用于蝦青素生物合成編碼雨生紅球藻β－C－4－加氧酶的核酸序列的制作方法

專利名稱：用于蝦青素生物合成編碼雨生紅球藻β－C－4－加氧酶的核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景總的來說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素的生物技術(shù)方法。具體地，本發(fā)明涉及具有β-C-4-加氧酶活性的肽；編碼此肽的NDA片段；編碼此肽的RNA片段；含載體和DNA片段的重組DNA分子；含上述重組DNA分子或DNA分子或DNA片段的宿主細(xì)胞或生物；以及用宿主生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素或含(3S，3’S)蝦青素的食品添加劑的生物技術(shù)方法。
諸如蝦青素的類胡蘿卜素是決定活體中所見的多種黃、橙和紅色的天然色素。類胡蘿卜素在自然界分布廣泛并在多種生活系統(tǒng)中具有兩種主要生物功能它們?cè)诠夂献饔弥谐洚?dāng)光捕獲色素，并且它們防止光氧化作用損傷。以下將討論類胡蘿卜素的這些和其它生物功能和它們重要的工業(yè)作用及其生物合成。
類胡蘿卜素作為光捕獲天線的一部分，可以吸收光子并將能量轉(zhuǎn)移至葉綠素，由此協(xié)助捕獲450至570納米范圍內(nèi)的光[見Cogdell RJ和Frank HA(1987)，在光合細(xì)菌中類胡蘿卜素如何作用，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)89563-79；Cogdell R(1988)葉綠體中的色素作用，在Goodwin TW(編輯)植物色素中，第183-255頁，學(xué)院出版社，倫敦；Frank HA，Violette CA，Trautman JK，Shreve AP，Owens TG和Albrecht AC(1991)光合作用中的類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)和光化學(xué)，純應(yīng)用化學(xué)63109-114；Frank HA，F(xiàn)arhoosh R，Decoster B和Christensen RL(1992)控制光合作用中從類胡蘿卜素到葉綠純素能量轉(zhuǎn)移效率的分子特征，于Murata N(編輯)光合作用研究，第I卷，第125-128頁，kluwer，Dordrecht；和Cogdell RJ和Gardiner AT(1993)光合作用中類胡蘿卜素的作用，酶學(xué)方法214185-193]。盡管類胡蘿卜素是光合作用生物中光捕獲天線蛋白-色素復(fù)合體必不可少的成分，但它們也是光合作用中心的重要成分。
大多數(shù)類胡蘿卜素位于光捕獲復(fù)合體II中[Bassi R，Pineaw B，Dainese P和Marpuqartt J(1993)光系統(tǒng)II的類胡蘿卜素結(jié)合蛋白，歐洲生物化學(xué)雜志212297-302]。光合活性類胡蘿卜素蛋白的特征及其在光捕獲系統(tǒng)中的確切位置都是未知的。通過導(dǎo)向樣品的線型二色性光譜可觀察到嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的光化學(xué)活性葉綠素-蛋白復(fù)合體中的類胡蘿卜素[見Breton J和Kato S(1987)光系統(tǒng)II中的色素位置從聚球藍(lán)細(xì)菌分離的葉綠素-蛋白亞基及核心顆粒的低溫線型二色性研究，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)89299-107]。這些復(fù)合體主要包含緊靠膜平面的在505和470納米附近吸收的β-胡蘿卜素。在無光化學(xué)活性的葉綠素-蛋白復(fù)合體中，β-胡蘿卜素在495和465納米附近吸收，并且分子垂直于膜平面定位。
已描述了類胡蘿卜素與藍(lán)細(xì)菌光系統(tǒng)(PS)II相關(guān)的證據(jù)[見，Suzuki R和Fujita Y(1977)光合反應(yīng)中心II作用誘導(dǎo)的類胡蘿卜素光漂白DCMU敏感性，植物細(xì)胞生理學(xué)18625-631；及Newman PJ和Sherman LA(1987)藍(lán)綠藻雪松聚球藍(lán)細(xì)菌的光系統(tǒng)I和II膜顆粒的分離和特征，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)，503343-361]。在PSII反應(yīng)中心核心中有兩個(gè)β-胡蘿卜素分子[見Ohno T，Satoh K和Katoh S(1986)從嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類純化的氧演化的復(fù)合體的化學(xué)組成，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)8521-8；Gounaris K，Chapman DJ和Barber J(1989)集胞藻PCC 6803的D1/D2/細(xì)胞色素b-559復(fù)合體的分離和特征，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)973296-301；及Newell RW，van Amerongen H，Barber J和van Grondelle R(1993)用偏振光對(duì)光系統(tǒng)II反應(yīng)中心進(jìn)行光譜鑒定PSII反應(yīng)中心中β-胡蘿卜素激發(fā)的證據(jù)，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)1057232-238]，但其確切作用仍不清楚[如Satoh K(1992)PSII反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)和功能，于MurataN(編輯)光合作用研究，第II卷，第3-12頁，Kluwer，Dordrecht]。已證實(shí)這兩個(gè)偶聯(lián)的β-胡蘿卜素分子保護(hù)分離的PSII反應(yīng)中心中的葉綠素P680免受光損傷[見De Las Rivas J，Telfer A和Barber J(1993)2個(gè)偶聯(lián)的β-胡蘿卜素分子保護(hù)分離的PSII反應(yīng)中心中的P680免受光損傷，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)1142155-164]，并可能與防止PSII的D1亞基降解的保護(hù)作用有關(guān)[見Sandmann G(1993)參與八氫番茄紅素變?yōu)榉鸭t素的去飽和反應(yīng)的基因和酶(摘要)，第十屆國際類胡蘿卜素會(huì)議，Trondheim CL1-2]。嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的高度純化的氧演化PSII復(fù)合體的光捕獲色素包含50個(gè)葉綠素a和7個(gè)β-胡蘿卜素，但不含葉黃素分子[見Ohno T，Satoh K和KatohS(1986)從嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類純化的氧演化復(fù)合體的化學(xué)組成，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)8521-8]。已證明β-胡蘿卜素在綠藻活性PSII的組裝中起作用[見Humbeck K，Romer S和Senger H(1989)活性PSII組裝中類胡蘿卜素重要作用的證據(jù)，植物179242-250]。
每個(gè)P700含40個(gè)葉綠素的從淺黃席藍(lán)細(xì)菌分離的PSI復(fù)合體平均包含1.3個(gè)β-胡蘿卜素分子[見Thornber JP，Alberte Rs，HunterFA，Shiozawa JA和Kan KS(1976)植物光合作用單位中葉綠素的構(gòu)成，Brookhaven Symp生物學(xué)28132-148]。在從每個(gè)P700含130±5個(gè)天線葉綠素分子的聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類菌株P(guān)CC6301制備的PSI顆粒中可觀察到16個(gè)類胡蘿卜素分子[見Lundell DJ，Glazer AN，Melis A和Malkin R(1985)藍(lán)細(xì)菌光系統(tǒng)I復(fù)合體的特征，生物化學(xué)雜志260646-654]。在嗜熱藍(lán)細(xì)菌細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌的PSI色素蛋白復(fù)合體中觀察到β-胡蘿卜素和葉黃素的基本含量及隱黃素和異隱黃素[見Coufal J，Hladik J和Sofrova D(1989)嗜熱藍(lán)細(xì)菌細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌的光系統(tǒng)I色素-蛋白復(fù)合體的類胡蘿卜素含量，光合作用23603-616]。含4個(gè)多肽(62，60，14和10kDa)的嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的亞基蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)每個(gè)P700包含約10個(gè)β-胡蘿卜素分子[見Takahashi Y，Hirota K和Katoh S(1985)聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的P700-葉綠素a-蛋白復(fù)合體的多種形式鐵，醌和類胡蘿卜素含量，光合作用研究6183-192]。此類胡蘿卜素專門結(jié)合攜帶有功能的天線葉綠素a的大多肽。這些復(fù)合體的熒光激發(fā)光譜顯示β-胡蘿卜素作用為PSI的有效天線。
如上所述，類胡蘿卜素的其它重要作用是防止光合器中由葉綠素激發(fā)的三重線態(tài)引起的光氧化過程。具有π-電子偶聯(lián)的9個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的類胡蘿卜素分子可吸收葉綠素的三重線態(tài)能量并由此防止有害單線態(tài)氧自由基的形成。聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類中類胡蘿卜素的三重線態(tài)可在封閉的PSII中心測到并且約25毫微秒增加的動(dòng)力學(xué)是由于來自天線中葉綠素三重線態(tài)的能量轉(zhuǎn)移[見Schlodder E和Brettel K(1988)11毫微秒生命期的封閉光系統(tǒng)II中的初級(jí)電荷分離，聚球藍(lán)細(xì)菌的氧演化光系統(tǒng)II復(fù)合體的閃光吸收光譜。生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)93322-34]。可以想象與自由基對(duì)形成的產(chǎn)率相比，此過程的產(chǎn)率更低，在保護(hù)葉綠素免受由于過度激發(fā)的損傷中起作用。
通過抑制所有生物中進(jìn)行有氧光合作用的類胡蘿卜素的生物合成的漂白除草劑如達(dá)草滅的使用可證明體內(nèi)類胡蘿卜素的保護(hù)作用[如Sandmann G和Boger P(1989)，除草劑抑制類胡蘿卜素生物合成。于Boger P和Sandmann G(編輯)除草劑作用的靶位點(diǎn)，第25-44頁，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida所綜述的]。光照時(shí)用達(dá)草滅處理引起類胡蘿卜素和葉綠素水平下降，而在黑暗中葉綠素水平不受影響。用吡啶酮除草劑、fluridone處理的阿氏顫藻細(xì)胞中的光合作用效率的抑制作用是由于藍(lán)藻葉黃素、玉米黃素和β-胡蘿卜素的相對(duì)豐度減少，接著引起葉綠素分子的光氧化作用[見Canto de Loura I，DubacqJP和Thomas JC(1987)氮缺失對(duì)藍(lán)細(xì)菌色素和脂肪的影響，植物生理學(xué)83838-843]。
已證明在植物中玉米黃素需要以非輻射方式分散天線葉綠素多余的激態(tài)能量[見，Demmig-Adams B(1990)植物中的類胡蘿卜素和光保護(hù)作用葉黃素玉米黃素的作用，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)10201-24；及Demmig-Adams B和Adams WWIII(1990)類胡蘿卜素玉米黃素和葉綠素?zé)晒獾母吣軕B(tài)猝滅，光合作用研究25187-197]。在藻類和植物中，光誘導(dǎo)的紫黃質(zhì)深度氧化產(chǎn)生玉米黃素與光保護(hù)過程有關(guān)[由Demmig-Adams B和Adams WWIII(1992)，光保護(hù)作用和植物對(duì)強(qiáng)光逆境的其它反應(yīng)，植物生理植物分子生物學(xué)年鑒43599-626綜述]。光誘導(dǎo)的紫黃質(zhì)深度氧化和黑暗中發(fā)生的逆反應(yīng)稱作“葉黃素循環(huán)”[見Demmig-Adams B和Adams WWIII(1992)光保護(hù)作用和植物對(duì)強(qiáng)光逆境的其它反應(yīng)，植物生理植物分子生物學(xué)年鑒43599-626]。不含任何玉米黃素并且可能不能進(jìn)行非輻射能量逸散的藍(lán)細(xì)菌地衣對(duì)高光強(qiáng)度敏感；含玉米黃素的藻類地衣對(duì)強(qiáng)光逆境更有耐受性[見Demmig-Adams B，Adams WWIII，Green TGA，Czygan FC和Lange OL(1990)形成藻共生的兩種地衣對(duì)光逆境的敏感性不同，一方有葉黃素循環(huán)而另一方式無葉黃素循環(huán)。生態(tài)學(xué)84451-456；Demmig-Adams B和AdamsWWIII(1993)適光性葉子的葉黃素循環(huán)、蛋白更新和強(qiáng)光耐受性，植物生理學(xué)1031413-1420；和Demmig-Adams B(1990)植物中的類胡蘿卜素和光保護(hù)作用葉黃素玉米黃素的作用，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)10201-24]。與藻類和植物相反，藍(lán)細(xì)菌不含葉黃素循環(huán)。但是，它們的確包含可支持葉綠素光保護(hù)作用的充足的玉米黃素和其它葉黃素。
類胡蘿卜素還有幾種其它功能。由藍(lán)細(xì)菌Gloeocapsa alpicola的抗紫外光突變體中β-胡蘿卜素的積累可以證明類胡蘿卜素保護(hù)免受近紫外光輻射產(chǎn)生的各種損傷的可能性[見Buckley CE和HoughtonJA(1976)近紫外光輻射對(duì)藍(lán)綠藻Gloeocapsa alpicola色素形成的影響的研究，微生物學(xué)學(xué)報(bào)10793-97]。在產(chǎn)生類胡蘿卜素的大腸桿菌細(xì)胞中更進(jìn)一步地證明了這一點(diǎn)[見Tuveson RW和Sandmann G(1993)大腸桿菌中表達(dá)的克隆類胡蘿卜素基因的抵抗由近紫外光激活的光毒性分子的保護(hù)作用，酶學(xué)方法214323-330]。類胡蘿卜素由于其猝滅各種氧自由基的能力而成為有效的抗氧化劑并由此保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。實(shí)際上在所有生物中類胡蘿卜素的這種功能是重要的[見Krinsky NI(1989)類胡蘿卜素的抗氧化功能，自由基生物醫(yī)學(xué)7617-635；和Palozza P和Krinsky NI(1992)體內(nèi)和體外類胡蘿卜素的抗氧化效應(yīng)——概述，酶學(xué)方法213403-420]。即使間接地，類胡蘿卜素也可影響其它細(xì)胞功能。盡管藍(lán)細(xì)菌中的類胡蘿卜素不是趨光性的主要光受體，但是在多變魚腥藍(lán)細(xì)菌中已觀察到類胡蘿卜素對(duì)趨光反應(yīng)的影響是由于可作為此系統(tǒng)中信號(hào)中間物的單態(tài)氧自由基的去除[見Nultsch W和Schuchart H(1985)藍(lán)細(xì)菌多變魚腥藍(lán)細(xì)菌的趨光反應(yīng)鏈模型，微生物學(xué)學(xué)報(bào)142180-184]。
在花和果實(shí)中，類胡蘿卜素有利于吸引傳粉者和傳播種子。后者與農(nóng)業(yè)緊密相關(guān)。果實(shí)和花中色素形成的種類和程度是許多農(nóng)作物最重要的特征。這主要是由于這些農(nóng)作物的顏色常常決定了它們對(duì)消費(fèi)者的吸引力并可由此提高它們的市場價(jià)值。
