專利名稱：：抗病型增效菌及其培養方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物及其培養方法，具體涉及一種抗病型增效菌及其培養方法。防治水稻紋枯病的生物抗菌素——井崗霉素延用至今，在我國已有二十多年，由于藥劑的單一性使藥效有所下降，甚至加大用量效果仍不理想。如何提高井崗霉素對水稻紋枯病的防治效果已成為科研的熱點，開發新型制劑，使之達到比井崗霉素更好的防治和增產效果，已成為本領域中技術人員的攻關方向。目前市場上出售的增產菌，是根據微生態學理論選育出的一種對作物生長有增產作用的微生物菌，增產菌對作物有明顯的增產作用，但在防治水稻紋枯病的試驗中，增產菌并未顯示出防治效果。本發明的目的在于提供一種抗病型增效菌SD23及其培養方法。作為本發明的抗病型增產菌SD23，根據動植物細菌命名法為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，該菌株已于1997年6月25日送交北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo.0310。本發明的上述目的是通過以下方式實現的一種抗病型增效菌SD23的培養方法，包括從起始菌株DM423經分離、提純、復壯、篩選、抗藥性培養、抗病性培養、適應性培養、穩定培養、誘變育種和優選步驟。本發明的抗病型增效菌SD23為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，已經在北京，中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNO.0310。本發明的優點是明顯的a.菌種安全性高由于該產品的應用對象是農作物，對菌種的安全性理應有較高的要求，為確保本發明產品的高安全性，本發明選用了作為治療嬰幼兒腹瀉的DM423菌株(芽孢桿菌)該菌株已通過動物安全試驗、毒性試驗、臨床應用等，安全可靠性高。b.對稻麥有增產作用以DM423菌株作為出發菌株。通過對單子葉作物的親和性選擇試驗和應用試驗，優選出對水稻、麥子等單子葉作物增產作用明顯的菌株作為本發明的生產用菌株。c.兼有抗生素和抗病菌的雙重效果本發明的菌株與生物抗生素井崗霉素配成復合制劑，既提高了防治效果。又增加了產量，使井崗霉素這個老產品煥發青春，為我國水稻生產發展、開發綠色食品和無公害農業以及替代化學農藥或少用化學農藥開辟了具有重要意義的途徑。本發明抗病型增產菌的培養方法，其優選的培養方案如下一、(參見附圖)二、適應性菌株的培養1.選配了不同程度的耐藥性培養基，以井崗霉素濃度不同分別為1號井崗霉素含量為10000ppm2號井崗霉素含量為20000pm3號井崗霉素含量為30000ppm4號井崗霉素含量為40000ppm5號井崗霉素含量為5000ppm2.找出菌株在井崗霉素不同濃度中的生長關系以相同含量的菌株稀釋液同劑量置于以上培養基中培養觀察分析生長情況，生長情況定量考查如下表注平板培養菌落數為每次三只平板，三次重復后的單只平板菌落數。3.采用階梯濃度法篩選適應性菌種應用微機分析技術將增產菌置于不同濃度的井崗霉素中，定向培養經過多世代強制性適應，采用理化誘變方法，終于獲得適應性較強的抗病型增效菌變異菌種。經過階梯培養法篩選出的適應性菌株，在生產中顯示了良好的效果。菌種在不同井崗霉素濃度培養基中的試驗結果如下表<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="492">培養基類號平板培養菌落數12622332141358</table></tables>以下將結合最佳具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1.出發菌株原始菌株DM423(B.Cereus)培養基斜面、平板培養基牛肉膏0.5％蛋白胨1％氯化鈉0.5％瓊脂1.5-2.0％pH7.0-7.50.105Mpa高壓滅菌30分鐘搖瓶培養基豆粉4％玉米粉2％魚粉0.4％蛋白胨0.2％酵母粉0.4％磷酸二氫鉀0.02％硫酸鎂0.02％碳酸鈣0.05％pH7.2-7.5發酵溫度32℃搖床振蕩式2.