF-AH產(chǎn)物。允許大量產(chǎn)生rPAF-AH產(chǎn)物的例如或者是諸如LB、EDM295(基于M9的補(bǔ)充了酵母膏和酸水解酪蛋白的極限培養(yǎng)基)的豐富培養(yǎng)基配方或者是“已知成分的”培養(yǎng)基諸如A675，一種基于A的極限培養(yǎng)基、pH6.75，使用甘油做為碳源并補(bǔ)充了微量元素和維生素。培養(yǎng)基中包括四環(huán)素以保持篩選所述質(zhì)粒。
            
將質(zhì)粒pBAR2/PH.2轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株MC1061(ATCC53338)，該菌株攜帶阿拉伯糖操縱子的缺失，因此不能代謝阿拉伯糖。MC1061亦是亮氨酸營養(yǎng)缺陷型，通過分批流加法(batch-fed process)使用含有補(bǔ)充所述亮氨酸突變的酪蛋白氨基酸的已知成分培養(yǎng)基培養(yǎng)。
            
用pBAR2/PH.2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M1061細(xì)胞于30℃在含有2gm/L葡萄糖的分批培養(yǎng)基中生長。葡萄糖起著細(xì)胞生長的碳源和阿拉伯糖啟動(dòng)子阻抑物的雙重作用。當(dāng)批料葡萄糖水平耗盡后(＜50mg/L)，開始營養(yǎng)流加(含有300gm/L葡萄糖)。以限制酸副產(chǎn)物(bi-product)形成的速率線性增加16小時(shí)。此時(shí)，將營養(yǎng)流加轉(zhuǎn)換為含有甘油而不是葡萄糖的培養(yǎng)基。同時(shí)，加入500gm/L L-阿拉伯糖使最終濃度為5gm/L。以恒定的流加速率保持甘油流加22小時(shí)。使用中空纖維過濾收獲細(xì)胞，濃縮懸浮液約10倍。將細(xì)胞漿儲(chǔ)存于-70℃。得到了最終細(xì)胞量約80gm/L(OD600＝50-60)，具有代表約總細(xì)胞蛋白10％的65-70U/OD/ml的PAF-AH活性。約75升的最終培養(yǎng)體積含有50-60gm PAF-AH。
            
當(dāng)由菌株SB7219或MC1061表達(dá)pBAR2/PH.2或PH.9時(shí)，可以達(dá)到高水平生產(chǎn)rPAF-AH產(chǎn)物。阿拉伯糖降解缺陷的其它菌株適于高細(xì)胞密度生產(chǎn)。優(yōu)選地，在以下條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。將指數(shù)生長的SB7219；pBAR2/PH.2和SB7219；pBAR2/PH.9菌株接種入裝有含有2g/L葡萄糖的分批培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。一旦葡萄糖被消耗完，則使用含有微量元素、維生素、鎂鹽和銨鹽的甘油溶液對罐進(jìn)行流加，以保持健康的指數(shù)生長。將罐保持于30℃、提供空氣以供應(yīng)氧氣并攪拌，以保持溶氧水平超過約15％飽和度。當(dāng)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度超過110g/L(細(xì)胞濕重)時(shí)，實(shí)行恒定流加速率，將L-阿拉伯糖的大劑量添加劑加入培養(yǎng)物(最終約0.5％)。觀察產(chǎn)物形成16-22小時(shí)。培養(yǎng)物通常達(dá)到40-50g/L(細(xì)胞干重)。通過離心收獲細(xì)胞，儲(chǔ)存于-70℃，純化rPAF-AH產(chǎn)物進(jìn)行分析。通常得到超過150單位/ml/OD600的比生產(chǎn)率。B.在酵母細(xì)胞中表達(dá)亦在啤酒酵母中表達(dá)重組人PAF-AH。使用酵母ADH2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)rPAF-AH表達(dá)，產(chǎn)生7U/ml/OD600(見下表5)。
            
表5構(gòu)建物 啟動(dòng)子  菌株  酶活性(U/ml/OD)pUC tac AH tac 大腸桿菌W3110  30pUC trp AH trp 大腸桿菌W3110  40pUC ara AH araB大腸桿菌W3110  20pET AH T7  大腸桿菌BL21(DE3)  50(Novagen)pHAB/PHaraB/T7 大腸桿菌XL-1   34pBAR2/PH.2 araBMC1061 90pYep ADH2AHADH2酵母BJ2.28 7C.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PAF-AH1.表達(dá)人PAF-AH cDNA構(gòu)建物除了pSFN/PAFAH.1，構(gòu)建以表達(dá)PAF-AH的質(zhì)粒使用了細(xì)胞肥大病毒的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子、牛生長激素基因的多聚腺苷酸化位點(diǎn)和SV40的復(fù)制起點(diǎn)，以使得所述質(zhì)粒在COS細(xì)胞中高拷貝數(shù)復(fù)制。將質(zhì)粒電穿孔進(jìn)入細(xì)胞。
            
構(gòu)建第一套質(zhì)粒，其中用已知在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以高水平表達(dá)的其它基因的側(cè)翼序列取代人PAF-AH cDNA的5’側(cè)翼序列(pDC1/PAFAH.1)或同時(shí)取代5’或3’側(cè)翼序列(PDC1/PAFAH.2)。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入COS、CHO或293細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生PAF-AH，其水平與實(shí)施例7中提出的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞后克隆sAH406-3的水平基本相同(0.01單位/ml或超出本底2-4倍)。構(gòu)建另一質(zhì)粒，其包括取代了細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子的Friend脾轉(zhuǎn)化灶形成病毒啟動(dòng)子。將人PAF-AH cDNA插入在Friend脾轉(zhuǎn)化灶形成病毒啟動(dòng)子控制之下的質(zhì)粒pmH-neo[Hahn等，Gene，127267(1993)]。用命名為pSFN/PAFAH.1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系NS0，篩選幾百個(gè)克隆，導(dǎo)致分離二個(gè)產(chǎn)生0.15-0.5單位/ml PAF-AH活性的轉(zhuǎn)染體(4B11和1C11)。假設(shè)比活為5000單位/毫克，這二個(gè)NS0轉(zhuǎn)染體的生產(chǎn)率對應(yīng)于約0.1mg/升。
            
2.表達(dá)小鼠-人嵌合PAF-AH基因構(gòu)建物具有在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pRc/CMV中的編碼小鼠PAF-AH的cDNA的構(gòu)建物(pRc/MS9)在轉(zhuǎn)染進(jìn)入COS細(xì)胞后，導(dǎo)致產(chǎn)生水平為5-10單位/ml(高于本底1000倍)的分泌的PAF-AH。假設(shè)小鼠PAF-AH的比活大約與人的酶相同，因此小鼠cDNA的表達(dá)水平比人PAF-AH cDNA高500-1000倍。
            
為檢查人和小鼠PAF-AH在COS細(xì)胞中表達(dá)水平之間的差異，構(gòu)建二個(gè)小鼠-人嵌合基因并在COS細(xì)胞測試表達(dá)。這些構(gòu)建物的第一個(gè)，pRc/PH.MHCl含有融合至表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)中的人PAF-AH的C末端343個(gè)氨基酸的小鼠PAF-AH多肽(SEQ IDNO21)的N末端的97個(gè)氨基酸的編碼序列。在質(zhì)粒pRc/PH.MHC2中的第二個(gè)嵌合基因，含有融合至pRc/CMV中的人PAF-AH的C末端400個(gè)殘基的小鼠PAF-AH多肽的N末端40個(gè)氨基酸的編碼序列。用pRc/PH.MHCl轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞導(dǎo)致在培養(yǎng)基中積累1-2單位/ml的PAF-AH活性。發(fā)現(xiàn)源自用pRc/PH.MHC2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基僅含有0.01單位/ml的PAF-AH活性。從這些實(shí)驗(yàn)看來，小鼠與人PAF-AH基因之間表達(dá)水平的差異至少部分歸因于殘基40和97之間的多肽區(qū)段、或?qū)?yīng)的編碼PAF-AH蛋白的該區(qū)的RNA或DNA區(qū)段。
            
3.重編碼PAF-AH編碼序列的首290bp在轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中人PAF-AH合成的低水平的一個(gè)假說是天然基因使用的密碼子對于有效表達(dá)是次優(yōu)的。但是，好象密碼子使用不可能對小鼠和人基因之間表達(dá)水平的500-1000倍的差異負(fù)責(zé)，因?yàn)閮?yōu)化密碼子一般對表達(dá)最多僅有10倍的影響。第二個(gè)解釋小鼠和人PAF-AH表達(dá)水平差異的假說是5’編碼區(qū)中的人PAF-AH mRNA形成了導(dǎo)致或者所述mRNA相對快速降解或者引起無效翻譯起始或延長的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
            
為檢驗(yàn)這些假說，構(gòu)建了編碼從氨基末端至殘基96的真正人PAF-AH蛋白的合成片段，但其中大多數(shù)的密碼子用不同序列的、但編碼同一氨基酸的密碼子置換(“重編碼”)。第二個(gè)密碼子從GTG變?yōu)镚TA導(dǎo)致產(chǎn)生Asp718位點(diǎn)，其位于所述合成片段的一端并存在于小鼠cDNA中。該片段的另一端具有通常在人基因的密碼子97發(fā)現(xiàn)的BamHI位點(diǎn)。約290bp Asp718/BamHI片段源自PCR片段，該P(yáng)CR片段用描述于Sandhu等，Biotechniques，1214-16(1992)中的用于構(gòu)建合成基因的雙不對稱PCR方法產(chǎn)生。將該合成的Asp718/BamHI片段與編碼人PAF-AH分子的剩余部分、起始于SEQ ID NO7的核苷酸453的DNA片段連接，使得編碼真正的人PAF-AH酶的序列插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen，San Diego)，產(chǎn)生質(zhì)粒pRc/HRH.4。所述重編碼的基因的完整序列陳述于SEQ ID NO30。與pRc/HPH.4中的人PAF-AH編碼序列鄰近的5’側(cè)翼序列源自在pRc/MS9中的編碼PAF-AH的小鼠cDNA的側(cè)翼序列(SEQ ID NO21的核苷酸1-116)。
            
為檢驗(yàn)pRc/HPH.4的人PAF-AH的表達(dá)，用pRc/HPH.4(重編碼人基因)、pRc/MS9(小鼠PAF-AH)或pRc/PH.MHCl(小鼠-人雜種1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。檢測所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的PAF-AH活性，發(fā)現(xiàn)含有5.7單位/ml(小鼠基因)、0.9單位/ml(小鼠-人雜種)或2.6單位/ml(重編碼人基因)。因此，重編碼人PAF-AH的首290bp編碼序列的策略在瞬時(shí)COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染中成功地將人PAF-AH表達(dá)水平從幾個(gè)納克/ml提高至約0.5微克/ml。將pRc/HPH.4的重編碼PAF-AH基因插入含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，將用該載體轉(zhuǎn)染DHFR-陰性中國倉鼠卵巢細(xì)胞。對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將進(jìn)行甲氨蝶呤篩選，以得到由于基因擴(kuò)增產(chǎn)生高水平人PAF-AH的克隆。
            
實(shí)施例9通過各種方法將大腸桿菌中表達(dá)的重組人血漿PAF-AH(起始于Ile42)純化為單一的考馬斯染色SDS-PAGE條帶，檢測天然PAF-AH酶表現(xiàn)的活性。A.純化重組PAF-AH使用的第一個(gè)純化程序與實(shí)施例1中對天然PAF-AH描述的類似。在4℃進(jìn)行以下步驟。將50ml產(chǎn)生PAF-AH的大腸桿菌(用表達(dá)構(gòu)建物trp AH轉(zhuǎn)化)的沉淀如實(shí)施例8中所述進(jìn)行溶菌。通過于10,000g離心20分鐘除去固體。以0.8ml/分鐘將上清液上樣至在緩沖液D(25mMTris-HCl，10mM CHAPS，0.5M NaCl，pH7.5)中平衡的Blue SepharoseFast Flow柱(2.5cm×4cm；20ml床體積)。用100ml緩沖液D洗滌該柱，用含有0.5M KSCN的緩沖液A以3.2ml/分鐘洗脫。將15ml的活性分部收集液上樣至在緩沖液D中平衡的1ml銅螯合Sepharose柱。用5ml緩沖液D洗滌該柱，接著用含有100mM咪唑的5ml緩沖液D以重力流速洗脫。通過SDS-PAGE分析含有PAF-AH活性的分部收集液。
            
純化的結(jié)果示于表6，其中一個(gè)單位等于μmol PAF水解/小時(shí)。于4℃得到的純化產(chǎn)物在SDS-PAGE上表現(xiàn)為低于43kDa標(biāo)記的單個(gè)深條帶，在其上下有一些擴(kuò)散染色。與實(shí)施例1中所述的血漿PAF-AH制備物相比，重組材料顯著地更純并表現(xiàn)出較高的比活。
            
表6樣品 體積   活性總活性蛋白比活 活性回收％   純化倍數(shù)(ml)  (單位(單位×   濃度(單位/ml)  103)   (mg/ml)   /mg)臺(tái)階  累計(jì)  臺(tái)階  累計(jì)溶菌液   4.5989  4451 15.6  63 100   1001 1藍(lán)   15 64   960  0.07  91422   22  14.4  14.4銅   1  2128 2128 0.55  3869220  48 4.2   61當(dāng)在室溫進(jìn)行同樣的純化程序時(shí)，除了低于43kDa標(biāo)記的條帶之外，一組低于29kDa標(biāo)記的條帶與檢測的凝膠條的PAF-AH活性相關(guān)。這些較低分子量條帶可能是保留酶活性的PAF-AH的蛋白水解片段。
            
亦在室溫進(jìn)行不同的純化程序。將產(chǎn)生PAF-AH的大腸桿菌(用表達(dá)構(gòu)建物pUC trp AH轉(zhuǎn)化)的沉淀(100g)再懸浮于200ml溶菌緩沖液(25mM Tris，20mM CHAPS，50mM NaCl，1mM EDTA，50μg/ml芐脒，pH7.5)，通過于15,000psi三次通過顯微流態(tài)儀(microfluidizer)溶菌。通過于14,300xg離心1小時(shí)除去固體。將上清液在稀釋緩沖液[25mM MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)，10mM CHAPS，1mM EDTA，pH4.9]中稀釋10倍，以25ml/分鐘上樣至在緩沖液E(25mM MES，10mM CHAPS，1mMEDTA，50mM NaCl，pH5.5)中平衡的S Sepharose Fast Flow柱(200ml)(陽離子交換柱)。用1升緩沖液E洗滌該柱，用1M NaCl洗脫，將洗脫液以50ml分部收集液收集，用0.5ml 2M Tris堿調(diào)節(jié)至pH7.5。合并含有PAF-AH活性的分部收集液，調(diào)節(jié)至0.5M NaCl。將S合并液以1ml/分鐘上樣至在緩沖液F(25mM Tris，10mM CHAPS，0.5M NaCl，1mMEDTA，pH7.5)中平衡的Blue Sepharose Fast Flow柱(2.5cm×4cm；20ml)。以4ml/分鐘用100ml緩沖液F洗滌該柱，用100ml含有3M NaCl的緩沖液F洗脫。重復(fù)進(jìn)行Blue Sepharose Fast Flow層析步驟以降低樣品中的內(nèi)毒素水平。合并含有PAF-AH活性的分部收集液，對緩沖液G(25mM Tris pH7.5，0.5M NaCl，0.1％吐溫80，1mM EDTA)透析。
            
純化的結(jié)果示于表7，其中一個(gè)單位等于μmol PAF水解/小時(shí)。
            
表7樣品體積活性總活性蛋白比活活性回收％純化倍數(shù)(ml)   (單位(單位 濃度(單位/ml)×103)   (mg/ml)  /mg)   臺(tái)階  累計(jì)  臺(tái)階  累計(jì)溶菌液  2005640  1128 57.4698 100   1001 1S   1115742  637  3.69 1557   5756 1616藍(lán)  1003944  394  0.84 4676   3562 3 48得到的純化產(chǎn)物在SDS-PAGE上表現(xiàn)為低于43kDa標(biāo)記的單個(gè)深條帶，在其上下有一些擴(kuò)散染色。與實(shí)施例1中所述的血漿PAF-AH制備物相比，重組材料顯著地更純并表現(xiàn)出較高的比活。
            
本發(fā)明考慮的再一純化程序涉及以下細(xì)胞裂解、澄清和第一柱步驟。在溶菌緩沖液(25mM Tris pH7.5，150mM NaCl，1％吐溫80，2mMEDTA)中將細(xì)胞1∶1稀釋。在冷卻的顯微流態(tài)儀中以15,000-20,000psi將材料通過三次以產(chǎn)生＞99％細(xì)胞破碎進(jìn)行溶菌。在稀釋緩沖液(25mMTris pH8.5，1mM EDTA)中將溶菌液稀釋1∶20，上樣至用Q-SepharoseBig Bead層析介質(zhì)(Pharmacia)裝柱并在25mM Tris pH8.5，1mM EDTA，0.015％吐溫80中平衡的柱。將洗脫液在25mM MES pH5.5、1.2M硫酸銨、1mM EDTA中稀釋1∶10，上樣至在同樣緩沖液中平衡的丁基Sepharose層析介質(zhì)(Pharmacia)。在25mM MES pH5.5、0.1％吐溫80、1mM EDTA中洗脫P(yáng)AF-AH活性。
            
本發(fā)明考慮的用于從大腸桿菌純化酶活性PAF-AH的再一方法包括以下步驟(a)制備在含有CHAPS的緩沖液中溶菌后產(chǎn)生溶解的PAF-AH上清液的大腸桿菌提取液；(b)稀釋所述上清液，上樣至于約pH8.0平衡的陰離子交換柱；(c)從所述陰離子交換柱洗脫P(yáng)AF-AH酶；(d)將所述陰離子交換柱的所述調(diào)節(jié)洗脫液上樣至藍(lán)染料配體親和柱；(e)使用包含3.0M鹽的緩沖液洗脫所述藍(lán)染料配體親和柱；(f)將所述藍(lán)染料洗脫液在用于羥基磷灰石層析的合適緩沖液中稀釋；(g)進(jìn)行羥基磷灰石層析，其中使用緩沖液(含或不含CHAPS)完成洗滌和洗脫；(h)將所述羥基磷灰石洗脫液稀釋至適當(dāng)鹽濃度以進(jìn)行陽離子交換層析；(i)將所述稀釋的羥基磷灰石洗脫液上樣至pH范圍約6.0-7.0的陽離子交換柱；(j)使用合適的配制緩沖液從所述陽離子交換柱洗脫P(yáng)AF-AH；(k)在低溫進(jìn)行陽離子交換層析；和(l)在缺少CHAPS的情況下以液體或冷凍形式配制PAF-AH。
            
優(yōu)選地，上述步驟(a)中的溶菌緩沖液是25mM Tris、100mMNaCl、1mM EDTA、20mM CHAPS、pH8.0；步驟(b)中為進(jìn)行陰離子交換層析，將所述上清液在25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0中稀釋3-4倍，該柱是在25mM Tris、1mM EDTA、50mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0中平衡的Q-Sepharose柱；步驟(c)中使用25mMTris、1mM EDTA、350mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0洗脫所述陰離子交換柱；步驟(d)中直接將步驟(c)的洗脫液上樣至藍(lán)染料親和柱；步驟(e)中用3M NaCl、10mM CHAPS、25mM Tris、pH8.0緩沖液洗脫所述柱；步驟(f)中通過在10mM磷酸鈉、100mM NaCl、10mMCHAPS、pH6.2中稀釋，完成稀釋所述藍(lán)染料洗脫液以進(jìn)行羥基磷灰石層析；步驟(g)中使用用10mM磷酸鈉、100mM NaCl、10mM CHAPS平衡的羥基磷灰石柱完成羥基磷灰石層析，使用50mM磷酸鈉、100mMNaCl(含或不含)10mM CHAPS、pH7.5完成洗脫；步驟(h)中通過在pH范圍約6.0-7.0、包含磷酸鈉(含或不含CHAPS)的緩沖液中稀釋，完成用于陽離子交換層析的所述羥基磷灰石洗脫液的稀釋；步驟(i)中用50mM磷酸鈉、(含或不含)10mM CHAPS、pH6.8平衡S Sepharose；步驟(j)中用諸如含有0.01％吐溫80的50mM磷酸鉀、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl、pH7.5的合適配制緩沖液完成洗脫；步驟(k)中于2-8℃完成陽離子交換層析。用于步驟(l)中穩(wěn)定PAF-AH的合適的配制緩沖液的實(shí)例包括50mM磷酸鉀、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl pH7.4(大約值，加入或不加入吐溫80和或Pluronic F68)或25mM磷酸鉀緩沖液，含有(至少)125mM NaCl、25mM精氨酸和0.01％吐溫80(含或不含約0.1和0.5％的Pluronic F68)。
            