因?yàn)轭惡}卜素?zé)o毒，所以它們有重要的作為食品工業(yè)著色劑的商業(yè)用途[見Bauernfeind JC(1981)作為著色劑和維生素A前體的類胡蘿卜素，學(xué)院出版社，倫敦]。西紅柿果實(shí)的紅色是由果實(shí)成熟期間在有色體中積累的番茄紅素提供的。全世界商業(yè)生產(chǎn)含高含量(超過80％干重)番茄紅素的西紅柿提取物用作食品著色劑的工業(yè)用途。此外，肉、羽毛或魚卵和鳥蛋呈現(xiàn)提供的食品類胡蘿卜素的顏色，于是類胡蘿卜素常用作家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的食品添加劑。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，培養(yǎng)某些藍(lán)細(xì)菌種類如螺旋藍(lán)細(xì)菌屬種類[見Sommer TR，Potts WT和Morrissy NM(1990)水產(chǎn)養(yǎng)殖中加工微藻的最新進(jìn)展，水生生物學(xué)204/205435-443]用于生產(chǎn)動(dòng)物和人類食品添加劑。因此，在生物技術(shù)方面，這些藍(lán)細(xì)菌中類胡蘿卜素，主要是β-胡蘿卜素的含量有重要商業(yè)潛力。
大多數(shù)類胡蘿卜素包含由8個(gè)C5類異戊二烯單位構(gòu)建的C40碳?xì)渲麈湶⒑幸幌盗泄曹楇p鍵。胡蘿卜素不含氧原子并且或是線型或含1或2個(gè)端環(huán)的環(huán)狀分子。葉黃素是胡蘿卜素的氧化衍生物。已鑒定了多種糖基化類胡蘿卜素和類胡蘿卜素酯。C40主鏈可進(jìn)一步延伸形成C45或C50類胡蘿卜素，或縮短產(chǎn)生衍類胡蘿卜素。一些非光合細(xì)菌也合成C30類胡蘿卜素?？梢栽贕oodwin TW(1980)類胡蘿卜素的生物化學(xué)，第1卷，第2版，Chapman和Hall編，New York；和Goodwin TW和Britton G(1988)類胡蘿卜素的分布和分析，于Goodwin TW(編)植物色素，第62-132頁，學(xué)院出版社，紐約中找到有關(guān)類胡蘿卜素的一般背景資料。
目前已有640多種不同的天然存在的類胡蘿卜素得到鑒定，由此，類胡蘿卜素決定了微生物、真菌、藻類、植物和動(dòng)物中所發(fā)現(xiàn)的主要的黃色，橙色和紅色的各種深淺。類胡蘿卜素由所有光合生物及幾種非光合細(xì)菌和真菌合成，而且它們經(jīng)過飼料也廣泛分布于動(dòng)物界。
類胡蘿卜素僅在光合生物和一些微生物中從類異戊二烯從頭合成，它們典型地在光合膜、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的蛋白復(fù)合體中積累。
如

圖1中詳細(xì)描述的，在β-胡蘿卜素生物合成途經(jīng)中，4種酶將中心的類異戊二烯途徑的牻牛兒牻牛兒焦磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素。類胡蘿卜素由類異戊二烯生物合成的一般途徑合成。盡管此途徑已知幾十年，但只有最近主要通過遺傳和分子生物學(xué)的應(yīng)用才得以闡明類胡蘿卜素生物發(fā)生中涉及的一些分子機(jī)理。這是由于參與將八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成胡蘿卜素和葉黃素的大多數(shù)酶是不穩(wěn)定的膜相關(guān)蛋白，所以一旦溶解即喪失活性[見Beyer P，Weiss G和Kleinig H(1985)黃水仙有色體的膜結(jié)合胡蘿卜素生成酶的溶解和重組，歐洲生物化學(xué)雜志153341-346；和Bramley PM(1985)類胡蘿卜素的體外生物合成，脂研究進(jìn)展21243-279]。然而，已報(bào)道了保留部分活性的來自集胞藻屬種類株系PCC 6714的胡蘿卜素生成酶的溶解作用[見Bramley PM和Sandmann G(1987)隱球藍(lán)細(xì)菌的胡蘿卜素生成酶的溶解作用，植物化學(xué)261935-1939]。沒有能直接測到酶活性的真正的類胡蘿卜素生物合成的體外系統(tǒng)。已經(jīng)開發(fā)了無細(xì)胞胡蘿卜素生成系統(tǒng)[見ClarkeIE，Sandmann G，Bramley PM和Boger P(1982)應(yīng)用分離的光合膜的胡蘿卜素生物合成FEBS lett 140203-206]，并且此酶系統(tǒng)適用于藍(lán)細(xì)菌[見Sandmann G和Bramley PM(1985)用偶聯(lián)布拉克須霉產(chǎn)八氫番茄紅素系統(tǒng)的隱球藍(lán)細(xì)菌勻漿生物合成類胡蘿卜素，植物164259-263；和Bramley PM和Sandmann G(1985)藍(lán)細(xì)菌隱球藍(lán)細(xì)菌葉黃素的體外和體內(nèi)生物合成，植物化學(xué)242919-2922]。在純化已在大腸桿菌中表達(dá)的多肽后，實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體中聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類菌株P(guān)CC7942的八氫番茄紅素脫氫酶的重組[見Fraser PD，Linden H和Sandmann G(1993)從過量表達(dá)的大腸桿菌菌株純化和重新活化重組聚球藍(lán)細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶，生物化學(xué)雜志291687-692]。
現(xiàn)在參考圖1，類胡蘿卜素從類異戊二烯前體合成。類異戊二烯生物合成的中心途經(jīng)可以看作從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸開始。從甲羥戊酸形成C5分子D3-異戊烯基焦磷酸(IPP)并且此C5分子是所有長鏈類異戊二烯合成的基礎(chǔ)。在IPP異構(gòu)化為r，r-二甲丙烯焦磷酸酯(DMAPP)后，結(jié)合另外3分子IPP產(chǎn)生C20牻牛兒牻牛兒焦磷酸(GGPP)。由異戊烯轉(zhuǎn)移酶催化這種1’-4縮合反應(yīng)[見Kleinig H(1989)類異戊二烯生物合成中質(zhì)體的作用，植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年鑒4039-59]。在植物中證實(shí)同一種酶GGPP合成酶可完成DMAPP至GGPP的所有反應(yīng)[見Dogbo O和Camara B(1987)通過親和層析從辣椒有色體純化異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶和牻牛兒牻牛兒焦磷酸合成酶，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)920140-148；和Laferriere A和Beyer P(1991)歐白芥白色質(zhì)體的牻牛兒牻牛兒二磷酸合成酶的純化，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)216156-163]。
類胡蘿卜素生物合成特異的第一步是2分子GGDD的頭對(duì)頭縮合產(chǎn)生前八氫番茄紅素焦磷酸(PPPP)。GGPP在去除焦磷酸后轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色的C40碳?xì)浞肿?5-順-八氫番茄紅素。這兩步反應(yīng)由在藍(lán)細(xì)菌和植物中都由單基因(crtB)編碼的可溶性酶八氫番茄紅素合成酶催化[見Chamovitz D，Misawa N，Sandmann G和Hirschberg J(1992)編碼類胡蘿卜素生物合成酶八氫番茄紅素合成酶的藍(lán)細(xì)菌基因在大腸桿菌中的分子克隆和表達(dá)，F(xiàn)EBS lett 296305-310；Ray JA，Bird CR，Maunders M，Grierson D和Schuch W(1987)來自番茄的與成熟相關(guān)的cDNA，pTOM5的序列，核酸研究1510587-10588；Camara B(1993)植物八氫番茄紅素合成酶復(fù)合體-組成的3種酶、免疫學(xué)和生物發(fā)生，酶學(xué)方法214352-365]。該途經(jīng)中所有隨后的步驟都發(fā)生在膜上。4個(gè)去飽和(脫氫作用)反應(yīng)經(jīng)過六氫番茄紅素，ζ-胡蘿卜素和四氫番茄紅素將八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)榉鸭t素。每次去飽和作用增加2個(gè)共軛雙鍵以致共軛雙鍵的數(shù)目從八氫番茄紅素中的3個(gè)增至番茄紅素中的11個(gè)。
對(duì)八氫番茄紅素的酶脫氫作用的分子機(jī)理的了解相對(duì)很少[見Jones BL和Porter JW(1986)高等植物中胡蘿卜素的生物合成，CRC植物科學(xué)評(píng)論3295-324；和Beyer P，Mayer M和Kleinig H(1989)分子氧和中間產(chǎn)物幾何異構(gòu)態(tài)是黃水仙有色體中胡蘿卜素去飽和作用和環(huán)化反應(yīng)所必需的，歐洲生物化學(xué)雜志184141-150]。已確定在藍(lán)細(xì)菌，藻類和植物中前兩次去飽和作用由單個(gè)膜結(jié)合酶八氫番茄紅素脫氫酶催化從15-順-八氫番茄紅素到ζ-胡蘿卜素[見Jones BL和Porter JW(1986)高等植物中胡蘿卜素的生物合成，CRC植物科學(xué)評(píng)論3295-324；和Beyer P，Mayer M和Kleinig H(1989)分子氧和中間產(chǎn)物幾何異構(gòu)態(tài)是黃水仙有色體中胡蘿卜素去飽和作用和環(huán)化反應(yīng)所必需的，歐洲生物化學(xué)雜志184141-150]。因?yàn)棣?胡蘿卜素產(chǎn)物主要是全反式構(gòu)型，所以推測在此去飽和步驟中有順-反式異構(gòu)作用。藍(lán)細(xì)菌中八氫番茄紅素脫氫酶多肽的初級(jí)結(jié)構(gòu)與藻類和植物的初級(jí)結(jié)構(gòu)相比是保守的(超過65％的相同殘基)[見Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果實(shí)成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成ζ-胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966；Pecker I，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物中類胡蘿卜素生物合成的分子特征鑒定番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因，于MurataN(編)光合作用研究，第III卷，第11-18頁，kluwer，Dordrectht]。此外，在兩個(gè)系統(tǒng)中，相同抑制劑阻遏八氫番茄紅素脫氫酶[見Sandmann G和Boger P(1989)除草劑抑制類胡蘿卜素的生物合成。于Boger P和Sandmann G(編)除草劑作用的靶位點(diǎn)，第25-44頁，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida]。結(jié)果，很可能藍(lán)細(xì)菌和植物中催化八氫番茄紅素和六氫番茄紅素去飽和作用的酶具有相似的生物化學(xué)和分子特征，這些特征不同于其它微生物中八氫番茄紅素脫氫酶的特征。一個(gè)這樣的不同之處是莢膜紅細(xì)菌、歐文氏菌屬種類或真菌的八氫番茄紅素脫氫酶分別將八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍浞鸭t素、番茄紅素或3，4-脫氫番茄紅素。
盡管氧不直接參與脫氫反應(yīng)，但是黃水仙有色體[見Beyer P，Mayer M和Kleinig H(1989)分子氧和中間產(chǎn)物幾何異構(gòu)態(tài)是黃水仙有色體中胡蘿卜素去飽和作用和環(huán)化反應(yīng)所必需的，歐洲生物化學(xué)雜志184141-150]和聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類菌株P(guān)CC 7942的無細(xì)胞系統(tǒng)[見Sandmann G和Kowalczyk S(1989)體外胡蘿卜素生成和組囊藍(lán)細(xì)菌中八氫番茄紅素脫氫酶反應(yīng)的特征鑒定，生物化學(xué)生物物理研究通訊，163916-921]中八氫番茄紅素去飽和作用依賴于分子氧作為可能最后電子受體。在藍(lán)細(xì)菌中脫氫酶-電子轉(zhuǎn)移酶的機(jī)理依賴于脫氫酶-單加氧酶的脫氫作用機(jī)理[見Sandmann G和Kowalczyk S(1989)體外胡蘿卜素生成和組囊藍(lán)細(xì)菌中八氫番茄紅素脫氫酶反應(yīng)的特征鑒定，生物化學(xué)生物物理研究通訊，163916-921]。在初級(jí)結(jié)構(gòu)已得到分析的所有八氫番茄紅素脫氫酶中存在保守的FAD結(jié)合模式[見Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果實(shí)成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成ζ-胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966；PeckerI，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物中類胡蘿卜素生物合成的分子特征鑒定番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因，于Murata N(編)光合作用研究，第III卷，第11-18頁，Kluwer，Dordrectht]。已證明辣椒中八氫番茄紅素脫氫酶含有蛋白結(jié)合的FAD[見Hugueney P，Romer S；Kuntz M和Camara B(1992)催化辣椒有色體中六氫番茄紅素和ζ-胡蘿卜素合成的黃素蛋白的特征鑒定和分子克隆，歐洲生物化學(xué)雜志209399-407]。因?yàn)榘藲浞鸭t素脫氫酶位于膜上，可以預(yù)測另外一種可溶的氧化還原成分。如所證明的，此假設(shè)成分可能使用NAD(P)+[見Mayer MP，Nievelstein V和Beyer P(1992)水仙有色體的NADPH依賴型氧化還原酶——可能參與胡蘿卜素去飽和作用的氧化還原介質(zhì)的純化和特征鑒定，植物生理生化30389-398]或另一種電子和氫載體如醌。用特異性抗體確定集胞藻屬種類株系PCC 6714和多變魚腥藍(lán)細(xì)菌菌株ATCC 29413中八氫番茄紅素脫氫酶的細(xì)胞定位主要(85％)在光合作用類囊體膜上[見Serrano A，Gimenez P，Schmidt A和Sandmann G(1990)光合自養(yǎng)原核生物中八氫番茄紅素脫氫酶的免疫化學(xué)定位和功能測定，普通微生物學(xué)雜志1362465-2469]。
ζ-胡蘿卜素在藍(lán)細(xì)菌藻類和植物中經(jīng)四氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成番茄紅素。對(duì)酶機(jī)理了解極少，推測由單一酶完成[見Linden H，VioqueA和Sandmann G(1993)通過異源互補(bǔ)從魚腥藻屬PCC 7120分離編碼ζ-胡蘿卜素脫氫酶的類胡蘿卜素生物合成基因，F(xiàn)EMS Microbiol Lett10699-104]。魚腥藻株P(guān)CC 7120的ζ-胡蘿卜素脫氫酶推測的氨基酸序列包含與八氫番茄紅素脫氫酶中所發(fā)現(xiàn)的一種雙核酸結(jié)合模式相似的模式。
兩個(gè)環(huán)化反應(yīng)將番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素。已得到證據(jù)，在聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類菌株P(guān)CC 7942[見Cunningham FX Jr，Chamovitz D，Misawa N，Gantt E和Hirschberg J(1993)催化β-胡蘿卜素生物合成的酶番茄紅素環(huán)化酶的藍(lán)細(xì)菌基因的克隆和在大腸桿菌中的功能性表達(dá)，F(xiàn)EBS Lett 328130-138]和植物中[見Camara B和Dogbo O(1986)來自辣椒有色體膜的番茄紅素環(huán)化酶的證實(shí)和溶解，植物生理學(xué)80172-184]，這種環(huán)化作用由單一酶番茄紅素環(huán)化酶催化。三乙胺化合物CPTA和MPTA抑制這種膜結(jié)合酶[見Sandmann G和Boger P(1989)除草劑抑制類胡蘿卜素生物合成，于Boger P和Sandmann G(編)除草劑作用的靶位點(diǎn)，第25-44頁，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)Lorida]。藍(lán)細(xì)菌僅進(jìn)行β-環(huán)化因而不包含ε-胡蘿卜素，δ-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素及它們的氧合衍生物。當(dāng)在C-6丟失質(zhì)子之后線型番茄紅素分子末端C-1，2雙鍵折疊到C-5，6雙鍵位置時(shí)，經(jīng)過“碳離子”中間產(chǎn)物形成β-環(huán)。已報(bào)道沒有任何環(huán)化胡蘿卜素中的7，8鍵不是雙鍵。因此，如在番茄紅素中的全去飽和作用或如四氫番茄紅素中至少一半分子的去飽和作用是反應(yīng)必需的。番茄紅素的環(huán)化涉及不需要氧的脫氫反應(yīng)。此反應(yīng)的輔因子未知。在聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7942的番茄紅素環(huán)化酶多肽中發(fā)現(xiàn)雙核酸結(jié)合模式，表明NAD(P)或FAD作為番茄紅素環(huán)化酶的輔酶。
