具有增加的琥珀酸產量的突變大腸桿菌菌株的制作方法

專利名稱：具有增加的琥珀酸產量的突變大腸桿菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明的合同來源根據美國能源部與代表Argonne國家實驗室的芝加哥大學之間的合同號W-31-109-ENG-38，美國政府具有本發明的權利。
本發明的背景1、本發明的領域本發明涉及生產琥珀酸，蘋果酸或延胡索酸的方法，更具體地說，本發明涉及大量產生琥珀酸，蘋果酸和延胡索酸的細菌。
2、本發明的背景羧酸可作為許多化學藥品的潛在前體。例如，琥珀酸可用作諸如1，4-丁二醇(BDO)，四氫呋喃和γ-丁酰內酯的塑料前體的原料。來自琥珀酸的新產物不斷開發出來，其中最引人注目的是由琥珀酸與BDO交聯形成的聚酯。一般來說，琥珀酸酯具有作為新的“綠色”溶劑的潛力，它能代替更有害的溶劑并可用作每年總產值超過十億美元的數百萬磅化學藥品的前體。與琥珀酸一起，其它的4碳二羧酸，如蘋果酸和延胡索酸也具有原料潛力。
從可更新的原料生產這類羧酸(例如，通過發酵方法)是代替從不可更新資源產生該羧酸的更耗能方法的一種途徑。琥珀酸是產丙酸細菌無氧發酵的一種中間體，但該過程產生低產量和濃度的琥珀酸。
厭氧瘤胃細菌，如Bacteroides ruminicola和Bacteroidesamylophilus也產生琥珀酸。然而，瘤胃細菌在發酵過程中在特征上不穩定。
很早就已知道大腸桿菌發酵產生混合酸，如在Stokes，J.L.1949，“以大腸桿菌懸液發酵葡萄糖”，細菌學雜志，57147-158中所述。然而，對于每摩爾發酵的葡萄糖，只生產1.2摩爾甲酸，0.1-0.2摩爾乳酸和0.3-0.4摩爾琥珀酸。因此，經發酵生產羧酸的努力導致相當大量的生長底物如葡萄糖不能轉變成所需產物。
在Glassner等的美國專利5143834中所列的發酵過程中使用的諸如A.succiniciproducens的一些細菌自然產生中等產量的琥珀酸。然而，該宿主生物將至少1摩爾碳水化合物轉化成1.33摩爾琥珀酸和0.67摩爾乙酸。乙酸副產物的產生說明昂貴的葡萄糖的1/3未轉變成琥珀酸。而且，已顯示A.succiniciproducens宿主菌株滲壓耐受性不高，不能耐受高濃度的鹽，且還受中等濃度產物的抑制。最后，A.succiniciproducens存在操作困難，因為作為專性厭氧生物，使用該生物的程序必須在無氧條件下進行。另外，接種物的培養基制品需要加入色氨酸且還需要混合4種不同的溶液，其中之一含腐蝕性和有毒的H2S。
在本領域需要一種經濟地生產大量羧酸，如琥珀酸，蘋果酸和延胡索酸的發酵方法。該方法應使用低花費的營養成份和底物且提供高發酵率。為了實現該方法，需要一種滲壓耐受性，特征清楚的兼性細菌宿主以達到2∶1摩爾比的產物與生長底物比產生所需產物。
本發明的概述本發明的一個目的是提供克服現有技術中許多缺陷的生產4-碳二羧酸的方法。
本發明的另一目的是提供一種兼性微生物菌株，它產生每升100克的蘋果酸濃度。本發明的一個特征是將不能將丙酮酸代謝為蘋果酸的細菌與蘋果酸酶基因結合。本發明的一個優勢是專一性生產蘋果酸，或生產蘋果酸及琥珀酸。
本發明的另一個目的是提供一種兼性微生物菌株，它以大約2∶1的琥珀酸與碳水化合物食品源之比產生琥珀酸。本發明的一個特征是在選擇培養技術后出現菌株。本發明的一個優勢是經濟地產生生產琥珀酸的突變株而不需對親本株進行耗時的遺傳操作。
簡單地說，本發明提供了一種分離生產琥珀酸的細菌的方法，包含分離缺乏降解丙酮酸之能力的兼性微生物；以有氧方法增加該微生物的生物量；將生物量置于無氧環境的葡萄糖富集培養基中使降解丙酮酸的突變體能生長并分離該突變體。