菌種選育流程(參見附圖2)3.選育方法(1)自然分離a.菌種單孢子懸浮液制備將天冬門葡萄糖斜面于28℃培養6-7天的菌種，用0.85％生理鹽水，洗下孢子加玻璃珠，振蕩數分鐘，使孢子團打成單孢子，經過滅菌漏斗(內有棉花或紗布)過濾去除菌絲即成為單孢子懸浮液。b.將上述懸浮液用生理鹽水稀釋成不同倍數，一般為102-108倍即可，以每一種稀釋度取數滴于含有培養基(天冬素葡萄糖瓊脂)的培養皿中，用無菌推棒涂抹置溫箱中28℃或37℃培養、一般28℃約6天，37℃約3天左右即可挑選菌種再經以下(2)、(3)、(4)、(5)和/或(7)物理化學誘變后進行篩選。(2)紫外線處理步驟取上述5ml單孢子懸浮液于直徑9cm的培養皿中在10-50瓦紫外燈下距離5-50cm避光照射0.5-5分鐘稀釋涂皿。(3)紫外線氯化鋰復合處理步驟經紫外線處理后的孢子懸浮液稀釋在0.1-1％(重量)氯化鋰的天冬素-葡萄糖培養基中25°-35℃培養5-10天。(4)快中子處理步驟將上述制備好的單孢子懸浮液，放在靜電加速器產生快中子的減速劑鈹旁，處理劑量為20krad-6krad的處理0.1-2分鐘，稀釋涂皿。(5)X光處理步驟將上述制備好的單孢子懸浮液置于X光照射機旁以2千、5千、1萬-5萬倫琴處理0.5-50秒鐘后稀釋涂皿。(6)Co60處理每支試管取上述單孢子懸浮液2ml分別放于γ射線中照射，分別用0.5-10萬倫琴處理0.5-2秒鐘，照射后稀釋涂皿。(7)高濃度井崗霉素培養基培養后自然分離步驟將上述篩選出的菌株制成孢子懸浮液在天冬素-葡萄糖培養基中加入井崗霉素，使井崗霉素濃度分別達2000-100000ppm(每隔1000ppm計50個處理)，在上述培養基中，于20-45℃溫箱中培養3-10天后挑選出SD23菌株測定活性和耐藥性。經過上述培養方法得到的SD23菌株具有如下特性應用效果將井崗霉素5.0×104μg/ml和本發明的抗病型增效菌SD2320×104μg/ml以下述比例混配，每畝施用200ml，試驗對水稻紋枯病的防治效果比例對水稻紋枯病的防治效果(％)崗霉素SD231∶192.291∶284.541∶382.541∶479.222∶181.462∶387.323∶178.543∶286.583∶490.144∶175.674∶389.585∶173.45從應用效果可以看出，井崗霉素中加入本發明的SD23菌后，使用正常劑量防治效果對水稻紋枯病的防效增加了11.1-20％，另外，經大田試驗結果證明，增產效果提高了6-10個百分點。上述實施例僅為了說明的目的，本發明的保護范圍將在權利要求書中體現。權利要求1.一種抗病型增產菌，其特征是一種SD23菌株為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，其保藏號為CGMCCNo.0310。2.一種抗病型增產菌的培養方法，其特征在于包括從起始菌株DM423(B.Cereus)出發，經分離、提純、復壯、篩選以及紫外線處理、紫外線氯化鋰復合處理、快中子處理、X射線處理、和/或Co60處理，最后經高濃度井崗霉素培養后自然分離得到，所述的紫外線處理條件為在10-50瓦紫外燈下，于距離5-50cm避光照射0.5-5分鐘；所述的紫外線氯化鋰復合處理條件為在0.1-1％(重量)氯化鋰的天冬素-葡萄糖培養基中于25°-35℃培養5-10天；所述的快中子處理條件是在靜電加速器產生快中子的減速劑鈹旁，處理劑量為20krad-6krad；所述的X光處理條件為在2000、5000、10000-50000倫琴劑量下處理后稀釋涂皿；所述的鈷60處理條件為0.5-10萬倫琴的γ射線下處理后稀釋涂皿以及高濃度井崗霉素培養條件為分別在2000-100000ppm的井崗霉素中，在20-45℃培養3-10天分離得到。全文摘要本發明揭示一種抗病型增產菌及其培養方法,其特征在于SD文檔編號C12N13/00GK1177635SQ9710654公開日1998年4月1日申請日期1997年8月1日優先權日1997年8月1日發明者馮鎮泰申請人:上海農樂生物制品廠