加入諸如羥基-，甲氧基-，氧-，環(huán)氧-，醛，羧酸組分的各種含氧側(cè)基形成各種葉黃素。對(duì)葉黃素的形成了解極少。β-胡蘿卜素的羥化作用在混合功能氧化酶反應(yīng)中需要分子氧。
已從紫色光合細(xì)菌莢膜紅細(xì)菌[見Armstrong GA，Alberti M，Leach F和Hearst JE(1989)莢膜紅細(xì)菌的類胡蘿卜素生物合成基因簇的核苷酸序列、組成和蛋白產(chǎn)物的性質(zhì)，普通分子遺傳學(xué)216254-268]和非光合細(xì)菌草生歐文氏菌[見Sandmann G，Woods WS和Tuveson RW(1990)草生歐文氏菌和轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株中類胡蘿卜素的鑒定，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 7177-82；Hundle BS，Beyer P，Kleinig H，Englert H和Hearst JE(1991)草生歐文氏菌的類胡蘿卜素和攜帶草生歐文氏菌類胡蘿卜素基因簇的大腸桿菌HB101菌株，光化學(xué)和光生物學(xué)5489-93；和Schnurr G，Schmidt A和SandmannG(1991)草生歐文氏菌的胡蘿卜素生成基因簇的圖譜及六個(gè)基因的功能鑒定，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 78157-162]及噬夏孢歐文氏菌[見Misawa N，Nakagawa M，Kobayashi K，Yamano S，Izawa I，NakamuraK和Harashima K(1990)通過大腸桿菌中基因產(chǎn)物的功能分析來闡明噬夏孢歐文氏菌類胡蘿卜素生物合成途徑，細(xì)菌學(xué)雜志1726704-6712]克隆了編碼整個(gè)途徑酶的基因簇。已從真菌粗糙脈孢菌中克隆兩種基因，編碼GGPP合成酶的al-3[見Nelson MA，Morelli G，Carattoli A，Romano N和Macino G(1989)藍(lán)光調(diào)節(jié)的粗糙脈孢菌類胡蘿卜素生物合成基因(albino-3)的分子克隆和白色菌環(huán)基因產(chǎn)物，分子細(xì)胞生物學(xué)91271-1276；和Carattoli A，Romano N，Ballario P，Morelli G和Macino G(1991)粗糙脈孢菌類胡蘿卜素生物合成基因(albino 3)，生物化學(xué)雜志2665854-5859]和編碼八氫番茄紅素脫氫酶的al-1[見Schmidhauser TJ，Lauter FR，RussoVEA和Yanofsky C(1990)粗糙脈孢菌的類胡蘿卜素生物合成基因al-1的克隆測序和光調(diào)節(jié)、分子細(xì)胞生物學(xué)105064-5070]。然而，由于缺少足夠的序列相似性，用這些基因作為異源分子探針從藍(lán)細(xì)菌或植物克隆相應(yīng)基因的嘗試并不成功。
已用分子遺傳方法從藍(lán)細(xì)菌克隆了類胡蘿卜素合成酶的第一個(gè)“植物型”基因。在克隆八氫番茄紅素脫氫酶基因的第一步中，在聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7942中分離了對(duì)八氫番茄紅素-脫氫酶特異的抑制劑達(dá)草滅有抗性的許多突變體[見Linden H，Sandmann G，Chamovitz D，Hirschberg J和Boger P(1990)所選的抗漂白除草劑達(dá)草滅的聚球藍(lán)細(xì)菌突變體的生化特征鑒定，農(nóng)藥生化生理學(xué)3646-51]。然后通過將野生型菌株轉(zhuǎn)化為除草劑抗性來克隆賦予抗達(dá)草滅抗性的基因[見Chamovitz D，Pecker I和Hirschberg J(1991)對(duì)除草劑達(dá)草滅抗性的分子基礎(chǔ)，植物分子生物學(xué)16967-974；Chamovitz D，Pecker I，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1990)克隆藍(lán)細(xì)菌中達(dá)草滅抗性基因，Z.Naturforsch 45482-486]。幾組證據(jù)表明先前稱為pds現(xiàn)在稱為crtP的克隆基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶。最確定的一個(gè)證據(jù)是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中八氫番茄紅素脫氫酶活性的功能性表達(dá)[見Linden H，Misawa N，Chamovitz D，PeckerI，Hirschberg J和Sandmann G(1991)不同的八氫番茄紅素脫氫酶基因在大腸桿菌中的功能互補(bǔ)和積累的胡蘿卜素的分析，ZNaturforsch 46c1045-1051；和Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果實(shí)成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成ζ-胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966]。也用相似方法從集胞藻屬種類的株系PCC6803中克隆了crtP基因[見Martinez-Ferez IM和Vioque A(1992)集胞藻屬種類的菌株P(guān)CC 6803的八氫番茄紅素脫氫酶基因的核苷酸序列及具有對(duì)除草劑達(dá)草滅抗性的新突變體的特征鑒定，植物分子生物學(xué)18981-983]。
隨后藍(lán)細(xì)菌crtP基因用作從藻類[見Pecker I，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物類胡蘿卜素生物合成的分子特征鑒定番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因，于Murata N(編)光合作用研究，第III卷，第11-18頁，Kluwer，Dordrectht]和高等植物[見Bartley GE，Viitanen PV，Pecker I，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolink PA(1991)編碼類胡蘿卜素生物合成途徑的酶八氫番茄紅素脫氫酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合細(xì)菌中的表達(dá)，美國國家科學(xué)院院報(bào)886532-6536；和Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966]克隆同源基因的分子探針。聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC 7942和集胞藻屬種類的株系PCC 6803的八氫番茄紅素脫氫酶分別由474個(gè)和467個(gè)氨基酸殘基組成，其序列高度保守(74％相同，86％相似)。計(jì)算的分子量是51kDa，盡管它略微疏水(水療法指數(shù)-0.2)，但不包括長度足以跨越脂雙層膜的疏水區(qū)。藍(lán)細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶的初級(jí)結(jié)構(gòu)與來自綠藻Dunalliela bardawil(61％相同，81％相似)[見Pecker I，Chamovitz D，Mann V，Sandmann G，Boger P和Hirschberg J(1993)植物中類胡蘿卜素生物合成的分子特征鑒定番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因，于Murata N(編)光合作用研究，第III卷，第11-18頁，Kluwer，Dordrectht]、番茄[見Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果實(shí)成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966]、辣椒[見HugueneyP，Romer S，Kuntz M和Camara B(1992)催化辣椒有色體中六氫番茄紅素和ζ-胡蘿卜素合成的黃素蛋白的特征鑒定和分子克隆，歐洲生物化學(xué)雜志209399-407]和大豆[見Bartley GE，Viitanen PV，Pecker I，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolnik PA(1991)編碼類胡蘿卜素生物合成途徑酶八氫番茄紅素脫氫酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合細(xì)菌中的表達(dá)，美國國家科學(xué)院院報(bào)886532-6536](62-65％相同及～79％相似)[見Chamovitz D(1993)藍(lán)細(xì)菌類胡蘿卜素生物合成早期步驟的分子分析八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫氫酶，博士論文，The Hebrew University of Jerusalem]的酶相比是高度保守的。真核生物八氫番茄紅素脫氫酶多肽與藍(lán)細(xì)菌酶大小相比較大(64kDa)；但是當(dāng)其進(jìn)入質(zhì)體時(shí)被加工成成熟形式。
莢膜紅細(xì)菌、歐文氏菌屬種類和粗糙脈孢菌的類胡蘿卜素酶包括crtI基因產(chǎn)物八氫番茄紅素脫氫酶中有高度結(jié)構(gòu)相似性[在Armstrong GA，Hundle BS和Hearst JE(1993)光合生物和非光合生物類胡蘿卜素生物合成基因產(chǎn)物的進(jìn)化保守和結(jié)構(gòu)相似性，酶學(xué)方法214297-311]。如上述指出的，八氫番茄紅素脫氫酶的初級(jí)結(jié)構(gòu)的高度保守也存在于氧合光合生物中。但是，除了氨基末端FAD結(jié)合序列，植物型”crtP基因產(chǎn)物和“細(xì)菌型”八氫番茄紅素脫氫酶(crtI基因產(chǎn)物)間的序列相似性很少(19-23％相同，42-47％相似)。已猜想crtP和crtI不是來源同一個(gè)原始基因，它們經(jīng)過趨同進(jìn)化獨(dú)立起源[見Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966]。兩種類型的酶催化的不同脫氫作用序列和它們對(duì)抑制劑的不同敏感性支持此假設(shè)。
盡管不象以八氫番茄紅素脫氫酶為例那么明確，但也看到在藍(lán)細(xì)菌和植物及藍(lán)細(xì)菌和其它微生物之間在八氫番茄紅素合成酶結(jié)構(gòu)上的相似區(qū)別。在聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7942的基因組中鑒定了編碼八氫番茄紅素合成酶的crtB基因(以前是psy)緊鄰crtP并在同一個(gè)操縱子中[見Bartley GE，Viitanen PV，Pecker I，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolnik PA(1991)編碼類胡蘿卜素生物合成途徑酶八氫番茄紅素脫氫酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合細(xì)菌中的表達(dá)，美國國家科學(xué)院院報(bào)886532-6536]。此基因編碼307個(gè)氨基酸的36kDa多肽，疏水指數(shù)為0.4。藍(lán)細(xì)菌八氫番茄紅素合成酶的推測氨基酸序列與番茄八氫番茄紅素合成酶相比高度保守[57％相同和70％相似；Ray JA，Bird CR，Maunders M，Grierson D和Schuch W(1987)番茄的與成熟相關(guān)的cDNA，pTOM5序列，核酸研究1510587-10588]，但與其它細(xì)菌的crtB序列相比保守性更低(在以10個(gè)間隙的匹配中有29-32％相同和48-50％相似)。兩種酶都包含在不同生物的異戊烯轉(zhuǎn)移酶中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)保守序列模式[見Bartley GE，Viitanen PV，PeckerI，Chamovitz D，Hirschberg J和Scolnik PA(1991)編碼類胡蘿卜素生物合成途徑酶八氫番茄紅素脫氫酶的大豆cDNA的分子克隆和在光合細(xì)菌中的表達(dá)，美國國家科學(xué)院院報(bào)886532-6536；CarattoliA，Romano N，Ballario P，Morelli G和Macino G(1991)粗糙脈孢菌類胡蘿卜素生物合成基因(albino3)，生物化學(xué)雜志2665854-5859；Armstrong GA，Hundle BS和Hearst JE(1993)光合生物和非光合生物類胡蘿卜素生物合成基因產(chǎn)物的進(jìn)化保守和結(jié)構(gòu)相似性，酶學(xué)方法214297-311；Math SK，Hearst JE和Poulter CD(1992)編碼牻牛兒牻牛兒二磷酸合成酶的草生歐文氏菌的crtE基因，美國國家科學(xué)院院報(bào)896761-6764；和Chamovitz D(1993)藍(lán)細(xì)菌類胡蘿卜素生物合成早期步驟的分子分析八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫氫酶，博士論文，The Hebrew University of Jerusalem]?？梢韵胂笤?個(gè)GGPP分子縮合期間，多肽中的這些區(qū)域參與焦磷酸的結(jié)合和/或去除。
通過在攜帶歐文氏菌crtB和crtE基因及藍(lán)細(xì)菌crtP基因的大腸桿菌細(xì)胞中篩選藍(lán)細(xì)菌基因組DNA的表達(dá)文庫從魚腥藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7120克隆編碼ζ-胡蘿卜素脫氫酶的crtQ基因(以前是2ds)[見Linden H，Vioque A和SandmannG(1993)通過異源互補(bǔ)從魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120分離編碼ζ-胡蘿卜素脫氫酶的類胡蘿卜素生物合成基因，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 10699-104]。因?yàn)檫@些大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生ζ-胡蘿卜素，所以可以在產(chǎn)生ζ-胡蘿卜素細(xì)胞的黃色背景上鑒定產(chǎn)生番茄紅素的棕紅色菌落。推測的魚腥藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7120的ζ-胡蘿卜素脫氫酶是含499個(gè)氨基酸殘基的56kDa多肽。令人驚奇地是，它的初級(jí)結(jié)構(gòu)與“植物型”(crtP基因產(chǎn)物)八氫番茄紅素脫氫酶相比不保守，卻與細(xì)菌型酶(crtI基因產(chǎn)物)有相當(dāng)?shù)男蛄邢嗨菩訹見Sandmann G(1993)參與八氫番茄紅素到番茄紅素的去飽和氫反應(yīng)的基因和酶(摘要)，第10次國際類胡蘿卜素大會(huì)，TrondheimCL1-2]。有可能藍(lán)細(xì)菌crtQ基因和其它微生物的crtI基因是由共同祖先進(jìn)化起源的。
利用基本上與crtP相同的克隆策略從聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7942克隆編碼番茄紅素環(huán)化酶的crtL基因(以前是lcy)。通過使用番茄紅素環(huán)化酶抑制劑2-(4-甲基苯氧)-三乙胺鹽酸(MPTA)，通過將野生型轉(zhuǎn)化成除草劑抗性型分離此基因[見Cunningham FX Jr，Chamovitz D，Misawa N，Gantt E和Hirschberg J(1993)催化β-胡蘿卜素生物合成的酶藍(lán)細(xì)菌番茄紅素環(huán)化酶基因的克隆和在大腸桿菌中的功能表達(dá)，F(xiàn)EBS Lett 328130-138]。番茄紅素環(huán)化酶是單基因產(chǎn)物并催化番茄紅素至β-胡蘿卜素的雙環(huán)化反應(yīng)。聚球藍(lán)細(xì)菌屬種類的菌株P(guān)CC7942中的crtL基因產(chǎn)物是含411個(gè)氨基酸殘基的46kDa多肽。它與噬夏孢歐文氏菌或草生歐文氏菌的crtY基因產(chǎn)物(番茄紅素環(huán)化酶)無序列相似性。
