專利名稱：高強度蛛絲蛋白的克隆方法
技術領域：
本發明涉及產生編碼蛛絲蛋白質的DNA片段的新方法。本發明還涉及編碼蛛絲蛋白質的DNA序列。本發明還進一步涉及用上述DNA序列生產蛛絲蛋白質的新方法。本發明還涉及純化這些蛛絲蛋白質和用它們制造纖維和薄膜的方法。
通過本發明所開發的克隆生產商業用量的高分子量蛛絲蛋白質，其分子量范圍從90,000到250,000以上，其分子量是從Nephilaclavipes所獲得的天然主要ampulate(拖絲)蛛絲蛋白的40％到100％以上。由于從這些高分子量蛋白質制造的絲具有優越的物理特性，如高抗張強度和很大的彈性，本發明所克隆的絲蛋白質有可觀的產業價值。
已通過本發明的幾種方法克隆了這些蛛絲蛋白質并已在E.coli表達系統中產生這些天然序列的蛛絲克隆。然后已將這些表達系統用于生產各種部分或完整長度的天然蛛絲蛋白質，這些蛋白質已經以每升細胞量超過2克的水平表達。然后純化這些蛛絲蛋白質并用于許多目的如精紡纖維，形成膜以及絲織有關的其他應用。
背景技術：
眾所周知，絲是由許多目的動物產生的(例如，昆蟲，蜘蛛和蛆)。例如蜘蛛產生天然的高抗張強度的網和拖絲。另一方面，蠶雖然以高產率產生絲卻具有被認為物理性質不如蛛絲蛋白質的絲蛋白質。例如蠶絲蛋白質具有的抗張強度遠低于蛛絲蛋白質的抗張強度。球形織工(Orb weaver)和其他蜘蛛雖然自然產生少量的絲線(經濟上不足以商業化)，卻是強的絲線。事實上，蛛絲可比Kevlar的絲強數倍(9.5×104/3×104Jkg-1)。這些優越的強度特性使蛛絲蛋白絲線成為降落傘，帆，防護服和需要強力絲線的其他應用的優先選擇。此外，這些蛛絲用做許多重金屬和包括生物學武器在內的有機物的吸收膜。它們還有作為選擇性結合DNA的吸收劑和作為許多其他化學物質，調料和香料的吸收劑的用途。
雖然可設想從培養蜘蛛可生產蛛絲，但幾個方面的原由都說明這是行不通的。首先，除很難養育之外，在生長密度很高時蜘蛛會吃掉它們的近鄰。其次，蜘蛛僅產生少量絲蛋白使得即使微克量的生產也驚人的昂貴。由于這些限制，生產商業用量的蛛絲蛋白質的唯一可行方法是將該蜘蛛基因克隆到一個可用來大規模生產的載體中。本發明達到了這個目的。
先前通過制造短的堿基對片段然后使用大量重復單位的方法已生產出合成的絲蛋白基因。已通過此方法得到有中等分子量的蛋白質(范圍在20,000到80,000)。為達到各種物理性質，對這個方法做了改變并已生產出不同序列的合成蛋白質。例如，以前的工人已經使用通過用短的天然絲蛋白質并改變其序列而得到的序列。
然而這些先前使用的方法產生的材料次于天然絲。而且，在某些情況下，這種先前的技術還產生了不適合長期使用的克隆，而長期使用是商業應用所需要的。因此，本發明的目的之一是克服聚合短DNA序列所發生的上述問題。本發明通過產生編碼高強度，高分子量絲蛋白質的長DNA而達到了這個目的。
由于高強度大的ampulate(拖絲)蜘蛛絲有這種潛力，已經研究了球形織工如Nephila clavipes的絲以期了解其強度的分子基礎。研究人員還試圖通過嵌入與蛛絲纖維高強度相關的重復元件，用有限的成功來克隆該天然蛋白或制造合成絲基因。
然而，伴隨克隆絲蛋白有許多問題。首先，天然氨基酸序列由許多重復亞單位組成，因此沒有許多可用于克隆該天然基因的單一位點。文獻表明Nephila clavipes的拖絲蛛絲蛋白羧基端是顯示出單一性的唯一區域。這導致了僅有少數克隆該天然基因的在先嘗試，結果更多是制造合成蛋白的在先嘗試。然而，由于被模擬的DNA序列的重復性，制做穩定的克隆及其產生的合成蛛絲蛋白質存在許多問題，例如有大量重復(特別是GCA重復)的DNA是不穩定的，因為轉錄錯誤和高幾率重組缺失導致DNA經常改變。由于這些問題，許多克隆的完整性便成為疑問。
在自然界，絲基因是十分穩定的，因為重復和非重復區是混雜的。不幸的是，合成的基因沒有將這種結構借給自身重組，特別是重組缺失的高度不穩定的。它們是因為沒有足夠量的基因被克隆而無法得到穩定的克隆，因此沒有得到可構成其天然穩定性基礎的非重復區。因此，獲得有非重復及重復區的穩定克隆即是本發明的目的之一。
克隆拖絲蛛絲的另一個問題是該基因的大小。蛛絲蛋白質一般是200,000kDa或更高并且相應的基因還至少有一個內含子。這樣，設想DNA片段的大小將是界于5-10Kb范圍再加上任何內含子。用目前技術，這么大的基因仍是十分難于克隆的。本發明克服了這個困難。
由于其機械強度性質，大部分注意力被放在克隆蛛絲蛋白質方面。在了解Nephila clavipes拖絲絲方面的一個主要進展是由Xu等取得的(Proc.Natl.Acad.Sci.877120，1990)。Xu等確定了來自一個部分克隆的蜘蛛拖絲絲的重復序列的一部分。雖然這個重復單位編碼達34個氨基酸，它不是完全保守的，因為在某些重復中該序列有缺失和改變。
然而，Xu等人發現在該序列中有兩個重要區域--賦予蛛絲某些重復區性質的重復區和一個非重復(羧基端)區。Hinan和Lewis(J.Biol.Chem.26719320，1992)報道了一個第二cDNA克隆，它被推測是來自第二蜘蛛蛋白。該序列有一個類似于Xu等人發現的重復區和一個羧基末端的非重復末端。Hinan和Lewis重復單位較長，它編碼51個氨基酸并是高度可變的。
在由Lewis等人于1991年10月23日在歐洲專利申請EP0452925A2，發表的蛛絲蛋白質的表達中，只有小蛋白質片段以低產量被明顯產生。這些小蛋白質片段可能不具有商業價值因為良好的機械性質僅來自于大蛋白質，特別是接近全長的大蛋白質。Lombardi等于1991年10月31日發表的國際專利申請 WO91/16351還以十分低的產量生產出重組蛛絲蛋白，但由于其小分子量這些克隆表現出低機械強度。
還推測因此而開發的蛛絲克隆不代表天然基因的真實拷貝。這一點通過許多研究得到證實例如Beckwith & Arcidiancono(J.Biol.Chem.269(9)6661，1994)表明兩種蜘蛛蛋白質有高同源性并且事實上可能代表相同的蛋白質。
雖然許多研究者已承認天然表達系統作為絲變異體是有用的。這些系統不能解決密碼子偏愛方面的難題。如果認為使用高保守重復區可產生改進的蛋白質，這些合成的基因表達系統遇到DNA穩定性問題，低的表達速率和生成的蛋白質性質不如天然蛛絲的性質稱心的麻煩。因此本發明的一個目的是解決這些問題。
Ferrari等在1988年5月19日發表的國際專利申請WO88/03553公開了合成的基因，這類基因產生的蛋白質具有絲-樣性質。此外，一些擬天然纖維蛋白質的短的重復序列蛋白質由Cappello等開發出來，它們被發表在1990年5月17日國際專利申請WO90/05177。Floyd(國際專利申請WO94/29450，1994年12月22日發表)還試圖用一些Xu等發現的天然重復單位開發一種蛛絲合成基因。然而所有這些克隆具有小的分子量從而使它們不具有所期望的天然蛛絲的性質。