B.重組PAF-AH的活性PAF乙酰水解酶的最顯著的特性是它對在底物的sn-2位置具有短殘基的底物的顯著的特異性。該嚴(yán)格的特異性將PAF乙酰水解酶與PLA2的其它形式區(qū)別開來。因此，為確定重組PAF-AH是否降解在sn-2位置有長鏈脂肪酸的磷脂，檢測1-棕櫚酰-2-花生四烯酰(arachidonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(花生四烯酰PC(arachidonyolPC))的水解，因?yàn)檫@是PLA2的良好特征鑒定形式的優(yōu)選底物。與用天然PAF-AH進(jìn)行的先前研究的預(yù)測一樣，當(dāng)與重組PAF-AH溫育時(shí)該磷脂不降解。在其它實(shí)驗(yàn)中，以0-125μM的濃度范圍將arachidonoylPC包括于標(biāo)準(zhǔn)PAF水解檢測中，以確定它是否抑制重組PAF-AH對PAF的水解。甚至在最高濃度的PAF-AH時(shí)都沒有抑制PAF水解，該濃度超過PAF濃度5倍。因此，重組PAF-AH表現(xiàn)出與天然酶一樣的底物選擇性；不識(shí)別長鏈底物。另外，重組PAF-AH酶快速地降解已進(jìn)行了sn-2脂肪酸氧化裂解的氧化磷脂(戊二酰PC)。天然血漿PAF-AH具有使其與其它磷脂酶區(qū)分的幾種其它特性，包括鈣依賴性、對修飾巰基或破壞二硫化物的化合物的抗性。
            
天然和重組PAF-AH酶都對DFP敏感，表明絲氨酸構(gòu)成它們活性位點(diǎn)的一部分。天然血漿PAF乙酰水解酶的不尋常的特征是它與循環(huán)中的脂蛋白緊密聯(lián)系，其催化效率受脂蛋白環(huán)境影響。當(dāng)本發(fā)明的重組PAF-AH與人血漿(預(yù)先用DFP處理以消除內(nèi)源酶活性)保溫時(shí)，它以與天然活性相同的方式與低密度和高密度脂蛋白相結(jié)合。這個(gè)結(jié)果是有意義的，因?yàn)橛写罅康淖C據(jù)表明，低密度脂蛋白的修飾對在動(dòng)脈粥樣化中觀察到的膽固醇沉積是必需的、脂類的氧化是該過程中的起始因子。PAF-AH在體外保護(hù)低密度脂蛋白在氧化條件下免受修飾，可能在體內(nèi)有這種作用。因此給予PAF-AH適于抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑中脂蛋白的氧化以及可以消除炎癥。
            
這些結(jié)果都確認(rèn)cDNA克隆sAH406-3編碼具有人血漿乙酰水解酶活性的蛋白。
            
實(shí)施例10在大腸桿菌中表達(dá)各種重組PAF-AH產(chǎn)物。產(chǎn)物包括具有單氨基酸突變的PAF-AH類似物和PAF-AH片段。A.PAF-AH氨基酸置換產(chǎn)物PAF-AH是脂酶，因?yàn)樗饬字琍AF。雖然在PAF-AH與其它已鑒定的脂酶之間沒有明顯的總類似性，但在結(jié)構(gòu)表征的脂酶的比較中發(fā)現(xiàn)了保守殘基。一個(gè)絲氨酸已被鑒別為活性位點(diǎn)的成員。該絲氨酸與天冬氨酸殘基和組氨酸殘基一起形成了代表該脂酶的活性位點(diǎn)的催化三聯(lián)體。這三個(gè)殘基在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中不相鄰，但是結(jié)構(gòu)研究已證實(shí)這三個(gè)殘基在三維結(jié)構(gòu)中是相鄰的。哺乳動(dòng)物脂酶結(jié)構(gòu)比較提示，該天冬氨酸殘基一般距離活性位點(diǎn)絲氨酸C末端24個(gè)氨基酸。另外，該組氨酸一般距離活性位點(diǎn)絲氨酸C末端109-111個(gè)氨基酸。
            
通過定點(diǎn)誘變和PCR，修飾人PAF-AH編碼序列的單個(gè)密碼子，以編碼丙氨酸殘基并在大腸桿菌中表達(dá)。如以下表8中所示，例如縮寫“S108A”表明位于位置108的絲氨酸殘基被改為丙氨酸，Ser273、Asp296或His351的點(diǎn)突變完全破壞了PAF-AH活性?；钚晕稽c(diǎn)殘基之間的距離對PAF-AH(Ser至Asp，23個(gè)氨基酸；Ser至His，78個(gè)氨基酸)和其它脂酶是類似的。這些實(shí)驗(yàn)證明Ser273、Asp296和His351是對活性關(guān)鍵的殘基，因此可能是催化三聯(lián)體殘基的候選者。半胱氨酸對于蛋白質(zhì)的功能完整性通常是關(guān)鍵的，因?yàn)樗鼈兙哂行纬啥蜴I的能力。血漿PAF-AH具有5個(gè)半胱氨酸。為確定這5個(gè)中的哪一個(gè)對酶活性是關(guān)鍵的，將每個(gè)半胱氨酸單獨(dú)地突變?yōu)榻z氨酸，在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生的突變體。使用這些重組產(chǎn)生的突變體的部分純化制備物的初步活性結(jié)果示于以下表8的第2欄，使用更加純化的制備物的結(jié)果示于表8的第3欄。數(shù)據(jù)顯示，所有的半胱氨酸突變體具有大致相同的活性，所以所有這些半胱氨酸對PAF-AH活性都不是必需的。其它點(diǎn)突變亦對PAF-AH催化活性幾乎沒有或沒有影響。在表8中，“++++”代表約40-60U/ml/OD600的野生型PAF-AH活性，“+++”代表約20-40U/ml/OD600活性，“++”代表約10-20U/ml/OD600活性，“+”代表1-10U/ml/OD600活性，“-”表明＜1U/ml/OD600活性。
            
表8突變 PAF-AH活性純化的制備物的PAF-AH比活野生型++++ 6.9mmol/mg/小時(shí)S108A ++++S273A  -D286A  -D286N  ++D296A  -D304A ++++D338A ++++H351A  -H395A，H399A  ++++C67S  +++ 5.7mmol/mg/小時(shí)C229S  +  6.5mmol/mg/小時(shí)C291S  +  5.9mmol/mg/小時(shí)C334S ++++6.8mmol/mg/小時(shí)C407S +++ 6.4mmol/mg/小時(shí)C67S，C334S，C407S6.8mmol/mg/小時(shí)B.PAF-AH片段產(chǎn)物通過用外切核酸酶III消化PAF-AH編碼序列的3’端不同的時(shí)間，然后將縮短的編碼序列連接至在所有三個(gè)讀框中編碼終止密碼子的質(zhì)粒DNA來制備C末端缺失。通過DNA序列分析、蛋白表達(dá)和PAF-AH活性特征鑒定了10個(gè)不同的缺失構(gòu)建物。除去21個(gè)至30個(gè)C末端氨基酸顯著降低了催化活性，除去52個(gè)殘基完全破壞了活性。參見圖3。
            
在PAF-AH的氨基末端產(chǎn)生了類似的缺失。制備了PAF-AH與大腸桿菌硫氧還蛋白于N末端的融合物，以促進(jìn)一致性的高水平表達(dá)PAF-AH活性[LaVallie等，Bio/technology，11187-193(1993)]。除去天然加工的N末端(Ile42)的19個(gè)氨基酸降低活性99％，而除去26個(gè)氨基酸完全破壞了融合蛋白中的酶活性。參見圖3。缺失12個(gè)氨基酸看來增強(qiáng)酶活性約4倍。
            
在以后通過與實(shí)施例1中描述的類似的方法從新鮮人血漿純化PAF-AH(使用Amicon的Microcon 30濾器濃縮Blue sepharose洗脫液而不是銅柱)，鑒別了除Ile42之外的二個(gè)N末端，Ser3s和Lys55。這種異質(zhì)性可能是血漿中酶的天然狀態(tài)，或可能在純化中發(fā)生。
            
將上述純化的材料進(jìn)行糖基化分析。將純化的天然PAF-AH在存在或不存在N-聚糖酶的情況下溫育，該酶從糖蛋白除去N連接的碳水化合物。將處理的PAF-AH樣品通過12％ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后使用兔多克隆抗血清通過蛋白印跡顯現(xiàn)。未用N-聚糖酶處理的蛋白質(zhì)以45-50kDa的擴(kuò)散條帶遷移，而用聚糖酶處理的蛋白質(zhì)以約44kDa的緊密條帶遷移，證實(shí)天然PAF-AH是糖基化的。
            
亦在重組PAF-AH(Ile42N末端)的純化制備物中觀察到N末端異質(zhì)性。這些制備物是N末端起始于Ala47、Ile42或與Ile42鄰接的人工起始Met1的多肽的混合物。1.PAF-AH片段與PAF-AH的初步比較鑒于觀察到的重組產(chǎn)生的PAF-AH的異質(zhì)性，制備其它重組產(chǎn)物并在重組表達(dá)和純化后檢測均質(zhì)性。在細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)期的不同時(shí)間點(diǎn)分析在大腸桿菌菌株MC1061中pBAR2/PH.2和pBAR2/PH.9的重組表達(dá)產(chǎn)物的組成。通過矩陣輔助激光吸收電離質(zhì)譜儀(MALDIMS)分析誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后5-22小時(shí)之間的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞的重組PH.2和PH.9的部分純化的樣品。
            
當(dāng)使用PH.2表達(dá)載體時(shí)，在部分純化的蛋白質(zhì)譜中預(yù)期為rPAF-AH蛋白的質(zhì)量值處觀察到2個(gè)峰。在所有的時(shí)間點(diǎn)都觀察到2個(gè)峰，在由培養(yǎng)基中的乙酸積累和/或氧消耗完表明的發(fā)酵逆境時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，觀察到較大的異質(zhì)性。在此質(zhì)量范圍內(nèi)MALDI-MS的精度是約±0.3％，大約是一個(gè)氨基酸的質(zhì)量。觀察到的較高的質(zhì)量峰與預(yù)期的PH.2載體的全長翻譯產(chǎn)物減去預(yù)期翻譯后除去的翻譯起始甲硫氨酸的存在一致。較低的質(zhì)量峰約少1200原子質(zhì)量單位。
            
當(dāng)使用PH.9表達(dá)載體時(shí)，在部分純化的蛋白質(zhì)譜中預(yù)期為rPAF-AH蛋白的質(zhì)量值處觀察到占優(yōu)勢的單峰。在所有的時(shí)間點(diǎn)都觀察到該單峰，在不同的時(shí)間點(diǎn)未觀察到異質(zhì)性增加。觀察到的該蛋白的質(zhì)量與預(yù)期減去起始甲硫氨酸的PH.9載體的全長翻譯產(chǎn)物的存在一致。2.純化PAF-AH片段為與純化的rPAF-AH(編碼Ile42-Asn441的DNA的表達(dá)產(chǎn)物)進(jìn)一步比較，純化重組表達(dá)的rPH.2(編碼Met46-Asa441的DNA的表達(dá)產(chǎn)物)和rPH.9(編碼Met46-Ile429的DNA的表達(dá)產(chǎn)物)制備物。rPH.9由大腸桿菌菌株SB7219產(chǎn)生，一般按照上述鋅螯合純化程序純化，而rPH.2由大腸桿菌菌株MC1061產(chǎn)生并如下述純化。通過用溶菌緩沖液(100mM琥珀酸鹽，100mM NaCl，20mM CHAPS，pH6.0)稀釋細(xì)胞沉淀(cell paste)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞溶菌。混合該漿液并通過高壓破碎溶菌。將溶菌的細(xì)胞離心，保留含有rPH.2的上清液。將澄清的上清液在含有1mM EDTA、10mMCHAPS、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液中稀釋5倍。然后將稀釋的上清液上樣至Q Sepharose柱。該柱先用三倍柱體積的含有1mM EDTA、50mM NaCl、10mM CHAPS、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液洗滌(洗滌1)，然后用10倍柱體積的含有1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0的25mM Tris緩沖液洗滌(洗滌2)，用10倍柱體積的含有1mm EDTA、100mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0的25mM Tris緩沖液洗滌(洗滌3)。用含有1mM EDTA、350mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0的25mM Tris緩沖液完成洗脫。將Q Sepharose洗脫液在25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0中稀釋3倍，然后上樣至Blue Sepharose柱。該柱首先用10倍柱體積的25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0洗滌。然后用3倍柱體積的25mM Tris、0.5M NaCl、10mM CHAPS、pH8.0洗滌。用25mM Tris、3.0M NaCl、10mM CHAPS、pH8.0完成洗脫。將Blue Sepharose洗脫液在10mM磷酸鈉、10mM CHAPS、pH6.2中稀釋5倍，然后上樣至層析柱。該柱用10倍柱體積的10mM磷酸鈉、100mMNaCl、0.1％ Pluronic F68、pH6.2洗滌。rPH.2用120mM磷酸鈉、100mMNaCl、0.1％ Pluronic F68、pH7.5洗脫。羥基磷灰石洗脫液用10mM磷酸鈉、0.1％ Pluronic F68、pH6.8稀釋6倍。使用0.5N琥珀酸將稀釋的羥基磷灰石洗脫液調(diào)節(jié)至pH6.8，然后上樣至SP Sepharose柱。然后用10倍柱體積的50mM磷酸鈉、0.1％ Pluronic F68、pH6.8洗滌，用50mM磷酸鈉、125mM NaCl、0.1％ Pluronic F68、pH7.5洗脫。通過稀釋成50mM磷酸鈉、125mM NaCl、0.15％ Pluronic F68、pH7.5中的最終濃度為4mg/ml配制洗脫的rPH.2，加入吐溫80至最終濃度為0.02％吐溫80。然后將配制的產(chǎn)物通過0.2u膜過濾，在使用之前貯存。3.通過測序比較PAF-AH片段和PAF-AH通過使用Applied Biosystems 473A型蛋白測序儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行N末端測序，使用Hewlett-PackardG1009A型C末端蛋白測序儀進(jìn)行C末端測序，比較純化的rPH.2和rPH.9制備物與純化的rPAF-AH制備物。與rPAF-AH相比，rPH.2制備物的N末端異質(zhì)性較低。rPH.9制備物的N末端分析與rPH.2的類似，但是觀察到rPH.9制備物的C末端異質(zhì)性比rPH.2相對低一些。
            
純化的rPH.2制備物含有具有N末端Ala47的主序列(約86-89％)和具有N末端Ala48的次序列(約11-14％)，在不同發(fā)酵條件下這二種N末端的比例相當(dāng)一致。純化的rPH.9制備物亦含有具有N末端Ala47的主序列(約83-90％)和具有N末端Ala48的次序列(約10-17％)。與之相反，試圖在細(xì)菌中產(chǎn)生起始于Ile42的多肽(rPAF-AH)導(dǎo)致具有起始于Ala47(20-53％)、Ile42(8-10％)或與Ile42鄰接的人工起始Met-1甲硫氨酸(37-72％)的多肽的各種混合物。對于rPH.2和rPH.9，細(xì)菌合成該多肽之后通過氨基末端肽酶有效地除去了起始甲硫氨酸，使得位于位置47的丙氨酸(或位于位置48的丙氨酸)做為N末端殘基。
            
對一批rPH.2進(jìn)行C末端測序，觀察到其具有HOOC-Asn-Tyr的C末端做為主序列(約80％)，與翻譯產(chǎn)物預(yù)期的HOOC-Asn441-Tyr440C末端一致，而約20％是HOOC-Leu。在rPH.2制備物通過SDS-PAGE分級(jí)分離之后，主要條帶和次要條帶的再測序產(chǎn)生了較低的次要條帶的HOOC-Leu-Met的C末端(AHL，在以下B.5.節(jié)中描述)，這與比全長翻譯產(chǎn)物短10個(gè)氨基酸的產(chǎn)物一致，還產(chǎn)生了低水平的HOOC-His。進(jìn)一步的肽作圖已顯示在一些批的PH.2蛋白中存在其它的C末端。通過直接測序的rPH9的C末端主要是HOOC-Ile-His(約78-91％，取決于各批)，與翻譯產(chǎn)物預(yù)期的HOOC-Ile429-His428C末端一致。在該技術(shù)中看來有一些本底(“噪音”)，所以不能排除如此低水平的其它序列。4.通過MALDI-MS比較PAF-AH片段與PAF-AH對純化的rPH.2和rPH.9制備物進(jìn)行MALDI-MS。rPH.2質(zhì)譜中在預(yù)期為rPAF-AH蛋白的質(zhì)量值處展現(xiàn)出2個(gè)峰(參見圖4)，與在上述B.1.節(jié)中用部分純化的蛋白質(zhì)觀察到的型式類似。次要的較低分子量峰通常以總量的約20-30％存在。rPH.9的質(zhì)譜顯示與預(yù)期減去翻譯起始甲硫氨酸的PH.9載體的全長翻譯產(chǎn)物一致的占優(yōu)勢的峰(參見圖5)。亦觀察到rPH.9的代表總量約5％的小的分子量稍低的肩峰。5.通過SDS-PAGE比較PAF-AH片段與PAF-AH對純化的rPAF-AH、rPH.2和rPH.9制備物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。在基于蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)期為rPAF-AH產(chǎn)物的電泳遷移范圍周圍，觀察到rPH.2的復(fù)雜條帶型式。在一個(gè)或一些凝膠中觀察到二個(gè)占優(yōu)勢的條帶，在主帶上下容易地觀察到次要條帶。將這些上部次要條帶、中部主要條帶和較低的次要條帶分別命名為AHU、AHM和AHL。所有這些條帶均在蛋白印跡上與抗-rPAF-AH單克隆抗體反應(yīng)，因此被鑒別為rPAF-AH相關(guān)產(chǎn)物。上部次要條帶AHU的深度隨蛋白儲(chǔ)存時(shí)間加深，推測代表rPAF-AH產(chǎn)物的修飾形式。rPAF-AH制備物的SDS-PAGE與rPH.2的類似。遷移在rPAF-AH預(yù)期分子量附近的有二個(gè)主帶，在主帶上面有次要條帶，主帶下有陰影。與之相反，rPH.9在SDS-PAGE上展示單一占優(yōu)勢條帶，沒有明顯分裂。亦觀察到在分子量稍低的位置和預(yù)期的二體位置的淺帶。未觀察到AHU樣的條帶。
            
亦在2D凝膠(在尿素中等電聚焦，接著第二向進(jìn)行SDS-PAGE)中分析純化的rPH.2和rPH.9制備物的組成。對于rPH.9，2D凝膠顯示在IEF方向上分離的5個(gè)主要斑點(diǎn)。在rPH.9的各批之間出現(xiàn)的電荷異質(zhì)性是一致的。與之相反，rPH.2的2D凝膠型式更加復(fù)雜，因?yàn)樗性贗EF和SDS-PAGE方向上分離的約15個(gè)斑點(diǎn)。6.比較PAF-AH片段與PAF-AH的活性純化的rPH.2和rPH.9具有與從血清純化的內(nèi)源PAF-AH不可區(qū)分的酶活性，rPH.2和rPH.9以與純化的內(nèi)源PAF-AH類似的方式與脂蛋白結(jié)合。
            
實(shí)施例11通過RNA印跡雜交進(jìn)行了人血漿PAF-AH mRNA在人組織中表達(dá)型式的初步分析。
            
使用RNA Stat 60(Tel-Test“B”，F(xiàn)riendswood，TX)從人大腦皮質(zhì)、心臟、腎臟、胎盤、胸腺和扁桃體制備RNA。另外，從人造血前體樣細(xì)胞系THP-1(ATCC TIB 202)制備RNA，該細(xì)胞系用佛波醇酯乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)誘導(dǎo)分化成為巨噬細(xì)胞樣表現(xiàn)型。將組織RNA和誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1-3天從早幼粒細(xì)胞THP-1細(xì)胞系制備的RNA通過1.2％瓊脂糖甲醛凝膠進(jìn)行電泳，接著轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。通過隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記全長人血漿PAF-AH cDNA，sAH406-3，在與實(shí)施例3中對文庫篩選所描述的那些條件的相同條件下與所述膜雜交。初始的結(jié)果表明，該P(yáng)AF-AH探針與胸腺、扁桃體的1.8kb條帶雜交，在較小的程度上與胎盤RNA雜交。
            