已從草生歐文氏菌[見Hundle B，Alberti M，Nievelstein V，Beyer P，Kleinig H，Armstrong GA，Burke DH和Hearst JE(1994)大腸桿菌中表達(dá)的草生歐文氏菌Eho10類胡蘿卜素基因的功能性重組，普通分子遺傳學(xué)254406-416；Hundle BS，Obrien DA，AlbertiM，Beyer P和Hearst JE(1992)草生歐文氏菌玉米黃素葡糖轉(zhuǎn)移酶的功能性表達(dá)和推測的雙磷酸結(jié)合位點(diǎn)，美國國家科學(xué)院院報(bào)899321-9325]和噬夏孢歐文氏菌[見Misawa N，Nakagawa M，KobayashiK，Yamano S，Izawa I，Nakamurak和Harashima K(1990)通過大腸桿菌中基因產(chǎn)物的功能分析來闡明噬夏孢歐文氏菌類胡蘿卜素生物合成途徑，細(xì)菌學(xué)雜志1726704-6712]克隆了β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)和玉米黃素糖化酶基因(crtX)。
首先描述了水生甲殼動(dòng)物中酮類胡蘿卜素蝦青素(3，3′-雙羥基-β，β-胡蘿卜素-4，4′-二酮)作為β-胡蘿卜素的一種氧化形式。后來發(fā)現(xiàn)蝦青素在許多海洋動(dòng)物和藻類中非常普遍。但是，僅少數(shù)動(dòng)物可以從其它類胡蘿卜素從頭合成蝦青素，而大多數(shù)動(dòng)物從它們的食物中獲得蝦青素。在植物界，蝦青素主要存在于一些種類的藍(lán)細(xì)菌、藻類和地衣中。但是，在高等植物種類的花瓣中很少發(fā)現(xiàn)蝦青素[見Goodwin TW(1980)類胡蘿卜素的生物化學(xué)，第1卷，第2版，Chapman和Hall，London和New York]。
已證實(shí)蝦青素在動(dòng)物中作為強(qiáng)抗氧化劑的功能[見Miki W(1991)動(dòng)物類胡蘿卜素的生物功能和活性，純應(yīng)用化學(xué)63141]。蝦青素是脂過氧化的強(qiáng)抑制劑并已證明在保護(hù)生物膜免受氧化損傷中起重要作用[見Palozza P和Krinsky NI(1992)體內(nèi)和體外類胡蘿卜素的抗氧化效應(yīng)——概述，酶學(xué)方法213403-420；Kurashige M，Okimasu E，Inove M和Utsumi K(1990)蝦青素抑制生物膜的氧化損傷，生理化學(xué)和生理醫(yī)學(xué)方法NMR 2227]。也已調(diào)查了蝦青素的化學(xué)預(yù)防效應(yīng)，已證明其中蝦青素明顯降低小鼠中誘導(dǎo)的膀胱癌的發(fā)生[見Tanaka T，Morishita Y，Suzui M，Kojima T，Okumura A和Mori H(1994)天然存在的類胡蘿卜素蝦青素對(duì)小鼠膀胱致癌作用的化學(xué)預(yù)防，致癌作用1515]。也證實(shí)蝦青素通過提高抗體產(chǎn)量發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[見Jyonouchi H，Zhang L和Tomita Y(1993)類胡蘿卜素免疫調(diào)節(jié)作用研究。II.蝦青素提高針對(duì)T-依賴型抗原的體內(nèi)抗體產(chǎn)量而不促進(jìn)多克隆B細(xì)胞的活化，營養(yǎng)癌癥19269；和Jyonouchi H，Hill JR，Yoshifumi T和Good RA(1991)類胡蘿卜素免疫調(diào)節(jié)作用研究I.β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞功能和體外培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的影響，營養(yǎng)癌癥1693]。蝦青素的完整生物醫(yī)學(xué)特征還有待闡明，但最初結(jié)果顯示蝦青素在癌癥和腫瘤預(yù)防及引發(fā)免疫系統(tǒng)正反應(yīng)中起重要作用。
蝦青素是鮭魚和蝦的主要類胡蘿卜素色素并賦予卵、肉和皮膚中有吸引的色素[見Torrisen OJ，Hardy RW，Shearer KD(1989)鮭魚中鮭類胡蘿卜素色素沉積和代謝，Crit Rev Aquatic Sci 1209]。1991年全世界鮭捕獲量約為720,000MT，其中25-30％是在各種水產(chǎn)養(yǎng)殖場所生產(chǎn)的[見Meyers SP(1994)世界水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展、飼料配方和類胡蘿卜素作用，純應(yīng)用化學(xué)661069]。預(yù)計(jì)到2000年可增加到460,000MT[見Bjorndahl T(1990)鮭魚水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)，BlackwellScientific，Oxford、第1頁]。鮭魚肉的紅色能吸引消費(fèi)者因而影響最終產(chǎn)品的價(jià)格。動(dòng)物不能合成類胡蘿卜素并且它們需要經(jīng)過食物鏈從初級(jí)生產(chǎn)者—海洋藻類和浮游植物獲得色素。強(qiáng)化培養(yǎng)中生長的動(dòng)物通常會(huì)有較差的顏色。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中人為加入含類胡蘿卜素的食品，對(duì)生產(chǎn)者來說有相當(dāng)?shù)馁M(fèi)用。
蝦青素是最昂貴的商用類胡蘿卜素化合物(現(xiàn)在1995年市場價(jià)值是每千克2,500至3,500美元)。主要用作向多種水生動(dòng)物提供色素的營養(yǎng)添加劑。在遠(yuǎn)東也用于飼養(yǎng)家禽以產(chǎn)生小雞的典型色素形成。它也是食品工業(yè)中受歡迎的有效的無毒性著色劑并用在化妝品中。近來報(bào)道蝦青素是人類中潛在的抗氧化劑，因此是可用的食品添加劑。
只有有限的天然(3S，3’S)蝦青素可以得到。商業(yè)上從一些甲殼動(dòng)物中提取蝦青素[見Torrisen OJ，Hardy RW，Shearer KD(1989)鮭魚中鮭類胡蘿卜素色素沉積和代謝，Crit Rev Aquatic Sci 1209]。從Phaffa[一種酵母，見Andrewes AG，Phaff HJ和Starr MP(1976)產(chǎn)紅色素酵母Phaffia rhodozyma的類胡蘿卜素，光化學(xué)，第15卷，第1003-1007頁]生產(chǎn)蝦青素的(3R，3’R)立體異構(gòu)體?，F(xiàn)在Hoffman-LaRoche生產(chǎn)含(3S，3’S)-，(3S，3’R)-和(3R，3’R)-異構(gòu)體的1∶2∶1混合物的合成蝦青素并以“CAROPHYLL Pink”的名稱高價(jià)(每千克2，5000加元)出售[見Mayer H(1994)對(duì)類胡蘿卜素合成的思考，純應(yīng)用化學(xué)，第66卷，第931-938頁]。最近，從產(chǎn)生諸如蝦青素的酮類胡蘿卜素的海洋細(xì)菌橙黃瓊脂桿菌和產(chǎn)堿菌PC-1中分離了參與酮化合物生物合成的稱為crtW的新基因。當(dāng)將crtW基因?qū)胗捎跉W文氏菌胡蘿卜素生成基因而積累β-胡蘿卜素的已加工的大腸桿菌時(shí)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化子合成蝦青素合成途徑中角黃素的前體[見Misawa N，Kajiwara S，Kondo K，Yokoyama A，Satomi Y，Saito T，Miki W和Ohtani T(1995)通過單基因?qū)Nβ-胡蘿卜素中亞甲基轉(zhuǎn)變?yōu)橥慕屈S素生物合成，第209卷，第867-876頁]。因此需要找到相對(duì)廉價(jià)的(3S，3’S)蝦青素來源用作水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料添加劑和各種其它工業(yè)用途的有用化學(xué)制劑。
雖然蝦青素在多種細(xì)菌、真菌和藻類中合成，但是與化學(xué)合成相比，其生產(chǎn)所用生物系統(tǒng)的主要限制是低產(chǎn)量高消耗的提取方法。解決這些問題的一種方法是用重組DNA技術(shù)增加生物系統(tǒng)中蝦青素合成的產(chǎn)量。這樣可以在易生長易提取的遺傳工程宿主如高等植物中生產(chǎn)蝦青素。此外，遺傳工程宿主中蝦青素的生產(chǎn)使得可以通過選擇適當(dāng)宿主以將合成的蝦青素用于例如水產(chǎn)養(yǎng)殖而無需提取。
因而廣泛認(rèn)識(shí)到需要編碼將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)榻屈S素的β-C-4-加氧酶的核酸片段，含有根據(jù)本發(fā)明所述的核酸序列的重組載體分子以及用這些載體分子或DNA片段轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的用于生物技術(shù)生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物，得到這些是非常有益的。
從以下描述和權(quán)利要求書中可以看到本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。
發(fā)明概述本發(fā)明的總目的是提供生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素的生物技術(shù)方法。
本發(fā)明的具體目的是提供具有β-C-4-加氧酶活性的肽和編碼此肽的DNA片段以進(jìn)行蝦青素和其它葉黃素的生物技術(shù)生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼包含對(duì)應(yīng)于上述肽的氨基酸序列的多肽的RNA片段。
本發(fā)明的另一目的是提供包含如上所述DNA片段和載體的重組DNA分子。
本發(fā)明的另一目的是提供含有上述重組DNA分子的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供在其細(xì)胞中含有上述重組DNA分子或上述DNA片段的轉(zhuǎn)基因宿主生物。
本發(fā)明的另一目的是提供在含有葉綠體和/或有色體的組織中表達(dá)β-C-4-加氧酶活性的轉(zhuǎn)基因宿主生物。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物的動(dòng)物或人類消費(fèi)的食品添加劑。
本發(fā)明的另一目的是提供用上述宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)蝦青素的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用上述宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、隱黃素、異隱黃素、羥基-β-胡蘿卜素-4-酮、玉米黃素、adonirubin和/或adonixanthin的方法。
從以下描述，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)勢將更清楚。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因的氨基酸序列的多肽的DNA片段。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因的氨基酸序列的多肽的RNA片段。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因的氨基酸序列的多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有載體和編碼對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因的多肽的DNA片段的重組DNA分子。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述重組DNA分子或DNA片段的宿主細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其細(xì)胞中含有上述重組DNA分子或上述DNA片段的轉(zhuǎn)基因宿主生物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用上述宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)蝦青素的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)其它葉黃素的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在植物中，特別是在含有色體的細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)基因的高表達(dá)的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及向有色體輸入轉(zhuǎn)基因編碼的類胡蘿卜素生物合成酶的方法。
附圖簡述此處參照下列附圖通過實(shí)施例描述本發(fā)明，其中圖1是β-胡蘿卜素生物合成的一般生化途徑，途徑中所有分子以全反式構(gòu)型表示，其中IPP是異戊烯基焦磷酸，DMAPP是二甲基焦磷酸，GPP是牻牛兒焦磷酸，F(xiàn)PP是法呢基焦磷酸，GGPP是牻牛兒牻牛兒焦磷酸及PPPP是前八氫番茄紅素焦磷酸；
圖2是本發(fā)明的crtO cDNA(CRTOA.SEQ)和Kajiwara等克隆的cDNA(CRTOJ.SEQ)[見Kaj iwara S，Kakizono T，Saito T，KondoK，Ohtani T，Nishio N，Nagai S和Misawa N(1995)雨生紅球藻蝦青素生物合成和大腸桿菌中蝦青素合成的新cDNA的分離和功能鑒定，植物分子生物學(xué)29343-352]的核苷酸序列之間的相同性圖示，用GCG軟件，其中()表示相同，(-)表示缺口，核苷酸編號(hào)根據(jù)對(duì)于CRTOA.AMI的SEQ ID No4和Kajiwara等的CRTOJ.AMI；圖3是本發(fā)明的crtO cDNA編碼的氨基酸序列(CRTOA.AMI)與Kajiwara等克隆的cDNA編碼的氨基酸序列(CRTOJ.AMI)[見，Kajiwara S，Kakizono T，Saito T，Kondo K，O htani T，Nishio N，Nagai S和Misawa N(1995)雨生紅球藻蝦青素生物合成和大腸桿菌中蝦青素合成的新cDNA的分離和功能鑒定，植物分子生物學(xué)29343-352]之間的相同性圖示，用GCG軟件，其中()表示相同，(-)表示缺口，氨基酸編號(hào)根據(jù)對(duì)于CRTOA.AMI的SEQ ID No4和Kajiwara等的CRTOJ.AMI；圖4是命名為pBCAR的pACYC184衍生的質(zhì)粒圖示，包含草生歐文氏菌的crtE、crtB、crtI和crtY基因，這些基因是大腸桿菌細(xì)胞中合成β-胡蘿卜素所必需的；圖5是命名為pZEAX的pACYC184衍生的質(zhì)粒圖示，包含草生歐文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ基因，這些基因是大腸桿菌細(xì)胞中合成玉米黃素所必需的；圖6是命名為pHPK的pBluescript Sk-衍生的質(zhì)粒圖示，包含編碼雨生紅球藻β-胡蘿卜素C-4-加氧酶的全長cDNA插入，此cDNA命名為crtO并在SEQ ID No1中列出，通過大腸桿菌顏色互補(bǔ)作用得到鑒定；圖7是命名為pCANTHA的pACYC184衍生的質(zhì)粒圖示，該質(zhì)粒是通過插入1.2kb PstI-PstI DNA片段衍生的，包含從圖6質(zhì)粒pHPK分離的并插入圖5質(zhì)粒pZEAX的crtZ基因編碼序列的PstI位點(diǎn)的編碼雨生紅球藻β-C-4-加氧酶的cDNA；此重組質(zhì)粒攜帶草生歐文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY基因和雨生紅球藻的crtO基因，所有這些基因都是大腸桿菌細(xì)胞中合成角黃素所必需的；圖8是命名為pASTA的pACYC 184衍生的質(zhì)粒圖示，該質(zhì)粒是通過插入1.2kb PstI-PstI DNA片段衍生的，包含從圖6質(zhì)粒pHPK分離的并插入圖5質(zhì)粒pZEAX中位于crtE基因下游600bp的PstI位點(diǎn)的編碼雨生紅球藻β-C-4-加氧酶的cDNA；此重組質(zhì)粒攜帶雨生紅球藻的crtO基因和草生歐文氏菌的crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ基因，所有這些基因都是大腸桿菌細(xì)胞中合成蝦青素所必需的。
圖9是命名為PAN3.5-KETO的pBR328衍生的質(zhì)粒圖示，該質(zhì)粒是通過插入1.2kb PstI-PstI DNA片段衍生的，包含從圖6質(zhì)粒pHPK分離的并插入質(zhì)粒pPAN35D5中位于β-內(nèi)酰胺酶基因中的PstI位點(diǎn)的編碼雨生紅球藻β-C-4-加氧酶的cDNA[描述見Hirschberg J，OhadN，Pecker I和Rahat A(1987)藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌R2.中抗除草劑突變體的分離和鑒定，Z.Naturforsch 42c102-112]；此重組質(zhì)粒攜帶雨生紅球藻的crtO基因，此基因是聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942細(xì)胞中合成蝦青素所必需的。