本發明還提供了一種突變體，其特征在于它產生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物作為發酵產物，它來自缺乏丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶的基因的親本且屬于大腸桿菌類細菌。
附圖的簡要描述通過參照


的本發明實施方案的下面的詳細描述可更好地理解本發明的上述和其它目的及優點，其中圖1是描繪根據本發明，琥珀酸與乙酸產量的比率增加的圖；圖2是描繪根據本發明用蘋果酸酶基因轉化NZN111后琥珀酸產量增加的圖。
本發明的詳細描述一般來說，本發明人發現了確定能經濟地以發酵方法生產大量琥珀酸，延胡索酸和蘋果酸的細菌的方法。
大腸桿菌突變的詳細描述在一個實施方案中，開發了琥珀酸產量增加的大腸桿菌的一個新突變菌株。本發明人命名該菌株為AFP111，表明該菌株由美國能源部選擇原料計劃的努力而產生。
如上所述，正常情況下，在無氧條件下野生型大腸桿菌產生發酵產物的混合物，其中琥珀酸是微量成份。然而，在無氧條件下生長AFP111時，主要代謝產物是琥珀酸。AFP111含有單一的自發染色體突變，它產生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物，其中琥珀酸是主要產物。用AFP111可產生每份葡萄糖重量99％的琥珀酸重量的最大產率。使用AFP111明顯降低了以發酵方法生產琥珀酸的成本。
厭氧發酵是從諸如葡萄糖的燃料獲得能量的最古老的途徑。在厭氧細胞中，這是唯一的產生能量過程。在大多數兼性細胞中，這是葡萄糖代謝中的專性第一階段，接著是經三羧酸循環對發酵產物的有氧氧化。
最廣泛使用的發酵類型是以產生的丙酮酸作為次末級產物的糖酵解。丙酮酸的貯存取決于在該生物中存在哪一種基因。在乳酸脫氫酶存在的條件下，當丙酮酸經NADH和H+還原成乳酸時糖酸解終止。在存在丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶時，形成乙醇。在存在丙酮酸甲酸裂解酶時，發酵以產生乙酸，乙醇和甲酸，或氫加二氧化碳終止。
如果在細菌基因組中出現的一個或許多突變消除了該微生物中負責丙酮酸降解的基因，那么丙酮酸會積累。在無氧生長的大腸桿菌中，這些基因是丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脫氫酶(ldh)。研究者可從Dr.David Clark，Southern Illinois Universitv，Carbondale IL63901大量獲得的大腸桿菌菌株NZN111在兩基因中均含有突變，其中由于大腸桿菌染色體DNA序列的改變，pfl和ldh均已失活。因此，NZN111不能經發酵生長。
獲得突變的詳細描述令人驚奇且預料不到的是，本發明人發現了NZN111的其它改變，這些改變在選擇培養期間自發地出現或經質粒轉化出現，最終導致出現產生琥珀酸作為主要產物的AFP111。
當在系列培養技術中使用選擇環境時出現導致AFP111型特征的NZN111的自發染色體突變。在第一步，在富集培養基，如LuriaBertaini(LB)肉湯(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，和1％NaCl，pH7.5)中以有氧發酵增加NZN111生物量。需要每毫升109至1010個細胞的產量。盡管可改變培養基，但在37℃，標準壓力下5-7小時的生長期期間可產生上述濃度。
作為第二步，將積累的生物量置于富含葡萄糖的無氧條件中以利于只有那些能降解丙酮酸的細胞(突變體)生長。具體地說，將細胞涂布于1.5％瓊脂，該瓊脂板含大約每升1-30克(g/l)的葡萄糖，優選10g/l葡萄糖，及30微克(μg)卡那霉素。卡那霉素抗性基因插入NZN111的乳酸脫氫酶基因中。在37℃下在控制的無氧環境中生長培養物24小時。產生好結果的一種無氧環境是二氧化碳和氫氣的混合物，它通過使用以GASPAKTM購自Becton-Dickinson，Cockeysville，Maryland的大氣控制裝置提供。
