專利名稱：人腫瘤壞死因子α衍生物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及人腫瘤壞死因子α(TNFα)衍生物的構建及其生物工程制備方法。
TNFα主要由激活的巨噬細胞產生的一種細胞因子，它能直接殺傷某些體外培養的腫瘤細胞和病毒感染細胞，使體內一些腫瘤發生出血性壞死。自1984年用生物工程技術獲得重組人腫瘤壞死因子α(rhTNFα)以后。在腫瘤病人系統給予rhTNFα臨床試驗中發現，在有療效的劑量范圍內會出現毒副反應。為克服rhTNFα的毒副作用，人們在局部給藥、復合用藥和對hTNFα結構改造提高活性降低毒副作用兩方面作了不懈的努力。1996年3月在TNF和相關細胞因子臨床應用和生物學功能國際會議上，瑞典、荷蘭和美國的幾個研究組報道rhTNFα+IFNγ+melphalan通過局部灌注治療300多例四肢惡性黑色素瘤、軟組織肉瘤患者治愈率達80％以上，rhTNFα用量高達3-4毫克/肢體也未出現毒性死亡，為rhTNFα臨床使用另辟蹊徑。自八十年代以來，構建高效低毒rhTNFα衍生物的努力一直沒有停止過。最近有報道TNFα和淋巴毒素(LTα或TNFβ)能誘導正常細胞和動物產生錳過氧化物歧化酶，保護它們免受輻射或腫瘤化療藥物的損傷；誘導蛋白酶產生殺傷腫瘤細胞。因此，抑瘤譜范圍廣，細胞毒活性高的人腫瘤壞死因子衍生物是一種前景看好的腫瘤治療藥物。hTNFαDa是近年來構建的新型腫瘤壞死因子衍生物，它的中國專利申請號為94112172.0。hTNFαDa的細胞毒活性比rhTNFα提高一個數量級，而毒副作用降低一個數量級以上，是一個很有應用前景的衍生物。但對hTNFαDa的理化性質分析及穩定性試驗過程中，發現它的熱穩定性比原型差。hTNFαDa的不足和衍生物a的C端由原來的Leu改為Phe有關，因為有報道認為第157位的Leu與第14位的Ala之間有氫鍵存在。
本發明的目的是構建一個提高細胞毒活性、擴大抑瘤譜范圍、穩定性好的人腫瘤壞死因子α。
本發明在構建hTNFα Db時我們維持C端部分不變。TNFα和LTα是在結構和功能上非常相似的兩個細胞因子，它們結合同樣的受體行使其細胞毒活性，但比較LTα和TNFα單體的立體結構圖，可發現TNFα頂端突出的環(#101-#113)比LTα近似位置的環(#84-#89)整整多出7個氨基酸。當LTα缺失這六個氨基酸時可大大提高細胞毒活性。TNFα#102-#107平均親水性是TNFα分子中親水性最高的三個部位之一。在TNFα#102-#107中引入缺失對TNFα的細胞毒活性有提高。1994年比利時的R.Lucas等實驗證明TNFα#101-#113結構類似lectin，對某些多糖分子有親和性，與裂解寄生蟲(Salivarian錐蟲)有關。這段多肽與腫瘤細胞殺傷與毒副作用有何關系有待進一步研究。本發明據此構建了hTNFαDb。人腫瘤壞死因子α衍生物有多種，本發明的衍生物命名為b，即hTNFαDb。它的N端來自hTNFα61，即hTNFα原型中缺失#1-#7共7個氨基酸，C端來自CG-hTNFα，即hTNFα原型中缺失#102-#107共6個氨基酸，hTNFαDb由145個氨基酸組成，包括第一個甲硫氨酸，比hTNFα原型少13個氨基酸。
hTNFαDb的克隆過程如下1)CG-hTNFα的構建從人基因組文庫中分離出hTNFα基因，切出第4外顯子，接上人工合成寡聚核苷酸片斷，組裝成hTNFαcDNA，作為PCR擴增CG-hTNFαcDNA的模板。PCR引物設計為第一對引物N端 5’GGCCATATGGTTGGTTCTTCTTCTCGTA 3’(primer1)(28mer)NdeIC端 5’GCAGGGGCTCTTGATGGC 3’(primer2)(18mer)第二對引物N端 5’GGGGCTGAGGCCAAGCCC 3’(primer3)(18mer)C端 5’CGGAATTCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG 3’(30mer) EcoRI (primer4)由此得到的兩個PCR產物分別為A、B。片段A用NdeI完全酶切，片段B用EcoRI完全酶切，然后將A與B等摩爾濃度平末端連接。再以連接液中的DNA為模板，用primer1及primer4進行PCR擴增，得到目的片段CG-hTNFα，將此片段用NdeI和EcoRI完全酶切后，與載體pRSETc連接。CG-hTNFα與hTNFα原型比較，缺失了#102-#107的氨基酸。