PAF在大腦中在正常生理以及病理病癥下合成。已知該分子的促炎性質(zhì)和潛在的神經(jīng)毒性性質(zhì)，預(yù)期PAF合成定位機(jī)制或其快速分解代謝機(jī)制對神經(jīng)組織的健康是關(guān)鍵的。PAF乙酰水解酶在神經(jīng)組織中的存在與其起這種保護(hù)性作用是一致的。有趣的是，在大腦中都鑒別到牛異三聚體胞內(nèi)PAF-AH[在Hattori等，J.Biol.Chem.，269(37)23150-23155(1994)中描述了它的克隆]和本發(fā)明的PAF-AH。為確定這二種酶是否在大腦的類似或不同的區(qū)室表達(dá)，克隆了牛大腦胞內(nèi)PAF-AH cDNA的人同源物，通過RNA印跡，使用前段中描述的基本相同的方法，將其在腦中的mRNA表達(dá)型式與本發(fā)明的PAF-AH的mRNA表達(dá)型式相比較。通過RNA印跡檢測的腦區(qū)域是小腦、髓質(zhì)、脊髓、豆?fàn)詈恕⑿尤屎?amygdala)、尾狀核、丘腦和枕極、大腦皮層的額葉和顳葉。在每種這些組織中都檢測到這二種酶的信息，盡管異三聚體胞內(nèi)形式比分泌形式豐富的多。其它組織的RNA印跡分析進(jìn)一步揭示異三聚體胞內(nèi)形式在廣泛的各種組織和細(xì)胞中表達(dá)，包括胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、大腦、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟和腎上腺。這種普遍存在的表達(dá)提示，異三聚體胞內(nèi)PAF-AH在細(xì)胞內(nèi)具有一般性管家功能。
            
亦檢測了從人血分離的單核細(xì)胞以及在其在培養(yǎng)中自發(fā)分化成為巨噬細(xì)胞時(shí)的PAF-AH表達(dá)。在新鮮單核細(xì)胞中未檢測到或極少檢測到RNA，但在分化成為巨噬細(xì)胞期間表達(dá)被誘導(dǎo)和保持。在分化細(xì)胞的培養(yǎng)基中有PAF-AH活性的伴隨積累。亦在誘導(dǎo)后1天而不是3天的THP-1細(xì)胞RNA中觀察到人血漿PAF-AH轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。THP-1細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)不表達(dá)PAF-AH的mRNA。
            
實(shí)施例12通過原位雜交檢測了人和小鼠組織中的PAF-AH表達(dá)。
            
從國家疾病研究和交換和合作性人組織網(wǎng)絡(luò)得到人組織。從S/JLJ小鼠收集正常小鼠大腦和脊髓以及EAE階段3小鼠脊髓。從受精后7至18天收集正常S/JLJ小鼠胚胎。
            
使用少量的OCT化合物(Miles，Inc.，Elkhart，IN)將組織塊置于Tissue Tek II冷凍模具(cryomolds)(Miles Laboratories，Inc.，Naperville，IL)中。將它們置于冷凍模具中央，用OCT化合物充滿冷凍模具，然后置于裝有2-甲基丁烷[C2H5CH(CH3)2，Aldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee，WI]的容器中，將該容器置于液氮中。一旦冷凍模具中的組織和OCT化合物冷凍，則將所述塊置于-80℃保存直至切片。將組織塊切成6μm厚，粘附于Vectabond(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)包被載玻片上，儲(chǔ)存于-70℃，置于50℃約5分鐘使其溫暖并除去冷凝水，然后于4℃在4％多聚甲醛中固定20分鐘，在每個(gè)級(jí)別于4℃脫水1分鐘(70％、95％、100％乙醇)，然后于室溫風(fēng)干30分鐘。將切片于70℃在70％甲酰胺/2XSSC中變性2分鐘，在2XSSC中清洗2次，脫水然后風(fēng)干30分鐘。將所述組織與放射標(biāo)記的單鏈mRNA原位雜交，該單鏈mRNA從源自PAF-AH基因的內(nèi)部1 Kb HindIII片段(SEQ ID NO7的核苷酸308-1323)的DNA通過體外RNA轉(zhuǎn)錄摻入35S-UTP(Amersham)制備，或從源自由Hattori等鑒別的異三聚體胞內(nèi)PAF-AH cDNA的DNA制備。使用各種長度的250-500bp的探針。于50℃雜交過夜(12-16小時(shí))；將35S標(biāo)記的核糖探針(riboprobe)(6×105cpm/切片)、tRNA(0.5μg/切片)和焦碳酸二乙酯(depc)處理的水加入雜交緩沖液，使其最終濃度為50％甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris pH7.5、10％葡聚糖硫酸酯、1XDenhardt溶液、100mM二硫蘇糖醇(DTT)和5mM EDTA。雜交后，于室溫在4XSSC/10mM DTT中洗滌切片1小時(shí)，然后于60℃于50％甲酰胺/1XSSC/10mM DTT中洗滌40分鐘，于室溫在2XSSC中洗滌30分鐘，于室溫在0.1XSSC中洗滌30分鐘。將切片脫水，風(fēng)干2小時(shí)，用Kodak NTB2照相乳膠包埋，風(fēng)干2小時(shí)，顯影(于4℃在完全黑暗中儲(chǔ)存后)，用蘇木精/曙紅復(fù)染。A.腦小腦。在小鼠和人的腦中，在小腦浦肯野細(xì)胞層、在籃細(xì)胞和齒狀核(小腦的四個(gè)深核之一)中的單個(gè)神經(jīng)元胞體中觀察到強(qiáng)烈的信號(hào)。在這些細(xì)胞類型中亦觀察到異三聚體胞內(nèi)PAF-AH的信息。另外，在灰質(zhì)的顆粒層和細(xì)胞層的單個(gè)細(xì)胞上觀察到血漿PAF-AH信號(hào)。
            
海馬。在人海馬切片中，看來是神經(jīng)元胞體的整個(gè)切片中的單個(gè)細(xì)胞顯示了強(qiáng)烈的信號(hào)。這些被鑒別為多形胞體和顆粒細(xì)胞。亦在海馬中觀察到異三聚體胞內(nèi)PAF-AH信息。
            
腦干。在人和小鼠的腦干切片上，在灰質(zhì)中的單個(gè)細(xì)胞上有強(qiáng)烈信號(hào)。
            
度層。在從大腦、枕和顳皮層上取的人皮層切片上和在小鼠全腦切片上，整個(gè)皮層的單個(gè)細(xì)胞都顯示強(qiáng)烈信號(hào)。這些細(xì)胞被鑒別為錐狀、星狀和多形胞體。在皮層的不同層中看來沒有表達(dá)顯示的分化。這些原位雜交結(jié)果與通過RNA印跡得到的大腦皮層結(jié)果不同。這種差異可能是原位雜交比RNA印跡更加敏感的結(jié)果。在小腦和海馬中，觀察到異三聚體胞內(nèi)PAF-AH的類似表達(dá)型式。
            
垂體。在人組織切片的遠(yuǎn)部中的分散的單個(gè)細(xì)胞上觀察到較弱的信號(hào)。B.人結(jié)腸正常的結(jié)腸和局限性結(jié)腸炎結(jié)腸都在切片的粘膜中存在的淋巴聚集物中展示信號(hào)，局限性結(jié)腸炎患者的切片中的信號(hào)稍強(qiáng)。局限性結(jié)腸炎結(jié)腸亦在固有層中有強(qiáng)烈信號(hào)。類似地，在患病的闌尾切片中觀察到高水平的信號(hào)，而正常的闌尾表現(xiàn)出較低的但可以檢測的信號(hào)。潰瘍性結(jié)腸炎患者的切片在淋巴聚集物中或者固有層中均未顯示明顯的信號(hào)。C.人扁桃體和胸腺在扁桃體的生發(fā)中心內(nèi)和胸腺內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞的分散群中觀察到強(qiáng)烈的信號(hào)。D.人淋巴結(jié)在從正常供體取得的淋巴結(jié)切片上觀察到強(qiáng)烈的信號(hào)，在從敗血癥休克的供體切片的淋巴結(jié)中觀察到較弱的信號(hào)。E.人小腸正常和局限性結(jié)腸炎的小腸在切片的淋巴集結(jié)和固有層中都有弱信號(hào)，疾病組織的信號(hào)略高。F.人脾臟和肺在任何脾臟(正常切片和脾膿腫(abcess)切片)或肺(正常切片和氣腫切片)組織中均未觀察到信號(hào)。G.小鼠脊髓在正常和EAE階段3的脊髓中，在脊髓灰質(zhì)中有強(qiáng)烈信號(hào)，EAE階段3脊髓中的表達(dá)略高。在EAE階段3脊髓中，在白質(zhì)和血管周套(perivascalar cuff)中的細(xì)胞(可能是浸潤巨噬細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞)顯示在正常脊髓中所沒有的信號(hào)。F.小鼠胚胎在11天的胚胎中，在第四腦室的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中信號(hào)是明顯的，該信號(hào)在胚胎發(fā)育成為小腦和腦干時(shí)的時(shí)間進(jìn)程中保持恒定。在胚胎成熟時(shí)，脊髓(第12天)、初生皮層和神經(jīng)節(jié)(第14天)和垂體(第16天)中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的信號(hào)變得明顯。在離開脊髓的神經(jīng)上的外圍神經(jīng)系統(tǒng)(起始于第14或第15天)中觀察到信號(hào)，在第17天，在胚胎須周圍出現(xiàn)強(qiáng)烈信號(hào)。亦在第14天的肝臟和肺臟中觀察到表達(dá)，在腸(起始于第15天)和口/喉的后面部分(起始于第16天)中觀察到表達(dá)。第18天時(shí)，表達(dá)型式已分化成為皮層、后腦(小腦和腦干)、離開脊髓腰區(qū)的神經(jīng)、口/喉后面部分、肝臟、腎臟中的信號(hào)，肺和腸中信號(hào)可能較弱。G.概述PAF-AH mRNA在扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)、淋巴集結(jié)、闌尾和結(jié)腸淋巴集結(jié)物中的表達(dá)與PAF-AH的可能占優(yōu)勢的體內(nèi)源是巨噬細(xì)胞的結(jié)論是一致的，因?yàn)檫@些組織均有大量組織巨噬細(xì)胞，其做為吞噬和抗原處理細(xì)胞起作用。
            
炎癥組織中PAF-AH的表達(dá)與單核細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞的作用是消除炎癥的假說一致。預(yù)期PAF-AH將鈍化PAF和促炎磷脂，由此向下調(diào)節(jié)由這些介質(zhì)引發(fā)的炎癥事件級(jí)聯(lián)。
            
在整個(gè)腦組織中已檢測到PAF，培養(yǎng)中的大鼠小腦顆粒細(xì)胞分泌PAF。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，PAF結(jié)合神經(jīng)組織中的特異性受體，誘導(dǎo)功能性和表型變化，例如鈣動(dòng)員、轉(zhuǎn)錄激活基因向上調(diào)節(jié)、神經(jīng)前體細(xì)胞系PC12的分化。這些觀察提示PAF在腦中的生理作用，與之一致的是，近期使用海馬組織切片培養(yǎng)物和PAF類似物以及拮抗劑的實(shí)驗(yàn)已暗示，PAF做為海馬長期增強(qiáng)的重要退行信使。因此，除了其在炎癥中的病理作用之外，看來PAF參與日常神經(jīng)元信號(hào)發(fā)生過程。胞外PAF-AH在腦中的表達(dá)可以起調(diào)節(jié)PAF介導(dǎo)的信號(hào)發(fā)生的時(shí)間長度和強(qiáng)度的作用。
            
實(shí)施例13使用產(chǎn)生PAF-AH的大腸桿菌做為免疫原，制備了對重組人血漿PAF-AH特異性的單克隆抗體。
            
用重組PAF-AH于第0天、第19天和第40天注射小鼠#1342。對于融合前加強(qiáng)，用PBS中的該免疫原注射所述小鼠，4天后處死小鼠，無菌取出其脾臟并置于10ml無血清RPMI1640中。通過浸泡于無血清RPMI1640中的二個(gè)玻璃顯微鏡載玻片的冷凍末端之間研磨脾臟，形成單細(xì)胞懸浮液，該無血清RPMI1640補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco，加拿大)。將細(xì)胞懸浮液通過無菌70目Nitex細(xì)胞濾過器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)過濾，通過于200g離心5分鐘洗滌2次，將沉淀再懸浮于20ml無血清RPMI中。以類似的方式制備3只首次用于實(shí)驗(yàn)的Balb/c小鼠的胸腺細(xì)胞。將融合前3天在含有11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中保持在對數(shù)期的NS-1骨髓瘤細(xì)胞于200g離心5分鐘，如前述段落中所述洗滌沉淀2次。
            
將1×108脾臟細(xì)胞與2.0×107NS-1細(xì)胞混合，離心，吸去上清液。通過輕敲試管使細(xì)胞沉淀松動(dòng)，在1分鐘的時(shí)間內(nèi)一邊攪拌一邊加入1ml的37℃ PEG 1500(75mM Hepes中50％，pH8.0)(BoehringerMannheim)，接著在7分鐘的時(shí)間內(nèi)加入7ml無血清RPMI。另外加入8mlRPMI，將細(xì)胞于200g離心10分鐘。棄去上清液后，將沉淀再懸浮于含有15％ FBS、100μM次黃嘌呤鈉、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷(HAT)(Gibco)、25單位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺細(xì)胞/ml的200ml RPMI中，接種于10個(gè)Coming平底96孔組織培養(yǎng)板(Coming，Coming New York)中。
            
于融合后的第2、4和6天，從融合板的孔中取出100μl的培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基置換。第8天時(shí)，通過ELISA篩選融合物，檢測與重組PAF-AH結(jié)合的小鼠IgG的存在。用100ng/孔在25mM TRIS、pH7.5中稀釋的重組PAF-AH于37℃將Immulon 4平板(Dynatech，Cambridge，MA)包被2小時(shí)。吸去包被溶液，加入200ul/孔的封閉溶液[在CMF-PBS中稀釋的0.5％魚皮明膠(Sigma)]，于37℃溫育30分鐘。用含有0.05％吐溫20的PBS(PBST)洗滌板三次，加入50μl培養(yǎng)上清液。于37℃溫育30分鐘后，如上述洗滌，加入在PBST中稀釋1∶3500的50μl辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。如上述溫育板，用PBST洗滌四次，加入由100mM檸檬酸鹽中的1mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％ H2O2、pH4.5組成的100μl底物。通過加入50μl 15％H2SO4，在5分鐘內(nèi)終止顏色反應(yīng)。在讀板儀上測定A490。
            
通過在96孔板中稀釋，將選擇的融合孔克隆二次，于5天后目視計(jì)數(shù)每孔的集落數(shù)?？寺〉碾s交瘤是90D1E、90E3A、90E6C、90G11D(ATCC HB 11724)和90F2D(ATCC HB 11725)。
            
使用Isostrip系統(tǒng)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)對雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行同型分析。結(jié)果顯示融合90的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體都是IgG1。
            
融合90的雜交瘤產(chǎn)生的所有單克隆抗體在ELISA檢測中功能良好，但是在蛋白印跡中不能結(jié)合PAF-AH。為制備可以通過蛋白印跡識(shí)別PAF-AH的抗體，用重組酶免疫小鼠#1958。如對融合90所述的那樣制備雜交瘤，但是通過蛋白印跡而不是ELISA篩選，以鑒別可以進(jìn)行蛋白印跡的克隆。
            
對于蛋白印跡，用含有125mM Tris pH6.8、4％ SDS、100mM二硫蘇糖醇和0.05％溴酚藍(lán)的等體積樣品緩沖液混合重組PAF-AH，在上樣至12％ SDS聚丙烯酰胺凝膠(Novex)之前煮沸5分鐘。于40毫安電泳后，在192mM甘氨酸、25mM Tris堿、20％甲醇和0.01％ SDS中于125V1小時(shí)將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Pierce)上。將該膜于4℃在含有5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的20mM Tris、100mM NaCl(TBS)中溫肓過夜。將印跡于室溫與在含有5％ BSA的TBS中稀釋1/8000的兔多克隆抗血清溫育1小時(shí)，然后用TBS洗滌，與在含有5％ BSA的TBS中的堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG于室溫溫育1小時(shí)。用TBS再次洗滌印跡，然后與100mM Tris-HCl pH9.5、100mM NaCl和5mM MgCl2中的0.02％磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯和0.03％氮藍(lán)四唑溫育。反復(fù)進(jìn)行水洗滌終止所述反應(yīng)。
            
將蛋白印跡分析中其上清液陽性的選擇的融合孔如上述進(jìn)行處理。雜交瘤143A在蛋白印跡中與PAF-AH反應(yīng)，將其克隆(ATCC HB11900)。
            
通過用弗氏佐劑中的100μg純化的重組酶通過三個(gè)月免疫，在兔子中產(chǎn)生對人血漿PAF-AH特異性的多克隆抗血清。
            
實(shí)施例14使用大鼠足水腫模型[Henriques等，Br.J.Pharmacol.，106579-582(1992)]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以評(píng)價(jià)本發(fā)明的重組PAF-AH對急性炎癥的療效。這些研究的結(jié)果證實(shí)rPAF-AH阻斷了PAF誘導(dǎo)的水腫。進(jìn)行了平行研究，以比較PAF-AH與二種市售PAF拮抗劑的效力。A.制備PAF-AH在顯微流態(tài)儀中將用PAF-AH表達(dá)載體puc trp AH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌溶菌，離心除去固體，將細(xì)胞上清液上樣至S-Sepharose柱(Pharmacia)。該柱用由50mM NaCl、10mM CHAPS、25mM MES和1mM EDTA、pH5.5組成的緩沖液充分地洗滌。通過將緩沖液的NaCl濃度提高至1M洗脫P(yáng)AF-AH。然后將使用Blue Sepharose柱(Pharmacia)的親和層析做為額外的純化步驟使用。在將PAF-AH制備物上樣至Blue Sepharose柱之前，稀釋樣品1∶2以將NaCl的濃度降至0.5M，將pH調(diào)節(jié)至7.5。在用由0.5M NaCl、25mM Tris、10mM CHAPS和1mM EDTA、pH7.5組成的緩沖液充分地洗滌Blue Sepharose柱后，通過將NaCl濃度提高至3.0M洗脫P(yáng)AF-AH。
            
通過SDS-PAGE評(píng)價(jià)，這種方式分離的PAF-AH的純度一般為95％，活性范圍為5000-10,000U/ml。對每個(gè)PAF-AH制備物進(jìn)行的其它質(zhì)量控制包括測定內(nèi)毒素水平和對新鮮得到的大鼠紅細(xì)胞的溶血活性。含有25mM Tris、10mM CHAPS、0.5M NaCl、pH7.5的緩沖液做為該酶的儲(chǔ)存介質(zhì)以及給藥的載體。在實(shí)驗(yàn)中使用的劑量基于在實(shí)驗(yàn)即將開始之前進(jìn)行的酶活性檢測。B.誘導(dǎo)水腫將重量為180-200克的6-8周齡雌性Long Evans大鼠(Charles River，Wilmington，MA)用于所有的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)操作之前，用麻醉劑氯胺酮(Fort Dodge Laboratories，F(xiàn)ort Dodge，IA)、甲苯噻嗪(Miles，ShawneeMission，KS)和乙酰丙嗪(Aveco，F(xiàn)ort Dodge，IA)的混合物麻醉動(dòng)物，每劑量每只動(dòng)物皮下給予約2.5mg氯胺酮、1.6mg甲苯噻嗪、0.2mg乙酰丙嗪。通過如下給予或者PAF或者酵母聚糖在足部誘導(dǎo)水腫。從于-20℃儲(chǔ)存于氯仿/甲醇(9∶1)的19.1mM母液為每個(gè)實(shí)驗(yàn)新鮮制備PAF(Sigma #P-1402)。在N2下干燥至需要的體積，在含有150mm NaCl、10mM Tris pH7.5和0.25％ BSA的緩沖液中稀釋1∶1000，超聲處理5分鐘。動(dòng)物在后足墊之間皮下接受50μl PAF(最終劑量為0.96nmole)，1小時(shí)后評(píng)價(jià)水腫，在一些實(shí)驗(yàn)中在2小時(shí)后再次評(píng)價(jià)水腫。為每個(gè)實(shí)驗(yàn)新鮮制備作為PBS中的10mg/ml懸浮液的酵母聚糖A(Sigma #A-8800)。動(dòng)物在后足墊之間皮下接受50μl酵母聚糖(最終劑量為500μg)，2小時(shí)后評(píng)價(jià)水腫。
            