培養期間產生了許多個AFP111菌落(大約每107個細胞中有2個)，其中大約一半能在液體培養基中生長以產生所需的產物混合物。
在質粒轉化的例子中，當用含突變的蘋果酸脫氫酶基因mdh的質粒pMDH13轉化NZN111時，恢復丙酮酸降解產生乳酸。系列培養該轉化子[NZN111(pMDH13)]產生含自發染色體突變的AFP111。AFP111產生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物作為發酵產物，與生長培養基中所用的葡萄糖重量相比，產生的琥珀酸高達99％。pMDH13的形成和轉化方案相似于W.E.Boernke等(1995年9月10日)Archives ofBiochemistry and Biophysics 322，No.1.pp.43-52所公開的方案，本文引用以供參考。
AFP111生長的詳細描述AFP111易于處理且其隨后的生長使該菌株比現有技術的A.succinici-producens更易于研究。例如，由于該生物的兼性有氧特征，本發明的生長方法不需嚴格使用無氧培養技術。該方法不需諸如葡萄糖和色氨酸的昂貴生長培養基來生產大量生物量。而且，該生物具有滲壓耐受性，能產生高于每升發酵液50g有機酸鹽的濃度而對其代謝無任何抑制。最后，AFP111細菌也在A.succiniciproducens不能同化的木糖和其它戊糖上生長。
為了對本文所述的菌株進行實驗評價，在無葡萄糖的生長培養基(Luria Broth)中有氧培養細胞至細胞密度達到0.5和10OD600之間。
一旦達到AFP111的這一合適的生物量，將細胞注射或轉移入密封的發酵反應室中以容納于其中。培養基是用葡萄糖或一些其它的合適的碳水化合物混合而成，如木糖，半乳糖或阿拉伯糖，濃度范圍為大約10到30g/l。改變現在容納的混合物的氣氛，從而實現無氧條件。實現該氣氛改變的一個方法是通過一個通氣站進行，其中將環境氣體交換成二氧化碳。
在將混合物導入發酵反應室之前，給反應室提供適當量的緩沖培養基，如MgCO3或CaMg(CO3)2，以維持近中性pH。為達到合適的緩沖能力，一般使用大約4至8重量百分數的緩沖培養基。當以固體提供緩沖培養基以賦予發酵液隨時間釋放的緩沖能力時獲得特別好的效果。
上述程序導致高產率的琥珀酸。例如，獲得6∶1比率的琥珀酸與乙酸的重量比，具有99％的產率。當在氫氣H2濃度為大約25％至100％之間存在下進行發酵時能進一步增加琥珀酸與乙酸的比率。這些結果表明，不象現有技術的微生物，本發明的突變體AFP111使用外源性氫作為還原劑。例如，當存在Luria培養基，葡萄糖，緩沖劑，氫氣與二氧化碳(CO2從緩沖劑中釋放)的混合物時，獲得的琥珀酸與乙酸比率達到9，如圖1所示。這一結果反應了本方法的另一個優勢，強調了葡萄糖降解為所需產物，而無不希望的產生乙酸的副反應。
下面表1顯示了原始親本LCB320(也從Southern IllinoisUniversity獲得)，NZN111和AFP111的羧酸產物分布。
當使用100％的二氧化碳氣體時，琥珀酸產量增加，琥珀酸濃度達到每升約45克，生產力達到大約每小時每升1.6克，琥珀酸克數相對于葡萄糖克數的百分產率達到99％，琥珀酸與乙酸重量比達到大約6。
表1AFP111和親本的產物產率，以相對于起始葡萄糖的摩爾產量(摩爾百分數)表示產物 原始親本中間親本突變體LCB320 NZN111 AFP111琥珀酸 12 2 109乳酸 24 0 0丙酮酸 1 17 0甲酸 26 0 0乙酸 51 6 49乙醇 80 15 47總產量 193％ 41％206％理論上的摩爾產率值可以是200％，因為1分子的葡萄糖可產生2分子的全部產物。
