專利名稱：癌胚抗原基因啟動子dna的克隆方法、序列及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及人癌胚抗原(CEA)基因啟動子DNA的克隆方法，及該CEA特異啟動子DNA的核苷酸排列順序、用途。屬于醫學基因工程技術領域。
使用自殺基因(HSV-TK基因)、抗癌基因、細胞凋亡基因治療腫瘤是當前腫瘤治療研究的新進展，雖然在臨床上已取得一定的療效(CulverRW et al:Gene therapy for the treament of malignantbrain tumors with in vivo tumor transduction with the herpessiwplexthymidine kinase gene/gancidovir system.Hunan Genefherapy 1994；5:3431)，但單純上述基因的應用，缺乏腫瘤的特異性，限制了基因治療在臨床上的應用范圍及治療效果。
癌胚抗原(CEA)是人胚胎時期的一種血清蛋白，主要是由胚胎大腸上皮細胞分泌產生的。在成熟期大腸上皮細胞已經失去了分泌癌胚抗原蛋白的功能，但在部分大腸癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤患者，癌胚抗原蛋白發生異常表達(Boring C S,et al:Cancer stati-stics.CA-Cancer Journal-for Clinians,42:19-38,1992)。自1965年發現CEA以來(Gold P and Fredman S O:Specific carcino-embryonic antigen of the human digestive systen,J Exp Ked,122:467,1965),CEA已成為世界上研究最為廣泛的腫瘤相關抗原，它不僅常規用于臨床CEA分泌性腫瘤的診斷、鑒別診斷與療效和預后的評價，最近資料還顯示CEA是人類腫瘤特異性主動免疫治療中最有希望的靶抗原。目前已經確定癌胚抗原基因的表達受到其上游的啟動子的調控，相信在CEA分泌性腫瘤中，與CEA表達有關的一些因子的異常表達重新激活了CEA基因的啟動子，故有CEA的異常表達。為開展CEA分泌性腫瘤特異基因治療，國外從結腸癌細胞克隆出CEA基因啟動子DMA，將其與治療基因連接，使治療基因特異性地只在腫瘤細胞中定位表達，達到選擇性殺傷腫瘤細胞，而正常細胞不受影響的治療效果。如CEA啟動子基因與HSV-TK基因連接，使TK基因只在CEA分泌性肺癌(腺癌)細胞中表達，在非CEA分泌性細胞不表達，使肺癌細胞對藥物GCV的敏感性提高了1000倍(Oski T et al:Gene therapy for carcinoembr-yoincantigen-producing human lungcacer cells by cell type-specificexpression of herpes siwplex virus thymidine kinasegene.CancerRes.54,5258,1994)，為腫瘤基因治療帶來新的前景。
本發明的目的是提供一種人胃癌CEA基因啟動子DNA克隆方法、胃癌CEA特異啟動子DNA的核苷酸排列順序。其特點是該DNA序列具有癌胚抗原基因啟動子活性必須序列，同時與結腸癌CEA基因啟動子不同，在+93位是C而不是G堿基(Schreme H et al.Nol Cell Biol,1990；10:2738；Richards CA et al.Hum Gene Ther 1995；6:881-93)；該DNA克隆作為一種大腸桿菌質粒，可在大腸桿菌大量擴增，經簡單純化，使用特意設計并連接在該基因克隆DNA兩端的不同酶切位點酶切，即可將其切下，并可定向插入新的基因治療用載體。在該段DNA調控下，外源基因只能在表達CEA的腫瘤細胞才發生表達，為CEA分泌性胃癌等腫瘤的特異性基因治療提供一個新的基因元件。
本發明的人胃癌癌胚抗原基因啟動子DNA克隆載體pCEAp(寄存于大腸桿菌JN109株，含該質粒的菌種命名為Eschertchia coli JN109/pCEAp，已于1997年9月11日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，登記入冊號為CCNCC No:0324)見