通過在就要給予PAF或酵母聚糖之前和在用PAF或酵母聚糖功擊之后的指定時(shí)間點(diǎn)測定足體積來定量水腫。以足體積增加的毫升數(shù)表示水腫。使用測定浸入的足置換的水體積的體積計(jì)(plethysmometer)(UGO Basile，#7150型)對麻醉的動(dòng)物測定體積置換測量。為保證一個(gè)時(shí)間點(diǎn)到下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的足浸入是可比的，用去不掉的墨水標(biāo)記后足發(fā)際線與后跟相交的地方。使用這一技術(shù)重復(fù)測定同一足表明精確度在5％之內(nèi)。C.PAF-AH給藥途徑和劑量在足墊之間局部注射PAF-AH，或者通過在尾靜脈靜脈內(nèi)注射系統(tǒng)注射。對于局部給予，大鼠接受了在右后足墊之間皮下傳遞的100μl PAF-AH(4000-6000U/ml)。左足通過給予100μl載體(緩沖鹽溶液)做為對照。對于系統(tǒng)給予PAF-AH，大鼠在尾靜脈中接受在300μl載體中靜脈給予的表明單位的PAF-AH。對照在尾靜脈接受適當(dāng)體積的載體靜脈內(nèi)注射。D.局部給予PAF-AH在大鼠(N＝4)右足墊之間皮下注射100μl PAF-AH(4000-6000U/ml)。用100μl載體(緩沖鹽溶液)注射左足。另外四只大鼠僅用載體注射。所有的大鼠都立即用通過皮下足注射的PAF攻擊，攻擊后1小時(shí)評(píng)價(jià)足體積。圖6描繪了通過局部給予PAF-AH阻斷了PAF誘導(dǎo)的足水腫，其中以每個(gè)處理組的足體積的平均增加(ml)±SEM表達(dá)水腫。在PAF攻擊之前接受了局部PAF-AH處理的組顯示比對照注射組降低的炎癥。與載體處理的對照的0.63±0.14(SEM)相比，在PAF-AH組中觀察到0.08ml±008(SEM)的足體積的增加。足體積的增加是PAF注射的直接結(jié)果，因?yàn)閮H用載體在足中注射的動(dòng)物未表現(xiàn)足體積的增加。E.靜脈內(nèi)給予PAF-AH在PAF攻擊之前15分鐘，用或者PAF-AH(300μl載體中2000U)或者僅用載體預(yù)先靜脈內(nèi)注射大鼠(每組N＝4)。圖7描繪了通過靜脈內(nèi)給予PAF-AH于攻擊后1和2小時(shí)時(shí)阻斷了PAF誘導(dǎo)的足水腫，其中以每個(gè)處理組的足體積的平均增加(ml)±SEM表達(dá)水腫。通過靜脈內(nèi)途徑接受2000U PAF-AH的組顯示在2小時(shí)時(shí)間進(jìn)程中炎癥降低。2小時(shí)時(shí)PAF-AH處理組的平均體積增加是0.10ml±0.08(SEM)，載體處理的對照的平均體積增加是0.56ml±0.11。F.比較在通過PAF或酵母聚糖誘導(dǎo)的水腫中的PAF-AH保護(hù)用或者PAF-AH(300μl載體中2000U)或者僅用載體預(yù)先靜脈內(nèi)注射處理大鼠(每組N＝4)。預(yù)處理后15分鐘，各組接受或者PAF或者酵母聚糖A，分別于1和2小時(shí)后評(píng)價(jià)足體積。如圖8中所示，系統(tǒng)給予PAF-AH(2000U)有效降低PAF誘導(dǎo)的足水腫，但未能阻斷酵母聚糖誘導(dǎo)的水腫，其中以每個(gè)處理組的足體積的平均增加(ml)±SEM表達(dá)水腫。PAF-AH處理組的平均體積增加是0.08±0.02，對照組的平均體積增加是0.49ml±0.03。G.PAF-AH保護(hù)的有效劑量滴定在二個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，在PAF攻擊前15分鐘，將各組大鼠(N＝3-4/組)用300μl體積的或者PAF-AH系列稀釋液或者載體對照靜脈內(nèi)預(yù)處理。將雙足都用PAF攻擊(如上述)，1小時(shí)后評(píng)價(jià)水腫。圖9描繪了在用增加的劑量的PAF-AH注射的大鼠中增強(qiáng)了保護(hù)免受PAF誘導(dǎo)的水腫，其中以每個(gè)處理組的體積的平均增加(ml)±SEM表達(dá)水腫。在這些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通過靜脈內(nèi)途徑給予的PAF-AH的ID50在40-80U/大鼠之間。H.隨給予后時(shí)間變化的PAF-AH的體內(nèi)效力在二個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，將2組大鼠(N＝3-4/組)用或者PAF-AH(300μl載體中2000U)或者載體自身靜脈內(nèi)預(yù)處理。給予后，各組于PAF-AH給予后15分鐘至47小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)接受PAF。PAF攻擊1小時(shí)后評(píng)價(jià)水腫。如圖10所示，給予2000U的PAF-AH保護(hù)大鼠免受PAF誘導(dǎo)的水腫至少24小時(shí)，其中以每個(gè)處理組的體積的平均增加(ml)±SEM表達(dá)水腫。I.PAF-AH的藥物動(dòng)力學(xué)4只大鼠通過靜脈內(nèi)注射接受300μl體積中的2000U PAF-AH。于各時(shí)間點(diǎn)收集血漿，儲(chǔ)存于4℃，通過使用雙單克隆抗體捕獲測定的ELISA測定PAF-AH的血漿濃度。簡言之，將單克隆抗體90G11D(實(shí)施例13)在50mM碳酸緩沖液pH9.6中稀釋至100ng/ml，在Immulon 4ELISA板上于4℃固定過夜。用含有0.05％吐溫20的PBS充分洗滌后，將所述板用在PBS中稀釋的0.5％魚皮明膠(Sigma)于室溫封閉1小時(shí)。將含有15mM CHAPS的PBS中稀釋的血清樣本以雙份加入洗滌的ELISA平板中，于室溫溫育1小時(shí)。洗滌后，將單克隆抗體90F2D(實(shí)施例13)的生物素綴合物以在PBS中稀釋的5μg/ml的濃度加入孔中，于室溫溫育1小時(shí)。洗滌后，將50μl的ExtraAvidin(Sigma)的1∶1000稀釋液加入孔中，于室溫溫育1小時(shí)。洗滌后，使用OPD做為底物使各孔顯色，定量。然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。圖11顯示1小時(shí)血漿酶水平達(dá)到了基于對于180-200克大鼠的5-6ml血漿體積的預(yù)期濃度，平均＝374U/ml±58.2，其中數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均±SEM。1小時(shí)后血漿水平持續(xù)下降，于24小時(shí)達(dá)到平均血漿濃度19.3U/ml±3.4，仍顯著高于通過酶測定發(fā)現(xiàn)約為4U/ml的內(nèi)源大鼠PAF-AH水平。J.PAF-AH與PAF拮抗劑的效力比較將各組大鼠(N＝4/組)用3種潛在抗炎劑的一種預(yù)處理腹膜內(nèi)給予的PAF拮抗劑CV3988(Biomol #L-103)(200μl乙醇中2mg)、腹膜內(nèi)給予的PAF拮抗劑Alproazolam(Sigma #A-8800)(200μl乙醇中2mg)或靜脈內(nèi)給予的PAF-AH(2000U)。對照大鼠用300μl體積的載體靜脈內(nèi)注射。腹膜內(nèi)給予PAF拮抗劑，因?yàn)樗鼈內(nèi)苡谝掖?。給予PAF拮抗劑后30分鐘，用PAF攻擊注射了或者CV3988或者Alprazolam的大鼠，以使PAF拮抗劑進(jìn)入循環(huán)，而PAF-AH和載體處理的大鼠在酶給予后15分鐘被攻擊。用PAF-AH注射的大鼠表現(xiàn)出超過由已確立的PAF拮抗劑CV3988和Alprazolam對PAF誘導(dǎo)的水腫的降低。參見圖12，其中以每個(gè)處理組的體積的平均增加±SEM表示水腫。
            
概括地講，rPAF-AH在體內(nèi)有效地阻斷由PAF介導(dǎo)的水腫?？梢曰蛘呔植拷o予或者通過靜脈內(nèi)注射系統(tǒng)性給予PAF-AH產(chǎn)物。在劑量研究中，發(fā)現(xiàn)160-2000U/大鼠范圍內(nèi)的靜脈內(nèi)注射顯著地降低PAF介導(dǎo)的炎癥，而ID50劑量看來在40-80U/大鼠的范圍內(nèi)?；?80-200克大鼠的血漿體積的計(jì)算，預(yù)測25-40U/ml范圍內(nèi)的血漿濃度應(yīng)該阻斷PAF引發(fā)的水腫。這些預(yù)測受到初步藥物動(dòng)力學(xué)研究的支持。發(fā)現(xiàn)2000UPAF-AH的劑量有效阻斷PAF介導(dǎo)的水腫至少24小時(shí)。給予PAF-AH后24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)該酶的血漿濃度為約25U/ml。發(fā)現(xiàn)PAF-AH比測試的所述2種已知的PAF拮抗劑更有效地阻斷PAF誘導(dǎo)的水腫。
            
總之，這些結(jié)果證實(shí)PAF-AH有效地阻斷PAF誘導(dǎo)的炎癥，可能在PAF是主要介質(zhì)的疾病中具有治療價(jià)值。
            
實(shí)施例15在第二個(gè)體內(nèi)模型即PAF誘導(dǎo)的胸膜炎中測試本發(fā)明的重組PAF-AH。當(dāng)導(dǎo)入胸膜腔時(shí)，PAF已顯示誘導(dǎo)血管泄漏[Henriques等，見上述]。用200μl在具有300μl重組PAF-AH(1500μmol/ml/小時(shí)，如實(shí)施例14中所述的制備)的0.9％對照緩沖液中或等體積對照緩沖液中的1％ Evans藍(lán)染料在尾靜脈注射雌性大鼠(Charles River，180-200g)。15分鐘后，所述大鼠接受注射入胸膜腔的100μl PAF(2.0nmol)。PAF攻擊1小時(shí)后，處死大鼠，通過用3ml肝素化磷酸緩沖鹽水清洗該腔收集胸膜液。通過胸膜腔中Evans藍(lán)染料的量(由620nm的吸收值定量)確定血管泄漏的程度。發(fā)現(xiàn)用PAF-AH預(yù)處理的大鼠比對照動(dòng)物的血管泄漏少(代表炎癥減輕超過80％)。
            
以上結(jié)果支持用本發(fā)明的重組PAF-AH酶治療患有胸膜炎的受治療者。
            
實(shí)施例16亦在抗原誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞募集模型中測試了本發(fā)明的重組PAF-AH酶。氣道中嗜酸性粒細(xì)胞的聚集是哮喘、鼻炎和濕疹中發(fā)生的晚期免疫應(yīng)答的特征。以2周的間隔，通過2次腹膜內(nèi)注射將BALB/c小鼠(Charles River)致敏，注射液由在4mg氫氧化鋁(Imject alum，PierceLaboratories，Rockford，IL)中的1μg卵清蛋白(OVA)組成。第二次免疫14天后，用或者氣溶膠化的OVA或者做為對照的鹽水攻擊致敏的小鼠。
            
攻擊之前，將小鼠隨機(jī)分為4組，4只小鼠/組。組1和3的小鼠用通過靜脈內(nèi)注射給予的由25mM Tris、0.5M NaCl、1mM EDTA和0.1％吐溫80組成的140μl對照緩沖液預(yù)處理。組2和4的小鼠用750單位的PAF-AH(140μl PAF-AH緩沖液中給予的活性為5,500單位/ml)預(yù)處理。給予PAF-AH或者緩沖液后30分鐘，如下述將組1和2組的小鼠暴露給氣溶膠化的PBS，而組3和4的小鼠暴露給氣溶膠化的OVA。24小時(shí)后，通過靜脈內(nèi)注射用或者140μl緩沖液(組1和3)或者140μl緩沖液中的750單位的PAF-AH(組2和4)第二次處理小鼠。
            
通過將動(dòng)物暴露給氣溶膠化的OVA，在致敏的小鼠中誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤氣管。將致敏的小鼠置于50ml錐形離心管(Coring)中，使用噴霧器(646型，DeVilbiss Corp.，Somerset，PA)強(qiáng)迫呼吸溶解于0.9％鹽水中的氣溶膠化的OVA(50mg/ml)20分鐘。以類似方式處理對照小鼠，但在噴霧器中使用的是0.9％鹽水。暴露給氣溶膠化OVA或鹽水48小時(shí)后，處死小鼠，切出氣管。將各組的氣管包埋于OCT中，在切片之前儲(chǔ)存于-70℃。
            
為評(píng)價(jià)氣管的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，用或者Luna溶液和蘇木精-曙紅溶液或用過氧化物酶染色4組小鼠的組織切片。從每組小鼠切出12個(gè)6μm厚切片，并相應(yīng)編號(hào)。如下述將奇數(shù)編號(hào)的切片用Luna染料染色。將切片于室溫在甲醛縮醇(formal alcohol)中固定5分鐘，于室溫用三遍2分鐘自來水清洗，然后于室溫在二遍5分鐘dH2O清洗。于室溫用Luna染料將組織切片染色5分鐘(Luan染料由90ml Weigert鐵蘇木精和10ml1％ Biebrich Scarlet組成)。將染色的載玻片在1％酸性酒精中蘸6次，于室溫在自來水中清洗1分鐘，在0.5％碳酸鋰溶液中蘸5次，于室溫在流動(dòng)的自來水中清洗2分鐘。通過70％-95％-100％乙醇(各1分鐘)將載玻片于室溫脫水，然后于室溫在二遍1分鐘二甲苯中透明，于Cytoseal 60中封固。
            
對于過氧化物酶染色，將偶數(shù)編號(hào)的切片在4℃丙酮中固定10分鐘，風(fēng)干。向每個(gè)切片加入200μl DAB溶液，在室溫靜置5分鐘。將載玻片于室溫在自來水中清洗5分鐘，將2滴1％鋨酸用于每個(gè)切片3-5秒鐘。于室溫將載玻片在自來水中清洗5分鐘，用25℃的Mayers蘇木精于室溫復(fù)染。然后在流動(dòng)的自來水中清洗載玻片5分鐘，通過70％-95％-100％乙醇(各1分鐘)將載玻片于室溫脫水，然后于室溫在二遍1分鐘二甲苯中透明，于Cytoseal 60中封固。
            
評(píng)價(jià)氣管粘膜下組織中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。發(fā)現(xiàn)組1和2的小鼠的氣管在整個(gè)粘膜下組織中有分散的極少的嗜酸性粒細(xì)胞。如對組3小鼠的氣管所預(yù)期的那樣(該組小鼠用緩沖液預(yù)處理并暴露給霧化OVA)，在整個(gè)粘膜下組織中發(fā)現(xiàn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞。與之相反，在用PAF-AH預(yù)處理并暴露給霧化OVA的組4小鼠的氣管中在粘膜下組織中發(fā)現(xiàn)了可以與二個(gè)對照組即組1和2中觀察到的相當(dāng)?shù)臉O少的嗜酸性粒細(xì)胞。
            
因此，表明用PAF-AH治療性治療了表現(xiàn)出晚期免疫應(yīng)答的受治療者，所述晚期免疫應(yīng)答包括諸如在哮喘和鼻炎中發(fā)生的嗜酸性粒細(xì)胞在氣道中聚集。
            
實(shí)施例17亦在二個(gè)不同的治療壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)(即在低出生體重嬰兒中發(fā)生的并引起顯著發(fā)病率和死亡率的急性出血性腸壞死)的大鼠模型中測試了本發(fā)明的PAF-AH產(chǎn)物。先前的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，用糖皮質(zhì)激素處理降低了動(dòng)物中和早產(chǎn)嬰兒中NEC的發(fā)生率，已提示糖皮質(zhì)激素的活性是通過增加血漿PAF-AH活性而發(fā)生。A.由PAF攻擊誘導(dǎo)的NEC的大鼠中的活性1.預(yù)防NEC將重組PAF-AH產(chǎn)物rPH.2(0.3ml中25,500單位，組2和4)或載體/緩沖液本身(25mM Tris、0.5M NaCl、1mM EDTA和0.1％吐溫80)(組1和3)給予重量為180-220克雌性Wistar大鼠(n＝3)的尾靜脈。如先前Furukawa等[J.Pediatr.Res.34237-241(1993)]所述，在rPH.2或載體注射后15分鐘時(shí)，將或者BSA(0.25％)-鹽水(組1和2)或者懸浮于BSA鹽水中的PAF(0.2μg/100g)在腸系膜上動(dòng)脈的水平注射入腹主動(dòng)脈。2小時(shí)后從Trietz至盲腸的韌帶取出小腸，用冷鹽水徹底洗滌，大體地檢查。從小腸的上部、中部和下部的顯微鏡檢查得到樣本。在組織在緩沖的福爾馬林中固定，通過用蘇木精和曙紅染色處理樣本以進(jìn)行顯微鏡檢查。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。
            
大體發(fā)現(xiàn)表明，用BSA鹽水的載體處理的組中是正常外觀的腸。類似的，缺乏PAF時(shí)注射的rPH.2對大體檢查沒有影響。與之相反，PAF注射入降主動(dòng)脈導(dǎo)致所述腸的漿膜表面快速、嚴(yán)重變色和出血。當(dāng)在粘膜面檢查一節(jié)小腸時(shí)注意到類似的出血，所述小腸看來已相當(dāng)?shù)膲乃馈．?dāng)在將PAF給予主動(dòng)脈之前15分鐘通過尾靜脈注射rPH.2時(shí)，所述腸看來正常。
            
在進(jìn)行顯微鏡檢查時(shí)，從組1、2和4得到的小腸證實(shí)固有層內(nèi)的正常絨毛結(jié)構(gòu)和正常細(xì)胞群體。與之相反，僅用PAF處理的組顯示在整個(gè)粘膜中的全厚度壞死和出血。
            
在上述實(shí)驗(yàn)中使用的大鼠中亦測定了血漿PAF-AH的活性。如下述測定PAF-AH活性。在尾靜脈注射之前，得到血液樣本。隨后就在注射PAF之前和處死大鼠時(shí)從大靜脈得到血液樣本。將約50μl的血液收集于肝素化毛細(xì)管中。離心后得到血漿(980xg 5分鐘)。如Yasuda和Johnston(Endocrinology，130708-716(1992))先前所述檢測酶。
            
發(fā)現(xiàn)注射前所有大鼠的平均血漿PAF-AH活性為75.5±2.5單位(1單位等于1nmole×分鐘-1×ml-1血漿)。注射載體后15分鐘的平均血漿PAF-AH活性為組1為75.2±2.6單位、組3為76.7±3.5單位。15分鐘后，用25,500單位rPH.2注射的動(dòng)物的血漿PAF-AH活性為組2為2249±341單位和組4為2494±623單位。組2和4的活性保持較高(1855±257單位)直至處死時(shí)(rPH.2注射后2.25小時(shí))(組2＝1771±308；組4＝1939±478)。這些結(jié)果表明，僅用載體注射的大鼠的血漿PAF-AH活性(組1和3)在實(shí)驗(yàn)過程中沒有改變。所有僅接受PAF注射的動(dòng)物都有NEC發(fā)展，而用rPH.2注射接PAF注射的大鼠受到完全保護(hù)。
            
2 NEC預(yù)防的劑量依賴性為確定大鼠中對抗NEC的保護(hù)是否是劑量依賴的，在PAF給予之前15分鐘用增加劑量的rPH.2處理動(dòng)物。起初，將25.5-25,500單位范圍的rPH.2給予大鼠尾靜脈。然后將PAF(0.2ml BSA鹽水中0.4μg)在給予rPH.2后15分鐘注射入腹主動(dòng)脈。PAF給予2小時(shí)后取出小腸，檢查NEC的發(fā)展。在外源給予該酶之前和rPH.2給予后2.25小時(shí)后測定血漿PAF-AH活性。結(jié)果是每組中2-5只動(dòng)物的平均值。
            
大體檢查的發(fā)現(xiàn)表明，所有接受小于2,000單位該酶的大鼠發(fā)展了NEC。接受最低保護(hù)量(2040單位)酶的動(dòng)物中在15分鐘后血漿PAF-AH活性是每毫升血漿363單位，代表高出基底水平5倍。當(dāng)以低于1,020總單位給予rPH.2時(shí)，得到的血漿酶活性平均約為160或更低，所有的動(dòng)物者發(fā)展了NEC。
            
3.對抗NEC的保護(hù)的時(shí)間長度為確定外源PAF-AH產(chǎn)物提供對NEC發(fā)展的保護(hù)的時(shí)間長度，通過尾靜脈對大鼠注射一次固定量的該酶，接著在不同的時(shí)間點(diǎn)用PAF攻擊。將rPH.2(0.3ml中8,500單位)或僅用載體給予大鼠尾靜脈中，將PAF(0.2ml BSA鹽水中0.36μg)于該酶給予后不同時(shí)間注射入腹主動(dòng)脈。PAF注射后2小時(shí)取出小腸，進(jìn)行大體檢查和組織學(xué)檢查以評(píng)價(jià)NEC發(fā)展。在酶給予后不同時(shí)間和PAF給予后2小時(shí)測定血漿PAF-AH活性。確定每個(gè)組的酶活性平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
            
結(jié)果表明，在注射rPH.2后的前8小時(shí)內(nèi)沒有大鼠發(fā)展NEC，但是在注射該酶的24和48小時(shí)后用PAF攻擊的動(dòng)物100％地發(fā)展NEC。
            
4.NEC的逆轉(zhuǎn)為確定給予PAF-AH產(chǎn)物是否可以逆轉(zhuǎn)由PAF注射誘導(dǎo)的NEC的發(fā)展，將25,500單位的該酶在給予PAF(0.4μg)之后2分鐘通過注射入大靜脈給予。沒有動(dòng)物發(fā)展NEC。但是，當(dāng)在注射PAF后15分鐘通過該途徑給予rPH.2時(shí)，所有的動(dòng)物均發(fā)展NEC，與Furukawa等[見上述]先前報(bào)道的通過給予PAF誘導(dǎo)的NEC發(fā)展的快速時(shí)間進(jìn)程是一致的。
            