當在NZN111中產生大腸桿菌NAD-依賴性蘋果酸酶(經過添加并誘導基因maeA)時，也產生琥珀酸。在這種情況下，使用誘導型質粒pMEE2-1以在轉化體NZN111(pMEE2-1)中表達蘋果酸酶基因。
從大腸桿菌MC1061分離的基因組DNA用作經PCR克隆蘋果酸酶的模板。用限制性核酸內切酶HindIII和PstI消化大腸桿菌MC1061，所得的消化物在1％TAE瓊脂糖凝膠上進行大小分離。使用上文所述PhotoGene核酸檢測系統(Cat8192SA)經Southera印跡分析測定含蘋果酸酶基因的基因組DNA片段的大。
制備生物素標記的探針的詳細描述引物以公開的該基因的部分DNA序列為基礎；有義CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT；反義GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC。
這些引物以1微摩爾(μM)與大約20納克(ng)基因組DNA在標準的100微升(μl)PCR反應液中混合，產生預期0.8千堿基(kb)的蘋果酸酶基因的內部片段。使用Qiaex凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，California)純化PCR產物并使用BioNick標記系統(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)進行生物素標記。生物素標記的PCR產物在用HindIII和第二種核酸內切酸裂解的基因組大腸桿菌DNA的Southern印跡分析中用作探針。蘋果酸酶基因測定為位于HindIII和PstI消化的DNA的含2.0-2.5kb片段的區域。
起始蘋果酸酶基因克隆詳述用HindIII和PstI消化1微克的大腸桿菌DNA并在預制的1％TAE瓊脂糖凝膠上進行大小分離。分離2.0-2.5kb區域的大腸桿菌DNA片段并使用Qiaex凝膠提取試劑盒純化。純化的DNA片段連接進已用PstI和HindIII裂解并用蝦堿性磷酸酶處理的pUC19的多接頭區。連接物然后用作PCR反應的模板以擴增完整的蘋果酸酶基因。1微升的連接混合物用作模板，其中含1uM靶向蘋果酸酶基因的有義引物GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT，及0.25μM靶向連接的pUC19DNA的反義引物TTTTCCCAGTCACGACGTTG。擴增參數為94℃變性，55℃雜交1分鐘，72℃延伸3分鐘，共35個循環。在1％TAE-瓊脂糖凝膠上分析PCR產物，使用Qiaex凝膠提取試劑盒分離并純化1.8kb的片段。用BcI和BgI消化部分PCR產物以證實該產物確實含有蘋果酸酶基因。用PstI和NcoI消化剩余的PCR產物，凝膠分離，再純化，然后連接進用NcoI和PstI裂解的表達載體pTRC99a(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)的多接頭區。以標準方法用連接混合物轉化大腸桿菌菌株NZN111，以使用Xmn的限制性片段分析篩選所得的菌落(4個實驗菌落和2個對照菌落)(預期0.7kb，1.4kb和3.9kb片段)。含克隆的蘋果酸酶基因的質粒命名為pMEE3。
蘋果酸酶的另一N端詳述100ml NZN(pMEE3)培養物以過夜培養的方式生長，使用Qiagen質粒試劑盒分離該質粒，分離的質粒用作PCR反應的模板。設計新引物以產生在蘋果酸酶第一次克隆中所用的引物下游81個堿基對的另一N端。20納克質粒用作模板，其中含有1μM有義引物AGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC和反義引物CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC。擴增參數與上面所述相同。以BclI和BglII的限制性圖譜再次證實部分PCR產物，證實了該產物含蘋果酸酶基因。用PstI和NcoI消化剩余的PCR物質，凝膠分離，再純化并連接進已用NcoI和PstI裂解的表達載體pTc99aa(Pharmacia，Inc.Piscataway，N.J.)的多接頭區。以標準方法用連接混合物轉化大腸桿菌株JM109并以限制性片段分析篩選所得菌落(3個實驗克隆和1個對照克隆)的所需插入片段。含該蘋果酸酶基因這一版本的質粒命名為pMEE2。