圖10是命名為pBIB的Ti雙元質(zhì)粒(大腸桿菌，土壤桿菌)T-DNA區(qū)的圖示[Becker D(1990)允許植物選擇標(biāo)記和報(bào)告基因交換的二型載體，核酸研究18230]，此質(zhì)粒是Ti質(zhì)粒pBI101的衍生物[Jefferson AR，Kavanagh TA和Bevan WM(1987)，GUS融合β-葡糖苷酸酶作為高等植物中敏感通用的基因融合標(biāo)記，The EMBO J.63901-3907]，其中BR和BL分別是T-DNA區(qū)的右邊界和左邊界，pAg7是土壤桿菌Ti質(zhì)?；?的聚腺苷酸化位點(diǎn)，pAnos是含土壤桿菌胭脂氨酸合成酶基因聚腺苷酸位點(diǎn)的250bp長DNA片段NPTII是編碼卡那霉素抗性的1800bp長的DNA片段，pnos是含土壤桿菌胭脂氨酸合成酶基因啟動(dòng)子序列的300bp長DNA片段，而pAnos是含土壤桿菌胭脂氨酸合成酶基因聚腺苷酸化位點(diǎn)的300bp長DNA片段；圖11是命名為pPTBIB的Ti雙元質(zhì)粒(大腸桿菌，土壤桿菌)T-DNA區(qū)的圖示，通過克隆番茄(Lycopersicon esculentum)標(biāo)記的PT的基因組DNA序列(如公開于Mann V，Pecker I和Hirschberg J(1994)，番茄(Lycopersicon esculentum)的八氫番茄紅素脫氫酶(Pds)基因的克隆和鑒定，植物分子生物學(xué)24429-434中的Pds基因的核苷酸1至1448)來制備此質(zhì)粒，此DNA序列包含Pds基因的啟動(dòng)子和多肽PDS氨基末端區(qū)域的編碼序列，多肽PDS作為進(jìn)入葉綠體和有色體的中間肽，將此DNA序列插入圖10的雙元質(zhì)粒載體pBIB的HindIII-SmaI位點(diǎn)，其中BR和BL，pAg7，pAnos，NPTII，pnos和pAnos為如上定義；圖12是命名為pPTCRTOBIB的Ti雙元質(zhì)粒(大腸桿菌，土壤桿菌)T-DNA區(qū)，該質(zhì)粒通過將雨生紅球藻crtO的cDNA的1110核苷酸長的Eco47III-NcoI片段(SEQ ID No1的核苷酸211至1321)克隆入圖11質(zhì)粒pPTBIB的SmaI位點(diǎn)來制備，使PDS氨基末端的編碼核苷酸序列位于crtO相同閱讀框架，其中BR和BL，pAg7，pAnos，NPTII，pnos和pAnos如上定義，PT是番茄Pds啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列，CRTO是雨生紅球藻crtO的核苷酸序列(SEQ ID No1的核苷酸211至1321)。
圖13表示從野生型(WT)和命名為2，3，4，6，9和10的crtO轉(zhuǎn)基因煙草植物提取的HindIII消化的基因組DNA的Southern DNA印跡分析，根據(jù)本發(fā)明，基本上按Sambrook等，分子克隆；實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.1989所述，使用crtO cDNA作為放射性探針，其中左側(cè)按千堿基對(duì)(kb)表示標(biāo)記(M)的DNA片段大小以及從含crtO cDNA序列的圖12所示的pPTPDSBIB序列推測的內(nèi)部T-DNAHindIII片段的預(yù)測位置(箭頭)；圖14表示蝦青素的生物合成途徑；圖15表示野生型煙草植物的花和根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因煙草植物的花。
優(yōu)選實(shí)施方案描述總的來說，本發(fā)明是關(guān)于生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素的生物技術(shù)方法。具體地，本發(fā)明涉及具有β-C-4加氧酶活性的肽；編碼此肽的DNA片段；編碼此肽的RNA片段；含載體和DNA片段的重組DNA分子；含上述重組DNA分子或DNA片段的宿主細(xì)胞或生物；以及用宿主生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素或含(3S，3’S)蝦青素的食品添加劑的生物技術(shù)方法。
單細(xì)胞淡水綠藻雨生紅球藻在面對(duì)不利的生長條件或適應(yīng)不同的環(huán)境逆境如磷酸鹽或氮饑餓、生長培養(yǎng)基中的高濃度鹽或高光強(qiáng)度時(shí)積累大量的(3S，3’S)蝦青素[見，Yong YYR和Lee YK(1991)Phycologia 30257-261；Droop MR (1954) Arch Microbiol20391-397；和Andrews A.G，Borch G，Liaaen-Jensen S和SnatzkeG(1974)Acta Chem Scand B28730-736]。藻類的營養(yǎng)細(xì)胞在此過程中形成孢囊并從綠色變?yōu)榧t色。本發(fā)明公開了命名為crtO的雨生紅球藻cDNA的克隆，此cDNA編碼將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)榻屈S素的β-C-4-加氧酶，并且在表達(dá)β-胡蘿卜素羥化酶(例如草生歐文氏菌crtZ基因產(chǎn)物)的異源系統(tǒng)中表達(dá)，導(dǎo)致(3S，3’S)蝦青素的合成。
crtO cDNA及其編碼的具有β-C-4-加氧酶活性的肽分別是新的核酸和氨基酸序列。crtO cDNA的克隆方法利用了已在其中轉(zhuǎn)染和表達(dá)了雨生紅球藻的cDNA文庫經(jīng)遺傳加工合成β-胡蘿卜素的大腸桿菌菌株。目測篩選棕紅色大腸桿菌細(xì)胞鑒定為產(chǎn)生角黃素的轉(zhuǎn)化子。由此，克隆的cDNA已在兩個(gè)異源系統(tǒng)(大腸桿菌和聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942細(xì)胞)中表達(dá)，兩者都能產(chǎn)生β-胡蘿卜素并進(jìn)一步含有加工的(單生歐文氏菌crtZ基因產(chǎn)物)或內(nèi)源的β-胡蘿卜素羥化酶活性，并且已證明在兩個(gè)系統(tǒng)中都能合成(3S，3’S)蝦青素。
crtO cDNA或其蛋白產(chǎn)物與從合成諸如蝦青素的酮胡蘿卜素的海洋細(xì)菌agrobacterium auranticacun和產(chǎn)堿菌PC-1分離的crtW及其蛋白產(chǎn)物的核酸或氨基酸序列相比沒有有意義的核酸或氨基酸序列相似性[見Misawa N，Kajiwara S，Kondo k，Yokoyama A，Satomi Y，Saito T，Miki W和Ohtani T(1995)通過由單個(gè)基因?qū)⑻細(xì)洇?胡蘿卜素中亞甲基轉(zhuǎn)變?yōu)橥慕屈S素生物合成，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，第209卷，第867-876頁]。
但是，crtO cDNA的核酸序列及其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列與最近克隆的從雨生紅球藻分離的編碼具有β-胡蘿卜素加氧酶活性的320個(gè)氨基酸蛋白產(chǎn)物的cDNA的核酸和氨基酸序列基本相同[見KajiwaraS，Kakizono T，Saito T，Kondo K，Ohtani T，Nishio N，Nagai S和Misawa N(1995)雨生紅球藻蝦青素生物合成和大腸桿菌蝦青素的合成的新cDNA的分離和功能鑒定，植物分子生物學(xué)29343-352]。然而，如用GCG軟件所確定的，如圖2中所示，crtO cDNA(圖2的CRTOA.SEQ)和Kajiwara等所述的cDNA(圖2的CRTOJ.SEQ)[見上參考文獻(xiàn)]間序列相同性程度是75.7％；如圖3所示，crtO cDNA蛋白產(chǎn)物(圖3的CRTOA.AMI)和Kajiwara等所述的蛋白(圖3的CRTOJ.AMI)間的序列相同性程度是78％。
如下面將詳細(xì)描述的，可用crtO cDNA使用生物技術(shù)在易于生長并可直接用作魚類食品添加劑的系統(tǒng)或允許簡便低耗提取蝦青素的系統(tǒng)中生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異及其有功能的天然存在的和/或人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽的DNA片段。此處和下面權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“等位和種變異及其有功能的天然存在的和/或人誘導(dǎo)的變體”是指DNA(或如下所述的RNA)的來源或本領(lǐng)域已知的獲得它的方法。但是，術(shù)語“變異”和“變體”是指存在序列不相似(即變異)。此處和以下權(quán)利要求書中本發(fā)明的序列變異是77-80％，優(yōu)選地80-85％，更優(yōu)選地85-90％，最優(yōu)選地90-100％的相同核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA片段包含如SEQ ID No1中所列出的序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA片段編碼如SEQ ID No4中所列出的氨基酸序列。
本發(fā)明也包括純化的DNA片段，其特征在于包含在高嚴(yán)格條件下[例如，按Sambrook等，分子克?。粚?shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.1989所述]與核酸探針雜交的序列，此探針包含SEQ ID No1或SEQ ID No2的至少15個(gè)，優(yōu)選地至少50個(gè)，更優(yōu)選地至少100個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少200個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少500個(gè)連續(xù)核苷酸。選擇性地，本發(fā)明的DNA片段可以以能在低嚴(yán)格條件下與含有SEQ IDNo1或SEQ ID No2的編碼序列(核苷酸166至1152)的核酸探針雜交為特征。這種低嚴(yán)格條件的例子按Sambrook等所述，用低雜交溫度，例如比如上面所述的高嚴(yán)格雜交條件所用溫度低20℃。
本發(fā)明的DNA片段也可以以能在高嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID No1或SEQ ID No2的編碼序列(核苷酸166至1152)的核酸探針雜交為特征。
本發(fā)明也包括能與SEQ ID No1或SEQ ID No2的至少10個(gè)核苷酸片段雜交的合成法合成的寡核苷酸(例如寡脫氧核苷酸或寡核糖核苷酸及其類似物)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異及其有功能的天然存在的和/或人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽的RNA片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA片段包含如SEQ ID No2中所列出的序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA片段編碼如SEQ ID No4中所列出的氨基酸序列。
本發(fā)明也包括純化的RNA，其特征在于包含在高嚴(yán)格條件下與核酸探針雜交的序列，此探針包含SEQ ID No1或SEQ ID No2的至少至少15個(gè)，優(yōu)選地至少50個(gè)，更優(yōu)選地至少100個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少200個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少500個(gè)連續(xù)核苷酸。選擇性地，本發(fā)明的RNA可以以能在低嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID No1或SEQ ID No2的編碼序列(核苷酸166至1152)的核酸探針雜交為特征。此外，本發(fā)明的RNA可以以能在高嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID No1或SEQ ID No2的編碼序列(核苷酸166至1152)核酸探針雜交為特征。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異及其有功能的天然存在的和/或人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽包含如SEQ ID No4中所列出的氨基酸序列。
應(yīng)當(dāng)注意本發(fā)明包括任何與上述多肽同源(即80-85％，優(yōu)選地85-90％，較優(yōu)選地90-100％的相同氨基酸)的肽。此處和下面權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“同源的”是指兩個(gè)肽之間的序列相同性。當(dāng)兩個(gè)對(duì)比序列中的一個(gè)位置由相同的氨基酸單體亞單位占據(jù)時(shí)，在此位置就是同源的。兩個(gè)序列間的同源性是兩個(gè)序列中同源位置數(shù)目的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列中10個(gè)位置有8個(gè)位置由相同氨基酸占據(jù)，那么這兩個(gè)序列是80％的同源。
本發(fā)明中所包括的其它多肽是等位變異、其它種同系物、天然突變體、誘導(dǎo)突變體以及在高或低嚴(yán)格條件(見上面)下與SEQ ID No1或SEQ ID No2編碼區(qū)(核苷酸166至1152)雜交的DNA編碼的肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有載體(例如質(zhì)?；虿《据d體)和編碼如上所述多肽的DNA片段的重組DNA分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，載體中存在的DNA片段與啟動(dòng)子可操作地連接。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含上述重組DNA分子或DNA片段的宿主細(xì)胞。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括原核生物(如細(xì)菌，包括大腸桿菌)和低等真核生物(例如酵母)及高等真核生物(例如藻類、植物或動(dòng)物細(xì)胞)。用本領(lǐng)域已知方法例如但不限于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、微注射、基因轟擊等將重組分子導(dǎo)入細(xì)胞?？梢允惯@樣制備的含有上述重組DNA分子的細(xì)胞生長形成菌落或分化形成分化的生物。重組DNA分子可以暫時(shí)包含在細(xì)胞中(例如通過本領(lǐng)域已知的暫時(shí)轉(zhuǎn)染方法)，但是優(yōu)選的是重組DNA分子穩(wěn)定包含在細(xì)胞中(例如通過本領(lǐng)域已知的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞可以內(nèi)源合成或通過遺傳工程方法使細(xì)胞合成β-胡蘿卜素，并且細(xì)胞包含內(nèi)源的或遺傳加工的β-胡蘿卜素羥化酶活性。這種細(xì)胞可以用作動(dòng)物(例如鮭魚)和人類消費(fèi)的食品添加劑。此外，如下描述的，這種細(xì)胞可用于提取蝦青素和/或其它葉黃素。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其細(xì)胞中含有上述重組DNA分子或上述DNA片段的轉(zhuǎn)基因宿主生物(例如高等植物或動(dòng)物)。用本領(lǐng)域已知方法可以將重組分子或DNA片段導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因宿主生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中還可以內(nèi)源合成或通過遺傳工程方法使細(xì)胞合成β-胡蘿卜素，并且優(yōu)選地宿主生物也包含內(nèi)源的或遺傳加工的β-胡蘿卜素羥化酶活性。這種生物可用作動(dòng)物(例如鮭魚)和人類消費(fèi)的食品添加劑。此外，如下描述的，這種生物可用于提取蝦青素和/或其它葉黃素。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用上述宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)蝦青素的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用上述宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)葉黃素如角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、隱黃素、異隱黃素、羥基-β-胡蘿卜素-4-酮、玉米黃素、adonirubin、3-羥基-β-胡蘿卜素-4-酮、3′-羥基-β-胡蘿卜素-4-酮和/或adonixanthin的方法。提供如上所述的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物用于這些目的。使宿主細(xì)胞或生物在利于產(chǎn)生和通過本領(lǐng)域已知方法提取葉黃素和上面所列的其它葉黃素的條件下生長。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表達(dá)編碼包含對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異或其有功能的天然存在的或人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地在含有色體組織中表達(dá)最高。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括編碼將蛋白導(dǎo)入植物葉綠體或有色體的多肽的第一個(gè)DNA片段(例如來自番茄Pds基因)和編碼包含對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異或其有功能的天然存在的和人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽第二個(gè)框架內(nèi)DNA片段的重組DNA載體。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括包含可在植物含葉綠體或有色體的組織中高度表達(dá)的啟動(dòng)子的第一個(gè)DNA片段(例如來自番茄Pds基因)和編碼包含對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異或其有功能的天然存在的和人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽第二個(gè)DNA片段的重組DNA載體。