這些觀察的總結(jié)表明，血漿PAF-AH活性的相對較小的增加(5倍)可以防止NEC。這些觀察與先前已證實(shí)胎兔[Maki，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85728-732(1988)]和早產(chǎn)嬰兒[Caplan，等，J.Pediatr.116908-964(1990)]中血漿PAF-AH活性相對較低的報(bào)道相結(jié)合，提示向低出生重量嬰兒預(yù)防性給予人重組PAF-AH產(chǎn)物可以用于治療NEC。
            
B.NEC新生兒模型中的活性如下述在NEC模型中評(píng)價(jià)PAF-AH產(chǎn)物rPH.2的效力，該模型中通過配方飼喂和窒息這二種人類疾病的常見風(fēng)險(xiǎn)因子協(xié)迫新生大鼠。在該模型中，在生命的第3天，約70-80％的動(dòng)物發(fā)展了與新生兒NEC類似的大體上的和顯微水平的腸損傷。從用CO2麻醉并通過腹部切口接生的懷孕Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)得到新生大鼠。收集新生動(dòng)物，干燥，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中在新生兒保育箱中保持。
            
首先，使用獨(dú)立的動(dòng)物組評(píng)價(jià)rPH.2的給予和吸收特征。于時(shí)間0點(diǎn)給予正常新生大鼠仔三種不同的腸或腹膜內(nèi)劑量的rPH.2 (3λ，15λ或75λ)之一，于1小時(shí)、6小時(shí)或24小時(shí)后收集血液以評(píng)價(jià)血漿PAF-AH活性。使用底物溫育檢測[Gray等，Nature，374549(1995)]和使用每個(gè)樣本的抗人rPAF-AH單克隆抗體(90F2D和90G11D，描述于實(shí)施例13中)的ELISA，測定PAF-AH活性。對于選擇的樣本，使用針對人rPAF-AH開發(fā)的二種不同的單克隆抗體(90F2D和90G11D，描述于實(shí)施例13中)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。采用使用1∶100稀釋的抗體和過夜溫育的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行免疫組織化學(xué)。
            
在正常新生大鼠腸道給予rPH.2之后，在任何時(shí)間點(diǎn)使用或者底物溫育檢測或者ELISA技術(shù)都沒有可檢測的血漿PAF-AH活性。使用腹膜內(nèi)給予rPH.2時(shí)，在給藥后1小時(shí)，使用這二種方法都有可檢測的顯著的循環(huán)PAF-AH活性，該活性在6小時(shí)達(dá)到高峰。較高劑量的rPH.2(從3至75λ，10-250U)導(dǎo)致較高的血漿PAF-AH活性。免疫組織化學(xué)分析揭示，在腸給藥后在腸粘膜的上皮細(xì)胞中存在rPAF-AH產(chǎn)物。該反應(yīng)性主要在腸絨毛中聚集，隱窩細(xì)胞中染色最少?；啬c中的染色比空腸多，在結(jié)腸的部分中免疫化學(xué)鑒別了一些rPAF-AH產(chǎn)物。在任何對照樣本中或在從通過腹膜內(nèi)給藥的動(dòng)物中獲得的樣本中沒有任何可證實(shí)的染色。因此，腸給予rPAF-AH產(chǎn)物導(dǎo)致該酶的局部粘膜上皮積累，沒有任何可檢測的系統(tǒng)性吸收，而與之相反，腹膜內(nèi)給予rPAF-AH產(chǎn)物導(dǎo)致高循環(huán)酶水平，但沒有局部粘膜積累。
            
在所述NEC模型中，按照Caplan等，Pediatr.Pathol.，141017-1028(1994)在新生大鼠中誘導(dǎo)NEC。簡言之，用從粉末(Esbiliac，Borden Inc)重構(gòu)的新生鼠仔配方每隔3小時(shí)通過飼喂管喂動(dòng)物。飼喂體積以0.1ml/飼喂起始，根據(jù)耐受提高至該方案的第4天。所有的動(dòng)物通過每日在密閉的塑料箱內(nèi)呼吸二次100％氮?dú)?0秒鐘，并暴露于冷凍(4℃)10分鐘，用窒息侵?jǐn)_(asphyxial insalt)攻擊。用每次飼喂后，以柔和操縱刺激腸道和膀胱功能。將動(dòng)物保持96小時(shí)或直至它們顯示痛苦的癥狀。發(fā)病的動(dòng)物腹脹、血糞、呼吸窘迫、發(fā)紺和昏睡，通過斷頭術(shù)無痛致死。處死后，大體檢查每只大鼠腸的壞死跡象，然后福爾馬林固定以進(jìn)行以后的組織學(xué)分析。將樣本以石蠟包埋，用切片機(jī)切片，用蘇木精和曙紅染色，由二個(gè)觀察者以盲法檢查。將腸損傷打分，1+是上皮細(xì)胞提升或分離、2+是上皮細(xì)胞脫去至中等絨毛(mid-villous)水平、3+是整個(gè)絨毛壞死、4+是透壁壞死。
            
為評(píng)價(jià)rPH.2的效力，用該化合物通過腸傳遞、腹膜內(nèi)傳遞或同時(shí)用這二種方法處理3個(gè)不同的大鼠組。該rPH.2制備物具有0.8mg/ml蛋白和約4000單位/mg PAF-AH活性，＜0.5EU/mg內(nèi)毒素/蛋白比例。通過口胃管將稀釋入每次飼喂(每隔3小時(shí))的25λ(80U)的rPH.2腸道給藥的動(dòng)物。通過每天二次的腹膜內(nèi)注射給予腹膜內(nèi)給藥的動(dòng)物75λ。對照動(dòng)物接受了不含rPH.2的適當(dāng)體積的緩沖液(20mM NaPO4，pH7.4)，與每個(gè)實(shí)驗(yàn)組同時(shí)研究。對每個(gè)處理組評(píng)價(jià)死亡率和NEC癥狀，使用FischerExact檢測統(tǒng)計(jì)分析差異。＜0.05的p-值被認(rèn)為顯著。結(jié)果示于以下的表9。
            
表9NEC 死亡對照(腹膜內(nèi)給予) 7/10   8/10rPH.2(240U每天2次腹膜內(nèi)) 6/11   8/11對照(腸道給予)  19/26  21/26rPH.2(每隔3小時(shí)腸道給予806/26   7/26U)對照(腹膜內(nèi)+腸道給予)  10/17  12/17rPH.2(每天2次腹膜內(nèi)給予240   3/14   7/14U和每隔3小時(shí)腸道給予80U)數(shù)據(jù)代表腹膜內(nèi)給藥的四個(gè)不同實(shí)驗(yàn)、腸道給藥的四個(gè)實(shí)驗(yàn)和腹膜內(nèi)+腸道給藥的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的累積結(jié)果。
            
與對照動(dòng)物相比，腸道rPH.2給予顯著地降低了NEC和死亡的發(fā)生率。四個(gè)不同的腸道給藥的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，用rPH.2預(yù)處理將NEC從19/26(對照)降低至6/26(p＜0.001)。在處理和對照動(dòng)物之間腸損傷是可變，但是大多數(shù)情況下特征為一些節(jié)中的中等絨毛壞死、在其它區(qū)域中的全部絨毛壞死、有時(shí)有透壁壞死區(qū)、剩余部分具有正常小腸組織學(xué)。具有腸損傷的處理動(dòng)物和對照動(dòng)物的NEC的最壞程度是類似的(對照的平均打分為2.8，rPH.2處理的大鼠的平均打分為2.4，p＞0.05)。
            
腹膜內(nèi)給藥rPH.2對該模型的NEC或死亡無顯著影響。癥狀的發(fā)生在該組與對照之間是類似的(對照為40±5小時(shí)，rPH.2處理的大鼠為36±7小時(shí))，這二組中NEC的程度是類似的(對照的平均打分為2.6，rPH.2處理大鼠的平均打分為2.5)。
            
進(jìn)行了其它的實(shí)驗(yàn)，其中對大鼠用與單處理組相同的劑量，即進(jìn)行腸道亦進(jìn)行腹膜內(nèi)給藥rPH.2(每隔3小時(shí)在每次飼喂中25λrPH.2，加上每天二次通過腹膜內(nèi)注射75λ)。結(jié)果示于上述表9中。盡管處理組和對照組在死亡率方面沒有顯著差異，rPH.2處理顯著地降低了NEC的發(fā)生率(對照中10/17，rPH.2處理大鼠中3/14，p＝0.04)。應(yīng)注意，rPH.2處理組中死亡的7只動(dòng)物中的6只在死亡前得到的血液培養(yǎng)物中大腸桿菌陽性。
            
這些結(jié)果進(jìn)一步支持PAF-AH產(chǎn)物在非PAF誘導(dǎo)的NEC的新生兒模型中的保護(hù)作用。用rPAF-AH產(chǎn)物進(jìn)行腸道處理防止了NEC，而此劑量的腹膜內(nèi)處理沒有可證實(shí)的效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)提示，用于有NEC風(fēng)險(xiǎn)的配方喂養(yǎng)的未成熟新生兒補(bǔ)充PAF-AH產(chǎn)物可以降低該疾病的發(fā)生率。
            
實(shí)施例18
            
檢測了PAF-AH產(chǎn)物在急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)豚鼠模型中的效力。
            
靜脈內(nèi)注射入豚鼠的血小板激活因子(PAF)在人類中產(chǎn)生了早期ARDS的顯著肺炎癥回憶。靜脈內(nèi)給予PAF幾分鐘內(nèi)，肺實(shí)質(zhì)充血，支氣管和細(xì)支氣管收縮[Lellouch-Tubiana等，見上述]。血小板和多形核嗜中性白細(xì)胞開始壁立，沿著肺的小動(dòng)脈可以容易地鑒別細(xì)胞聚集物[Lellouch-Tubiana，Br.J.Exp.Path.，66345-355(1985)]。PAF輸注亦破壞支氣管上皮細(xì)胞，其從氣道壁分離并在氣道腔中聚集。對氣道上皮細(xì)胞的這種破壞與在ARDS發(fā)展的人類中發(fā)生的透明膜形成是一致的。嗜中性白細(xì)胞和血小板壁立，緊接著這些細(xì)胞血細(xì)胞滲出進(jìn)入肺的肺泡隔和肺泡腔。由PAF引發(fā)的細(xì)胞浸潤伴隨著導(dǎo)致氣道水腫的顯著的血管泄漏[Kirsch，Exp.Lung Res.，18447-459(1992)]。水腫的證據(jù)受到體外研究的進(jìn)一步支持，其中PAF在灌注的豚鼠肺中誘導(dǎo)了125I標(biāo)記的血纖蛋白原的劑量依賴性(10-1000ng/ml)外滲[Basran，Br.J.Pharmacol.，77437(1982)]。
            
基于上述觀察，開發(fā)了豚鼠ARDS模型。將插管置于麻醉的雄性Hartly豚鼠(約350-400克)的頸靜脈中，將在500μl體積的做為載體的含有0.25％牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水(PBS-BSA)中稀釋的PAF，以100-400ng/kg范圍的總劑量在15分鐘時(shí)間內(nèi)輸注。在PAF輸注后各種時(shí)間點(diǎn)，處死動(dòng)物，收集肺組織。在用PAF輸注的豚鼠中，到15分鐘時(shí)劑量依賴性肺損傷和炎癥是非常明顯的，在60分鐘時(shí)繼續(xù)存在。嗜中性白細(xì)胞和紅血細(xì)胞存在于PAF處理的豚鼠的肺泡腔，但在對照或假輸注動(dòng)物中不存在。上皮細(xì)胞破壞的證據(jù)亦是明顯的，是人ARDS患者透明膜形成的回憶。從用PAF輸注的豚鼠取得的支氣管肺泡灌洗(BAL)樣本的蛋白測定，顯示炎癥肺中蛋白的顯著積累，是血管泄漏的明顯證據(jù)。
            
發(fā)現(xiàn)rPH.2在ARDS豚鼠模型中完全保護(hù)免受PAF介導(dǎo)的肺損傷。用或者rPH.2(500μl中2000單位)或僅500μl PAF-AH緩沖液預(yù)處理豚鼠組。15分鐘后用500μl體積中的400ng/kg PAF輸注這些豚鼠，在15分鐘時(shí)間內(nèi)輸注。另外，用500μl PBS-BSA輸注豚鼠假組。PAF輸注完成后，處死動(dòng)物，通過用含有2μ/ml肝素的10ml鹽水灌洗肺二次，以防止凝血收集BAL流體。為測定BAL中的蛋白濃度，將樣品在鹽水中稀釋1∶10，測定OD280。發(fā)現(xiàn)假處理豚鼠的BAL流體的蛋白濃度為2.10±1.3mg/ml。與之截然相反，發(fā)現(xiàn)用PAF輸注的動(dòng)物的BAL流體的蛋白濃度為12.55±1.65mg/ml。在用rPH.2預(yù)處理的豚鼠中，發(fā)現(xiàn)BAL流體的蛋白濃度為1.13±0.25mg/ml，這與假處理對照相當(dāng)，證實(shí)PAF-AH產(chǎn)物完全阻斷了對PAF應(yīng)答的肺水腫。
            
實(shí)施例19在二個(gè)不同的急性胰腺炎模型中評(píng)價(jià)了PAF-AH產(chǎn)物rPH.2的效力。A.大鼠胰腺炎模型中的活性從Charles River Laboratories(Wilmngton，MA)購買雄性Wistar大鼠(200-250g)。將其置于23±2℃、具有12小時(shí)光/暗循環(huán)的控制環(huán)境房間中，用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物(chew)和水隨意飼養(yǎng)動(dòng)物。將動(dòng)物隨機(jī)分配至或者對照組或者實(shí)驗(yàn)組。用50mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)麻醉大鼠，通過切入頸動(dòng)脈安放聚乙烯導(dǎo)管(V3大小，Biolab products，Lake Havasu，AZ)。將導(dǎo)管皮下穿插至露出頸背側(cè)區(qū)域，使動(dòng)物從麻醉蘇醒。使大鼠得到水，但禁食過夜。對清醒的動(dòng)物于次日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在間歇期間，通過持續(xù)輸注鹽水(0.2ml/h)保持導(dǎo)管開放。在實(shí)驗(yàn)日，用rPH.2或載體對照靜脈內(nèi)注射動(dòng)物，接著輸注或者(1)每小時(shí)5μg/kg雨蛙肽3.5小時(shí)，或者(2)每小時(shí)10μg/kg雨蛙肽5小時(shí)，(Research Plus，Bayonne，NJ)。輸注完成后，立即用戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，切開其腹部，從下腔靜脈吸取5ml血液以進(jìn)行后續(xù)檢測。然后通過放血處死動(dòng)物。測定血清淀粉酶、血清脂酶和血清膽紅素，收集胰臟。將胰臟塊或者在4％磷酸緩沖甲醛溶液中固定以進(jìn)行組織學(xué)檢測，或者立即深凍于-80℃以測定髓過氧化物酶活性。如下述評(píng)價(jià)其它胰臟塊的胰臟含水量和胰臟淀粉酶和胰蛋白酶。如下述在胰臟和肺中評(píng)價(jià)做為嗜中性白細(xì)胞匯集(sequestration)的測定的髓過氧化物酶活性。亦如下述評(píng)價(jià)肺血管通透性。使用未配對斯氏t檢驗(yàn)完成數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。報(bào)告的數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均±S.E.M.。當(dāng)p＜0.05時(shí)，將結(jié)果中的差異認(rèn)為顯著的。
            
1.胰臟含水量將胰臟塊吸干、稱重(濕重)，然后于120℃干燥34小時(shí)，再稱重(干重)。將濕重和干重之間的差異計(jì)算為胰臟含水量并以胰臟濕重的百分比表達(dá)。認(rèn)為胰臟含水量升高是水腫的發(fā)展。
            
2.血清和胰臟淀粉酶使用4，6-亞乙基(G7)-對硝基苯(G1)-α1D-maltoplaside(ET-G7PNP)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)做為底物，按照Pierre等，Clin.Chem.，221219(1976)測定血清中淀粉酶活性。使用同樣方法測定勻漿于10mM磷酸緩沖液pH7.4中的胰臟組織的淀粉酶活性。
            
3.胰臟胰蛋白酶使用Boc-Gin-Ala-Arg-MCA做為底物，熒光測定胰蛋白酶活性。簡言之，在杯中混合200μl的樣品和2.7ml的含有150mM NaCl、1mMCaCl2和0.1％牛血清白蛋白的50mM Tris緩沖液(pH8.0)。預(yù)溫育20秒鐘后，將100μl底物加入樣品開始反應(yīng)。讀取熒光讀數(shù)(激發(fā)380nm，發(fā)射440nm)，以斜率表達(dá)。為合并不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，將多個(gè)部分中的胰蛋白酶活性表達(dá)為總胰蛋白酶活性的百分比。
            
4.組織學(xué)和形態(tài)計(jì)量法對于光學(xué)顯微術(shù)，將胰臟的頭、體和尾的完整的隨機(jī)橫切片在10％中性磷酸緩沖福爾馬林中固定。將石蠟包埋的5μm切片用蘇木精-曙紅(H&E)染色，由熟練的形態(tài)學(xué)家以盲式檢查。將腺泡細(xì)胞損傷/壞死定義為或者(a)存在腺泡細(xì)胞空胞或(b)腺泡細(xì)胞空泡形成和膨脹、腺泡的整個(gè)或部分組織結(jié)構(gòu)破壞，這二者都與炎癥反應(yīng)相關(guān)。使用裝備有NIH-1200圖象分析軟件的計(jì)算機(jī)化面積計(jì)圖象分析視頻裝置(CCD-72型，Dage-MTI，Michigan city，IN)，對腺泡細(xì)胞損傷/壞死的數(shù)量和腺泡組織占據(jù)的總面積進(jìn)行形態(tài)計(jì)量定量。對每個(gè)組織樣本檢查10個(gè)隨機(jī)選擇的顯微鏡視野(125x)。以由符合損傷/壞死標(biāo)準(zhǔn)的面積所占據(jù)的總腺泡組織的百分比表達(dá)腺泡細(xì)胞損傷/壞死的程度。
            
5.胰臟和肺髓過氧化物酶(MPO)活性測定通過測定組織過氧化物酶活性評(píng)價(jià)胰臟和肺中嗜中性白細(xì)胞匯集。將處死時(shí)收集的組織樣本儲(chǔ)存于-70℃直至檢測。將樣本(50mg)解凍并在1ml 20mM磷酸緩沖液(pH7.4)中勻漿和離心(10,000xg，10分鐘4℃)。將產(chǎn)生的沉淀再懸浮于含有0.5％溴化十六烷基三甲基銨(Sigma，St Louis，MO)的50mM磷酸緩沖液(pH6.0)中，進(jìn)行四個(gè)循環(huán)的冷凍-解凍。然后通過超聲處理40秒鐘進(jìn)一步破碎懸浮液和離心(10,000xg，5分鐘4℃)。將由所述提取的酶、1.6mM N-四甲聯(lián)苯胺(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)、80mM磷酸鈉緩沖液(pH5.4)和0.3mM過氧化氫的反應(yīng)混合物于37℃溫育110秒鐘，在CobasBio自動(dòng)分析儀中測定655nm的吸收。然后針對組織樣本的部分干重校正該吸收值。
            
6.測定肺血管通透性胰膽總管的梗阻亦通常導(dǎo)致可以由肺血管通透性和組織檢查定量的嚴(yán)重胰腺炎相關(guān)肺損傷。
            
處死動(dòng)物前2小時(shí)，給予靜脈內(nèi)大劑量注射5mg/kg異硫氰酸熒光素白蛋白(FITC-白蛋白，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。通過定量FITC-白蛋白從血管腔泄漏入支氣管肺泡腔，評(píng)價(jià)肺微血管通透性。簡言之，剛剛處死后，使用鉗子阻斷右支氣管，暴露出氣管。接著，通過使用插入氣管的插管灌洗右肺。合并三次鹽水(60ml灌洗液)洗液，于激發(fā)494nm和發(fā)射520nm下測定血清和灌洗液中的FITC熒光。計(jì)算灌洗液與血液的熒光比例，做為肺中微血管通透性的測定。亦用H&E將肺染色并進(jìn)行組織學(xué)檢查。
            
7.雨蛙肽和rPH.2給予的影響僅用雨蛙肽以5μg/kg/小時(shí)輸注3.5小時(shí)，導(dǎo)致大鼠中典型的輕度促分泌素誘導(dǎo)的胰腺炎，其特征是血淀粉酶過多、由胰臟含水量測定的胰臟水腫和包括顯著的腺泡細(xì)胞空泡化和胰臟水腫的組織學(xué)變化。對照動(dòng)物中的鹽水輸注不會(huì)導(dǎo)致這些生物化學(xué)或組織學(xué)變化。在開始雨蛙肽輸注之前30分鐘。靜脈內(nèi)給予5、10或20mg/kg的rPH.2，不會(huì)顯著改變由僅輸注雨蛙肽誘導(dǎo)的胰臟水腫(含水量)和組織學(xué)變化的程度。給予rPH.2亦對雨蛙肽誘導(dǎo)的胰臟胰蛋白酶原的激活或淀粉酶含量沒有影響。
            