本發明涉及部分和全長的蛛絲蛋白克隆的新合成。某些部分長度克隆還被聚合成分子量達到和超過天然蛛絲分子量的其他克隆。本發明已使開發具有全范圍性質的天然絲樣克隆成為可能。熟悉分子生物學的人員可使用這些克隆作為創建其他有用的絲性質，如強度，流動點，黏度和彈性的克隆的起點。而且，這些新序列可被用做設計其他合成基因的起點。因為某些蜘蛛將顏色或色素結合到其絲蛋白質中，這些方法還可容許天然著色的蛋白質。
本發明還涉及轉染的宿主在培養基中發酵的獨特化學方法。通過細菌發酵生產絲蛋白質的主要難題之一是蛋白質被蛋白酶部分降解。事實上，由蛋白酶產生的蛋白質降解速率在某些情況下可大于高分子量絲蛋白表達的速率，由此使商業操作成為不可實現的。本發明克服了這個潛在難題。
這些以及其他目的和本發明的優點從下面描述中被表現出來。
附圖簡述
圖1顯示編碼蛛絲蛋白的2KbDNA序列發明概述本發明涉及生產編碼絲蛋白的DNA片段的方法，其步驟包括(i)選擇從產絲蜘蛛得到的靶DNA，該靶DNA包括多個重復和非重復區；(ii)選擇至少10個核苷酸的單鏈DNA引物，該引物有一個與靶DNA中一個區域互補的DNA序列；和(iii)將該DNA引物反復與變性的靶DNA結合，并將結合的DNA引物和靶DNA核苷酸及有校讀能力的DNA聚合酶一起溫孵，以產生DNA片段。其中DNA片段與所述靶DNA互補并至少是2Kb。在更具體的實施方案中，可產生至少5Kb的DNA片段。
在上述產生編碼絲蛋白的DNA片段之方法的進一步實施方案中，該方法包括使用兩個不同的DNA引物代替一個引物的步驟。在仍是用一個單鏈DNA引物或兩個不同的DNA引物產生DNA片段的該方法之進一步實施方案中，該靶DNA是通過反轉錄編碼蛛絲的全長mRNA制得的cDNA，并且該方法進一步包括步驟(i)在該方法所制得的第一鏈cDNA的氨基末端加入一個引物位點和(ii)用該cDNA的多聚T區作為第一聚合酶引發區。仍是在這些生產DNA片段的方法的進一步實施方案中，用聯接盒在該DNA的未知末端創建第二引物位點。仍是在進一步實施方案中，用末端轉移酶在該DNA的未知末端創建第二引物位點以產生一個選自包括多聚dT，多聚dA，多聚dG和多聚dC的引物位點。
產生DNA片段的上述方法所用DNA引物可選自由起始和終止序列(i)-(xx)所代表的DNA給出如下GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(ii) GGCGAATTCACCCTGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(iii) GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；(iv) TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；(v) GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；(vi) GAYGAYGGNAAYGCNGT；(vii) TGNTGNCCSGTTCG；(viii) CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；(ix) GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；(x) GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；(xi) TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；(xii) TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；(xiii) TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；(xiv) CCNCGNCCNCTYCC；(xv) GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；(xvi) GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；(xvii) GGWGGACGAGGTGGATTA；(xviii) GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；(xix) CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and(xx) GGNGGNGCNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCCNGGNGCNGGNGGN，
其中N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；和R＝A，G。
產生DNA片段的該方法的另一實施方案中，通過與至少含上述序列(i)-(xx)之一的DNA探針雜交選擇該靶DNA，該探針被可逆結合到一個支持物上以富集編碼絲的DNA片段。
在產生編碼絲蛋白DNA片段的另一方法實施方案即被稱作聚合方法中，該方法包括步驟(i)選擇一個編碼從產絲蜘蛛獲得的絲蛋白的靶DNA，該靶DNA包括多個重復和非重復區；(ii)選擇第一對不同的DNA引物，兩引物與該靶DNA中的一個區域互補，并且第一對引物中至少有一個由序列(i)-(xxvi)所代表；(iii)通過第一對DNA引物與變性靶DNA的重復結合并將結合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和有校讀能力的DNA聚合酶一起溫孵以產生第一DNA片段，該第一DNA片段與靶DNA互補并至少是2Kb。此聚合方法進一步包括步驟(iv)選擇第二對不同的DNA引物，該第二對DNA引物與第一對DNA引物的兩個序列相比至少有一個是不同的，并且第二對DNA引物中至少有一個由序列(i)-(xxvi)所代表；(v)通過第二對DNA引物與變性靶DNA重復結合并將該結合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和校讀能力的DNA聚合酶一起溫孵來生產第DNA片段，與第一DNA片段相比第二DNA片段是不同的，并且還與靶DNA互補，該第DNA片段至少是2Kb；(vi)限制性酶解第一和第二DNA片段；并(vii)將第一和第二DNA片段的限制酶解部分重組到被聚合的DNA中，該聚合的DNA編碼蛛絲蛋白并至少是4Kb長。