2)hTNFα61的構建以hTNFαcDNA為模板，設計相應的PCR引物，得到的PCR擴增產物即為hTNFα61cDNA。PCR引物設計為N端引物5’GCCATATGCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA 3’(31mer)NdeIC端引物5’CCGGAATTCTCAGAAGGCAATGATCCCAAAGTA 3’(33mer) EcoRI將PCR擴增產物用NdeI和EcoRI完全酶切后，與載體pRSETc連接。
3)hTNFαDb的克隆用HincII和EcoRI從pCG-hTNFα表達質粒中分離出帶缺失#102-#107的CG-hTNFα的C端部分，取代pRSETc-hTNFα61的相應部位，建成pRSET-hTNFαDb的表達質粒。與hTNFα相比，其特點是N端缺失#1-#7位氨基酸，中間缺失#102-#107位氨基酸。經測序證實hTNFαDb的核苷酸序列符合設計要求后，轉化大腸桿菌受體菌。
接種單菌落于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養液，37℃振蕩培養過夜，過夜培養物以1∶100擴大培養2.0-4.0小時，加IPTG至終濃度0.001-1.0mM，繼續培養3-6小時，離心收集菌體。
沉淀懸浮于十倍體積的超聲破碎液(0.2M NaCl，0.1M Tris，0.05MEDTA pH8.0)。超聲破碎后離心，上清液加固體硫酸銨至40-60％飽和度，離心收集沉淀。沉淀溶于buffer A(10mM Tris，pH8.0)中，樣品上至預處理好的Sephadex G-25層析柱，buffer A洗脫，收集蛋白峰。經過Sephadex脫鹽的樣品，再上樣至DEAE-Cellulose DE-52離子交換層析柱，用鹽濃度梯度0.05-1.0M(如KCl、NaCl等)的10mMTris.Cl，pH8.0的溶液洗脫，收集含鹽的洗脫液，得到純度達95％以上的目的蛋白。hTNFαDbN端15個氨基酸經序列測定為Met Pro Ser Asp Lys ProVal Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln，完全符合原設計的結構。
hTNFαDb的細胞毒活性用L929細胞檢測。在工程菌里的表達量通過SDS-PAGE，Hoefer公司的GS-300掃描密度儀分析，占細菌總蛋白的60-80％，其中可溶性hTNFαDb約為40％。
hTNFαb工程菌發酵后菌體經SDS-PAGE硝酸銀染色及Western印跡分析表明，hTNFαDb單體的分子量約為16kD，比16.9kD的衍生物a小，等電點為pH6.5，柱層析純化后的hTNFαDb經HPLC-C4柱分析為一個峰，純度大于95％，比活為2×108IU/mg蛋白。較hTNFα原型的比活提高一個數量級。穩定性試驗結果表明，在37℃及56℃時，hTNFαDb的熱穩定性明顯高于hTNFαDa。體外抑瘤試驗顯示hTNFαDb和hTNFαDa對人胃癌細胞株MKN-28、MKN-45等細胞的生長有明顯的抑制作用，此外，hTNFαDb對人小細胞型肺癌細胞株(SPC-A)、肺癌細胞株(A549)、人結腸癌細胞株(BGC)、人黑色素瘤(A375)等細胞的生長有抑制作用，與hTNFαDa相比，擴大了抑瘤譜。而且其穩定性，尤其是熱穩定性也得到了明顯的提高。與原型比較，hTNFα的細胞毒活性提高了一個數量級。
圖1是hTNFαDb重組載體的構建示意圖。