以較高計(jì)量的雨蛙肽即10μg/kg/小時(shí)向大鼠輸注5小時(shí)，導(dǎo)致更加嚴(yán)重的胰腺炎，與對照相比其特征在于血清淀粉酶活性和胰臟水腫的更顯著的增加、胰臟MPO活性的顯著增加和胰臟中胰蛋白酶原激活和淀粉酶活性的顯著增加。胰臟組織學(xué)表明，不僅有胰臟水腫和腺泡細(xì)胞空泡化，亦有一些片狀壞死和少量浸潤細(xì)胞。
            
在開始輸注雨蛙肽(10μg/kg/小時(shí))之前30分鐘給予rPH.2(5或10mg/kg靜脈內(nèi))，減輕了由僅輸注雨蛙肽誘導(dǎo)的許多胰臟變化的程度。結(jié)果示于以下表10中。劑量為5mg/kg的rPH.2處理導(dǎo)致血清淀粉酶活性降低(從10984±1412至6763±1256)。較高的10mg/kg rPH.2劑量未導(dǎo)致血淀粉酶過多的進(jìn)一步改善。用或者5或者10mg/kg rPH.2處理，亦導(dǎo)致由含水量測定的雨蛙肽誘導(dǎo)的胰臟水腫發(fā)展的一些減退(僅雨蛙肽為90.61±0.27，雨蛙肽+5mg/kg rPH.2為88.21±0.61)。5mg/kg劑量的rPH.2提供了胰臟MPO活性的顯著減輕(僅雨蛙肽為超過對照2.92＋0.32倍，雨蛙肽和rPH.2為1.19＋0.21，p＜0.05)。較高劑量的rPH.2未導(dǎo)致MPO活性的進(jìn)一步提高。這二種劑量的rPH.2都未顯著地改變胰臟中胰蛋白酶原激活或淀粉酶含量。胰臟組織學(xué)表明，在rPH.2預(yù)處理后在顯微壞死和浸潤方面有一些改善。
            
已經(jīng)在臨床上和在胰腺炎的幾個(gè)模型中觀察了胰腺炎相關(guān)的肺損傷。以5μg/kg/小時(shí)輸注雨蛙肽3.5小時(shí)，導(dǎo)致較輕形式的胰腺炎，未導(dǎo)致肺的顯著損傷。但是，以10μg/kg/小時(shí)輸注雨蛙肽5小時(shí)，導(dǎo)致更嚴(yán)重的胰腺炎，亦導(dǎo)致由增加的肺血管通透性(0.31±0.04至0.79±0.09)、肺MPO活性(表明嗜中性白細(xì)胞匯集)和組織學(xué)檢查的嗜中性白細(xì)胞浸潤定量的肺損傷。
            
在輸注雨蛙肽之前30分鐘以5mg/kg的劑量給予rPH.2，顯著地減輕了由僅輸注雨蛙肽誘導(dǎo)的肺MPO活性的上升(僅雨蛙肽為3.55±0.93，雨蛙肽和rPH.2為1.51±0.26)。rPH.2處理顯著地降低了雨蛙肽輸注后在肺組織中觀察到的顯微變化的嚴(yán)重性。rPH.2處理降低了雨蛙肽誘導(dǎo)的肺血管通透性增加，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。在降低雨蛙肽誘導(dǎo)的肺損傷的嚴(yán)重性方面，較高的10mg/kgrPH.2劑量不比較低的劑量更有效。
            
表10對照 雨蛙肽(CER) CER+   CER+(無CER)   10μg/kg/h  5mg/kg rPH.2  10mg/kg rPH.2血清淀粉酶(U/l)   961±17410984±1412 6763±1256   8576±1024胰臟含水量(％濕重)72.71±0.64 90.61±0.27 88.21±0.61  89.00±0.94胰臟MPO(比對照增加 1.0 2.92±0.32  1.19±0.21   1.42±0.19的倍數(shù))胰臟胰蛋白酶活性(1000x斜率/ 0.12±0.06  9.70±2.50  8.33±1.75   9.15±1.28μgDNA)胰臟淀粉酶含量(U/μgDNA)  0.28±0.06  0.42±0.07  0.45±0.04   0.46±0.044肺血管通透性(灌洗液/血清％) 0.31±0.04  0.79±0.09  0.70±0.09   0.70±0.07肺MPO(比對照增加 1.0 3.55±0.93  1.51±0.26   1.64±0.22的倍數(shù))B.負(fù)鼠(opossum)胰腺炎模型中的活性從Scott-Hass得到二種性別的健康、隨機(jī)捕獲的美洲負(fù)鼠(Didelphis virginiana)(2.0kg-4.0kg)，將其置于23±2℃、具有12小時(shí)光/暗循環(huán)的控制環(huán)境房間中，用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物和水隨意飼喂。禁食過夜后，用50mg/kg戊巴比妥鈉(Veterinary Laboratories Inc.，Lenexa，KS)腹膜內(nèi)麻醉大鼠。在無菌條件下通過中線切開進(jìn)行剖腹術(shù)，將所有動(dòng)物的膽胰總管結(jié)扎以誘導(dǎo)急性壞死性胰腺炎。另外，結(jié)扎膽囊管以防止膽囊做為膽汁庫。將動(dòng)物隨機(jī)分配至或者對照或者實(shí)驗(yàn)組。從結(jié)扎胰管的第二天起，實(shí)驗(yàn)組通過尾靜脈靜脈內(nèi)接受每天5mg/kg體重的rPH.2(以4mg/ml的溶液提供)，而對照組僅接受同樣體積的安慰劑載體的靜脈內(nèi)注射。處理后1天和2天(胰管結(jié)扎后第三天和第四天)，使用過量的戊巴比妥鈉將動(dòng)物無痛致死。從心臟抽取血液樣本以測定血清淀粉酶、血清脂酶和血清膽紅素，收集胰臟。將胰臟塊或者在4％磷酸緩沖甲醛溶液中固定以進(jìn)行組織學(xué)檢測，或者立即深凍于-80℃以測定髓過氧化物酶活性。如上述本實(shí)施例的A節(jié)那樣評(píng)價(jià)其它胰臟塊的胰臟含水量和胰臟淀粉酶。如上述在胰臟中評(píng)價(jià)做為嗜中性白細(xì)胞匯集的測定的髓過氧化物酶活性。亦如上述評(píng)價(jià)肺血管通透性。
            
報(bào)告的數(shù)據(jù)代表從三個(gè)或更多的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的多個(gè)測定得到的平均±平均標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。當(dāng)數(shù)據(jù)僅由二組組成時(shí)使用斯氏t-檢驗(yàn)，或當(dāng)比較三組或更多的組時(shí)通過變異分析(ANOVA)，評(píng)價(jià)變化的顯著性。如果ANOVA表明有顯著差異，則使用Tukey方法做為post hoc檢驗(yàn)，分析組間數(shù)據(jù)的差異。當(dāng)p值＜0.05時(shí)，認(rèn)為表明顯著差異。
            
結(jié)果示于表11。胰膽總管梗阻導(dǎo)致以血淀粉酶過多、血脂酶過多和胰臟深度壞死為特征的嚴(yán)重壞死性胰腺炎。另外，胰膽總管梗阻與血清膽紅素水平的顯著增加相關(guān)。胰管結(jié)扎后的第二天開始靜脈內(nèi)給予rPH.2(5mg/kg/天)，減輕了由管梗阻和僅安慰劑處理誘導(dǎo)的許多胰臟變化的程度。與安慰劑處理的動(dòng)物相比，rPH.2處理一天降低了血清淀粉酶水平，盡管該差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，與安慰劑相比，rPH.2處理二天(胰管結(jié)扎后第四天)顯著地降低了血清淀粉酶水平。與對照相比，rPH.2處理一天或二天降低了血清脂酶水平，盡管該差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。與對照相比，rPH.2處理二天降低了胰臟淀粉酶含量，盡管處理一天導(dǎo)致胰臟淀粉酶增加。未觀察到用rPH.2處理影響血清膽紅素水平、胰臟髓過氧化物酶活性或胰臟含水量。
            
由膽胰管梗阻誘導(dǎo)的主要特征性組織學(xué)變化，包括顯著壞死、炎癥細(xì)胞浸潤、腺泡細(xì)胞空泡化和腺泡腔的顯著擴(kuò)張。對胰臟腺泡細(xì)胞損傷的形態(tài)計(jì)量檢查顯示。在rPH.2處理一天和二天后rPH.2對胰臟的主要保護(hù)效應(yīng)。rPH.2處理一天后，腺泡細(xì)胞損傷降低至總腺泡細(xì)胞組織的約23％，與安慰劑處理的動(dòng)物的48％損傷形成對比。處理二天后，腺泡細(xì)胞損傷的這種降低更加顯著，此時(shí)rPH.2處理導(dǎo)致總腺泡細(xì)胞組織的約35％損傷，與安慰劑處理的動(dòng)物的約60％損傷形成對比。
            
由FITC注射定量的肺血管通透性顯示。與安慰劑組相比，rPH.2處理一天和二天后的高度顯著差異。肺的組織學(xué)檢查顯示所有安慰劑處理的動(dòng)物中都有嚴(yán)重的肺損傷。肺損傷的特征為具有主要巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的間質(zhì)和肺泡內(nèi)浸潤的深度炎癥反應(yīng)，以及片狀但是顯著的間質(zhì)水腫和肺泡膜增厚。給予rPH.2導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤的顯著減少和所有時(shí)間的間質(zhì)水腫降低。
            
總之，這些結(jié)果顯示，胰管結(jié)扎后48小時(shí)開始以5mg/kg/天的劑量靜脈內(nèi)給予rPH.2，導(dǎo)致淀粉酶和脂酶血液水平上升的顯著減輕和由H & E染色切片的形態(tài)計(jì)量分析定量的腺泡細(xì)胞損傷的顯著減輕，和胰腺炎誘導(dǎo)的肺損傷的嚴(yán)重性的顯著減輕。在胰腺炎的這個(gè)臨床相關(guān)模型中，給予rPAF-AH產(chǎn)物顯示了降低胰腺炎嚴(yán)重性的有益效應(yīng)。
            
表11處理一天后(于第三天處死)處理二天后(于第四天處死)安慰劑  rPH2.5   安慰劑rPH.25mg/kgmg/kg血清膽紅素(mg/dl)  5.49±0.96  7.10±0.60   6.54±0.55   4.91±0.79血清淀粉酶(U/升)   5618±899   4288±6756538±1355   3106±467*血清脂酶(U/升) 2226±554   1241±2631424±2571023±295胰臟含水量(％) 81.10±0.56 81.52±0.79  80.05±1.07  79.32±0.49胰臟MPO1345±286   1142±83 1149±2321033±130(OD/部分干重)胰臟淀粉酶 706±92 1101±105950±85  712±131(U/μg DNA)肺血管通透性   0.76±0.09  0.21±0.04**0.57±0.13   0.23±0.04*(FITC灌洗液/血清％)腺泡細(xì)胞損傷   48％23％ 60％ 35％(總腺泡組織％)*p＝0.02，與安慰劑相比**p＜0.001，與安慰劑相比實(shí)施例20進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)PAF-AH產(chǎn)物rPH.2對與HIV感染相關(guān)的神經(jīng)毒性的影響。人1型免疫缺陷病毒(HIV-1)感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致由細(xì)胞凋亡引起的神經(jīng)元損失。由各種抗原性刺激包括與神經(jīng)細(xì)胞接觸激活的HIV-1感染的單核細(xì)胞，分泌高水平的神經(jīng)毒性促炎細(xì)胞因子，包括PAF。評(píng)價(jià)了rPH.2對由HIV感染和激活的單核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的神經(jīng)毒性的影響。
            
如下述用HIV感染和激活單核細(xì)胞。在白細(xì)胞提取法(leukopheresis)之后從HIV和乙肝血清陰性供體的外周骨髓細(xì)胞(PBMC)回收單核細(xì)胞，如Genis等，J.Exp.Med.1761703-1718(1992)中所述通過逆流離心淘洗純化(＞98％)。在含有重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MSCF)(Genetics Institute，Inc Cambridge，MA)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)中做為貼壁單層培養(yǎng)細(xì)胞(T-75培養(yǎng)瓶中1×104細(xì)胞/ml)。在這些條件下，單核細(xì)胞分化成為巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)7-10天后，以感染復(fù)數(shù)(MOI)0.01的感染性病毒粒子/靶細(xì)胞將巨噬細(xì)胞暴露給HIV-1ADA(保藏號(hào)碼M60472)。在這些條件下，20-50％的單核細(xì)胞在HIV-1接種后7天被感染，由免疫熒光和原位雜交技術(shù)可以確定[Kalter等，J.Immunol.，146298-306(1991)]。每隔2-3天，用新鮮培養(yǎng)基再流加所有的培養(yǎng)物。HIV-1感染后5-7天和在按照Kalter等，見上述評(píng)價(jià)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性高峰期(107cpm/ml)，將HIV-1感染的培養(yǎng)物和未感染單核細(xì)胞的平行培養(yǎng)物用LPS(10ng/ml)或載體于37℃刺激30分鐘，然后于-80℃快速冷凍直至用于神經(jīng)毒性檢測。
            
如下述建立人大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物。按照修改的Banker和Cowan，Brain Res.，126397-425(1977)的程序，從第二個(gè)三個(gè)月(妊娠13-16周)的人胎兒腦組織端腦得到人胎兒腦組織。簡言之，收集腦組織，在30ml冷Hank BSS(含有Ca+2和Mg+2+25mM HEPES和5X慶大霉素)中洗滌，從粘附的腦脊膜和血液分離，切成2mm3塊。將組織壓迫通過230μM Nitex袋并通過火焰打磨的Pasteru吸管研磨10-15次。將組織于4℃于550rpm離心5分鐘，將沉淀再懸浮于5-10ml的含有N1組分(胰島素，5mg/l；運(yùn)鐵蛋白，5mg/l；亞硒酸鹽，5μg/l；孕酮20nM；腐胺，100μMM)以及10％胎牛血清(FCS)、PSN抗生素混合物(青霉素，50mg/l；鏈霉素，50mg/l；新霉素，100mg/l)和兩性霉素(2.5mg/l)的MEM-hipp(D-葡萄糖，5g/l；L-谷氨酰胺，2mM；HEPES，10mM；丙酮酸鈉，1mM；KCl，20mM)中。通過用0.4％錐蟲藍(lán)稀釋Hank BSS(1∶1 v/v)并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)測定細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率。用10ml吸管柔和研磨細(xì)胞5次，以105細(xì)胞/12mm玻璃蓋玻片的密度植板，所述蓋玻片用多聚-L-賴氨酸(70K-150K MW，Sigma，St.Louis，MO)預(yù)包被，置于24孔培養(yǎng)皿中。將1ml培養(yǎng)基吸入每個(gè)培養(yǎng)孔。在5％ CO2/95％空氣的濕潤空氣中于37℃培養(yǎng)細(xì)胞10-28天，每隔3天更換培養(yǎng)基。在這些條件下，培養(yǎng)物是＞60-70％均質(zhì)的神經(jīng)元，有20-30％星形膠質(zhì)細(xì)胞，＜1％小膠質(zhì)和～10％巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)染色。培養(yǎng)14-28天后，神經(jīng)元培養(yǎng)物表達(dá)足夠水平的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)或非-NMDA受體，在給予NMDA或α-氨基-3-羥基-5-甲基-4異噁唑丙酸(AMPA)興奮毒性(excitotoxic)劑量后死亡。
            
如下述進(jìn)行神經(jīng)毒性檢測。將測試樣品以1∶10 v/v濃度用于神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物24小時(shí)，測試樣品是(a)LPS刺激的HIV-1感染的單核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，(b)對照培養(yǎng)基，(c)含有以51μg/ml添加的rPH.2的條件培養(yǎng)基或(d)添加了rPH.2的載體的條件培養(yǎng)基。使用市售藥盒(Apop Tag；ONCOR，Gaithersburg，MD)，通過在4％多聚甲醛中固定的神經(jīng)元蓋玻片上原位鑒別凋亡細(xì)胞核而測定神經(jīng)毒性，該藥盒使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)以將洋地黃毒苷-dUPT結(jié)合至新酶切DNA的游離3’-OH端(TUNEL染色)。使用計(jì)算機(jī)化形態(tài)計(jì)量儀(MCID，Imaging Research，St.Catherine，Ontario，Canada)，分析≥15個(gè)隨機(jī)選擇的顯微鏡視野中TUNEL染色的神經(jīng)元的數(shù)字化圖象的每個(gè)50X視野的TUNEL染色細(xì)胞核數(shù)量/總神經(jīng)元數(shù)。以TUNEL染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞核百分比±SEM表達(dá)數(shù)據(jù)，示于圖13中。通過ANOVA或配對t-檢驗(yàn)確定對照和實(shí)驗(yàn)處理之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)，顯著性為p≤0.05。這些培養(yǎng)物的定量確認(rèn)了HIV感染并激活的單核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，在大腦皮層神經(jīng)元的總?cè)后w中的接近25％中誘導(dǎo)了神經(jīng)元細(xì)胞死亡，rPH.2可以將該毒性降低至小于總神經(jīng)元的5％。rPH.2自身無神經(jīng)毒性，因?yàn)?0μg/mlrPH.2與用對照培養(yǎng)基處理的培養(yǎng)物相比對神經(jīng)元細(xì)胞死亡沒有影響。這些結(jié)果清楚地表明，通過使用激活的HIV感染的單核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的主要成分一定是因?yàn)镻AF，因?yàn)橥ㄟ^與PAF-AH產(chǎn)物共溫育可以幾乎完全消除神經(jīng)毒性，該酶對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PAF的代謝負(fù)責(zé)。這些發(fā)現(xiàn)提示。在治療與HIV-1感染相關(guān)的CNS神經(jīng)疾病中潛在的治療干預(yù)。
            
實(shí)施例21接近4％的日本人口的血漿PAFAH活性水平低或不可檢測。這種缺陷已與哮喘兒童的嚴(yán)重呼吸綜合癥相關(guān)[Miwa等，J.Clin.Invest.，821983-1991(1988)1，這種兒童看來以常染色體隱性方式遺傳了這種缺陷。
            
為確定是否這種缺陷由無活性但是存在的酶或由不能合成PAF-AH引起，檢測多個(gè)PAF-AH活性缺陷的患者血漿的PAF-AH活性(通過實(shí)施例10對轉(zhuǎn)染體描述的方法)和如下在夾心ELISA中使用單克隆抗體90G11D和90F2D(實(shí)施例13)檢測PAF-AH的存在。用100ng/孔的單克隆抗體90G11D包被Immulon 4平底板(Dynatech，Chantilly，VA)并儲(chǔ)存過夜。用在CMF-PBS中稀釋的0.5％魚皮明膠(Sigma)于室溫封閉所述板1小時(shí)，然后洗滌3次。在含有15mM CHAPS的PBS中稀釋患者血漿，加入板的每個(gè)孔中(50μl/孔)。于室溫溫育這些板1小時(shí)，洗滌4次。將通過標(biāo)準(zhǔn)方法生物素化并在PBST中稀釋的50μl 5μg/ml單克隆抗體90F2D加入每個(gè)孔中，于室溫溫育這些板1小時(shí)，然后洗滌3次。接著將在CMF-PBST中稀釋1/1000的50μl ExtraAvidin(Sigma)加入每個(gè)孔中，將這些板在顯色之前于室溫溫育1小時(shí)。
            
觀察到PAF-AH活性與酶水平的直接相關(guān)?；颊哐逯腥狈钚杂扇狈蓹z測的酶所反映。類似地，具有一半正?；钚缘难獫{樣本含有一半正常水平的PAF-AH。這些觀察提示，PAF-AH活性缺陷是由于不能合成該酶或由于所述單克隆抗體不能識(shí)別的無活性酶引起的。
            
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示，該缺陷是由于人血漿PAF-AH基因的遺傳損害。分離了PAF-AH缺陷個(gè)體的基因組DNA，用做用PAF-AH基因特異性引物的PCR反應(yīng)的模板。首先擴(kuò)增一個(gè)個(gè)體的每個(gè)編碼序列外顯子并測序。觀察到外顯子9內(nèi)的單個(gè)核苷酸變化(SEQ ID NO7的位置996的G變?yōu)門)。該核苷酸變化導(dǎo)致PAF-AH序列(V279F)的位置279的纈氨酸被苯丙氨酸置換。從發(fā)現(xiàn)具有同樣點(diǎn)突變的另外11個(gè)PAF-AH缺陷個(gè)體的基因組DNA擴(kuò)增外顯子9。
            