在上述聚合方法的更具體的實施方案中，全部引物都由序列(i)-(xxvi)所代表。在另一具體聚合方法實施方案中，全部引物都是不同的。在仍是一個更具體的聚合方法實施方案中，聚合的DNA至少是6Kb到8Kb長。
在DNA序列實施方案中，本發明涉及編碼蛛絲蛋白的一個DNA序列，其中該DNA序列包括多個重復和非重復區并有至少2Kb長。在更具體的實施方案中，該DNA序列有至少5Kb長。在仍是本發明的一個更具體的DNA序列實施方案中，該DNA包括如圖1描述的序列。
在產生絲蛋白方法的實施方案中，本發明包括步驟(i)選擇一個DNA；(ii)將該DNA插入一個表達載體；(iii)用該表達載體轉染宿主細胞；(iv)在培養基中發酵被轉染的宿主以生產絲蛋白；和(v)回收絲蛋白。在更具體的絲蛋白生產方法實施方案中，用于發酵被轉染的宿主的培養基含有蛋白酶抑制劑。在一個更進一步絲蛋白生產方法的實施方案中，該方法包括步驟(i)用超聲能量破壞宿主細胞；(ii)用超聲能量重懸浮絲蛋白；和(iii)離心破碎的宿主細胞以使細胞膜與絲蛋白分開。在這些絲蛋白生產方法中，絲蛋白的純化通過超濾或乙醇沉淀來完成。
精紡絲蛋白所用的方法實施方案中，本發明涉及一種方法包括步驟(i)濃縮由超濾或乙醇沉淀純化的絲蛋白；(ii)將濃縮的絲蛋白拉成纖維；(iii)精紡絲纖維以生產絲線；和(iv)洗絲線以除去任何增溶劑試劑。增溶劑選自六氟異丙醇，氫氧化鈉，氫氧化鉀，尿素，尿素磷酸酯，鋰鹽，有機溶劑，鹽酸胍，硫酸銨，醋酸，磷酸，二氯醋酸，甲酸和硫酸。精紡絲還有一種更具體的方法，該方法進一步包括用錫或鈦的氧化物包被絲纖維或絲線的步驟。
在纖維實施方案中，本發明涉及含根據本發明的任何方法制造的蛛絲線的一種纖維。在進一步的纖維實施方案中，該纖維包括根據本發明的任何方法結合Kelvlar，石墨或碳纖維，以及蠶絲制成的蛛絲線。
該蛋白可被用做涂層，擠壓成纖維或制成聚合膜。
發明詳述產絲蜘蛛DNA來源在本發明的方法被專門開發以克隆Nephila clavipes大的ampulate(拖絲)蛛絲。克隆和生產絲蛋白質的方法可用于所有的產絲蜘蛛。
作為群體，蜘蛛的絲分泌腺可達8種。雖然沒有一個蜘蛛的種有全部8種絲分泌腺，所有的蜘蛛至少有3種絲分泌腺并且多數蜘蛛有5種分泌腺。每種分泌腺產生不同類型的絲，它們具有不同的性質。例如，某些絲干燥得快，而其他的絲保持粘性。
蜘蛛歸屬于節肢動物門，蜘蛛綱和蜘蛛目。真正的蜘蛛歸于Labidognatha亞目。其他蜘蛛類型包括梳足(comb footed)，蟹形(crab)，捕魚者(fisher)，漏斗網(funnel web)，麻梳斑(hackled-band)，球形織工(orbweavers)，跳蛛(jumping)和魔面枝(ogre faced stick)。來自下面任何屬的蜘蛛可按照本發明被使用Micrathena，Mastophora，Araneus，Argiope，Nephila或Gasteracantha。
球形織工是其中結果最好的的蜘蛛群，因為它們吐出的絲有很高的強度和柔韌性。球形織工被稱為Argiopidae并包括箭頭型Micrathena sagittata，流星錘蜘蛛Mastophora sornigera，迷宮Metepeira labysrinthea，石斑Araneus marmoreus，黑黃花園Argiope bruennichi，金絲Nephila clavipes，和棘身Gasteracantha cancriformis。
因為Nephila clavipes的絲線結實并且其絲分泌腺大而易于切割，已對Nephila clavipes進行了最多的遺傳研究。其他的球形織工也產生結實的絲線。
雖然所有的蜘蛛都產絲，形成絲線的蛋白質的分子組成變化很大并有不同的用途。例如，Antrodiatus蜘蛛吐出只含兩種蛋白質的簡單類型的絲。相反，被稱為網織者的Araneoidea科蜘蛛產生達8種不同類型的絲。球形織工用數種蛋白質產生各種絲以生成較大強度和柔韌性的網。
蛛絲蛋白質還有不同的質量，取決于其是由那一種絲分泌腺分泌出。已知最強的絲來自球形織工的大的ampulate分泌腺。在球形織工產生的8種絲中，大的ampulate(拖絲)絲由于其物理強度和非粘性質而被選擇用于這個研究。雖然碳水化合物與該纖維有關，這種拖絲絲由蛋白質組成。在蜘蛛的吐絲器中，液體絲經過不可逆轉變成為含高相對比例的丙氨酸和甘氨酸的不溶性形式。這種纖維包含一個具有靈活界面的反平行β折疊。這種絲的氨基酸組成(在下表中顯示)模擬本發明的克隆的氨基酸組成。
Nephila clavipes大的ampulate蛛絲的氨基酸組成百分比氨基酸 蛋白質 220Kd帶 190kD帶谷氨酸8.52 9.77 9.35絲氨酸3.51 2.57 2.79甘氨酸 41.6645.8844.80精氨酸1.28 1.98 2.28丙氨酸 25.2528.5728.35脯氨酸0.78 0.37 0.51酪氨酸4.20 3.25 3.26亮氨酸4.82 4.62 4.48
絲聚合物，ACS，論文集，絲氨酸，544，1994。
克隆兩個引物PCR的克隆雖然許多研究試圖用PCR技術克隆重復的絲基因，至少已出現兩個問題。這些PCR技術對長度為8-15Kb的基因不能以良好的忠實性轉錄DNA。事實上，在這類文獻中所報道的大多數克隆轉錄都有轉錄錯誤。因此，本發明開始克服這些缺點并發現通過使用某種程度的簡并引物可產生一個或多個PCR產物。
使用了來自Nephila clavipes腹部的基因組DNA。為從蜘蛛分離該DNA，嚴格遵循了Sambrook等的分子克隆一實驗室手冊，1-3卷，冷泉港實驗室，紐約(1989)中描述的制備方法。這個方法產生超過2Kb的高分子量基因組DNA。
發明者用許多與Xu等人公開的序列數據相關的引物做了實驗。所用的某些引物在上文作為序列(i)-(xx)公開。雖然Bechwith &Arcidiacono也試用了這些引物，本發明者是用雙引物PCR克隆系統產生達2Kb長度的蛛絲蛋白之第一人。本發明者還能用被要求專利保護的cDNA和下述單位點克隆方法生產較高Kb的蛛絲蛋白質。
使用從如Xu等人和Hinman和Lewis定義的spidrin 1得到的引物生成PCR克隆的初始條件。用有Taq聚合酶(Stratagene產品號600131，許可證來自Perkin Elmer，Stratagen，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA)的常規PCR，發明者僅能得到達700-1000bp的PCR產物。這證實了其它人的發現。甚至這些小片段也被認為是質量上可疑的。用Taq延伸因子(Stratagene產品號600148)，得到一些達1900左右的帶如實施例1所示。然而，當使用另一種有校讀作用的聚合酶時(Takara Taq LA)，僅得到一條主要的帶如下面實施例2中所描述的。