目前由以下實(shí)施例和上面描述一起闡明本發(fā)明。實(shí)施例在實(shí)施例中指出的下列方法和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)是藻類和生長條件 雨生紅球藻(菌株34/7來自藻類和原生生物培養(yǎng)保藏中心，Windermere，UK)由利物浦John Moores大學(xué)AndrewYoung博士慷慨提供。藻類的懸浮培養(yǎng)物在如Nichols和Bold所述的液體培養(yǎng)基中生長[見Nichols HW，Bold HC(1964)Trichsarcinapolymorpha藻類學(xué)雜志134-39]。收獲細(xì)胞，用水沖洗并重新懸浮在去氮培養(yǎng)基中用于蝦青素生物合成的誘導(dǎo)。將培養(yǎng)物在連續(xù)光照(光子通量75μE/m2/S)下，于25℃在80rpm搖床上保留在250毫升Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中。
cDNA文庫的構(gòu)建在Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters364125-128中詳細(xì)描述了從雨生紅球藻中構(gòu)建cDNA文庫。簡要地說，從在缺氮條件下生長5天的藻類細(xì)胞(細(xì)胞顏色棕紅)中提取總RNA。從50毫升培養(yǎng)基收獲細(xì)胞并用Tri試劑提取RNA(分子研究中心，INC)。通過在寡脫氧胸苷酸纖維素(Boehringer)上的兩次分級(jí)分離循環(huán)分離多聚腺苷酸化RNA。終產(chǎn)量為總RNA的1.5％。用ZAP-cDNA合成試劑盒將cDNA文庫構(gòu)建在Uni-ZAPTMXR載體中(都來自Stratagene)。用菌株XL1-Blue MRF′(Stratagene)的大腸桿菌細(xì)胞擴(kuò)增cDNA文庫。
質(zhì)粒和大腸桿菌菌株 從Tuveson處獲得含有細(xì)菌草生歐文氏菌類胡蘿卜素生物合成必需基因的質(zhì)粒pPL376[關(guān)于質(zhì)粒pPL376的進(jìn)一步細(xì)節(jié)見Tuveson RW，Larson RA和Kagan J(1988)大腸桿菌中表達(dá)的克隆類胡蘿卜素基因在保護(hù)免受由近紫外光和特異的光毒性分子引起的失活中的作用，細(xì)菌學(xué)雜志1704675-4680]。攜帶質(zhì)粒pPL376的大腸桿菌菌株JM109細(xì)胞積累了淺黃色類胡蘿卜素，玉米黃素糖苷。在第一步中，從此質(zhì)粒中刪除1.1kb SalI-SalI片段使編碼玉米黃素糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因crtX失活。在第二步中，在自身連接后質(zhì)粒DNA的BamHI部分切割刪除0.8kb片段，使編碼β-胡蘿卜素羥化酶的crtZ失活。BglII部分切割產(chǎn)生7.4kb片段，將此片段克隆到質(zhì)粒載體pACYC184的BamHI位點(diǎn)。如圖4所示，得到的攜帶基因crtE、crtB、crtI和crtY的重組質(zhì)粒命名為pBCAR[Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters 364125-128]。
將質(zhì)粒pBCAR轉(zhuǎn)染入大腸桿菌SOLR菌株細(xì)胞(Stratagene)。在含氯霉素的Luria Broth(LB)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落(在Sambrook等，分子克?。粚?shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1989中描述]攜帶此質(zhì)粒并由于β-胡蘿卜素的積累而發(fā)展成深黃-橙色。
如圖5所示，構(gòu)建命名為pZEAX的另一質(zhì)粒，此質(zhì)粒允許在大腸桿菌中合成和積累玉米黃素[Lotan和Hirschberg(1995)FEBSLetters 364125-128中詳細(xì)描述了此質(zhì)粒]。大腸桿菌S0LR菌株的細(xì)胞用作pZEAX質(zhì)粒的宿主。大腸桿菌細(xì)胞在LB培養(yǎng)基(見上)上于37℃在225rpm的搖床上避光生長。向培養(yǎng)基中加入氯芐青霉素(50微克/毫升)和/或氯霉素(30微克/毫升)(兩者都來自Sigma)以挑選適當(dāng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
如圖6所示，如Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters364125-128(見下面描述)所描述的，通過顏色互補(bǔ)鑒定包含β-胡蘿卜素C-4-加氧酶全長cDNA的質(zhì)粒pHPK。從質(zhì)粒pHPK分離含雨生紅球藻β-C-4加氧酶cDNA的1.2kb PstI-PstI DNA片段并插入質(zhì)粒pZEAX的crtZ基因編碼序列中的PstI位點(diǎn)。此重組質(zhì)粒命名為pCANTHA并在圖7中表示。
也將同一個(gè)1.2kb PstI-PstI片段插入存在于質(zhì)粒pZEAX中crtE基因600bp下游的PstI位點(diǎn)。得到的重組質(zhì)粒命名為pASTA并在圖8中表示。
也將同一個(gè)1.2kb PstI-PstI片段插入存在于帶有質(zhì)粒載體pBR328中的藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942的psbA1基因[Hirschberg J，Ohad N，Pecker I和Rahat A(1987)藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌R2中除草劑抗性突變體的分離和特征鑒定，Z Naturforsch 42c102-112]的質(zhì)粒pPAN35D5中的β-內(nèi)酰胺酶基因中的PstI位點(diǎn)[Hirschberg J，OhadN，Pecker I和Rahat A(1987)藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌R2中的除草劑抗性突變體的分離和特征鑒定，Z.Naturforsch 42c102-112]。此質(zhì)粒命名為PAN3.5-KETO并在圖9中表示。按照Golden所述方法將此質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942細(xì)胞[Golden SS(1988)通過經(jīng)典基因轉(zhuǎn)移方法誘變藍(lán)細(xì)菌，酶學(xué)方法167714-727]。
噬菌體文庫的切割及β-胡蘿卜素加氧酶基因的篩選用攜帶質(zhì)粒pBCAR的大腸桿菌SOLR菌株細(xì)胞中ExAssit輔助噬菌體(Stratagene)對(duì)按上述方法制備的cDNA文庫進(jìn)行大量切割。將以噬菌粒的切割文庫轉(zhuǎn)染入大腸桿菌XL1-Blue菌株的細(xì)胞并將細(xì)胞鋪在含1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，50微克/毫升氨芐青霉素和30微克/毫升氯霉素的LB平板上，密度為每個(gè)平板產(chǎn)生約100至150個(gè)菌落。將平板37℃過夜培養(yǎng)并在室溫下進(jìn)一步培養(yǎng)兩天以上。然后4℃保存平板直到篩選菌落顏色變化。
有色體中高度表達(dá)crtO的質(zhì)粒 如圖10-11所示，將含Pds基因啟動(dòng)子和作為進(jìn)入葉綠體和有色體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多肽PDS氨基末端區(qū)編碼序列的番茄(Lycopersicon esculentum)基因組DNA序列(Pds基因的核苷酸1至1448)[如Mann V，Pecker I和Hirschberg J(1994)，番茄(Lycopersicon esculentum)八氫番茄紅素脫氫酶基因(Pds)的克隆和特征鑒定，植物分子生物學(xué)24429-434中公開的]克隆進(jìn)入圖10所示的雙元質(zhì)粒載體pBIB[描述于Becker D(1990)，允許植物選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因交換的雙元載體，核酸研究18230]的HindIII-SmaI位點(diǎn)。重組質(zhì)粒命名為pPTBIB并在圖11中表示。
如圖12所示，將含雨生紅球藻crtO的cDNA(SEQ ID No1的核苷酸211至1321)的1，110核苷酸長的Eco47III-NcoI片段亞克隆入質(zhì)粒pPTBIB的SmaI位點(diǎn)(圖11)使得Pds氨基末端編碼核苷酸序列與crtO處于同一閱讀框架中。重組質(zhì)粒命名為pPTCRTOBIB。
轉(zhuǎn)基因高等植物的形成 從大腸桿菌細(xì)胞中提取pPTCRTOBIB的DNA并用電穿孔方法按對(duì)大腸桿菌所述的[Dower JW，Miller FJ和Ragdsale WC(1988)通過高壓電穿孔高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌，核酸研究186127-6145]將其轉(zhuǎn)移至根瘤土壤桿菌菌株EHA 105的細(xì)胞中[描述于Hood EE，Gelvin SB、Melchers LS和Hoekema A(1993)，轉(zhuǎn)基因研究2208-218]。土壤桿菌細(xì)胞于28℃在補(bǔ)充了作為選擇劑的50微克/毫升鏈霉素和50微克/毫升卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長。在生長穩(wěn)定期時(shí)從上清培養(yǎng)物中收集攜帶pPTCRTOBIB的土壤桿菌細(xì)胞并如Horsch RB，F(xiàn)ry JE，Hoffmann NL，Eicholtz D，Rogers SG和FraleyRT，將基因轉(zhuǎn)入植物的簡單通用方法，科學(xué)(1985)2271229-1231；和Jefferson AR，Kavanagh TA和Bevan WM(1987)GUS融合β-葡糖苷酸酶作為高等植物的敏感和通用基因融合標(biāo)記，The EMBO J.63901-3907所述的用于轉(zhuǎn)化。
用轉(zhuǎn)化的土壤桿菌細(xì)胞感染煙草株NN的葉外植體并按照上面引用的Horsch等(1985)和Jefferson等(1987)所述方法再生卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因植物。
目前參照?qǐng)D13，通過DNA-DNA印跡分析測定全面發(fā)育的再生植物中crtO基因構(gòu)建體DNA序列的存在。為此目的，從葉中提取DNA[根據(jù)Kanazawa和Tsutsumi(1992)，從Nelumbo屬植物提取限制性DNA，植物分子生物學(xué)報(bào)告10316-318所述方法]，用限制性內(nèi)切酶HindIII消化，通過凝膠電泳按大小分離這些片段并與放射標(biāo)記的crtO序列(SEQ ID No1)雜交。
已確定所檢查的每個(gè)轉(zhuǎn)基因植物包含至少1個(gè)crtO DNA序列拷貝，產(chǎn)生源自pPTCRTOBIB T-DNA內(nèi)部HindIII-HindIII片段的1.75kb條帶(箭頭)、其它源自部分消化的條帶、其它大小隨植物基因組中插入位置變化的條帶和源自煙草植物本身也出現(xiàn)在陰性對(duì)照野生型泳帶中的1.0kb條帶。
序列分析 通過雙脫氧方法進(jìn)行DNA序列分析[見Sanger F，Nicklen S & Coulsen AR(1977)用鏈終止反應(yīng)抑制劑進(jìn)行DNA測序，美國國家科學(xué)院院報(bào)745463-5467]。
分析類胡蘿卜素 將生長在LB液體培養(yǎng)基中的大腸桿菌細(xì)胞以13,000g離心10分鐘，在水中洗一次后再離心。除去水后，將細(xì)胞重新懸浮在70微升丙酮中并于65℃培養(yǎng)15分鐘。將樣品再在13,000g離心10分鐘并將含類胡蘿卜素的上清液放入干凈試管。在氮?dú)?N2)氣流下吹干類胡蘿卜素提取物并在-20℃保存直到需要分析。將0.5-1.0gr植物組織和100微升丙酮混合，65℃培養(yǎng)15分鐘，然后按上述方法處理樣品就可從植物組織中提取類胡蘿卜素。
用酸化反相C18柱Spherisorb ODS-2(硅5微米，4.6毫米×250毫米)(Phenomenex)進(jìn)行類胡蘿卜素提取物的高效液相色譜(HPLC)。通過三相Merck-HitachiL-6200A高壓泵以流速1.5毫升/分鐘泵入流動(dòng)相。流動(dòng)相由包含己烷/二氯甲浣/異丙醇/三乙胺(88.5∶10∶1.5∶0.1，體積/體積)的無梯度溶劑系統(tǒng)組成。用Waters 996光電二極管系統(tǒng)探測儀測定470納米處的峰。與化學(xué)純?chǔ)?胡蘿卜素、玉米黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、角黃素、adonirubin和蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)樣品(后四種由利物浦John Moores大學(xué)Andrew Young博士慷慨提供)比較，通過它們的保留時(shí)間和它們的典型吸收譜來鑒定每個(gè)類胡蘿卜素。
用乙酸乙酯/苯(7∶3，體積/體積)作為洗脫液，用硅膠60 F254板(Merck)進(jìn)行薄層色譜(TLC)。用Shimadzu UV-160A分光光度計(jì)記錄可見光吸收光譜。所有光譜在丙酮中記錄。以％III/II的方式表示光譜細(xì)微結(jié)構(gòu)[Britton，G.(1995)紫外線/可見光光譜學(xué)，于類胡蘿卜素，第IB卷，光譜學(xué)，Britton G，Liaaen-Jensens和Pfander H.Birkhauser Verlag編輯，Basel.第13-62頁]。
對(duì)從大腸桿菌細(xì)胞提取的類胡蘿卜素的分離和鑒定進(jìn)行處理以增加TLC硅板上吸附(降低Rf值)。類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)和蝦青素生物合成途徑在圖14中給出。下列細(xì)節(jié)是指圖14中編號(hào)1至9的類胡蘿卜素。
β-胡蘿卜素(1).與真正的(1)不可分的Rf0.92，Rt.可見λ最大納米(428)，452，457，％III/II＝0。
β-胡蘿卜素-4-酮(2).與真正的(2)不可分的Rf0.90，Rt.VISλ最大納米455，％III/II＝0。
角黃素(3).與真正的(3)不可分的Rf0.87，Rt.可見λ最大納米470.％III/II＝0。
β-玉米黃素(4).Rf0.83.Rt.可見λ最大納米(428)，451，479，％III/II＝0。
Adonirubin(5).與真正的(5)不可分的Rf0.82.Rt.可見λ最大納米476，％III/II＝0。
蝦青素(6).與真正的(6)不可分的Rf0.79.Rt.可見λ最大納米477，％III/II＝0。
Adonixanthin(7).Rf0.72.Rt.可見λ最大納米464，％III/II＝0。