為測試該突變是否削弱了該酶，通過與實(shí)施例10中描述的類似的方法制備含有該突變的大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建物。當(dāng)導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，該表達(dá)構(gòu)建物未產(chǎn)生PAF-AH活性，而沒有該突變的對照構(gòu)建物有完全活性。該氨基酸置換大概導(dǎo)致結(jié)構(gòu)修飾，該修飾引起了觀察到的活性缺陷和缺乏與本發(fā)明的PAF-AH抗體的免疫反應(yīng)性。
            
因此本發(fā)明的PAF-AH特異性抗體可以用于檢測血清中PAF-AH異常水平(正常水平為約1-5U/ml)和跟蹤用PAF-AH的治療病理病癥的進(jìn)展的診斷方法。另外，鑒別PAF-AH基因中的基因損害使得可以篩選日本患者表現(xiàn)出的PAF-AH缺陷。該突變造成增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Mae II)，因此使得可以用限制性長度多態(tài)性(RFLP)分析的簡單方法區(qū)分活性和突變等位基因。參見Lewin，第136-141頁，載于Genes V，Oxford University Press，New York，New York(1994)。
            
通過用MaeII消化DNA、DNA印跡和與外顯子9探針(SEQ ID NO17的核苷酸1-396)雜交，進(jìn)行篩選12個(gè)PAF-AH缺陷患者的基因組DNA。發(fā)現(xiàn)所有的患者均具有與所述突變等位基因一致的RFLP。
            
雖然已在具體實(shí)施方案中描述本發(fā)明，但應(yīng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到多種變化和修飾。因此，只有附錄的權(quán)利要求書中出現(xiàn)的這種限制才能限制本發(fā)明。序列表(1)一般資料(i)申請人ICOS CORPORATION(ii)發(fā)明名稱血小板激活因子乙酰水解酶(iii)序列數(shù)30(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive(C)城市芝加哥(D)州Illinois(E)國家美國(F)郵政編碼60606-6402(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Rin-Laures，Li-Hsien(B)注冊號(hào)33,547(C)參考/檔案號(hào)27866/34026(ix)電信資料(A)電話(312)474-6300(B)傳真(312)474-0448(C)電傳25-3658(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
            
(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala1   5   10  15Phe(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述 SEQ ID NO2Ile Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro1   5   10  15(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly1   5   10(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置基團(tuán)(13，21，27)(C)其它信息/注釋＝″于每個(gè)這些位置的核苷酸為肌苷?！?xi)序列描述SEQ ID NO4ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA32(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG   30(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
            
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC32(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度1520個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型eDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置162..1484(xi)序列描述SEQ ID NO7GCTGGTCGGA GGCTCGCAGT GCTGTCGGCG AGAAGCAGTC GGGTTTGGAG CGCTTGGGTC  60GCGTTGGTGC GCGGTGGAAC GCGCCCAGGG ACCCCAGTTC CCGCGAGCAG CTCCGCGCCG 120CGCCTGAGAG ACTAAGCTGA AACTGCTGCT CAGCTCCCAA G ATG GTG CCA CCC 173Met Val Pro Pro1AAA TTG CAT GTG CTT TTC TGC CTC TGC GGC TGC CTG GCT GTG GTT TAT   221Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu Ala Val Val Tyr5  10  15  20CCT TTT GAC TGG CAA TAC ATA AAT CCT GTT GCC CAT ATG AAA TCA TCA   269Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His Met Lys Ser Ser25  30  35GCA TGG GTC AAC AAA ATA CAA GTA CTG ATG GCT GCT GCA AGC TTT GGC   317Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly40  45  50CAA ACT AAA ATC CCC CGG GGA AAT GGG CCT TAT TCC GTT GGT TGT ACA   365Gln Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser Val Gly Cys Thr55  60  65GAC TTA ATG TTT GAT CAC ACT AAT AAG GGC ACC TTC TTG CGT TTA TAT   413Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe Leu Arg Leu Tyr70  75  80TAT CCA TCC CAA GAT AAT GAT CGC CTT GAC ACC CTT TGG ATC CCA AAT   461Tyr Pro Ser Gln Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu Trp Ile Pro Asn85  90  95 100AAA GAA TAT TTT TGG GGT CTT AGC AAA TTT CTT GGA ACA CAC TGG CTT   509Lys Glu Tyr Phe Trp Gly Leu Ser Lys Phe Leu Gly Thr His Trp Leu105 110 115ATG GGC AAC ATT TTG AGG TTA CTC TTT GGT TCA ATG ACA ACT CCT GCA   557Met Gly Asn Ile Leu Arg Leu Leu Phe Gly Ser Met Thr Thr Pro Ala120 125 130AAC TGG AAT TCC CCT CTG AGG CCT GGT GAA AAA TAT CCA CTT GTT GTT   605Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Leu Val Val135 140 145TTT TCT CAT GGT CTT GGG GCA TTC AGG ACA CTT TAT TCT GCT ATT GGC   653Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr Ser Ala Ile Gly150 155 160ATT GAC CTG GCA TCT CAT GGG TTT ATA GTT GCT GCT GTA GAA CAC AGA   701Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala Val Glu His Arg165 170 175 180GAT AGA TCT GCA TCT GCA ACT TAC TAT TTC AAG GAC CAA TCT GCT GCA   749Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp Gln Ser Ala Ala185 190 195GAA ATA GGG GAC AAG TCT TGG CTC TAC CTT AGA ACC CTG AAA CAA GAG   797Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Lys Gln Glu200 205 210GAG GAG ACA CAT ATA CGA AAT GAG CAG GTA CGG CAA AGA GCA AAA GAA   845Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln Arg Ala Lys Glu215 220 225TGT TCC CAA GCT CTC AGT CTG ATT CTT GAC ATT GAT CAT GGA AAG CCA   893Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp His Gly Lys Pro230 235 240GTG AAG AAT GCA TTA GAT TTA AAG TTT GAT ATG GAA CAA CTG AAG GAC   941Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu Gln Leu Lys Asp245 250 255 260TCT ATT GAT AGG GAA AAA ATA GCA GTA ATT GGA CAT TCT TTT GGT GGA   989Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His Ser Phe Gly Gly265 270 275GCA ACG GTT ATT CAG ACT CTT AGT GAA GAT CAG AGA TTC AGA TGT GGT  1037Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg Phe Arg Cys Gly280 285 290ATT GCC CTG GAT GCA TGG ATG TTT CCA CTG GGT GAT GAA GTA TAT TCC  1085Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp Glu Val Tyr Ser295 300 305AGA ATT CCT CAG CCC CTC TTT TTT ATC AAC TCT GAA TAT TTC CAA TAT  1133Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu Tyr Phe Gln Tyr310 315 320CCT GCT AAT ATC ATA AAA ATG AAA AAA TGC TAC TCA CCT GAT AAA GAA  1181Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser Pro Asp Lys Glu325 330 335 340AGA AAG ATG ATT ACA ATC AGG GGT TCA GTC CAC CAG AAT TTT GCT GAC  1229Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln Asn Phe Ala Asp345 350 355TTC ACT TTT GCA ACT GGC AAA ATA ATT GGA CAC ATG CTC AAA TTA AAG  1277Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met Leu Lys Leu Lys360 365 370GGA GAC ATA GAT TCA AAT GTA GCT ATT GAT CTT AGC AAC AAA GCT TCA  1325Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser Asn Lys Ala Ser375 380 385TTA GCA TTC TTA CAA AAG CAT TTA GGA CTT CAT AAA GAT TTT GAT CAG  1373Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys Asp Phe Asp Gln390 395 400TGG GAC TGC TTG ATT GAA GGA GAT GAT GAG AAT CTT ATT CCA GGG ACC  1421Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu Ile Pro Gly Thr405 410 415 420AAC ATT AAC ACA ACC AAT CAA CAC ATC ATG TTA CAG AAC TCT TCA GGA  1469Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln Asn Ser Ser Gly425 430 435ATA GAG AAA TAC AAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAAAAAA AAAAAA  1520Ile Glu Lys Tyr Asn440(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度441個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Val Pro Pro Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu1   5  10  15Ala Val Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His20  25  30Met Lys Ser Ser Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala35  40  45Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser50  55  60Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe65  70  75  80Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser Gln Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu85  90  95Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Gly Leu Ser Lys Phe Leu Gly100 105 110Thr His Trp Leu Met Gly Asn Ile Leu Arg Leu Leu Phe Gly Ser Met115 120 125Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gly Glu Lys Tyr130 135 140Pro Leu Val ValPhe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr145150 155 160Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala165 170 175Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp180 185 190Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr195 200 205Leu Lys Gln Glu Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln210 215 220Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp225 230 235 240His Gly Lys Pro Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu245250 255Gln Leu Lys Asp Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His260 265 270Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg275 280 285Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp290 295 300Glu Val Tyr Ser Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu305 310 315 320Tyr Phe Gln Tyr Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser325 330 335Pro Asp Lys Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln340 345 350Asn Phe Ala Asp Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met355 360 365Leu Lys Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser370 375 380Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys385 390 395 400Asp Phe Asp Gln Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu405 410 415Ile Pro Gly Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln420 425 430Asn Ser Ser Gly Ile Glu Lys Tyr Asn435 440(2)SEQ ID N09的信息(i)序列特征(A)長度1123個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置未確定(xi)序列描述SEQ ID NO9AAATATAAAT TTTAATAACA CCACACATAA ATTTCAAACT ACTTTCCCTA AGTTTCTAGC  60TGAAGTTTTA AATGAGTGTG TTTTTAATTT ATTAGAAAGT GGATTGAAGA GAAAACATTG 120GAAGATGAAG GAAGGCGTTT CAGTTAAACC CCAAATAACT CTGTGTTACA CTGAGCTATG 180AAACGGCTCC TTCTAGCTCC ATTTCTCCTC AGACCTAAGT GCTATTCCTG ATTGTCCTTC 240ATTGTCATTT CCAGGGAGAA ATGACACCAG CACAGTGGCA GGCCTTCCAA TCTGGAGCAC 300GGTCCACACA ACTTCCGAAT TGGTGTTCAG TGTAAAGTGT ATCGGAGTGC GGAAAATGCG 360CAGGGCATTG CCAACTATAG ATGCTCGGAG TAATTCAGTG TATTCAGAGA ACACGGTGAA 420ACAAGGAAAA CCGGCCTGAC TGGGGGGTGA ATTCAGCAGG GAGTAAATCT GATCGGCATC 480AGGTCTGCGG AAAGGAGCTG GTGAGCACGA CACCACCAGG CATTGCCTGG CTCTCTCCGC 540GGCGGGCTAA GTTAACCTCG GGTCCAGGTG CGGGCCATGG TCTTGGGGAG GGTGCTGGGT 600GCGCTCGAGC AGGCTACGTC GGGAGCCGCC GCTGCTAGTG AGAGCCGGGC CACACACGCT 660CCTCCCCGGT ACCTCCTCCA GCATCACCAG GGGAGGAGAG GGTCGGGCAC AAGGCGCGCT 720AGGCGGACCC AGACACAGCC GCGCGCAGCC CACCCGCCCG CCGCCTGCCA GAGCTGCTCG 780GCCCGCAGCC AGGGGGACAG CGGCTGGTCG GAGGCTCGCA GTGCTGTCGG CGAGAAGCAG 840TCGGGTTTGG AGCGCTTGGG TCGCGTTGGT GCGCGGTGGA ACCCCCCAGG GACCCCAGTT 900CCCGCGAGCA GCTCCGCGCC GCGCCTGAGT GAGGAGGGGC CCCGGGGGCG AGGCGGGAGT 960GGGAGGAAGG GCACGGTCGC CGCGCTGGAG GTCGGGACCC CGGAGCGGCG ACCGGCCGGG1020GTGGGCTCGC TGAGTCGCAC CCGCTCTGCT GGCCGGTCCT GGGCTCACAG TCCCTGCAGC1080CCTCGGAAAC AGCGCTAGGA TCCTTCGGGA GAGGAGAGAT GAC  1123(2)SEQ ID N010的信息(i)序列特征(A)長度417個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
            
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置145..287(xi)序列描述SEQ ID NO10GTACCAATCT AAAACCCAGC ACAGAAAAAT ACATGTTTTA TTTTTTCCAA GTGTTACTAG  60TACCTCAGCC TTTCTTGATT TGTCAGCTTA TTTAAGGCCT CTTCATTGCA TACTTCTTTT 120TTCTTTTAAT CATCTGCTTC GAAGGAGACT AAGCTGAAAC TGCTGCTCAG CTCCCAAGAT 180GGTGCCACCC AAATTGCATG TGCTTTTCTG CCTCTGCGGC TGCCTGGCTG TGGTTTATCC 240TTTTGACTGG CAATACATAA ATCCTGTTGC CCATATGAAA TCATCAGGTA AGAGGTGTAT 300TTGTTCAAGG TCTTGAGCAA CTGATCTGTC GCCATACTTC AAGTGGGCCC CAAGAAGTTG 360CACATCTGCA CATCTAAACA AGTCCTATTT AAAGGCTTAT GGAGATCCTG TATTCTC417(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度498個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置251..372(xi)序列描述SEQ ID NO11CATTAGGAGG TAACAGTCCA AGGCAGCTGA GAGAAAGGCT ATGTCTACTT TCATCTCTTT  60ACCCTCCAAA ACCCCTACAC AGTGTTTCAA ACAGAGAGAC CCTCAATAAT TGCATATCTT 120ACTTGTTAGG TTGAGAAAGA AAGAAGGCCA GAAACTATGG GAAGTAACTT GATTCCGTTG 180GAATTCTTTT GCATAATAAA ATCTGATATG TAATGGATGA CAAATGAGAT AATATTTACC 240TGTTTTTCAG CATGGGTCAA CAAAATACAA GTACTGATGG CTGCTGCAAC GTTTGGCCAA 300ACTAAAATCC CCCGGGGAAA TGGGCCTTAT TCCGTTGGTT GTACAGACTT AATGTTTGAT 360CACACTAATA AGGTAATGCT TTGATTTATA CAACTTATCC TGATACTCTA ATATTGTCTG 420TCGCTATGGA CCACTAGAAG GTGTTCAAAT GTGACCTTGC CCTCACCTGA GAATGACTCA 480TTTTCGAATT TGTATTGT   498(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度433個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置130..274(xi)序列描還SEQ ID NO12CAGCAGCCTA AAGTCTTAGA CTTTGTGAAC ACAGAGGTAT TGAGTCCCAC TAATTAATAT  60CGAAAATAGC TGCTGGAATA TGTTTGAGAC ACAACTTCTC TAAAAGTGCA TTAATTTCTT 120TCTTAACAGG GCACCTTCTT GCGTTTATAT TATCCATCCC AAGATAATGA TCACCTTGAC 180ACCCTTTGGA TCCCAAATAA AGAATATTTT TGGGGTCTTA GCAAATTTCT TGGAACACAC 240TGGCTTATGG GCAACATTTT GAGGTTACTC TTTGGTAAGA TTTCTGTTGA TCCTTCTTTG 300TAGGCTCTTG CATGTATGAA AACCTTGAAA ACAACAAGAA CTTCAAGTAG TTAAGACCAA 360AGTAGATTTT TCTTCAGTCC AAATAGCTCC TAAAATGATA AGGAAAGTAT TTCTTTAAAG 420CCCAGGCAAC TAC433(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度486個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置164..257(xi)序列描述SEQ ID NO13TTGGTGGGTA TCTAGTAGCA GTCTTTTTAA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG  60ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA 120CACTCAGAGA AAACCTTAAC TATAACCTTC CATTGTTGTC TAGGTTCAAT GACAACTCCT 180GCAAACTGGA ATTCCCCTCT GAGGCCTGGT GAAAAATATC CACTTGTTGT TTTTTCTCAT 240GGTCTTGGGG CATTCAGGTA ATGTTTGAGA GGTTGAACAA TTTTGGCTTC CAGGAATAAA 300TGACAATTTT TTTATTCAAG AAAGAAATAG CAGAGTTTGG AATGTCATGC AGGCCCTTGT 360CTGGAGGAGT TGGGGTTCCT CAATAATTGG CTGTGGGTCT ATTGATCAGT CCTAGACCTG 420TCTGGTCAAG TAGTTTTTTC CCTACTATCA GCTCATTGGG ATTAGCCTCA CAGCAGAGAA 480GAAAGG486(2)SEQ ID NO14的信息
            
(i)序列特征(A)長度363個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置113..181(xi)序列描述SEQ ID NO14CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT AGTGACTCAG  60CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT 120ATTCTGCTAT TGGCATTGAC CTGGCATCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA 180GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA 240ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAAGTTTAT TTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG 300TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT 360AAC   363(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度441個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子
            
(B)位置68..191(xi)序列描述SEQ ID NO15GAACTGAGAA ACATGGTCAG ATGAGGAAGG GAAGGAGCAT GCATAAATAA TTTTGCTTGT  60ATTATAGAGA TAGATCTGCA TCTGCAACTT ACTATTTCAA GGACCAATCT GCTGCAGAAA 120TAGGGGACAA GTCTTGGCTC TACCTTAGAA CCCTGAAACA AGAGGAGGAG ACACATATAC 180GAAATGAGCA GGTACATTGC AGTGAAAGGA GAGGTGGTTG GTGACCTAAA AGCATGTACA 240AAAGGATGAC ATTTGTTAAT TTAATTTTAC ACCTGGCAAG TTATGCTCCT AGCTCTCCTA 300TTTCCCATTC CCAAAAGATC TGTCAATAGA TTCCTGGAGC AGTAAAATTC CCTTAATGGA 360ATATCTAGTT CATAGTAAAA ACAAAGGCAA ATACAAAAAT TTGGGAGATG ACAGTGAATA 420TTCAGAATTC CTCGAGCCGG G   441(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度577個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置245..358(xi)序列描述SEQ ID NO16GGTTAAGTAA ATCGTCTGAA GTCACATAGT AGGTAAGGCA AAACAGAGCC AGGATTTGGA  60CTAAGGCTAT ACCTATGTGC AAAGCTGGGG CCTGTGTCAT TATGGTAGCA AGTAATAGTC 120ACTAATCAGA TTTCCAGTTT ATAACTGACC AACGATTTTT CCCAAATACA GCTTCTACCT 180AAACTTTAAA ATAAGTGTTA TAACTTTTTA CTTTGTCATT TCCTTCTTCT AATAATTATA 240TTAGGTACGG CAAAGAGCAA AAGAATGTTC CCAAGCTCTC AGTCTGATTC TTGACATTGA 300TCATGGAAAG CCAGTGAAGA ATGCATTAGA TTTAAAGTTT GATATGGAAC AACTGAAGGT 360AAGCTATAAA AAGTAATTTT TCTCTTGTCC TACAGTTCTT TATTGTTTTT TGTCATTTAA 420TTTTCTGCCT ATATTGCAAG GTACAATATG ATAAAGGGCT GCAACCAGCC CCTCCCCAAT 480GCGCACACAC AGACACACAA AGCAGTACAG GTAAAGTATT GCAGCAATGA AGAATGCATT 540ATCTTGGACT AGATATGAAT GCAAAGTTAG TCAGTTT  577(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度396個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置108.199(xi)序列描述SEQ ID NO17ATCAATGTAT TTACCATCCC CATGAAATGA ACAATTATAT GATTGACAAA TCATTTCTTC  60TAACACCACG AAATAGCTAT AAATTTATAT CATGCTTTTT CAAATAGGAC TCTATTGATA 120GGGAAAAAAT AGCAGTAATT GGACATTCTT TTGGTGGAGC AACGGTTATT CAGACTCTTA 180GTGAAGATCA GAGATTCAGG TAAGAAAATA AGATAGTAAA GCAAGAGAAT AGTAAATTAT 240TGGAAGAAAT TATATTGTGA GATATAATTT TTATTCAAAT TCTTAGTGAA GGAAGGGGAT 300CTCTTGGAGT TTATAAGGCT ATTCTTTTGC CCCCATAAAA TACTCTATAT ACATTTTCCT 360AGGCTAAAAC ATCTCCTCTC CTGCTATTAA AATCTC   396(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度519個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置181..351(xi)序列描述SEQ ID N018CTTACAAAGT TAATCATATC CCTTTCCCAC ATTGAAGTAT GATACCTCTT TATTCCAATC  60AGATAACCCA TAATAAACTG GTATGGTGCG TGTCCACCAA TCCTAGCATT ATTAGGATGT 120CCTCAATGTT GGCTAGTATG TAACCAGTTT AATTTCATCA TTGTCAACAA ATATCTACAG 180ATGTGGTATT GCCCTGGATG CATGGATGTT TCCACTGGGT GATGAAGTAT ATTCCAGAAT 240TCCTCAGCCC CTCTTTTTTA TCAACTCTGA ATATTTCCAA TATCCTGCTA ATATCATAAA 300AATGAAAAAA TGCTACTCAC CTGATAAAGA AAGAAAGATG ATTACAATCA GGTAAGTATT 360AGTGACTTAT TTCATTATGT GAAACAAACT TGAAGCTTGG GTAAATATCA ATCGATATCA 420TTTGGTAACT ATTAAAGAAT TGCTGAATTG GTTGTTTAGA CTTTCAATAA GGAGAGAATT 480AGATAATCTC AGTTTCTAAG TACATTTAGT CTACTCTTT519(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度569個(gè)堿基對(B)類型核酸
            