圖1，由以下DNA元件組成1、CEA分泌性腫瘤細胞表達的特異啟動子--癌胚抗原基因上游調控序列；
2、大腸桿菌質粒骨架(包括大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性β內酰氨酶基因)--質粒pGEM-3zf(+)。
本發明用于構建人胃癌癌胚抗原基因啟動子DNA克隆的主要細胞株和原始質粒是pGEN-3zf(+)源自華美公司。
人胃癌細胞株GN803細胞，源自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。
前述人胃癌癌胚抗原基因啟動子DNA克隆方法如下1．首先設計引物。
利用Priwer軟件在計算機中設計出一對合適的引物，為了便于克隆，分別在引物Ⅰ的5′端引入了SacⅠ酶切位點序列(GAGCTC)，在引物Ⅱ的5′端引入了HindⅢ酶切位點序列(AAGCTT)，引物Ⅰ:5′-AATTGAGCTCTCCATCCACCTTGCCGAA引物Ⅱ:5′-GCTCAAGCTTACTCCATGGTCTCTGCTG引物由Sangon上海生物工程公司合成。
2、從人胃癌細胞株GN803常規分離制備DNA模板。
3、PCR擴增以抽提的803細胞DNA為模板，用我們設計合成的引物做PCR擴增，獲得單一CEA啟動子DNA片段見圖2(3)。
4、CEA啟動子克隆以pGEN-3zf(+)為克隆載體，將載體用SacⅠHindⅢ雙酶切后，電泳回收酶切片斷。PCR擴增獲得的啟動子DNA片段經同樣雙酶切后，用乙醇沉淀；按DNA片段∶載體=3∶1的比例，在T4連接酶作用下于14℃過夜連接，轉染菌JN109宿主菌并鋪板；用氨芐青霉素及藍、白菌落雙重篩選，獲得純化的CEA啟動子DNA質粒克隆。
5、CEA啟動子DNA測序分析由上述克隆方法得到的基因啟動子DNA，其序列如下↓-156AAGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG GAAAAAAGAG-116GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA-76GGACACCTGA ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG-36CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC TCAGGGCAGA+5GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG+45ACAAAACGTT CCTGGAACTC AAGCTCTTCT CCACAGAGGA+85GGACAGACCA GACAGCAGAG ACCATGGAGT+115↑+93(箭頭后的數字表示箭頭所指的堿基在癌胚抗原基因啟動子DNA中所處的序列編號，無箭頭的數字表示其左側堿基的序列編號。)本發明的基因啟動子DNA的主要用途如下可定向插入新的基因治療用載體(如病毒或質粒載體)，在該段DNA調控下，外源性治療基因(如TK等腫瘤自殺基因、抑癌基因、細胞凋亡基因、細胞因子、反義核苷酸等)只在表達CEA的腫瘤細胞才發生表達，可用于CEA分泌性腫瘤，特別是胃癌的基因治療。
本發明提供的pCEAp質粒，寄存在大腸桿菌JN109，含pCEAp質粒的菌株命名為大腸桿菌JM109/pCEAp(Eschertchia coli JN109/pCEApl。該菌種可在含50-100ug/ml氨芐青霉素的LB培養基中(1％ tryptone.0.5％ yeast extract,1％ NaCl)培養擴增。
下面實施例對本發明的人胃癌細胞癌胚抗原基因啟動子DAN克隆pCEAp的制備、鑒定和特點做了詳細地說明，但不意味著限制本發明的內容。在這些實例中，人胃癌細胞株購自中國科學院生物研究所細胞庫。質粒pGEN-3zf(+)購自華美公司。
圖1是質粒pCEAp的構建示意圖。
圖2是酶切電泳圖。
圖3是測序熒光圖普。
實施例1胃癌CEA基因啟動子DNA片段的擴增與制備。
利用Primer軟件在計算機中設計出一對合適的引物，為了便于克隆，在兩條引物5’端分別加入SacⅠ酶切位點，HindⅢ酶切位點。
