專利名稱：殺菌肽－x基因構建、生產工藝及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程生產多肽藥物技術領域。
殺菌肽是瑞典科學家Boman于1980年首先從惜古比天蠶中發現的，后來科學家們又從其他蠶類和蠅類發現多種殺菌肽。在80年代人們都是從昆蟲中分離純化殺菌肽，并進行了結構分析及生物學活性的研究。結果表明殺菌肽是一類堿性小肽，等電點9-10，由33-39個氨基酸殘基組成，C-末端酰胺化、水溶性好、對熱穩定、分子量僅4Ku左右，因此無抗原性；生物學活性表明殺菌肽可殺菌、殺腫瘤細胞，還有抗病毒作用，其作用機制是殺菌肽分子直接插入細胞膜，造成孔洞而使上述細胞崩解而死亡。因此對抗生素耐藥菌株仍有殺傷作用，若殺菌肽應用于臨床，對于那些由耐藥菌感染的疾病病人無疑是個福音。近年來感染性疾病又重新肆虐全球，發病率逐年上升，這一方面是由于新的病毒或致病菌的出現，另一個重要方面是很多致病菌對現有抗生素產生抗性而耐藥。據統計，每年全世界各種傳染病死亡人數高達1700萬，占總死亡人數1／3，人們渴望著新的殺菌藥問世!另外值得重視的是殺菌肽的抗腫瘤活性，研究者發現殺菌肽對腫瘤細胞有很強的殺傷作用，但對正常真核細胞卻無影響，推測可能由于正常細胞含有膽固醇及豐富骨架結構有關。
據世界衛生組織統計，全世界惡性腫瘤患者1400萬，每年死亡500萬。我國每年約100萬新增的惡性腫瘤患者，死亡120萬。鑒于殺菌肽對于這兩類嚴重威脅人類生命的疾病均有潛在的治療價值，研究者們夢寐以求能獲得大量高純度的殺菌肽來進行臨床試驗，但這一問題始終未能解決。昆蟲體液中雖然可提取殺菌肽，但提取步驟繁雜，在含量極低的昆蟲中很難獲得大量殺菌肽；隨著分子生物學技術的廣泛應用，不少實驗室試圖以基因工程手段來獲取大量殺菌肽，也未獲理想結果。由于殺菌肽本身具有殺菌作用，無法直接在大腸桿菌中表達殺菌肽，只能用酵母體系及昆蟲或昆蟲細胞體系進行基因表達，例如1991年Hellers將天蠶素B基因在天蠶蛹及昆蟲細胞中表達；1992年Reichhart將綠蠅防御素A基因在酵母中表達，每升中僅含1mg表達產物。在國內，1987年徐飛等將柞蠶殺菌肽D基因在酵母中表達；1994年葉玉坤等也用酵母表達了此基因，表達水平為1．14mg／升。到目前為止，未見其他研究單位有大腸桿菌中高效表達殺菌肽的報道。
從工業化生產的角度考慮，在基因工程表達體系中，大腸桿菌最為理想。因為它具有成本低、周期短、表達水平高、易于操作等優點，但這一體系缺乏對表達產物修飾功能，例如糖基化、酰胺化等功能。對于殺菌肽來說若采用大腸桿菌進行表達，要解決三個難題第一，如何避免表達產物殺宿主菌，我們采用了融合表達方式，即在殺菌肽前加進其他蛋白，使表達產物為融合蛋白，此種表達產物無殺菌活性。在設計目的基因時除了采用大腸桿菌偏愛的密碼子外，在目的基因上游融合了其他蛋白基因，同時引進了溴化氰或鈀配合物專一切割序列；第二，如何使大腸桿菌表達的殺菌肽C-端為酰胺。由于有活力的殺菌肽C-端為酰胺，而大腸桿菌又無酰胺化能力因此在構建殺菌肽-X基因時在C-端外加了一個門冬酰胺；第三，如何正確切割表達的融合蛋白，放出有活力的殺菌肽-X，首先我們采用的是溴化氰切割，獲得了預期結果，顯然這種傳統切割方法是應用了有毒的溴化氰，因此很難用于大量生產，而采用鈀配合物切割則完全避免了傳統方法的缺點，不僅它無毒不污染環境，還有切割效果好成本低等特點。由于我們集中了高效表達，有效切割的優勢，使殺菌肽-X的工業化生產成為可能。
本發明的目的在于創造一種抗惡性腫瘤，無抗原性的新型藥物，另外還可用于治療耐藥致病菌感染的疾病。