啟動子誘導物條件最佳化的詳述；用1.5ml pMEE2的過夜培養物接種含100μg/ml氨芐青霉素的30毫升LB培養基。生長2小時后，將30ml培養物分成3-10ml等份試樣。用0，100μM和10μM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導酶活性。在0，1，2，3和4小時從每個培養物中取出2ml樣品。根據標準方法分離蛋白質并按上面所述測定活性。相對于時間的酶產量在下面表2中描述表2在LB培養基中以IPTG誘導的蘋果酸酶產量時間(小時) 無IPTG100μM IPTG10μM IPTGμg/分鐘/mg蛋白質03.09 --14.83 26.5 5.8424.26 38.2 10.0638.46 75.3 32.749.92 88.2 38.95在圖2中描述了pMEE2表達的生理學效應。在2ml含氨芐青霉素的LB培養基中有氧生長雙份NZN111(pMEE2)培養物和作為對照的NZN111(pTRC99a)。每種培養物的一份用10μMIPTG誘導。3小時后，OD600從0.6增加到4.8。將1毫升該培養物注射進裝有10ml含20g/1葡萄糖，1g/L乙酸和0.5g固體MgCO3的LB培養基的密封的58ml瓶中。氣氛由1∶1∶2比率的空氣∶氫氣∶二氧化碳組成并高出環境壓力1個大氣壓。立即取樣并在37℃，100rpm搖動培養期間間隔從培養基取樣。下面表3提供了用pMEE2及原始載體(pTRC99a)轉化NZN111時的產物產率的比較。
表3NZN111(pMEE2)與NZN111(pTRC99a)中蘋果酸酶表達的效果產物載體 maeAg/L琥珀酸 0.3 6.5乳酸0.4 0.4乙酸00乙醇00.2表3中所示的結果是大約19至42小時的培養期間的結果。
乳芽孢桿菌屬突變體詳述本發明還確定了經發酵更高產地生產蘋果酸的方法。蘋果酸是琥珀酸的前體，原則上是比琥珀酸更好的終產物，其生產少一步還原步驟。蘋果酸產量的理論化學計算法是1摩爾葡萄糖和2摩爾二氧化碳轉變成2摩爾的蘋果酸。因此可生產蘋果酸而不浪費葡萄糖。也可形成延胡索酸，它是蘋果酸的脫水產物，且是還原途徑中琥珀酸的前體。也可同時形成蘋果酸和延胡索酸而不產生副產物，但蘋果酸的更高的可溶性使其在大規模生產方法中是優選的。
用負責蘋果酸酶生產的基因(如maeA)轉化合適的細菌可產生過量的蘋果酸。一般來說，理想的細菌應缺乏乳酸脫氫酶活性以及其它代謝丙酮酸的酶，從而導致積累丙酮酸。用maA轉化細菌可直接產生蘋果酸。為了維持高水平的蘋果酸生產，細菌必須不能將蘋果酸轉變回乳酸或轉變成延胡索酸或琥珀酸。一些乳芽孢桿菌屬菌株缺乏負責該轉變的丙乳酸酶，延胡索酸酶和延胡索酸還原酶，所以這類菌株是在發酵方法中生產蘋果酸的特別合適的候選物。由于其極高的滲透壓耐受性特征，進一步增強了乳桿菌屬的合適性。Lactobacillusgasseri是用于該操作的接近條件的宿主，因為已顯示它在葡萄糖發酵期不能代謝蘋果酸且在遺傳上可被較好地鑒定。干酪乳芽孢桿菌也具有相當大的潛力，因為它比L.gasseri表現出更高的滲壓耐受性。
一般來說，在缺乏功能性乳酸脫氫酶基因的乳芽孢桿菌屬宿主中誘導在諸如pTRK327的合適的乳芽孢桿菌屬表達載體中的蘋果酸酶基因(如maeA)可形成蘋果酸。經過將蘋果酸酶插入宿主的乳酸脫氫酶基因中可實現這一點。