引物Ⅰ:5′-AATTGAGCTCTCCATCCACCTTGCCGAA引物Ⅱ:5′-GCTCAAGCTTACTCCATGGTCTCTGCTG人胃癌細胞株GN803細胞經含10％小牛血清的1640培養基，在37℃,5％CO2培養箱內培養，按Stafford改良方法(Blin W and O.W.Stafford:Nacleic Acid Res 1996；3:2303)從連續培養生長良好的803細胞(約1.3×107)中分離制備DNA模板，經Hpal酶切，用以上設計合成的引物，采用熱啟動的PCR擴增法(Sally WE et al.Wature.1989:341:544.及O′Aquila K T et al Nucleic acid Res.1992:20；1717)，按以下條件進行30個循環；94.5℃ 1分鐘→60℃ 1分鐘→72℃ 2分鐘，末次循環72℃延伸5分鐘，即得到CEA基因啟動子DNA擴增片段。取少許作凝膠電泳，呈現317bp的一個單一條帶(圖2(3))。
實施例2胃癌CEA基因啟動子DNA克隆測序分析。
PCR擴增產物的測序啟動子DNA片段純化后作為模板，按Sanger測序法(Sanger F et al:Proc Natl Acad Sci 1977,74:5463)加入熒光素標記的ddWTP，在引物Ⅰ的引導下進行PCR擴增，取擴增產物加入自動測序儀中測序。在自動讀序儀中可檢測到A、T、C、G四種色彩不同的熒光素波型，整個圖型清晰，易于讀取，一次讀出除引物外的270個堿基，與國外已報導的從結腸癌細胞克隆出的CEA基因啟動子同段(CEA基因啟動子-156到+115的序列)序列(Schrewe H et al.Cloningof the complet gene conveying cell typesp specific expression.NolCell Biol,1990；10:2738.及Richards CA et al.Tranwscrip-tionl regulatory seqwences of carcinoeabryonic antigen:Iden-tification and use with cytosine deauinase for tunor-specificgene therapy Hum Gene Ther 1995；6:881)相比，在+93位國外序列為G，本序列為C，同源性為99.63％，其測序熒光圖譜見圖3，該啟動子DNA測序結果如下↓-156AAGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG GAAAAAAGAG-116GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA-76GGACACCTGA ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG-36CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC TCAGGGCAGA+5GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG+45ACAAAACGTT CCTGGAACTC AACCTCTTCT CCACAGAGGA+85GGACAGACCA GACAGCAGAG ACCATGGAGT+115↑+93(箭頭后的數字表示箭頭所指的堿基在癌胚抗原基因啟動子DNA中所處的序列編號，無箭頭的數字表示其左側堿基的序列編號。)實施例3,CEA基因啟動子DNA質粒克隆的構建。
以pGEN→3zf(+)為克隆載體，將載體用Sacl,HindⅢ雙酶切后，電泳回收酶切片斷。PCR擴增獲得的啟動子DNA片段(見實施例1)經同樣雙酶切后，用乙醇沉淀。按DNA片段∶載體=3∶1的比例，在T4連接酶作用下于14℃過夜連接，轉染JN109宿主菌并鋪于含氨芐青霉素和X-Gal LB瓊脂糖平板培養過夜，次日挑取白色菌落。用含氨芐青霉素的LB培養基(1％ tryptone,0.5％ yeast extract,1％NaCl),37℃培養擴增，抽提質粒，用SacⅠ,HindⅢ酶雙切，切出一近300bp(含部分引物)片段(圖2(2))，而對照空載體雙酶切后未見此300bp片段(圖2(4)！。證實克隆成功(圖1)。與現有技術相比較本發明有以下優點和特點1、該克隆具有CEA基因啟動子活性必須序列區(-90到+60)，和國外從結腸癌細胞分離的CEA基因啟動子(Schrene H et al,Wol CellBiol,1990；10:2738；Richards Ca et al. Hum Gene Ther 1995；6；881-93)相比，在+93位國外序列為G，本序列為C。