實施例1用Taq聚合酶克隆在本實施例中，通過Beckwith&Arcidiacono的方法分離的Nephila clavipes DNA被與下面兩引物一起使用引物(i)GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT，和(ii)GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC。
引物(i)編碼基于正向閱讀框的聚丙氨酸重復序列。將框內起始密碼和BamH1和EcoR I前導限制性位點插入作為懸垂以便于克隆的前導序列還被插入到引物中。引物(ii)是基于Xu等的反向序列的PCR引物(bp2218到2242)。這個序列還有一個框內終止密碼子和一個EcoR I限制位點。如本實施例和實施例2中所示，結果取決于PCR條件并且在無更新的聚合酶時是非陽性的。常規的Taq和Taq的延伸因子產生的結果不同，推測是由于錯讀或假引發的結果。
PCR混合液如下5微升Taq延伸因子緩沖液(Stratagene)；1微升Taq聚合酶5微克/微升(Stratagene)；1微升的1微克/微升DNA模板(蜘蛛基因組DNA)；1微升的2微摩爾引物(i)于水中；1微升的2微摩爾引物(ii)于水中；5微升NTP’s(各2微摩爾的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，pH7.0)；45微升的Taq延伸因子(Stratagene)；和水到總體積100微升。
PCR循環條件如下94℃放置2分鐘；和PCR條件(30循環)60℃退火1分鐘；和94℃變性1分鐘。或者，60℃退火1分鐘和72℃延伸2分鐘的PCR條件可用72℃處理2分鐘代替。
取5微升一份該反應混合物用1％瓊脂糖電泳顯示DNA帶進行分析。用此技術，達到7條DNA帶，它們被推測為代表該序列中的一些丙氨酸重復區。最大的DNA片段是1900-2000bp(并被認為是2Kb片段)。這基本上與實施例2中得到的是同樣的帶。用Gene CapsuleTM(貨號786-001自Gene Technology Inc.，3830 Washington Blvd.，St.Louis，MO63108)從膠中切下帶，用酚和乙醇沉淀。用下面實施例中描述的方法將這些帶克隆到E.coliXL1 MRF’超感受態細胞。在用引物(ii)和(iii)使用實施例2中描述的Takara Ex Taq LA聚合酶PCR條件時也發現了2Kb片段。
實施例2用Takara Taq LA聚合酶克隆用研缽和研杵研磨蜘蛛腹部分離基因組DNA并按照Sambrook等的分子克隆實驗室手冊1-3卷，冷泉港實驗室，紐約(1989)的方法提取。
本實施例的克隆用下列引物完成引物(iii)GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC，和引物(ii)GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC。
引物(iii)從Mello等，絲聚合物，ACS，論文集，Ser 544(1994)描述的肽序列4制得。引物(ii)如上述實施例1的描述制得。
使用下述PCR混合液和條件。PCR混合液5微升10X Takara LAPCR緩沖液；5微升Takara dNTP混合液；1微升引物(iii)(2微摩爾)；1微升引物(ii)(2微摩爾)；1微升校讀活性的TakaraEx Taq；1微升蜘蛛基因組DNA；水到總體積50微升；和50微升的礦物油。Takara LA PCR緩沖液，dNTP混合液，和Takara Ex Taq由Panvera公司565Science Dr.，Madison，WI 53711分銷的Takara Roll試劑盒提供。PCR循環條件如下初始放置94℃1分鐘；PCR條件(30循環)68℃1分鐘退火和延長；并4℃下后放置。
為插入該2Kb片段到E.coli中，選用熟悉的載體pUC18，因為該質粒有數個克隆位點并能表達好蛋白質。還知道該載體適合于用熟知的引物進行序列分析。為插入該2Kb片段到E.coli XL1 MRF’中，pUC18首先在從Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178-9916獲得的1微克/微升DNA制備液中制備。限制酶也類似的被使用以消化該插入片段。限制酶實驗方案如下5微克或以下的質粒或DNA插入片段；5微升的限制酶10X緩沖液；5微升1毫克/毫升乙酰化BSA；5微升限制酶(EcoR I)；水到終體積50微升；并37℃溫孵3小時。
在酚抽提后還要對載體處理并用EcoR I限制酶徹底酶解。該載體類似的被小牛腸堿性磷酸酯酶(CIAP)處理。該處理防止載體重連接。
除了限制性實驗方案外，CIAP實驗方案如下10微升CIAP 10X緩沖液含500毫摩爾tris-HCI，pH9.0，10毫摩爾氯化鎂，1毫摩爾氯化鋅和10毫摩爾亞精胺；1單位CIAP；水到終體積100微升；和37℃溫孵60分鐘。在37℃，一CIAP單位每分鐘將水解6.0毫摩爾的對硝基苯磷酸酯。在含1.0毫摩爾氯化鋅，1.0毫摩爾氯化鎂，pH10.4的0.1摩爾甘氨酸緩沖液中測定這些單位。下一步是連接該插入片段到pUC18中。為達此目的，用酚提取和乙醇沉淀純化該DNA并然后按下述實驗方案連接。
連接實驗方案100毫微克載體DNA；100毫微克或以下的DNA插入片段；1單位T4DNA連接酶(Weiss Unite)；1微升連接酶10X緩沖液；加水補足終體積10微升；和室溫溫孵1小時。
然后用Clonetech方法將該新載體插入從Clonetech Laboratories，Inc.，4030 Fabian Way，Palo Alto，CA 94303獲得的E.coli XL1 MRF′中以便進入超感受態細胞。
通過青霉素抗性在LB肉湯中篩選轉化子，10克/升細菌蛋白胨，5克/升酵母膏，和5克/升氯化鈉，用50微克/微升青霉素。通過首先查看適當大小的質粒(約4.3Kb)檢查克隆中的適當插入片段。還用生物素標記的探針和雜交檢測檢查插入片段。對轉化中的5個最好的插入檢測了被插入的蛋白的表達，因為在這種方式時蛋白質應在pUC18中表達。
用上述PCR技術容易生成該2Kb的插入片段。這個技術產生的結果比下面三個方法都好通過基于肽序列分析的探針篩選絲的鳥槍克隆庫(Xu等)；來自絲分泌腺的cDNA插入片段(Hinman和Lewis)；和使用Taq聚合酶或其他非校讀聚合酶的PCR(Beckwith和Arcidiacono)。