本發明方案包括1．基因構建2．在大腸桿菌中高效融合表達3．對表達產物的正確有效切割4．殺菌肽-X的分離純化殺菌肽-X基因的構建我們設計的殺菌肽-X基因是參照了屈賢銘、戴祝英、張雙全等從中國家蠶蛹中提取的殺菌肽CMIV的氨基酸序列，采用大腸桿菌偏愛的密碼子，并在C-端加進門冬酰胺密碼子而成為殺菌肽-X全部編碼序列，在編碼序列上下游分別引入內切酶識別位點(上游為EcoR I和Nde I，下游有Spe I和BamH I)，為了拼接的方便，將整個基因分為交錯相搭的6個寡聚核苷酸片段。將互補片段分別混合，加熱80℃再冷卻，使復性，再通過連接反應，成為完整的合成基因，將完整基因以EcoR I和BamH I位點克隆至pUC9中，轉化至大腸桿菌JM109，通過篩選挑出陽性菌落，從陽性菌落中挑取DNA，測定序列，證明與預期結果一致，具體序列如下5′AATTCG CAT ATG AGA TGG AAA ATC TTC AAG AAA ATC GAAGTT GGT CAG AAC ATT CGT GAC GGC ATT GTG AAA GCG GGT CCGCGT GTT GCA GTA GTA GGT CAA GCT GCT ACC ATC AAC TAG TG3′和改良型腫瘤壞死因子(TNF-b)基因的融合表達，操作步驟如下1．用PCR法去除TNF-b中的終止密碼子，再和上述殺菌肽-X基因連接，成為融合蛋白基因，以Nco I和BamH I插入表達載體pET-11d中，轉化至大腸桿菌BL-21(DE3)中，經IPTG誘導8小時，用SDS-PAGE電泳檢測，掃描，計算表達蛋白的含量約50％。收集菌體破碎，離心，收集融合蛋白，用溴化氰裂解，100mg融合蛋白加50mg溴化氰，在室溫下作用24小時，以20倍水稀釋以終止反應。
2．和TNF-b基因融合，并引入鈀配合物切割單元半胱氨酸-組氨酸-編碼序列，表達的融合蛋白，以鈀配合物切割。
這種融合蛋白的基因和步驟1中大體相同，但以PCR法加入鈀配合物切割單元的序列-TGC-CAC-表達體系與(1)相同，表達量為50％。
上述兩種表達的融合蛋白，經溴化氰或鈀配合物切割均可獲得有活性的殺菌肽-X，經CMII陽離子層析，可獲得純品SDS-PAGE電泳，銀染一條帶。
和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)基因融合表達，步驟如下1．用含GST的表達載體pGEX-KG和殺菌肽-X基因連接，轉化至BL-21(DE3)中，經IPTG誘導5小時，可測出融合表達的蛋白，經SDS-PAGE電泳后掃描，表達量為30％，經溴化氰裂解，可得到有活力的殺菌肽-X。
2．以PCR法引入鈀配合物切割序列(TGC-CAC)。
PCR引物15′-GGG GGA TCC TGC CAC AGA TGG AAA ATC TTCAAG AAA-3′
PCR引物25′-CCC CCA AGC TTC TAG TTG ATG GTA GCA GC-3′以克隆在pUC中的殺菌肽-X為模板，PCR產物含TGC-CAC。
將PCR產物以BamH I和HindIII雙酶切，并和pEX-KG連接，宿主菌的誘導條件同(1)，最后將表達產物用鈀配合物切割，切割后可測出殺菌活性。
上述兩種切割方式的產物均可用CMII層析純化至SDS-PAGE銀染一條帶。
結果表明，每立升發酵液至少可得殺菌肽-X 10mg，并證明具有很強的殺菌能力，這一成果在殺菌肽研究史上是一個重大突破，使工業化生產殺菌肽供臨床應用將成為現實，殺菌肽將可能成為“21世紀的抗生素”。
我們已將純的重組殺菌肽-X進行了體外抗腫瘤試驗，證明對三種腫瘤細胞(白血病細胞株K562、U937、HL-60)有明顯殺傷作用，經掃描電鏡觀察，用微克水平(5μmol／L)的殺菌肽-X處理腫瘤細胞48-60小時后，細胞嚴重崩解，使完整圓形的腫瘤細胞變為煤炭渣狀，而對正常細胞無影響，我們分離了正常人的白細胞加相同濃度的殺菌肽，經48-60小時培養，白細胞不但不死亡，并且有輕微刺激生長作用。