玉米黃素(8).與真正的(8)不可分的Rf0.65.Rt.可見λ最大納米(428)，451，483，％III/II＝27。
羥基-β-胡蘿卜素-4-酮(9)，Rf0.80，Rt，3.0.可見λ最大納米464，％III/II＝0。
手性構(gòu)型 通過蝦青素的衍生的非對(duì)映異構(gòu)camphanate的HPLC測定蝦青素的手性構(gòu)型[Renstrom B，Borch G，Skulberg M和Liaaen-Jensen S(1981)雨生紅球藻的(3S，3’S)蝦青素的光學(xué)純度，光化學(xué)202561-2565]。分析證實(shí)大腸桿菌細(xì)胞合成純的(3S，3’S)蝦青素。實(shí)施例1 克隆β-C-4-加氧酶基因在λZAPII載體上從如上所述通過氮缺失誘導(dǎo)合成蝦青素的雨生紅球藻細(xì)胞的多聚腺苷酸化RNA構(gòu)建cDNA文庫，。將完整文庫切割插入攜帶質(zhì)粒pBCAR的大腸桿菌菌株SOLR的積累β-胡蘿卜素的細(xì)胞(見圖4)。根據(jù)直徑大小為3毫米的菌落顏色來篩選β-胡蘿卜素加氧酶基因。蝦青素和β-胡蘿卜素氧化形式(即葉黃素)具有不同的較深顏色因而可從黃色β-胡蘿卜素背景中分辨。篩選包括約100,000個(gè)菌落，這些菌落生長在含有用于選擇以質(zhì)粒繁殖形式的λZAPII載體和pBCAR質(zhì)粒的氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上。幾個(gè)菌落表現(xiàn)有不同色調(diào)但僅有一個(gè)菌落表現(xiàn)顯著的棕紅色。挑選這個(gè)推測含有葉黃素生物合成基因的菌落用于下面實(shí)施例中所述的進(jìn)一步分析。實(shí)施例2 分析大腸桿菌中β-C-4-加氧酶活性將推測含有葉黃素生物合成基因的棕紅色菌落(見上面實(shí)施例1)劃線并作進(jìn)一步分析。首先，通過從棕紅色菌落中制備質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)染入大腸桿菌菌株XL1-Blue的細(xì)胞并在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上篩選來分離攜帶負(fù)責(zé)大腸桿菌中葉黃素合成的cDNA克隆的重組ZAPII質(zhì)粒。將命名為pHPK的這個(gè)質(zhì)粒(pHPK是含有從棕紅色菌落分離的插入的入ZAPII載體)用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生β-胡蘿卜素的大腸桿菌細(xì)胞(大腸桿菌SOLR菌株攜帶圖4所示的質(zhì)粒pBCAR)，得到棕紅色菌落。用丙酮從轉(zhuǎn)化子和宿主細(xì)胞(作為對(duì)照)提取類胡蘿卜素并用HPLC分析。
合成β-胡蘿卜素的宿主細(xì)菌(攜帶圖4中所示質(zhì)粒pBCAR的大腸桿菌SOLR菌株)的類胡蘿卜素HPLC分析與棕紅色菌落相比，揭示了在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中僅觀察到微量的β-胡蘿卜素，然而出現(xiàn)了新的角黃素主峰和另一個(gè)β-胡蘿卜素-4-酮的小峰[詳述見Lotan和Hirschberg(1995)FEBS Letters 364125-128]。這些結(jié)果表明命名為crtO的質(zhì)粒pHPK中的cDNA編碼有β-C-4-加氧酶活性的酶，此酶經(jīng)β-胡蘿卜素-4-酮將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)榻屈S素(見圖14)。因此，可以斷定單個(gè)酶通過分別對(duì)β-胡蘿卜素β’-環(huán)的C4和C4′的對(duì)稱作用來催化這個(gè)兩步酮化轉(zhuǎn)變。實(shí)施例3 大腸桿菌細(xì)胞中蝦青素的合成將分離的雨生紅球藻crtO cDNA和草生歐文氏菌crtZ基因一起在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)以測定β-胡蘿卜素羥化酶(例如草生歐文氏菌crtZ基因產(chǎn)物)是否將產(chǎn)生的角黃素轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素和/或由β-胡蘿卜素羥化酶作用從β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化來的玉米黃素是否由β-C-4-加氧酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素。為此目的，用如圖8所示含crtZ和crtO的質(zhì)粒pASTA單獨(dú)或選擇性地用如圖6所示含crtO的pHPK和如圖5所示含crtZ的pZEAX兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株SOLR的細(xì)胞。提取所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的類胡蘿卜素并如上述方法用HPLC分析。表1中給出的結(jié)果表明從含質(zhì)粒pASTA的細(xì)胞提取的類胡蘿卜素的組成。在攜帶pHPK和pZEAX的大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相似的類胡蘿卜素組成。
表1
表1所示結(jié)果證明，具有β-端基或4-酮-β-端基的類胡蘿卜素在碳原子C-3和C-3′處作用為crtZ基因產(chǎn)物催化的羥化反應(yīng)底物。β-胡蘿卜素和角黃素的羥化作用分別產(chǎn)生玉米黃素和蝦青素。這些羥化作用導(dǎo)致蝦青素和中間酮類胡蘿卜素，3-羥基-β-胡蘿卜素-4-酮、adonixanthin和adonirubin的合成。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，通過表達(dá)基因crtO和編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因可以在異源細(xì)胞中產(chǎn)生蝦青素。實(shí)施例4 β-胡蘿卜素C-4-加氧酶基因的序列分析將通過多聚腺苷酸尾的存在所確定的質(zhì)粒pHPK中的全長cDNA插入(1771個(gè)堿基對(duì))用于核苷酸序列分析。1995年5月1日將SEQ IDNo1中所列出的序列及SEQ ID No3(329個(gè)氨基酸)中所列出的其翻譯成的氨基酸序列保存在EMBL數(shù)據(jù)庫中并分別得到錄入號(hào)X86782和X86783。
在此序列中鑒定了825個(gè)核苷酸(SEQ ID No3中核苷酸166至1152)的開放閱讀框架(ORF)。如大腸桿菌細(xì)胞(見上面實(shí)施例3)中其功能性表達(dá)所證實(shí)的，此ORF編碼具有SEQ ID No4中所列出的329個(gè)氨基酸的β-胡蘿卜素C-4-加氧酶。編碼此酶的基因命名為crtO。實(shí)施例5 用crtO轉(zhuǎn)化藍(lán)細(xì)菌根據(jù)Golden所述方法[Golden SS(1988)通過經(jīng)典方法和基于基因轉(zhuǎn)移方法誘變藍(lán)細(xì)菌，酶學(xué)方法167714-727]，將圖9所示的pPAN3.5-KETO質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的細(xì)胞中。將藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞在含氯霉素的BG11培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上鋪板。對(duì)10日后出現(xiàn)的氯霉素抗性聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的菌落分析其類胡蘿卜素含量。如下面表2中所詳述的，這些細(xì)胞的HPLC分析表明細(xì)胞的主要類胡蘿卜素成分是β-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素-4-酮、角黃素、adonirubin和蝦青素。對(duì)用其中crtO基因逆向的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的因此不能合成活性蛋白的聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942和野生型細(xì)胞的相似分析表明不能產(chǎn)生β-胡蘿卜素-4-酮，角黃素、adonirubin和蝦青素。
這些結(jié)果證明雨生紅球藻的crtO可在藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)并且其表達(dá)提供了β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)榻屈S素所需的β-C-4-加氧酶酶促活性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的內(nèi)源β-胡蘿卜素羥化酶能夠?qū)⑦@樣生成的角黃素轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素。因?yàn)樗芯G色光合作用生物的類胡蘿卜素生物合成途徑相似[見圖1和10，及Pecker I，ChamovitzD，Linden H，Sandmann G和Hirschberg J(1992)番茄果實(shí)成熟期間催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?chǔ)?胡蘿卜素的單一多肽受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，美國國家科學(xué)院院報(bào)894962-4966]，所以可以推測，在任何組織中也表達(dá)內(nèi)源β-胡蘿卜素羥化酶的藻類和高等植物中可以通過表達(dá)crtO生產(chǎn)蝦青素。進(jìn)一步推測，只要生物包含內(nèi)源的或加工的β-胡蘿卜素生物合成途徑，通過在表達(dá)內(nèi)源或遺傳工程的β-胡蘿卜素羥化酶的任一組織中表達(dá)crtO就可以通過任一生物生產(chǎn)蝦青素。
表2
實(shí)施例6 測定異源系統(tǒng)中民的蝦青素的手性構(gòu)型通過蝦青素衍生的非對(duì)映異構(gòu)camphanate的HPLC測定如實(shí)施例3所述的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的蝦青素及如實(shí)施例5中所述的聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942細(xì)胞產(chǎn)生的蝦青素的手性構(gòu)型[Renstrom B，Borch G，Skulberg M和Liaaen-Jensen S(1981)雨生紅球藻的(3S，3’S)蝦青素的光學(xué)純度，光化學(xué)202561-2565]。分析證明上述大腸桿菌和聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942細(xì)胞合成純的(3S，3’S)蝦青素。實(shí)施例7 用crtO轉(zhuǎn)化高等植物在高等植物中生產(chǎn)天然蝦青素有兩個(gè)預(yù)期的益處。首先，蝦青素作為純化學(xué)品廣泛用作魚類飼料添加劑。它是潛在的適于人類消費(fèi)的食品著色劑并在化妝品工業(yè)中有潛在用途。其次，誘導(dǎo)花和果實(shí)中蝦青素生物合成可以提供增強(qiáng)其外表和/或營養(yǎng)價(jià)值的吸引人的粉紅/紅色。
在花和果實(shí)中，類胡蘿卜素一般在典型含色素的質(zhì)體有色體中合成并積累至高濃度，于是向這些器官提供典型的深色。誘導(dǎo)有色體中蝦青素的合成確保了高濃度酮類胡蘿卜素的積累。導(dǎo)致葉綠體中類胡蘿卜素濃度增加的類胡蘿卜素生物合成基因的過度表達(dá)或葉綠體中類胡蘿卜素組成的其它變化可能損傷類囊膜，削弱光合作用并因此對(duì)植物有害。相反，類胡蘿卜素濃度的增加或有色體中類胡蘿卜素組成的變化不影響植物生存力及果實(shí)和花的產(chǎn)量。
因此，使用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將所述的從藻雨生紅球藻分離的crtO基因以使其尤其在含有色體細(xì)胞中的表達(dá)受正調(diào)控某種方式移入高等植物。
為此目的，在大腸桿菌中組裝圖12所示的含T-DNA的雙元質(zhì)粒載體，將啟動(dòng)子和由來自番茄種類(Nicotiana tabacum NN)的Pds基因編碼的轉(zhuǎn)過肽的編碼DNA序列與雨生紅球藻crtO的編碼DNA序列連接。按上述方法將此DNA構(gòu)建體經(jīng)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用穩(wěn)定轉(zhuǎn)移入煙草(煙草NN)植株以形成轉(zhuǎn)基因植物，植物獲得了尤其在花組織(含有色體細(xì)胞)中產(chǎn)生酮類胡蘿卜素的能力。應(yīng)當(dāng)注意Pds基因啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)植物葉綠體和/或含有色體組織中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。應(yīng)進(jìn)一步注意部分Pds編碼序列編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)肽能夠指導(dǎo)結(jié)合(即框架內(nèi))蛋白進(jìn)入植物有色體和/或葉綠體。
如圖15所示，例如在煙草花的蜜腺組織的含有色體細(xì)胞中，此DNA構(gòu)建體誘導(dǎo)蝦青素和其它酮類胡蘿卜素積累至較高水平而將正常黃色變?yōu)榧t色。
測定轉(zhuǎn)基因植物中如葉的含葉綠體組織和如花的含有色體組織中類胡蘿卜素的濃度和組成并與正常的非轉(zhuǎn)化植物比較。
如上所述通過薄層色譜(TLC)和高壓液相色譜(HPLC)測定野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉(含葉綠體組織)和花的蜜腺組織(含有色體組織)中類胡蘿卜素的組成。
下面表3中總結(jié)了野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉(含葉綠體組織)和花的蜜腺組織(含有色體組織)中總類胡蘿卜素濃度。
下面表4中總結(jié)了野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉中類胡蘿卜素組成的百分?jǐn)?shù)。
下面表5中總結(jié)了野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植物的花蜜腺組織中類胡蘿卜素組成的百分比。
表3 每克鮮重中的類胡蘿卜素(微克)
表4含葉綠體組織(葉)中總類胡蘿卜素組成的百分?jǐn)?shù)(％)
表5含有色體組織(花)中總類胡蘿卜素組成的百分?jǐn)?shù)(％)
<p>請(qǐng)注意特別是在轉(zhuǎn)基因煙草植物含有色體組織中羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3′-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、adonirubin、adonixanthin和蝦青素的濃度增高。
于是，本發(fā)明通過提供具有β-C-4-加氧酶活性的肽；編碼此肽的DNA片段；編碼此肽的RNA片段；含載體和DNA片段的重組DNA分子；含上述重組DNA分子或DNA片段的宿主；以及用宿主生產(chǎn)(3S，3’S)蝦青素或含(3S，3’S)蝦青素的食品添加劑的生物技術(shù)方法使(3S，3′S)蝦青素的相對(duì)低耗的生物技術(shù)生產(chǎn)成為可能從而成功地克服了目前已知構(gòu)型的不足之處。
雖然本發(fā)明已就有限的幾個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行一些變化、修改和其它應(yīng)用。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人Joseph Hirschberg，tamer Lotan and Marker(ii)發(fā)明名稱(iii)序列數(shù)4(iv)聯(lián)系地址(A)名稱Mark M.Friedman c/o Robert Sheinbein(B)街道2940 Birchtree space lane(C)城市Siver Spring(D)州名Maryland(E)國家美國(F)郵政編號(hào)20906(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型1.44兆，3.5”軟盤(B)計(jì)算機(jī)Twinhead Slimnote-890TX(C)操作系統(tǒng)MS-DOS版本6.2Windows版本3.11(D)軟件Word for Windows版本2.0(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)遞交日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)遞交日(viii)律師/代理人信息(A)名稱Friedmam，mark M.