與上述三個方法比較，實施例2的PCR技術快速，不向序列引入其他報道的方法明顯引入的錯誤。并且只直接對目的基因。本技術僅用蛛絲的氨基末端或羧基末端的少量序列就能對除主要ampulate(拖絲)絲以外的絲或有類似性質的其他蜘蛛絲進行測序。
為確定是否蛋白質正在E.coli宿主中表達，開展抗體檢測以便確定蛛絲蛋白。下面討論這些抗體檢測。此外，SDS膠表明2Kb的插入片段正在以高產率產生94kDa蛋白。按照Mellow等，Silk Polymerw，ACS，Symposium Ser.544(1994)的方法進行凝膠電泳。用LB肉湯，從該細菌生產的總蛋白質產率范圍在0.1-10％。用Bio-Rad Laboratories，3300Regatta Blvd.，Richmond，CA94804，的BioRad試劑盒#170-6460進行的Western印記也證實該蛋白質是絲蛋白，并且它是抗體反應所顯示的唯一蛋白質。
按照正常條件用Promega銀序列分析儀，貨號Q4130Promega公司，2800Woods Hollow Rdlk Madison，WI 53711-5399，對此2Kb插入片段以及本發明者開發的其他插入片段測序。用多引物，缺失克隆和基于實施例1的其他克隆進行此實驗。圖1中給出的DNA和蛋白質序列對該序列作了表征。
來自cDNA的克隆許多研究者試圖克隆Nephila clavipes蛛絲卻少有成功因為克隆到小片段時。從dDNA克隆所牽涉的問題包括不能得到全長的mRNA，蛋白質的反轉錄和可靠性都不好。另一主要問題是從絲分泌腺不能得到滿意量的mRNA。本發明的cDNA技術(于下面描述)解決了這些難題。
實施例3A.全長mRNA的開發在本克隆技術成功之前，必須解決獲得全長mRNA問題。由于在蜘蛛的絲分泌腺中mRNA拷貝數十分低，就決定用蠶絲Bombyx mori以開發出從蜘蛛絲分泌腺取得全長mRNA的類似方法。在嘗試了數個分離mRNA方法之后發現PerSeptive Diagnostics(Cambridge，MA)的mRNA純化試劑盒能始終如一的分離到全長mRNA而沒有任何可見的降解。此mRNA純化技術用生物磁珠分離法和寡(dT)20顆粒分離mRNA。
B.長而精確的PCR技術的開發開發過程的下一步是將mRNA轉變成良好的第一鏈模板，然后可靠的復制DNA。用Invitrogen Cycle mRNA反轉錄儀，3985 B SorrentoValley Blvd.，San Diego，CA 92121的Invitrogen公司的cDNA循環試劑盒L1310-01和PCR擴增系統證明不令人滿意，因為生成的引物只適合于擴增小片段mRNA。此后，發明者決定開發他們自己的技術以獲得一個10Kb的mRNA。此方法的第一個部分是使反轉錄反應最佳化。通過嘗試各種反轉錄酶，包括AMV(Avian Myelobastosis病毒)，反轉錄酶(M5101)和被修飾成除去了核酸酶H活性的(M-MLV(MoloneyMurine Lerkemia病毒)反轉錄酶(M5301)找出了生成第一鏈的優選反轉錄酶。見Tanese & Goff，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.851977(1988)。M5101和M5301均得自Promega公司，2800 WoodsHollow Road，Nadison，WI 53711。按照Promega指導使用的M-MLV是優選的，因為它給出最高的可靠性和最長的產物長度。因此推薦使用M-MLV和下列反轉錄酶實驗方案2微升10X反轉錄酶緩沖液；2微升M-MLV反轉錄酶(Promega)；2微升二巰基蘇糖醇；1微升多聚d(T)20；和13微升mRNA。
生成第一鏈后，有必要擴增該mRNA片段(在用酚抽提和乙醇沉淀后)。由于mRNA有多聚A末端，使用多聚T的引物。在另一端，需要標記序列并存在幾種可能性。若將一個標記盒放在一個加工過的末端，該技術對低數目的第一鏈DNA有低的連接幾率。由于mRNA的多A末端接近編碼該蛋白質的羧基端，標記一個末端的方法是現成的。因此，采用僅標記一個末端的方法并使用末端轉移酶。優選的方法是使用末端轉移酶加多A到第一鏈的3’端。這通過單引物法從mRNA的cDNA兩端擴增來完成。該方法如下10微升末端轉移酶緩沖液(Promega配方)；1微升末端轉移酶(Promega)；5微升上述反轉錄方法得到的第一鏈DNA；1微升寡d(T)612；1微升d(A)；和7微升水；并在37℃溫孵1小時。末端轉移酶緩沖液和末端轉移酶均得自Promega公司，2800 WoodsHollow Rd.，Madison，WI 53711-5399，貨號M1871。
然后再用酚和乙醇沉淀分離DNA，并進行PCR。下面描述的技術產生在一端有多dA而在另一端有dT的DNA鏈。對這樣一個需要用多T做引物的長而精確的cDNA擴增方法在長段DNA上進行PCR的問題通過使用下面Takara LA DNA擴增法得到解決。cDNA的PCR擴增如下1微升來自上述末端轉移酶方法的DNA；10微升10XTakara LA緩沖液；10微升dNTPs(Takara)；1微升多d(T)20引物；1微升TakaraEx Taq LA聚合酶；78微升水；和100微升礦物油。PCR條件如下94℃初始放置1分鐘；擴增循環(40)是94℃30秒鐘；55℃2分鐘；和72℃3分鐘；繼之以2℃后放置。
該擴增開始顯示一條多重mRNA帶。為得到需要的特異引物，首先，只用編碼絲蛋白非重復區的2Kb的引物(ii)擴增由最初擴增物得到的cDNA，該2Kb片段還通過使用第一次PCR得到的cDNA1微升結合了終止密碼子。這樣產生的單鏈cDNA僅有一個末端的多d(A)。此新引物僅擴增絲蛋白的選擇性文庫。這還產生了一條優先擴增絲蛋白cDNA的帶。其次，使用PCR方法，其中與引物(ii)和多d(T)20一起使用1微升上述反應液。完成此反應后，用溴乙錠在瓊脂糖凝膠上形成三條清楚的mRNA帶。這些mRNA帶表明形成于蛛絲基因的三個不同大小的mRNA帶，該三個基因編碼約95kDa，190kDa，和220kDa的蛋白質。在天然蛛絲中，190kDa和220kDa蛋白質被加強，而所有三種蛋白質都被形成。如電泳所證實的，在克隆和天然蜘蛛拖絲絲中都產生同樣的三種蛋白質。這對顯示克隆正確的基因是重要的。這些結果另人信服的表明根據PCR分析在該蛋白質存在三個起始部位，因為它們的最后2Kb片段是同源的。這些片段中最大的有14Kb長。兩個最大的片段隨后被克隆。如上面實施例2中注釋的，通過用Sma I平端限制性切開pUC18并用CIAP處理克隆了最大的一個片段。通過連接它到如上實施例2所示的載體中而平端插入cDNA。用試劑盒號200230，Stratagene Cloning Systems，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，CA 92037將其轉化超感受態E.coli XL1 Blue MRF′。