實施例根據本發明前述構建獲得hTNFαDb，并對其分離純化。hTNFαDb工程菌37℃過夜培養物以1∶100擴大培養2.5-3小時，加IPTG至終濃度0.4mM，繼續培養4小時，離心收集菌體。沉淀懸浮于十倍體積的超聲破碎液(0.2MNaCl，0.1MTris.Cl，0.05MEDTA，pH8.0)。超聲破碎后離心，上清液加固體硫酸銨至40-60％飽和度，離心收集沉淀。沉淀溶于buffer A(10mM Tris，pH8.0)中，柱層析分離。
洗脫得到的樣品經15％SDS-PAGE電泳，呈現一條帶，分子量約16kD，HPLC C4柱分析為一個峰，純度96％。用小鼠L929細胞株細胞檢測hTNFα的細胞毒活性，純化樣品比活為1.8×108U/毫克蛋白。
權利要求
1.一種人腫瘤壞死因子α衍生物Db的抗腫瘤藥，其特征在于hTNFαDb是由兩個衍生物拼接而成，它的N端來自hTNFα61，即hTNFα原型中缺失7個氨基酸(#1-#7)；C端來自CG-TNFα，是hTNFα原型中缺失6個氨基酸(#102-#107)，hTNFαDb由145個氨基酸組成，包括第一個甲硫氨酸，比hTNFα原型少13個氨基酸。
2.一種人腫瘤壞死因子α衍生物Db的制備方法，包括CG-hTNFα的構建，hTNFα61的構建和hTNFαDb的克隆，其特征在于1)CG-hTNFα的構建從人基因組文庫中分離出hTNFα基因，切出第4外顯子，接上人工合成寡聚核苷酸片斷，組裝成hTNFαcDNA，作為PCR擴增CG-hTNFαcDNA的模板；PCR引物設計為第一對引物N端 5’GGCCATATGGTTGGTTCTTCTTCTCGTA 3’(primerl)(28mer) NdeIC端 5’GCAGGGGCTCTTGATGGC 3’(primer2)(18mer)第二對引物N端 5’GGGGCTGAGGCCAAGCCC 3’(primer3)(18mer)C端 5’CGGAATTCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG 3’(30mer) EcoRI(primer4)2)hTNFα61的構建以hTNFαcDNA為模板，設計相應的PCR引物，得到的PCR擴增產物即為hTNFα61cDNA；PCR引物設計為N端引物5’GCCATATGCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA 3’(31mer)NdeIC端引物5’CCGGAATTCTCAGAAGGCAATGATCCCAAAGTA 3’(33mer) EcoRI將PCR擴增產物用NdeI和EcoRI完全酶切后，與載體pRSETc連接；3)hTNFαDb的克隆用HincII和EcoRI從pCG-hTNFα表達質粒中分離出帶缺失#102-#107的CG-hTNFα的C端部分，取代pRSETc-hTNFα61的相應部位，建成pRSET-hTNFαDb的表達質粒；4)hTNFαDb的發酵、分離純化。
3.根據權利要求2所述的人腫瘤壞死因子α衍生物Db的制備方法，其特征在于工程菌的發酵分離純化的更好條件是1)工程菌單菌落活化后接種LB培養液，30-38℃振蕩培養8-12小時，繼續擴大培養2.0-4.0小時，加IPTG至終濃度0.001-1.0mM，繼續培養3-6小時，離心收集菌體；2)菌體沉淀超聲破碎后離心，上清液加固體硫酸銨40-60％飽和度，離心收集沉淀，沉淀經柱層析脫鹽，再經離子交換層析柱分離，分離時用含鹽濃度梯度0.05-1.0M的緩沖液洗脫，收集含鹽的洗脫液。
全文摘要
本發明涉及人腫瘤壞死因子α(TNFα)衍生物的構建及其生物工程制備方法。通過改變人腫瘤壞死因子一級結構得到了hTNFαDa。它的比活性比hTNFα原型提高十倍,毒副作用降低了一個數量級,在這研究的基礎上,本發明構建了hTNFαDb,其特征是:N端缺失7個氨基酸,中間缺失第102位至107位6個氨基酸。與原型比較,hTNFαDb的細胞毒活性提高了一個數量級。與衍生物a比較,hTNFαDb除保持相同的細胞毒活性外,擴大了抑瘤譜的范圍,并且重組蛋白的熱穩定性明顯提高。
文檔編號C12N15/19GK1184114SQ9710664
公開日1998年6月10日 申請日期1997年10月7日 優先權日1997年10月7日
發明者李昌本, 趙壽元, 邵軼虹 申請人:復旦大學