(B)登記號(hào)33,883
(C)參考/著錄號(hào)325/5(ix)電信信息(A)電話972-3-562553(B)傳真972-3-562554(C)電傳(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1771個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO1GGC ACG AGC TTG CAC GCA AGT CAG CGC GCG CAA GTC AAC ACC TGC CGG 48TCC ACA GCC TCA AAT AAT AAA GAG CTC AAG CGT TTG TGC GCC TCG ACG 96TGG CCA GTC TGC ACT GCC TTG AAC CCG CGA GTC TCC CGC CGC ACT GAC 144TGC CAT AGC ACA GCT AGA CGA ATG CAG CTA GCA GCG ACA GTA ATG TTG 192GAG CAG CTT ACC GGA AGC GCT GAG GCA CTC AAG GAG AAG GAG AAG GAG 240GTT GCA GGC AGC TCT GAC GTG TTG CGT ACA TGG GCG ACC CAG TAC TCG 288CTT CCG TCA GAA GAG TCA GAC GCG GCC CGC CCG GGA CTG AAG AAT GCC 336TAC AAG CCA CCA CCT TCC GAC ACA AAG GGC ATC ACA ATG GCG CTA CGT 384GTC ATC GGC TCC TGG GCC GCA GTG TTC CTC CAC GCC ATT TTT CAA ATC 432AAG CTT CCG ACC TCC TTG GAC CAG CTG CAC TGG CTG CCC GTG TCA GAT 480GCC ACA GCT CAG CTG GTT AGC GGC ACG AGC AGC CTG CTC GAC ATC GTC 528GTA GTA TTC TTT GTC CTG GAG TTC CTG TAC ACA GGC CTT TTT ATC ACC 576ACG CAT GAT GCT ATG CAT GGC ACC ATC GCC ATG AGA AAC AGG CAG CTT 624AAT GAC TTC TTG GGC AGA GTA TGC ATC TCC TTG TAC GCC TGG TTT GAT 672TAC AAC ATG CTG CAC CGC AAG CAT TGG GAG CAC CAC AAC CAC ACT GGC 720GAG GTG GGC AAG GAC CCT GAC TTC CAC AGG GGA AAC CCT GGC ATT GTG 768CCC TGG TTT GCC AGC TTC ATG TCC AGC TAC ATG TCG ATG TGG CAG TTT 816GCG CGC CTC GCA TGG TGG ACG GTG GTC ATG CAG CTG CTG GGT GCG CCA 864ATG GCG AAC CTG CTG GTG TTC ATG GCG GCC GCG CCC ATC CTG TCC GCC 912TTC CGC TTG TTC TAC TTT GGC ACG TAC ATG CCC CAC AAG CCT GAG CCT 960GGC GCC GCG TCA GGC TCT TCA CCA GCC GTC ATG AAC TGG TGG AAG TCG 1008CGC ACT AGC CAG GCG TCC GAC CTG GTC AGC TTT CTG ACC TGC TAC CAC 1056TTC GAC CTG CAC TGG GAG CAC CAC CGC TGG CCC TTC GCC CCC TGG TGG 1104GAG CTG CCC AAC TGC CGC CGC CTG TCT GGC CGA GGT CTG GTT CCT GCC 1152TAG CTG GAC ACA CTG CAG TGG GCC CTG CTG CCA GCT GGG CAT GCA GGT 1200TGT GGC AGG ACT GGG TGA GGT GAA AAG CTG CAG GCG CTG CTG CCG GAC 1248ACG CTG CAT GGG CTA CCC TGT GTA GCT GCC GCC ACT AGG GGA GGG GGT 1296TTG TAG CTG TCG AGC TTG CCC CAT GGA TGA AGC TGT GTA GTG GTG CAG 1344GGA GTA CAC CCA CAG GCC AAC ACC CTT GCA GGA GAT GTC TTG CGT CGG 1392GAG GAG TGT TGG GCA GTG TAG ATG CTA TGA TTG TAT CTT AAT GCT GAA 1440GCC TTT AGG GGA GCG ACA CTT AGT GCT GGG CAG GCA ACG CCC TGC AAG1488GTG CAG GCA CAA GCT AGG CTG GAC GAG GAC TCG GTG GCA GGC AGG TGA1536AGA GGT GCG GGA GGG TGG TGC CAC ACC CAC TGG GCA AGA CCA TGC TGC1584AAT GCT GGC GGT GTG GCA GTG AGA GCT GCG TGA TTA ACT GGG CTA TGG1632ATT GTT TGA GCA GTC TCA CTT ATT CTT TGA TAT AGA TAC TGG TCA GGC1680AGG TCA GGA GAG TGA GTA TGA ACA AGT TGA GAG GTG GTG CGC TGC CCC1728TGC GCT TAT GAA GCT GTA ACA ATA AAG TGG TTC1771(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度1771核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO2GGC ACG AGC UUG CAC GCA AGU CAG CGC GCG CAA GUC AAC ACC UGC CGG 48UCC ACA GCC UCA AAU AAU AAA GAG CUC AAG CGU UUG UGC GCC UCG ACG 96UGG CCA GUC UGC ACU GCC UUG AAC CCG CGA GUC UCC CGC CGC ACU GAC 144UGC CAU AGC ACA GCU AGA CGA AUG CAG CUA GCA GCG ACA GUA AUG UUG 192GAG CAG CUU ACC GGA AGC GCU GAG GCA CUC AAG GAG AAG GAG AAG GAG 240GUU GCA GGC AGC UCU GAC GUG UUG CGU ACA UGG GCG ACC CAG UAC UCG 288CUU CCG UCA GAA GAG UCA GAC GCG GCC CGC CCG GGA CUG AAG AAU GCC 336UAC AAG CCA CCA CCU UCC GAC ACA AAG GGC AUC ACA AUG GCG CUA CGU 384GUC AUC GGC UCC UGG GCC GCA GUG UUC CUC CAC GCC AUU UUU CAA AUC 432AAG CUU CCG ACC UCC UUG GAC CAG CUG CAC UGG CUG CCC GUG UCA GAU 480GCC ACA GCU CAG CUG GUU AGC GGC ACG AGC AGC CUG CUC GAC AUC GUC 528GUA GUA UUC UUU GUC CUG GAG UUC CUG UAC ACA GGC CUU UUU AUC ACC 576ACG CAU GAU GCU AUG CAU GGC ACC AUC GCC AUG AGA AAC AGG CAG CUU 624AAU GAC UUG UUG GGC AGA GUA UGC AUC UCC UUG UAC GCC UGG UUU GAU 672UAC AAC AUG CUG CAC CGC AAG CAU UGG GAG CAC CAC AAC CAC ACU GGC 720GAG GUG GGC AAG GAC CCU GAC UUC CAC AGG GGA AAC CCU GGC AUU GUG 768CCC UGG UUU GCC AGC UUC AUG UCC AGC UAC AUG UCG AUG UGG CAG UUU 816GCG CGC CUC GCA UGG UGG ACG GUG GUC AUG CAG CUG CUG GGU GCG CCA 864AUG GCG AAC CUG CUG GUG UUC AUG GCG GCC GCG CCC AUC CUG UCC GCC 912UUC CGC UUG UUC UAC UUU GGC ACG UAC AUG CCC CAC AAG CCU GAG CCU 960GGC GCC GCG UCA GGC UCU UCA CCA GCC GUC AUG AAC UGG UGG AAG UCG1008CGC ACU AGC CAG GCG UCC GAC CUG GUC AGC UUU CUG ACC UGC UAC CAC1056UUC GAC CUG CAC UGG GAG CAC CAC CGC UGG CCC UUC GCC CCC UGG UGG1104GAG CUG CCC AAC UGC CGC CGC CUG UCU GGC CGA GGU CUG GUU CCU GCC1152UAG CUG GAC ACA CUG CAG UGG GCC CUG CUG CCA GCU GGG CAU GCA GGU1200UGU GGC AGG ACU GGG UGA GGU GAA AAG CUG CAG GCG CUG CUG CCG GAC1248ACG CUG CAU GGG CUA CCC UGU GUA GCU GCC GCC ACU AGG GGA GGG GGU1296UUG UAG CUG UCG AGC UUG CCC CAU GGA UGA AGC UGU GUA GUG GUG CAG1344GGA GUA CAC CCA CAG GCC AAC ACC CUU GCA GGA GAU GUC UUG CGU CGG1392GAG GAG UGU UGG GCA GUG UAG AUG CUA UGA UUG UAU CUU AAU GCU GAA1440GCC UUU AGG GGA GCG ACA CUU AGU GCU GGG CAG GCA ACG CCC UGC AAG1488GUG CAG GCA CAA GCU AGG CUG GAC GAG GAC UCG GUG GCA GGC AGG UGA1536AGA GGU GCG GGA GGG UGG UGC CAC ACC CAC UGG GCA AGA CCA UGC UGC1584AAU GCU GGC GGU GUG GCA GUG AGA GCU GCG UGA UUA ACU GGG CUA UGG1632AUU GUU UGA GCA GUC UCA CUU AUU CUU UGA UAU AGA UAC UGG UCA GGC1680AGG UCA GGA GAG UGA GUA UGA ACA AGU UGA GAG GUG GUG CGC UGC CCC1728UGC GCU UAU GAA GCU GUA ACA AUA AAG UGG UUC1771(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1771個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO3GGC ACG AGC TTG CAC GCA AGT CAG CGC GCG CAA GTC AAC ACC TGC CGG 48TCC ACA GCC TCA AAT AAT AAA GAG CTC AAG CGT TTG TGC GCC TCG ACG 96TGG CCA GTC TGC ACT GCC TTG AAC CCG CGA GTC TCC CGC CGC ACT GAC 144TGC CAT AGC ACA GCT AGA CGA ATG CAG CTA GCA GCG ACA GTA ATG TTG 192Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu5GAG CAG CTT ACC GGA AGC GCT GAG GCA CTC AAG GAG AAG GAG AAG GAG 240Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu10 15 20 25GTT GCA GGC AGC TCT GAC GTG TTG CGT ACA TGG GCG ACC CAG TAC TCG 288Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser30 35 40CTT CCG TCA GAA GAG TCA GAC GCG GCC CGC CCG GGA CTG AAG AAT GCC 336Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala45 50 55TAC AAG CCA CCA CCT TCC GAC ACA AAG GGC ATC ACA ATG GCG CTA CGT 384Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Mer Ala Leu Arg60 65 70GTC ATC GGC TCC TGG GCC GCA GTG TTC CTC CAC GCC ATT TTT CAA ATC 432Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile75 80 85AAG CTT CCG ACC TCC TTG GAC CAG CTG CAC TGG CTG CCC GTG TCA GAT 480Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp90 95 100 105GCC ACA GCT CAG CTG GTT AGC GGC ACG AGC AGC CTG CTC GAC ATC GTC 528Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val110 115 120GTA GTA TTC TTT GTC CTG GAG TTC CTG TAC ACA GGC CTT TTT ATC ACC 576Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr125 130 135ACG CAT GAT GCT ATG CAT GGC ACC ATC GCC ATG AGA AAC AGG CAG CTT 624Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu140 145 150AAT GAC TTC TTG GGC AGA GTA TGC ATC TCC TTG TAC GCC TGG TTT GAT 672Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp155 160 165TAC AAC ATG CTG CAC CGC AAG CAT TGG GAG CAC CAC AAC CAC ACT GGC 720Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly170 175 180 185GAG GTG GGC AAG GAC CCT GAC TTC CAC AGG GGA AAC CCT GGC ATT GTG 768Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val190 195 200CCC TGG TTT GCC AGC TTC ATG TCC AGC TAC ATG TCG ATG TGG CAG TTT 816Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe205 210 215GCG CGC CTC GCA TGG TGG ACG GTG GTC ATG CAG CTG CTG GGT GCG CCA 864Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro220 225 230ATG GCG AAC CTG CTG GTG TTC ATG GCG GCC GCG CCC ATC CTG TCC GCC 912Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala235 240 245TTC CGC TTG TTC TAC TTT GGC ACG TAC ATG CCC CAC AAG CCT GAG CCT 960Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro250 255 260 265GGC GCC GCG TCA GGC TCT TCA CCA GCC GTC ATG AAC TGG TGG AAG TCG1008Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser270 275 280CGC ACT AGC CAG GCG TCC GAC CTG GTC AGC TTT CTG ACC TGC TAC CAC1056Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His285 290 295TTC GAC CTG CAC TGG GAG CAC CAC CGC TGG CCC TTC GCC CCC TGG TGG1104Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp300 305 310GAG CTG CCC AAC TGC CGC CGC CTG TCT GGC CGA GGT CTG GTT CCT GCC1152Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala315 320 325TAG CTG GAC ACA CTG CAG TGG GCC CTG CTG CCA GCT GGG CAT GCA GGT1200TGT GGC AGG ACT GGG TGA GGT GAA AAG CTG CAG GCG CTG CTG CCG GAC1248ACG CTG CAT GGG CTA CCC TGT GTA GCT GCC GCC ACT AGG GGA GGG GGT1296TTG TAG CTG TCG AGC TTG CCC CAT GGA TGA AGC TGT GTA GTG GTG CAG1344GGA GTA CAC CCA CAG GCC AAC ACC CTT GCA GGA GAT GTC TTG CGT CGG1392GAG GAG TGT TGG GCA GTG TAG ATG CTA TGA TTG TAT CTT AAT GCT GAA1440GCC TTT AGG GGA GCG ACA CTT AGT GCT GGG CAG GCA ACG CCC TGC AAG1488GTG CAG GCA CAA GCT AGG CTG GAC GAG GAC TCG GTG GCA GGC AGG TGA1536AGA GGT GCG GGA GGG TGG TGC CAC ACC CAC TGG GCA AGA CCA TGC TGC1584AAT GCT GGC GGT GTG GCA GTG AGA GCT GCG TGA TTA ACT GGG CTA TGG1632ATT GTT TGA GCA GTC TCA CTT ATT CTT TGA TAT AGA TAC TGG TCA GGC1680AGG TCA GGA GAG TGA GTA TGA ACA AGT TGA GAG GTG GTG CGC TGC CCC1728TGC GCT TAT GAA GCT GTA ACA ATA AAG TGG TTC1771(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度329個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu5Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu10 15 20 25Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser30 35 40Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala45 50 55Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Arg60 65 70Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile75 80 85Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp90 95 100 105Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val110 115 120Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr125 130 135Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu140 145 150Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp155 160 165Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly170 175 180 185Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val190 195 200Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe205 210 215Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro220 225 230Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala235 240 245Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro250 255 260 265Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser270 275 280Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His285 290 295Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp300 305 310Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala315 320 32權(quán)利要求
1.含有編碼具有如SEQ ID No4中所列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA片段，其中所述核苷酸序列選自等位變體、種變體、天然存在的變體、人誘導(dǎo)的變體及其結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA片段，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID No1中所列出的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的DNA片段，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID No1的166至1152位核苷酸所列出的序列。
5.含有在高嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸探針雜交的核苷酸序列的DNA片段。
6.含有在低嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No1的核苷酸166至1152的核酸探針雜交的核苷酸序列的DNA片段。
7.含有在高嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸探針雜交的核苷酸序列的DNA片段。
8.含有在低嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No2的核苷酸166至1152的核酸探針雜交的核苷酸序列的DNA片段。
9.含有編碼具有如SEQ ID No4中所列出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的RNA片段。
10.如權(quán)利要求9所述的RNA片段，其中所述核苷酸序列選自等位變體、種變體、天然存在的變體、人誘導(dǎo)的變體及其結(jié)合。
11.如權(quán)利要求9所述的RNA片段，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID No2中所列出的核苷酸序列。
12.如權(quán)利要求9所述的RNA片段，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID No2的166至1152位核苷酸所列出的序列。
13.含有在高嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸探針雜交的核苷酸序列的RNA片段。
14.含有在低嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No1的核苷酸166至1152的核酸探針雜交的核苷酸序列的RNA片段。
15.含有在高嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸探針雜交的核苷酸序列的RNA片段。
16.含有在低嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No2的核苷酸166至1152的核酸探針雜交的核苷酸序列的RNA片段。
17.含有對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異及其有功能的天然存在的和人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽。
18.如權(quán)利要求17所述的多肽，其中所述氨基酸如SEQ ID No4中所示。
19.含有與SEQ ID No4中所列出的序列同源的氨基酸序列的多肽。
20.含有由在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID No1的核苷酸166至1152雜交的DNA片段編碼的氨基酸序列的多肽，具有β-C-4-加氧酶活性。
21.含有如權(quán)利要求2所述DNA片段的重組載體DNA分子。
22.含有如權(quán)利要求21所述的重組載體DNA分子的宿主，所述宿主選自細(xì)胞和生物。
23.含有如權(quán)利要求2所述的DNA片段的宿主，所述宿主選自細(xì)胞和生物。
24.一種生產(chǎn)選自蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、隱黃素、異隱黃素、羥基-β-胡蘿卜素-4-酮、玉米黃素、adonirubin、adonixanthin或其結(jié)合的葉黃素的方法，包括以下步驟(a)提供如權(quán)利要求22所述的宿主；(b)提供所述宿主適于生產(chǎn)葉黃素的生長條件；及(c)從所述宿主中提取葉黃素。
25.一種生產(chǎn)選自蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、隱黃素、異隱黃素、羥基-β-胡蘿卜素-4-酮、玉米黃素、adonirubin、adonixanthin或其結(jié)合的葉黃素的方法，包括以下步驟(a)提供如權(quán)利要求23所述的宿主；(b)提供所述宿主適于生產(chǎn)葉黃素的生長條件；及(c)從所述宿主中提取葉黃素。
26.如權(quán)利要求22所述的宿主，其中所述宿主用作食品添加劑。
27.如權(quán)利要求23所述的宿主，其中所述宿主用作食品添加劑。
28.表達(dá)編碼包含對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異或其有功能的天然存在的或人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。
29.如權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述表達(dá)在含有色體的組織中最高。
30.包含編碼指導(dǎo)蛋白進(jìn)入植物葉綠體或有色體的多肽的第一個(gè)DNA片段和編碼包含對(duì)應(yīng)于雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異或其有功能的天然存在的和人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽的第二個(gè)框架內(nèi)DNA片段的重組DNA載體。
31.如權(quán)利要求30所述的重組DNA載體，其中所述第一個(gè)DNA片段源自番茄Pds基因。
32.包含含有在植物葉綠體或有色體組織中高度表達(dá)的啟動(dòng)子的第一個(gè)DNA片段及編碼包括對(duì)應(yīng)雨生紅球藻crtO基因、其等位和種變異或其有功能的天然存在的和人誘導(dǎo)的變體的氨基酸序列的多肽的第二個(gè)DNA片段的重組DNA載體。
33.如權(quán)利要求30所述的重組DNA載體，其中所述第一個(gè)DNA片段源自番茄Pds基因。
全文摘要
總的來說,本發(fā)明涉及生產(chǎn)(3S,3’S)蝦青素的生物技術(shù)方法。具體地,本發(fā)明涉及具有β－C－4－加氧酶活性的肽;編碼此肽的DNA片段;編碼此肽的RNA片段;含載體和DNA片段的重組DNA分子;含上述重組DNA分子或DNA片段的宿主細(xì)胞或生物;以及用宿主生產(chǎn)(3S,3’S)蝦青素或含(3S,3’S)蝦青素的食品添加劑的生物技術(shù)方法。
文檔編號(hào)C12P7/24GK1247565SQ97180152
公開日2000年3月15日 申請(qǐng)日期1997年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月28日
發(fā)明者V·曼, J·海爾施伯格, T·勞坦, M·哈克 申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來語大學(xué)依蘇姆研究開發(fā)公司