通過用1％瓊脂糖凝膠檢測插入片段的大小鑒定有插入的陽性轉化子。然后通過使用PCR和多d(T)20引物測定正確插入的陽性插入片段。還通過下面討論的抗體方法測定這些陽性結果。用SDS電泳膠測定大的mRNA的抗體檢測所得的陽性結果并發現產生三個不同的蛋白質，也提供了多起始位點。一個蛋白質稍微大于2Kb片段而其他兩個蛋白質稍微短于天然蛛絲拖絲蛋白質。然而，用Western染色法給這些高分子量染色是困難的，而這對天然蛋白質來說也是一樣。
雖然未試圖插入起始密碼子或肯定閱讀框是正確的，這些克隆產生了大量的蛋白質。事實上，某些克隆產生太多的蛋白質以至妨礙了生長。就發明者所知，一個培養物顯示出這樣多的目標蛋白質的合成還是首次。正如下面發酵一節所進一步解釋的，令人驚奇的發現是培養條件，如低溫，幫助提高了蛋白質的生產。已發現那些蛋白質干擾用于測序的質粒DNA的分離，從而當DNA編碼細菌中的蛋白質時，難于得到適當的序列。然而，這些蛋白質中的每一個的序列的最后部分是相同的(除在氨基末端的少數不同之外，而這部分在某些克隆是缺失的)。這些克隆在羧基端具有相同的序列(至少1900個的堿基)因為它們閱讀同樣的DNA編碼區。
從單位點引物系統克隆如前面所述，引物(ii)是獨有的，因為它編碼大的ampulate(拖絲)絲蛋白的羧基端。然而，有必要開發一種方法，該方法將進一步伸入氨基方向并有助于延伸出整個序列。已開發出兩個此類方法。一個是用鳥槍法制造DNA克隆，這在下面討論。不大可能認為有人能將完整的基因克隆到一個插入片段中并用這個方法制造蛋白質。由于發明者知道所述羧基端對其他所關注的蛛絲是唯一的，他們認為可以開發出一個PCR方法，它必須以一個已知的唯一位點為起始點。這個技術，即第二個方法，將連接盒與DNA末端相牽連，盡管使用末端轉移酶同樣是有效的。
實施例4為便利在DNA末端做唯一的標記，從而可開發結合于該位點的PCR引物，Takara試劑盒的一些序列盒被開發出來。下面公開的序列盒系統被使用。
序列盒1.Sau3A盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAG-5’序列盒2.EcoR I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCTTAA-5’序列盒3.Hind III盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTTCGA-5’序列盒4.Pst I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCA-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTG-5’序列盒5.Sal I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCAGCT-5’序列盒6.Sba I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAT-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAGATC-5’引物C15’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3’引物C2
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’引物(ii)5’-GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’見Isegawa等，Mol & CeH.Probes 6467(1992)為進行此鑒定，有必要在上述限制性位點之一消化高分子量蜘蛛基因組DNA。限制性消化方法如下2微升的1微克/微升基因組DNA；20單位的適當限制酶(根據六個上述限制性盒之一或所提供的其他盒，同樣的限制性盒與限制酶一起使用)；5微升的10X限制酶緩沖液；蒸餾水到總體積50微升；并在37℃溫孵3小時。
然后清洗該限制性消化物并通過乙醇沉淀再濃縮和重新溶解于無菌水。然后將序列盒連接到各自的DNA消化物。連接反應方法如下5微升基因組DNA消化物；2.5微升一種適當的序列盒(如上述的1-6)(20毫微克/微升)；7.5微升Takara連接溶液；并室溫溫孵30分鐘。
然后清洗該連接反應混合物并用乙醇沉淀再濃縮和重新溶解于5微升無菌水中。因為Takara試劑盒的Taq沒有校讀活性或高可靠性，使用Takara LA PCR試劑盒的試劑和聚合酶并產生十分精確的轉錄。使用的實驗方案描述如下第一個PCR擴增混合液有2微升DNA溶液；1微升序列盒7(引物C1)；1微升序列盒9(引物(ii))；10微升10X LA Ex Taq聚合酶緩沖液；1微升Ex Taq LA聚合酶；10微升dNTPs(每種2.5mM)；和水到總體積100微升。PCR反應條件如下94℃開始放置1分鐘；擴增(30循環)94℃30秒鐘；55℃2分鐘；和72℃1-3分鐘；2℃后放置。
在第一次PCR擴增后，在同樣條件下進行第二次PCR擴增，不同的是基因組DNA溶液用1微升第一PCR的產物替換并且序列盒7(引物C1)被用序列盒8(引物C2)替換。
第二PCR產物的瓊脂糖凝膠顯示序列盒系統中的三個帶Pst I，Hind III和EcoR I。這些是長度大于40Kb和某些是大于100Kb的淺帶。若凝膠中出現明顯的顯帶，則被推斷是由于極端長的PCR產物，盡管發明者沒能發現任何這樣長的PCR的報道。然后從凝膠切下這些PCR產物的每一個并通過Gene Clean再純化。這些產物都是平端片段并直接克隆到pUC18的Sma I平末端限制位點和轉化進入E.coli XL1 BlueMRF′。若在插入時全部這些插入片段有某種程度的缺失，它們仍產生超過20Kb的質粒克隆(一般約23Kb)，這對插入完整的拖絲蛛絲基因是足夠長的。如下面討論的，由于高濃度的絲產生而導致的生化問題，E.coli轉化子在肉湯培養中生長的不太好。
像前面討論的cDNA轉化子那樣，這些轉化子生長的不太好并看上去形成像絲樣的絨團。為此，本發明者們開始確定是否產生了蜘蛛絲。下述的抗體和凝集實驗顯示產生了大量的絲蛋白。SDS凝膠電泳檢測了三種蛋白質的存在(推測是來自于上述實施例3所描述的cDNA的作用)并且最大的兩個片段在整個長度上與天然蛛絲相配。Western印記也顯示用cDNA所得到的同樣結果，即，較小的絲片段染色很好。由于沉淀和其他問題，十分大的蛋白質在Western雜交中沒有像天然絲那樣顯示陽性。實施例3反應像本實施例。然而在兩種情況下和用天然蛛絲時較大蛋白質染色是陰性的。