另外，我們進行了殺菌試驗，將幾株耐藥菌，例如痢疾桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌都有良好殺傷作用。
我們的實驗結果與國外以提取法制備的殺菌肽的結果一致。1988年美國路易斯安娜大學的Jaynes發現殺菌肽對癌細胞有破壞作用；1983年Hultmark用了三種天蠶殺菌肽(A、B、D)對十一種細菌都有很強的殺傷性。國人戴祝英等用家蠶殺菌肽可殺傷K562、U937等白血病細胞；郭玉梅等觀察到殺菌肽對宮頸癌實體瘤有抑制作用。
本發明優點是創造了一種適宜于工業化生產殺菌肽的工藝，根本解決了殺菌肽來源困難的矛盾。
采用大腸桿菌表達體系，既經濟又簡便，且表達水平高。尤其是我們將高效表達體系和新型的切割劑-鈀配合物結合起來，優化了條件，使成為成本低，無污染等特點的工藝。最后可獲得大量高純度有活力的重組殺菌肽-X，它成為治療惡性腫瘤新型藥物并治療由耐藥致病菌感染的傳染病。
下面是
具體實施例方式1．殺菌肽X基因的構建，具體步驟如下首先按照天然家蠶CMIV氨基酸序列，在C-端外加一個門冬酰胺，在編碼序列上下游分別引入內切酶識別位點(上游為EcoR I和Nde I，下游有Spe I和BamH I)，最大限度地采用大腸桿菌偏愛的密碼子，為了拼接的方便，將整個基因分為交錯相搭的6個寡聚核苷酸片段。將互補片段分別混合，加熱80℃再冷卻，使復性，再通過連接反應，成為完整的合成基因。
具體的6個寡聚核苷酸片段序列如下EcoR1 Nde11 35′AATTCGCATATGAGATGGAAAATCTTCAAGAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGAACATTCGTGACGG3′-GCGTATACTCTACCTTTTAGAAGTTCTTTTAGCTTTTTCAACCAGTCTTGTAAGCACTGCC2 5CATTGTGAAAGCGGGTCCG GCTGTTGCAGTAGTAGGTCAAGCTGCTACCATCAACAGTG-3′GTAACACTTTCGCCCAGGCCGACAACGT CATCATCCAGTTCGACGATGGTAGTGATCACCTAG-5′4 6 Spe1 BamH1將完整基因以EcoR I和BamH I位點克隆至pUC9中，轉化至大腸桿菌JM109，通過篩選挑出陽性菌落，從陽性菌落中挑取DNA，測定序列，證明與預期結果一致，具體序列如下5′-AATTCGCAT ATG AGA TGG AAA ATC TTC AAG AAA ATCGAA GTT GGT CAG AAC ATT CGT GAC GGC ATT GTG AAAGCG GGT CCG CGT GTT GCA GTA GTA GGT CAA GCT GCTACC ATC AAC TAG TG-3′由上述序列可見殺菌肽-X的編碼序列的第一密碼子為ATG，表達后為甲硫氨酸，此處為CNBr的切割位點。2．和TNF-b基因融合表達，以CNBr切割融合蛋白首先要以PCR法將TNF-b基因中的終止密碼子消除，并在5′-端和3′-端分別引入Nco I位點(以便和表達載體連接)和EcoR I位點(和殺菌肽-X基因連接)。
5′-端引物5′-GCTTCCATGGTTCGTAAACG-3′3′-端引物5′-GCGAATTCAGAGCGATAATACCG-3′經過30個循環后，收集擴增產物，再以Nco I和EcoR I雙酶切。
再將殺菌肽-X基因以EcoR I和BamH I切割，將這兩種基因連接并克隆至pET11-d中，構成重組的表達載體。