2、自行設計的PCR引物具有CEA啟動子DNA高度保守和特異的序列，又分別含有SacⅠ,HindⅢ酶切位點序列，便干CEA啟動子DNA的擴增、測序與克隆；并且無非特異條帶的擴增。
3、該DNA克隆作為一種大腸桿菌質粒，可在大腸桿菌大量擴增、經簡單純化，使用特意設計并連接在該基因克隆DNA兩端的不同酶切位點酶切，即可將其切下，并可定向插入新的基因治療用載體，在該DNA調控下，外源基因只在表達CEA的腫瘤細胞才發生表達。從而達到特異性殺傷CEA分泌性腫瘤的效果。
權利要求
1．一種含人胃癌癌胚抗原基因啟動子DNA的克隆載體，其特征在于由下列DNA元件組成(1)、癌胚抗原(CEA)分泌性腫瘤細胞表達的特異啟動子--癌胚抗原基因上游調控序列；(2)、大腸桿菌質粒骨架(包括大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性β內酰氨酶基因)。
2．如權利要求1所述的DNA的克隆方法，其特征在于創建了一對適當的PCR引物，引物Ⅰ:5′-AATTGAGCTCTCCATCCACCTTGCCGAA,引物Ⅱ:5′-GCTCAAGCTTACTCCATGGTCTCTGCTG)，該對引物不僅具有癌胚抗原啟動子DNA高度保守而特異的序列，而且分別含有Sacl,HindⅢ酶切位點序列。
3．如權利要求2方法克隆的基因啟動子DNA的序列，其特征是具有癌胚抗原基因啟動子活性必須序列區(-90到+60)，但與現有技術從結腸癌細胞分離的CEA基因啟動子相比，在+93位不是G，而是C:↓-156AAGATTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG GAAAAAAGAG -116GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA -76GGACACCTGA ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG -36CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC TCAGGGCAGA +5GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG +45ACAAAACGTT CCTGGAACTC AAGCTCTTCT CCACAGAGGA +85GGACAGACCA GACAGCAGAG ACCATGGAGT +115↑+93(箭頭后的數字表示箭頭所指的堿基在癌胚抗原基因啟動子DNA中所處的序列編號，無箭頭的數字表示其左側堿基的序列編號。)
4．根據權利要求2方法克隆的具有權利要求3序列的基因啟動子的用途，其特征在于作為一種大腸桿菌質粒，可在大腸桿菌大量擴增，經簡單純化，使用特別設計并已連接于在該基因克隆DNA兩端的不同酶切位點酶切，即可將其切下，并可定向插入新的基因治療用載體(如病毒或質粒載體等)，在該段DNA調控下，外源性治療基因(如TK等腫瘤自殺基因，抑癌基因、細胞凋亡基因、細胞因子、反義核苷酸等1只在表達CEA的腫瘤細胞才發生表達，從而可用于CEA分泌性腫瘤，如胃癌、大腸癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的基因治療、與預防復發等目的。
全文摘要
本發明涉及人癌胚抗原(CEA)基因啟動子DNA的克隆方法、序列及其用途,其特點是:該DNA序列與結腸癌CEA基因啟動子不同,在+93位是C而不是G堿基。在CEA分泌性腫瘤基因治療中,將該基因片段與治療基因重組,可望取得選擇性殺傷腫瘤細胞,而對正常細胞不受影響的效果。
文檔編號C12N15/12GK1216321SQ97114280
公開日1999年5月12日 申請日期1997年10月31日 優先權日1997年10月31日
發明者王曉懷, 謝波, 江悅華 申請人:廣州軍區廣州總醫院醫務部科訓科