專利名稱：類固醇的微生物11α－羥基化方法
技術領域：
本發明涉及類固醇11α-羥基化的微生物方法。
在活體內和活體外，類固醇的微生物11α-羥基化方法都是公知方法。例如，Shibahara等已在Biochim.Biophys.Acta，202(1970)，172-179中報道了由赭曲霉(Aspergillus ochraceus)的無細胞制劑進行孕甾酮的11α-羥基化。還已經知道，類固醇的微生物11α-羥基化反應是不可預測的，而且總是導致不完全轉化。通常達到80-85％的轉化度。不過，對工業應用而言，獲得可預測的高轉化率是重要的，這最好是得到高于95％的11α-羥基化類固醇產率。Deshayes等在Bull.Soc.Chim.Fr.，(1980)，II24-34中討論了優化這類發酵過程中的數學模型。例如，在坎利酮(canrenone)的11α-羥基化反應中，Deshayes公開了在最佳條件下，當在一種培養基(特別是在麥芽提取物和胰蛋白酶(trypticase)的基質中含10g/l的葡萄糖)中使用赭曲霉時，可獲得優于95％的產率。在這些條件下可轉化高達1.5g/l的坎利酮，這被視為本領域中的一個進步，例如Blunt等在J.Chem.Soc.，6(1971)，1136中所公開的，這些作者采用最高0.5g/l的底物不能獲得高于90％的11α-羥基化坎利酮產率。
既然可以推理，雜質會對微生物過程產生有害影響，因此可預料，通過提高起始原料的純度可獲得進一步的優化。然而，現已令人驚奇地發現，通過使用更低純度的底物，特別是使用純度低于97％的底物可得到進一步的改進。因此，本發明涉及一種使用氧和微生物在活體外將類固醇轉化為其相應的11α-羥基類似物的微生物方法，所述微生物選自赭曲霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)、Rhizopus nigricans、少根根霉(Rhizopus arrhizus)以及盤多毛孢屬(Pestelotia)菌株，本方法的特征在于使用純度低于97％的類固醇。
所述微生物優選是赭曲霉。類固醇的純度優選高于90％。更優選的是，類固醇純度為90-95％。采用不純底物的本方法提供不同底物濃度下的微生物轉化率，這些底物濃度顯著地高于Blunt或Deshayes所公開的最大濃度。
可以對具有未取代的11-位的類固醇使用本微生物方法。優選的例子是雌-4-烯-3，17-二酮(estr-4-ene-3，17-dione)和坎利酮。
下表闡述了雜質對轉化度的出乎意料的效果。
表I
*各種天然雜質添加到純底物中表II
通過下列實施例進一步闡述本發明。實施例實施例1含有帶葡萄糖的礦質生長培養基的搖瓶用赭曲霉孢子接種并于28℃下在往復式振蕩器上放置15小時。然后用250ml萌發孢子懸液接種含5l培養基的攪拌式發酵器。采用的培養基含有葡萄糖/酵母提取物培養基(葡萄糖40g/l，酵母提取物10g/l，pH 5.0)。培養條件如下攪拌器速度750rpm，氣流0.2l/l/m，溫度28℃。用防沫電極測定起泡情況，通過自動添加硅基防泡劑進行控制。當培養物的生物量濃度至少為2g/l時，添加少量雌-4-烯-3，17-二酮(1g/l)以誘導羥基化酶的合成。3小時后，添加更高濃度的類固醇以達到如表1給出的所需濃度。當重復性地觀察不到轉化率提高時，停止類固醇轉化。實施例2在搖瓶中制備如實施例1中所述的同樣的培養物。當培養物的生物量濃度至少為4g/l時，立刻添加坎利酮以達到如表II給出的所需濃度。當重復性地觀察不到轉化率提高時，停止類固醇轉化。
權利要求
1.使用氧和微生物在活體外將類固醇轉化為其相應的11α-羥基類似物的微生物方法，所述微生物選自赭曲霉、黑曲霉、葡枝根霉，Rhizopus nigricans、少根根霉以及盤多毛孢屬菌株，該方法的特征在于使用純度低于97％的類固醇。
2.根據權利要求1的方法，其中的微生物是赭曲霉。
3.根據權利要求1或2的方法，其中類固醇純度為90-95％。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中使用高于0.5g/l的類固醇濃度。
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中的類固醇選自雌-4-烯-3，17-二酮和坎利酮。
全文摘要
本發明涉及使用氧和微生物在活體外將類固醇轉化為其相應的11α－羥基類似物的微生物方法,所述微生物選自赭曲霉、黑曲霉、葡枝根霉,Rhizopus nigricans、少根根霉以及盤多毛孢屬菌株,該方法的特征在于使用純度低于97%的類固醇。
文檔編號C12R1/685GK1207136SQ96199469
公開日1999年2月3日 申請日期1996年12月10日 優先權日1995年12月12日
發明者M·威爾斯馬, P·范德美登 申請人:阿克佐諾貝爾公司