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置156..304(xi)序列描述SEQ ID NO19TGAAACACAT CTAAGTAGAT CAAATTACAA GTTTTATTTC TTCTTTGGTT TTCAGTAAAC  60AGACCAACAA GACCAGTACC TTTCCTTACA CTCTAACTAA AAAAATAATA ATTTTATCAA 120ACAATGTGAC TTTTAAATGT CTTGTTCTCT TTTAGGGGTT CAGTCCACCA GAATTTTGCT 180GACTTCACTT TTGCAACTGG CAAAATAATT GGACACATGC TCAAATTAAA GGGAGACATA 240GATTCAAATG TAGCTATTGA TCTTAGCAAC AAAGCTTCAT TAGCATTCTT ACAAAAGCAT 300TTAGGTAAGA AACTATTTTT TTCATGACCT AAACCGAGAT GAATCTCGAG GACAAAGCTG 360TCTATCTTAA TACAGCTTTA GTACTATTTA AACTATTTCC AGTTGGTTTA CAATGGAACA 420AAGCAGTATA TCAATTTGAA AACAGAAATT TGAGAAAGTC AATTTTGCTG CTTTACATCT 480CTATATCATA GAAAGCAAAT CAACTGTTAA AGGTAATATT CTTTGTATGA GCTAGAGTGA 540CTCATGTGAG GATATCGAAC GACGGTGCT   569(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度469個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征
            
(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置137..253(xi)序列描述SEQ ID NO20GATACAGAGG CACATCGTCT CTACCATCCT AACGGAACTT GTGTAATTTG TAAATCTTTA  60TTGCCACCTA GGGGCATCCA AACTGTTTAA TGCTCTCAAA AGTTTAATAT GTTGATTAAC 120ACTTTATATT TTATAGGACT TCATAAAGAT TTTGATCAGT GGGACTGCTT GATTGAAGGA 180GATGATGAGA ATCTTATTCC AGGGACCAAC ATTAACACAA CCAATCAACA CATCATGTTA 240CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAGTCTT 300GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGAGAGAGAG 360AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT TTCCCAAAGG ACTCATATTT TAAAATGTAG 420GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA CTAAGAATTT TTTCCCTTT 469(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度1494個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置117..1436(xi)序列描述SEQ ID NO21GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC  60CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG 116ATG GTA CCA CTC AAA CTG CAG GCG CTT TTC TGC CTC CTC TGC TGC CTC   164Met Val Pro Leu Lys Leu Gln Ala Leu Phe Cys Leu Leu Cys Cys Leu1   5  10  15CCA TGG GTC CAT CCT TTT CAC TGG CAA GAC ACA TCT TCT TTT GAC TTC   212Pro Trp Val His Pro Phe His Trp Gln Asp Thr Ser Ser Phe Asp Phe20  25  30AGG CCG TCA GTA ATG TTT CAC AAG CTC CAA TCG GTG ATG TCT GCT GCC   260Arg Pro Ser Val Met Phe His Lys Leu Gln Ser Val Met Ser Ala Ala35  40  45GGC TCT GGC CAT AGT AAA ATC CCC AAA GGA AAT GGA TCG TAC CCC GTC   308Gly Ser Gly His Ser Lys Ile Pro Lys Gly Asn Gly Ser Tyr Pro Val50  55   60GGT TGT ACA GAT CTG ATG TTC GGT TAT GGG AAT GAG AGC GTC TTC GTG   356Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Gly Tyr Gly Asn Glu Ser Val Phe Val65  70  75  80CGT TTG TAC TAC CCA GCT CAA GAT CAA GGT CGC CTC GAC ACT GTT TGG   404Arg Leu Tyr Tyr Pro Ala Gln Asp Gln Gly Arg Leu Asp Thr Val Trp85  90  95ATC CCA AAC AAA GAA TAT TTT TTG GGT CTT AGT ATA TTT CTT GGA ACA   452Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Ile Phe Leu Gly Thr100 105 110CCC AGT ATT GTA GGC AAT ATT TTA CAC CTC TTA TAT GGT TCT CTG ACA   500Pro Ser Ile Val Gly Asn Ile Leu His Leu Leu Tyr Gly Ser Leu Thr115 120 125ACT CCT GCA AGC TGG AAT TCT CCT TTA AGG ACT GGA GAA AAA TAC CCG   548Thr Pro Ala Ser Trp Asn Ser Pro Leu Arg Thr Gly Glu Lys Tyr Pro130 135 140CTC ATT GTC TTT TCT CAT GGT CTC GGA GCC TTC AGG ACG ATT TAT TCT   596Leu Ile Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Ile Tyr Ser145 150 155 160GCT ATT GGC ATT GGC TTG GCA TCT AAT GGG TTT ATA GTG GCC ACT GTC   644Ala Ile Gly Ile Gly Leu Ala Ser Asn Gly Phe Ile Val Ala Thr Val165 170 175GAA CAC AGA GAC AGA TCT GCA TCG GCA ACT TAC TTT TTT GAA GAC CAG   692Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Phe Phe Glu Asp Gln180 185 190GTG GCT GCA AAA GTG GAA AAC AGG TCT TGG CTT TAC CTG AGA AAA GTA   740Val Ala Ala Lys Val Glu Asn Arg Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Lys Val195 200 205AAA CAA GAG GAG TCG GAA AGT GTC CGG AAA GAA CAG GTT CAG CAA AGA   788Lys Gln Glu Glu Ser Glu Ser Val Arg Lys Glu Gln Val Gln Gln Arg210 215 220GCA ATA GAA TGT TCC CGG GCT CTC AGT GCG ATT CTT GAC ATT GAA CAT   836Ala Ile Glu Cys Ser Arg Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu His225 230 235 240GGA GAC CCA AAA GAG AAT GTA CTA GGT TCA GCT TTT GAC ATG AAA CAG   884Gly Asp Pro Lys Glu Asn Val Leu Gly Ser Ala Phe Asp Met Lys Gln245 250 255CTG AAG GAT GCT ATT GAT GAG ACT AAA ATA GCT TTG ATG GGA CAT TCT   932Leu Lys Asp Ala Ile Asp Glu Thr Lys Ile Ala Leu Met Gly His Ser260 265 270TTT GGA GGA GCA ACA GTT CTT CAA GCC CTT AGT GAG GAC CAG AGA TTC   980Phe Gly Gly Ala Thr Val Leu Gln Ala Leu Ser Glu Asp Gln Arg Phe275 280  285AGA TGT GGA GTT GCT CTT GAT CCA TGG ATG TAT CCG GTG AAC GAA GAG   1028Arg Cys Gly Val Ala Leu Asp Pro Trp Met Tyr Pro Val Asn Glu Glu290 295 300CTG TAC TCC AGA ACC CTC CAG CCT CTC CTC TTT ATC AAC TCT GCC AAA   1076Leu Tyr Ser Arg Thr Leu Gln Pro Leu Leu Phe Ile Asn Ser Ala Lys305 310 315 320TTC CAG ACT CCA AAG GAC ATC GCA AAA ATG AAA AAG TTC TAC CAG CCT   1124Phe Gln Thr Pro Lys Asp Ile Ala Lys Met Lys Lys Phe Tyr Gln Pro325 330 335GAC AAG GAA AGG AAA AAT GAT TAC AAT CAA GGG CTC AGG CAC CAG AAC   1172Asp Lys Glu Arg Lys Asn Asp Tyr Asn Gln Gly Leu Arg His Gln Asn340 345 350TTT GAC GAC TTT ACT TTT GTA ACT GGC AAA ATA ATT GGA AAC AAG CTG  1220Phe Asp Asp Phe Thr Phe Val Thr Gly Lys Ile Ile Gly Asn Lys Leu355 360 365ACA CTG AAA GGA GAA ATC GAT TCC AGA GTA GCC ATC GAC CTC ACC AAC  1268Thr Leu Lys Gly Glu Ile Asp Ser Arg Val Ala Ile Asp Leu Thr Asn370 375 380AAA GCT TCG ATG GCT TTC TTA CAA AAG CAT TTA GGG CTT CAG AAA GAC  1316Lys Ala Ser Met Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu Gln Lys Asp385 390 395 400TTT GAT CAG TGG GAC CCT CTG GTG GAA GGA GAT GAT GAG AAC CTG ATT  1364Phe Asp Gln Trp Asp Pro Leu Val Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu Ile405 410 415CCT GGG TCA CCC TTT GAC GCA GTC ACC CAG GCC CCG GCT CAG CAA CAC  1412Pro Gly Ser Pro Phe Asp Ala Val Thr Gln Ala Pro Ala Gln Gln His420 425 430TCT CCA GGA TCA CAG ACC CAG AAT TAGAAGAACT TGCTTGTTAC ACAGTTGCCT 1466Ser Pro Gly Ser Gln Thr Gln Asn435 440TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG   1494(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度2191個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置92..1423(xi)序列描述SEQ ID NO22CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG  60TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G ATG TTG CCA CCC AAA CTG CAT112Met Leu Pro Pro Lys Leu His1   5GCG CTT TTC TGC CTC TGC AGC TGC CTC ACA CTG GTT CAT CCT ATT GAC   160Ala Leu Phe Cys Leu Cys Ser Cys Leu Thr Leu Val His Pro Ile Asp10   15  20TGG CAA GAC CTA AAT CCT GTT GCC CAT ATT AGA TCA TCA GCA TGG GCC   208Trp Gln Asp Leu Asn Pro Val Ala His Ile Arg Ser Ser Ala Trp Ala25  30  35AAT AAA ATA CAA GCT CTG ATG GCT GCT GCA AGT ATT AGG CAA AGT AGA   256Asn Lys Ile Gln Ala Leu Met Ala Ala Ala Ser Ile Arg Gln Ser Arg40  45  50  55ATT CCC AAA GGA AAT GGA TCT TAT TCT GTC GGT TGT ACA GAT TTG ATG   304Ile Pro Lys Gly Asn Gly Ser Tyr Ser Val Gly Cys Thr Asp Leu Met60  65  70TTT GAT TAT ACT AAT AAG GGC ACC TTT TTG CGT TTG TAT TAT CCA TCG   352Phe Asp Tyr Thr Asn Lys Gly Thr Phe Leu Arg Leu Tyr Tyr 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(xi)序列描述SEQ ID N024CGGCGGGCTG CTGGCCCTTC CCGGCTGTTC GTAGAGCCGG ATCCTGCAGC GCCCCTGAGA  60CGAACCGCCC CGATGCGGTG CTCCTCAGCG CCACGGGACG CAGCCGGGGC CGGCCGTGTT 120GGCGCAGCTC CCACGACGTA CGCTTCCTTT CCAGGCTCGA GGAAAGCCTC TCCCACAAAC 180ACCGTCCCAG CTGGGAAGTG AGGCGGAGTT TTGGTCCCTC CCCTCCGGCA GCGCCCGGCA 240TTCCGTCCGT CCGTCCGTCC GTCCGTGCGG CGCACGGCGC CCTGCAGAGC CGGGACACCG 300CAGCAGGGTA GGAGGACCCG GAGGTGGTGT GCAGCCACAG GTTTCCATCC TGCCCCCACC 360TCCCGGGGAG CAGCCCTGTG CTATACCCAA CCCCCCGCAC AGAGCACTGA GCCGGCTGCT 420GCCTGCCTGC ACCCCGCCGT GGGACCTTCT GCTCTTCCCA ACAAGTG ATG GCA TCG   476Met Ala Ser1CTG TGG GTG AGA GCC AGG AGG GTG TTC ATG AAA AGT CGT GCT TCA GGT   524Leu Trp Val Arg Ala Arg Arg Val Phe Met Lys Ser Arg Ala Ser Gly5  10  15TTC TCG GCG AAG GCG GCG ACG GAG ATG GGG AGC GGC GGC GCG GAG AAG   572Phe Ser Ala Lys Ala Ala Thr Glu Met Gly Ser Gly Gly Ala Glu Lys20  25  30  35GGC TAT CGG ATC CCC GCC GGG AAG GGC CCG CAC GCC GTG GGC TGC ACG   620Gly Tyr Arg Ile Pro Ala Gly Lys Gly Pro His Ala Val Gly Cys 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Trp Leu Met Gly Asn Ile Leu Ser65  70  75  80TTA CTC TTT GGT TCA GTG ACA ACT CCT GCA AAC TGG AAT TCC CCT CTG   288Leu Leu Phe Gly Ser Val Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu85  90  95AGG CCT GGT GAA AAA TAC CCA CTT GTT GTT TTT TCT CAT GGT CTT GGA   336Arg Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Leu Va1 Val Phe Ser His Gly Leu Gly100 105 110GCA TTC AGG ACA ATT TAT TCT GCT ATT GGC ATT GAC CTG GCA TCT CAT   384Ala Phe Arg Thr Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His115 120 125GGG TTT ATA GTT GCT GCT GTA GAA CAC AGA GAT AGA TCT GCA TCT GCA   432Gly Phe Ile Val Ala Ala Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala130 135 140ACT TAC TAT TTC AAG AAC CAA TCT GCT GCA GAA ATA GGG AAA AAG TCT   480Thr Tyr Tyr Phe Lys Asn Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Lys Lys Ser145 150 155 160TGG CTC TAC CTT AGA ACC CTG AAA GAA GAG GAG GAG ATA CAT ATA CGA   528Trp Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Lys Glu Glu Glu Glu Ile His Ile Arg165 170 175AAT AAG CAG GTA CGA CAA AGA GCA AAA GAA TGT TCC CAA GCT CTC AGT   576Asn Lys Gln Val Arg Gln Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser180 185 190CTG A 580Leu(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Gly Xaa Ser Xaa Gly1   5(2)SEQ ID N028的信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO28TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G 41(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
            
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO29ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG32(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度1335個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO30ATGGTACCCC CAAAGCTGCA CGTCCTGTTT TGTCTGTGTG GATGTCTCGC CGTCGTGTAC  60CCCTTCGATT GGCAGTATAT CAACCCCGTG GCTCACATGA AGAGCAGCGC CTGGGTGAAT 120AAGATCCAGG TGCTCATGGC CGCACCAAGC TTCGGTCAGA CCAAGATTCC TAGAGGCAAC 180GGCCCCTACA GCGTGGGCTG CACCGATCTG ATGTTCGACC ATACCAACAA AGGAACTTTT 240CTGAGACTGT ACTACCCCAG CCAGGACAAC GACAGACTGG ATACTCTGTG GATCCCAAAT 300AAAGAATATT TTTGGGGTCT TAGCAAATTT CTTGGAACAC ACTGGCTTAT GGGCAACATT 360TTGAGGTTAC TCTTTGGTTC AATGACAACT CCTGCAAACT GGAATTCCCC TCTGAGGCCT 420GGTGAAAAAT ATCCACTTGT TGTTTTTTCT CATGGTCTTG GGGCATTCAG GACACTTTAT 480TCTGCTATTG GCATTGACCT GGCATCTCAT GGGTTTATAG TTGCTGCTGT AGAACACAGA 540GATAGATCTG CATCTGCAAC TTACTATTTC AAGGACCAAT CTGCTGCAGA AATAGGGGAC 600AAGTCTTGGC TCTACCTTAG AACCCTGAAA CAAGAGGAGG AGACACATAT ACGAAATGAG 660CAGGTACGGC AAAGAGCAAA AGAATGTTCC CAAGCTCTCA GTCTGATTCT TGACATTGAT 720CATGGAAAGC CAGTGAAGAA TGCATTAGAT TTAAAGTTTG ATATGGAACA ACTGAAGGAC 780TCTATTGATA GGGAAAAAAT AGCAGTAATT GGACATTCTT TTGGTGGAGC AACGGTTATT 840CAGACTCTTA GTGAAGATCA GAGATTCAGA TGTGGTATTG CCCTGGATGC ATGGATGTTT 900CCACTGGGTG ATGAAGTATA TTCCAGAATT CCTCAGCCCC TCTTTTTTAT CAACTCTGAA 960TATTTCCAAT ATCCTGCTAA TATCATAAAA ATGAAAAAAT GCTACTCACC TGATAAAGAA1020AGAAAGATGA TTACAATCAG GGGTTCAGTC CACCAGAATT TTGCTGACTT CACTTTTGCA1080ACTGGCAAAA TAATTGGACA CATGCTCAAA TTAAAGGGAG ACATAGATTC AAATGTAGCT1140ATTGATCTTA GCAACAAAGC TTCATTAGCA TTCTTACAAA AGCATTTAGG ACTTCATAAA1200GATTTTGATC AGTGGGACTG CTTGATTGAA GGAGATGATG AGAATCTTAT TCCAGGGACC1260AACATTAACA CAACCAATCA ACACATCATG TTACAGAACT CTTCAGGAAT AGAGAAATAC1320AATTAGGATT CTAGA 133權(quán)利要求
            
1.純化和分離的人血漿血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)多肽片段，其缺失陳述于SEQ ID NO8中的成熟人PAF-AH氨基酸序列的最多達(dá)前12個(gè)N末端氨基酸。
            
2.選自以下的權(quán)利要求1的PAF-AH多肽片段(a)具有SEQ ID NO8的Met46做為起始N末端氨基酸的多肽；(b)具有SEQ ID NO8的Ala47做為起始N末端氨基酸的多肽；(c)具有SEQ ID NO8的Ala48做為起始N末端氨基酸的多肽；
            
3.權(quán)利要求1或2的任何一項(xiàng)的PAF-AH多肽片段，其缺失SEQ IDNO8的氨基酸序列的最多達(dá)30個(gè)C末端氨基酸。
            
4.具有選自以下的SEQ ID NO8的殘基做為其C末端殘基的權(quán)利要求1或2的任何一項(xiàng)的PAF-AH多肽片段(a)  Ile429，(b)  Leu431，和(c)  Asn441。
            
5.權(quán)利要求1的PAF-AH多肽片段的變異體，其在SEQ ID NO8的序列中具有一個(gè)選自以下的氨基酸置換(a)  S108A，(b)  S273A，(c)  D286A，(d)  D286N，(e)  D296A，(f)  D304A，(g)  D338A，(h)  H351A，(i)  H395A，(j)  H399A，(k)  C67S，(l)  C229S，(m)  C291S，(n)  C334S，和(o)  C407S。
            
6.人PAF-AH多肽變異體，其在SEQ ID NO8的序列中具有一個(gè)選自以下的氨基酸置換(a)  D286A(b)  D286N(c)  D304A。
            
7.編碼按照權(quán)利要求1或6的任何一項(xiàng)的PAF-AH多肽片段、變異體或變異體片段的分離的多核苷酸。
            
8.編碼具有SEQ ID NO8的Met46做為N末端殘基和Ile429或Asn441做為C末端殘基的人PAF-AH片段或變異體片段的分離的多核苷酸。
            
9.是DNA的權(quán)利要求7或8的任何一項(xiàng)的多核苷酸。
            
10.包含權(quán)利要求9的DNA的DNA載體。
            
11.用按照權(quán)利要求9的DNA以在所述PAF-AH多肽片段、變異體或變異體片段的宿主細(xì)胞中表達(dá)的方式穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
            
12.產(chǎn)生血漿PAF-AH的PAF-AH多肽片段、變異體或變異體片段的方法，包括在合適的營養(yǎng)中使按照權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞生長并從所述細(xì)胞或其生長的培養(yǎng)基分離所述PAF-AH片段、變異體或變異體片段。
            
13通過權(quán)利要求12的方法產(chǎn)生的PAF-AH多肽片段、變異體或變異體片段。
            
14.藥學(xué)組合物，包含權(quán)利要求1、6或13的任何一項(xiàng)的PAF-AH片段、變異體或變異體片段以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、佐劑或載體。
            
15.治療對PAF介導(dǎo)的病理病癥易感或患有PAF介導(dǎo)的病理病癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括在所述哺乳動(dòng)物中以足以補(bǔ)充PAF-AH活性和鈍化PAF病理效應(yīng)的量給予按照權(quán)利要求14的藥學(xué)組合物。
            
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中病理病癥是胸膜炎、哮喘、鼻炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、急性呼吸窘迫綜合癥、急性胰腺炎或與HIV感染相關(guān)的神經(jīng)疾病。
            
全文摘要
            
本發(fā)明提供編碼人血漿血小板激活因子乙酰水解酶的純化和分離的多核苷酸序列。也提供重組產(chǎn)生預(yù)期可用于調(diào)節(jié)病理性炎癥事件的血小板激活因子乙酰水解酶產(chǎn)物的材料和方法。
            
文檔編號(hào)C12N9/14GK1239999SQ97180413 
            
公開日1999年12月29日 申請日期1997年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月13日
            
發(fā)明者L·S·考森斯, C·D·埃伯哈德特, P·格雷, H·L·特隆, L·W·特約爾克, C·L·維爾德 申請人:艾科斯有限公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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