在這些克隆中有許多生長還存在一些值得注意的問題--類似于用cDNA克隆所觀察到的但產量高得驚人。其中的一些克隆在37℃在像LB肉湯類的肉湯培養中生長不好。有趣的是，據發明者推測隨該克隆帶來了啟動子并助長了生產速率。避免與質粒DNA相結合的全長絲之測序問題(它引起在在瓊脂糖凝膠上形成帶)的一個方法是亞克隆進入產生非蛋白質或小分子量蛋白質的次級克隆中。這個問題比上面描述的cDNA克隆所觀察到的問題或下述聚合物所觀察到的問題更嚴重。這些克隆像cDNA克隆產生大量的蛋白質并可被用于大規模生產。該DNA序列的最后2Kb已經被確定以與使該序列成為完整的2Kb插入片段相配。
從基因組絲DNA進行鳥槍克隆雖然已知此具體方法用于克隆蠶絲DNA，本發明發現此技術還適合蛛絲DNA分離。然而預期將不得不通過雜交探針篩選達50,000個克隆以發現適當的含完整基因的克隆。與上面討論的其他克隆方法不同，不期望這些克隆(或僅少量克隆)中的任何克隆將不經廣泛剪接而產生蛋白質。因此，本發明者開始改進這個技術。本發明者研制的改進涉及使用生物素標記的探針，如那些用于進行克隆的，附著在玻璃珠上的生物素探針。已發現這個技術將在克隆前富集至少含部分絲基因的序列。該生物素探針篩選含雜交到該探針的專一區域的DNA序列。因此，DNA片段可能不含完整的基因。然而，這個技術被用于得到蛛絲基因并用做生成蛋白質表達克隆的起點。與實施例1-4中描述的克隆技術比較，這些鳥槍法是初步的方法但仍是克隆Nephila和其他蛛絲蛋白質的適合方法。
實施例5借助于生物素探針用雜交探針篩選克隆是已知的。例如，Sigma試劑盒(Cool-1)(Sigma化學公司，14508信箱，Louis街，MO63178-9916)提供按照BioRad方法雜交的Sigma硝酸纖維素膜上克隆的斑點雜交之最終顯影試劑。這些方法有許多種并且大多數熟悉分子生物學的人員已經實踐了這類技術。
濃縮雜交到生物素標記探針的DNA片段的技術未被人們所熟知。在此系統中，DNAL(Lake Success，NY)M-280玻璃珠被用于用下面方法預富集基因組DNA。首先，生物素探針與Dynabeads M-280Streptavidin混合于離心管中。100微升的珠和100微升的生物素探針(1微克/微升)混在一起并使之在室溫結合10分鐘。此珠被裝載于有管磁鐵的離心管中并將液體輕輕倒出。然后用含0.1摩爾氯化鈉的TE緩沖液洗3次。將在95℃2分鐘預變性的基因組DNA100微升加入到此珠。在42℃讓珠與DNA雜交2小時，使用等量的結合溶液，該溶液是2X并含10毫摩爾tris HCI(pH7.5)，1毫摩爾EDTA和2摩爾氯化鈉。然后將溫度降低到室溫并在雜交液中洗珠3次。然后將富集的DNA用含0.1摩爾氯化鈉的0.15摩爾的氫氧化鈉洗脫。將此DNA濃縮到5微升水中并通過插入到pUC18載體的Sma I位點使之克隆。仍用結合到蛛絲序列的各種生物素標記探針篩選正確的片段。對陽性克隆測序。此技術是非常有效的但在篩選上需要做較多工作。由于可富集DNA以致篩選僅需要不到500個克隆。然而若沒有富集，則必須篩選200,000到2千萬個克隆以得到一個含絲基因的克隆。
聚合方法使用實施例1和實施例2中描述的雙引物克隆技術和基于Nephila型序列的20多種不同引物，那些2Kb的插入片段是克隆的最大蛛絲片段。由此，推論制造較大片段需要不同的技術。考慮到由于根據蛋白質測序的現有信息未產生較大的片段，需要這種技術從向氨基端編碼的部分蛋白質獲得另外的序列信息。雖然2Kb片段含蓋全長的40％，聚合方法對增加長度特征被認為是必要的--因為長度通常隨絲聚合物的大小而變化。因此，發明者希望聚合2Kb插入片段以制造比天然基因大的蛋白質。
本發明的發明者推斷PCR將形成聚合這些插入片段的適當方法，因為它避免所報道的序列的重復。本發明的聚合方法在下面實施例中給出。
具有各種有用限制位點的PCR片段構造由修飾現有開始和終止引物的懸垂端來完成。其他開始和終止引物如上述的引物(i)和(ii)有不同的限制位點，除缺失了終止框架密碼子因此蛋白質將繼續被翻譯進入貫穿所述位點的mRNA外，還使較長的構建物被制造出來。開始時，起始密碼子被留下來從而存在多個蛋白質幫助檢查缺失和增加轉錄。生成有獨特限制位點的不同2Kb插入片段所用的引物在下面給出。這些引物被稱為(xxi)-(xxvi)。
有BamH I位點的引物(xxi)5’-GGCGGATCCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’有Hind III位點的引物(xxii)5’-GGCAAGCTTGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’有Sal I位點的引物(xxiii)5’-GGCGTCGACGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’有BamH I位點但無終止密碼子的引物(xxiv)5’-GGCGGSTCCACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’有Hind III位點但無終止密碼子的引物(xxv)5’-GGCAAGCTTACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’有Sal I位點但無終止密碼子的引物(xxvi)5’-GGCGTCGACACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’實施例6(4Kb構建物)
用pUC18的2Kb插入片段通過引物(i)和(xxv)的PCR生成本實施例的4Kb構建物。引物(ii)和(xxii)被用于獨立進行的反應，該反應與上述實施例2相關，不同的是用起始2Kb的質粒代替基因組DNA。用LA(長而精確)PCR技術，被發現的DNA片段是有新的限制位點的2Kb片段和代表完整質粒的兩條帶。