進一步將重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經篩選，獲陽性菌落，用含氨芐青霉素的LB培養液37℃培養，加0．4 mM IPTG誘導8小時，收集細胞。用SDS-PAGE電泳檢測，表達的融合蛋白占總菌體蛋白50％。
用超聲破菌，離心收集沉淀，100mg蛋白溶于8ml 70％甲酸中加50mg CNBr，在室溫下作用24小時，加20倍水稀釋以終止反應。由于兩種基因間含有ATG，因此在融合蛋白中出現甲硫氨酸，用CNBr切割后，位于甲硫氨酸后的肽鍵斷裂，放出完整的殺菌肽-X分子。3．和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)基因融合表達，以鈀配合物切割表達產物表達載體pGEX-KG中含有GST基因，可以和殺菌肽-X基因連接，并引入鈀配合物切割單元(半胱氨酸一組氨酸密碼子TGC-CAC)。
為了達到上述目的，以克隆在pUC9中的殺菌肽-X基因為模板，進行PCR，使此基因的N-端含有TGC-CAC。
引物15′-GGG GGA TCC TGC CAC AGA TGG AAA ATC TTC AAGAAA-3′引物25′-CCC CCA AGC TTC TAG TTG ATG GTA GCA GC-3′經過30輪擴增，PCR產物以BamH I和HindIII雙酶切，并和pGEX-KG連接，轉化至BL21(DE3)中，陽性菌在LB中培養，經0．1mM IPTG誘導5小時，可見融合蛋白表達，經SDS-PAGE電泳檢測，融合蛋白占菌體總蛋白30％。
收集培養后菌體，超聲破碎，保留上清液，測定蛋白濃度，加入約2倍摩爾濃度的鈀配合物，用HAc調節pH2左右，經過約24小時反應，即可放出殺菌肽-X分子。
鈀配合物的結構為Cis[Pd(en)(H2O)2]2+，在反應體系中的鈀配合物可通過與DTTC反應產生沉淀被除去。4．用離子交換層析純化用CMII纖維素裝柱，上樣液為pH5．1 0．05 M NH4Ac緩沖液，將上述切割后的蛋白液上柱，用上柱液洗滌。
用以pH5．1 0．05 M-1 M NH4Ac梯度洗脫，出現兩個峰，收集第二個峰，即為殺菌肽-X。經SDS-PAGE電泳銀染一條帶。
權利要求
1．一種稱之為殺菌肽-X的基因，其特征是根據提取的中國家蠶殺菌肽CMIV的氨基酸序列(35肽)，在C末端加一個門冬酰胺(或谷氨酰胺)，成為36肽，其編碼序列采用大腸桿菌偏愛密碼子，用化學方法合成了全基因。
2．根據權利要求1所述的基因其特征是和改良型腫瘤壞死因子(TNF-b)或谷胱甘肽硫轉移酶基因融合，分別插入pET-11d和GST-KG表達載體，轉化至大腸桿菌中，可獲得表達融合蛋白的菌稱為工程菌。3．根據權利要求2所述的工程菌，其特征是工程菌用超聲破碎，經溴化氰或用鈀配合物裂解融合蛋白可放出有活力的殺菌肽-X，以離子交換層析，可獲得重組殺菌肽-X純品，SDS-PAGE電泳銀染一條帶。4．根據權利要求1所述的殺菌肽-X，其特征是重組殺菌肽-X，用于惡性腫瘤(包括白血病)及抗感染，特別對那些耐藥致病菌感染的疾病更有價值。
全文摘要
本發明屬于基因工程生產多肽藥物領域,其目的在于創造一種新藥,可抗腫瘤及治療耐藥菌感染疾病。本發明參照了殺菌肽CMⅣ的氨基酸序列,化學合成其基因。將合成的基因在大腸桿菌中實現兩種體系融合表達,表達水平分別為50%和30%。裂解融合蛋白,經層析,最后可獲得SDS－PAGE銀染一條帶的純品。用重組殺菌肽－X純品對白血病細胞株和白血病病人白細胞都有良好的殺傷作用;另外,對幾種耐藥細菌都有明顯殺傷性。
文檔編號C12P21/02GK1205361SQ9710698
公開日1999年1月20日 申請日期1997年6月3日 優先權日1997年6月3日
發明者徐賢秀, 朱龍根, 朱德煦, 董雪吟, 邱奇峰, 謝維 申請人:南京大學