盡管參考列舉的實施方案的詳細描述已描述了本發明，這些詳細描述并不打算限制在所附權利要求中限定的本發明的范圍。
權利要求
1.一種分離生產琥珀酸的細菌的方法，包含a)分離缺乏降解丙酮酸之能力的兼性微生物；b)在有氧過程中增加該微生物的生物量；c)將該生物量置于無氧環境中的富含葡萄糖的培養基中使降解丙酮酸的突變體得以生長；d)分離該突變體。
2.如權利要求1所述的方法，其中該兼性微生物缺乏丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶活性。
3.如權利要求1所述的方法，其中缺乏降解丙酮酸之能力的該兼性微生物是NZN111。
4.如權利要求1所述的方法，其中該微生物在Luria培養基中有氧培養。
5.如權利要求1所述的方法，其中該生物量增加到大約每毫升109到1010個細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其中該富含葡萄糖的培養基含大約1g/l到30g/l的葡萄糖。
7.一種突變體，其特征在于它產生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物作為發酵產物，該突變體來自缺乏丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因的親本，屬于大腸桿菌類細菌。
8.如權利要求7所述的突變體，其中該親本是NZN111。
9.如權利要求7中所要求的AFP111。
10.如權利要求7中所述的突變體，其中琥珀酸是主要發酵產物。
11.一種產生產琥珀酸的微生物的方法，包含a)將產羧酸的微生物置于缺乏葡萄糖的培養基中以增加其生物量；b)將增加的生物量置于無氧氣氛中的富含葡萄糖的發酵培養基中；c)從生物量中分離產琥珀酸的微生物。
12.如權利要求11所述的方法，其中該微生物是滲壓耐受性的。
13.如權利要求11所述的方法，其中該微生物經遺傳操作而表達能使該微生物將丙酮酸轉變成二羧酸的酶。
14.如權利要求13所述的方法，其中該酶是蘋果酸酶。
15.如權利要求14所述的方法，其中該微生物選自乳芽孢桿菌屬和大腸桿菌細菌。
16.如權利要求15所述的方法，其中該微生物是來自缺乏丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因的親本的大腸桿菌細菌，產生的羧酸主要是琥珀酸。
17.如權利要求16所述的方法，其中在富含氫氣的氣氛中增加琥珀酸的形成。
18.如權利要求15所述的方法，其中該微生物是乳芽孢桿菌屬細菌且產生的羧酸是蘋果酸。
19.如權利要求11所述的方法，其中該微生物的特征在于它產生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物作為發酵產物，它來自缺乏丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因的親本，它屬于大腸桿菌類細菌。
20.如權利要求11所述的方法，其中在富含葡萄糖的培養基中的葡萄糖濃度是大約10到30g/l。
全文摘要
提供了分離生產琥珀酸的細菌的方法,該方法包括增加缺乏降解丙酮酸之能力的生物體的生物量,將所說的生物量置于無氧環境的葡萄糖富集培養基中使降解丙酮酸的突變體生長。本發明還提供了生產高含量琥珀酸的突變體,它來自缺乏丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因的親本且屬于大腸桿菌類細菌。
文檔編號C12P7/44GK1202930SQ96198547
公開日1998年12月23日 申請日期1996年10月31日 優先權日1995年11月2日
發明者馬克·多尼利, 辛西婭·S·米拉德, 露西·斯托斯 申請人:芝加哥大學