然后按照公司的指導手冊通過1％瓊脂糖凝膠(70伏在8厘米膠上電泳90分鐘)--Gene Capsules(Geno Technology，Inc.St.Louis，MO63108)分離這些帶。用EcoR I和Hind III雙限制性酶切這些帶并用EcoR I切2微克的載體和用如上述實施例2中的CIAP處理。然后通過酚抽提和乙醇沉淀再純化兩個2Kb片段的每個片段和載體并溶解進入10微升的TE緩沖液。Sambrook等描述了TE緩沖液。每5微升一份被加入到連接反應液中(如上述實施例2中的連接反應中)并連接在一起。用Invitrogen電穿孔儀，貨號S1670-01(購自Invitrogen公司，3985 BSorrento Valley Vlvd，San Diego，CA 92121)，提供的常規細菌方法將它們電穿孔到E.coli XL1 Blue MRF′細胞(試劑盒號200230)，E.coli TOPP細胞(試劑盒號200241)和E.coli Sure細胞(試劑盒號200238)中。E.coli細胞得自Stratagene Coning Systems，11011North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92137。由于較少轉化子有缺失，Sure細胞產生較好的結果。成功的轉化子產生94和188kDa的蛋白質，其中的后者類似于在有關天然蛛絲的文獻中報道的190kDa蛋白質。
實施例7(6Kb聚合構建物)用上述實施例2的方法通過3個片段的PCR生成本實施例中的6Kb構建物這個方法包括用三個2Kb構建物和下面的引物組組1引物(i)和(xxiv)；組2引物(xxi)和(xxv)；和組3引物(xxii)和(ii)。
它們以實施例6的4Kb聚合構建物中描述的同樣方式被構建進入pUC18。然而發現在某些使用Sure細胞的情況，缺失沒有產生比天然絲大的蛋白質，在許多情況中如用引物(i)和引物(ii)和轉化子DNA的PCR產物瓊脂糖凝膠所判斷的，有些缺失沒有發生。Sure細胞是優選的，因為它們是重組缺陷型。正如所期望的，在DNA大到一定大小以上時，它變得不穩定并缺失了重復片段。
實施例8(8Kb聚合構建物)
本實施例的8Kb構建物恰如上面實施例的6Kb構建物被生成，不同的是4個2Kb片段從下面4組引物被生成組1引物(i)和(xxiv)；組2引物(xxi)和(xxv)；組3引物(xxii)和(xxvi)；和組4引物(xxiii)和(ii)。
它們被插入的方式與實施例6和7的其他插入片段是相同的。即使在幾乎所有情況都發生了缺失，比天然絲大的蛋白質被產生說明該聚合方法可被用于制造性質優良的合成絲。用這個技術和全長DNA，該序列可被改變以產生天然絲DNA的聚合物單位，該聚合物是有比正常高得多的分子量的終產物。其中的一些克隆產生大小上類似于或大于全長天然絲的蛋白質。
從其他技術如cDNA法和上述單一位點系統得到的克隆還可被剪接在一起以制造其他聚合物。用全長克隆或從其剪接的片段經過本發明的聚合技術使達800kDa的克隆成為可能。
載體與生產系統對于蛛絲蛋白質的克隆，E.coli和pUC18是優選的起始生產系統。兩者都有高可靠性的良好穩定的表達并通過它們的細胞膜分泌絲蛋白。雖然唯一的一個表達系統實施例被給出，編碼天然蛋白質或從它們獲得的聚合物可用于任何載體或基因組結合系統方面的應用。因為載體和宿主的可能列表長得不能再長，下面僅給出少數實施例。
細菌系統E.coli表達系統是優選的因為它們有產生很高水平的重組蛋白質和分泌它們到細胞膜外所必要的生物化學機制。它們還易于用簡單發酵生長。此外，該系統的許多蛋白質生產的主要問題已經被解決以至它們屬于最通用的表達系統。pUC18屬于最常用的載體。除pUC為其中之一的通用人造質粒外，基于裂解噬菌體，噬菌體質粒嵌合體，和穿梭載體的其他載體也可作為表達插入的系統。這類質粒的實例包括pBR322，pSP-64，pUR278和pORF1。噬菌體載體的實例包括λ，12001，λgt10，Charon 40，M13mp19和從天然細菌噬菌體修飾的其他噬菌體。
芽孢桿菌(Bacillus)表達系統，包括B.subtilis系統，也可被使用。這些細菌有通過宿主良好分泌的優點，這就導致較少的加工步驟和加工成本。雖然可使用表達盒，用迄今所研究的載體宿主系統發現表達盒不是必須的。一種可起E.coli和Bacillus穿梭載體作用的噬菌體質粒嵌合體是pTZ18R，它可從Pharmacia買到(Piscataway，NJ)。
許多其他細菌系統可被用于表達。
被保藏的克隆一個代表性克隆于1995年7月2日被保藏在American Type CultureCollection(12301 Parklawn Dr. Rockville，Maryland 20852)并給予ATCC號69832。保藏物包括E.coli XL1 MRF′細胞，菌種名稱PA21，含帶有全長蛛絲基因能表達全長Nephila clavipes絲蛋白的pUC18質粒(23Kb)。
酵母和霉菌系統Saccharoomyces cerevisiae，Schizosaccharomcyces pombe，Pichiapastoris，Asperillus sp.，Hansenula sp.，和Streptomyces sp.可被用做表達系統。然而Aspergillus和Pichia系統是例外，很少有證據表明這些系統會產生比細菌更多的蛋白質或經得起驗證的產量增大。然而這些系統對產生USP或食品等級的物質更合需要，因為細菌發酵物有毒素和與其結合的熱原，而這些酵母和霉菌系統中的許多已顯示作為食品級的物質是安全的。
植物轉化系統植物系統可被用于生產轉基因蛋白質如絲。雖然蛋白質的質量可能低于微生物系統中產生的蛋白質質量，植物培養是十分便宜的。可使用Agrobacter型轉染系統，它使遺傳學屬性進入植物基因組。用基因槍插入法，電穿孔法或一些其他插入工具可通過細菌如Agrobactertumafaciens LB4404插入這些系統。一旦被插入，它們可以穩定形式和可遺傳方式結合進植物基因組中。這些植物系統有許多優點，如方便培育和大量收獲。農民有經驗栽培這種產業重要性的植物如煙草，大豆，油菜子和其他野生農作物，它們是對絲生產有意義的主要植物。目前的方法有從煙草和大豆純化高分子量蛋白質。
昆蟲系統可使用Baculovirus表達系統并且該系統在昆蟲細胞系中高水平表達蛋白質是眾所周知的。通過一些載體包括pBacPAK6，pBacPAK8或pBacPAC9完成復制和高效轉染。它們可被用于高水平表達盡管它們可能不如其他系統那樣低成本。
其他動物系統還有許多載體可被用于插入各種動物。雖然它們目前是不具有商業價值的載體宿主系統，但可應用在該蛋白質將來成為有用之物的地方。
發酵方法被轉染宿主的第一次發酵在LB中進行，其中含10克細菌蛋白胨，5克Bacto酵母提取物和5克鹽和蒸餾水到一升終濃度。在此特定的肉湯中觀察到大量產蛛絲細菌的沉淀或絮狀物。此觀察是重要的，因為它表明了蛋白質通過細胞膜被分泌出來。然而這些高分泌率似乎使細胞有些滲漏。因此，增加生理鹽濃度可能穩定培養物。
發明者發現在低溫時，特別是在室溫或室溫以下，蛋白質生產增加。還發現，較高溫時發酵培養基中的蛋白質消失得比在室溫或室溫以下快。這個現象表明在約37℃的較高溫誘導出蛋白酶。值得注意的是，像許多蛋白酶如溶菌酶或蛋白酶K那樣，該蛋白酶似乎不降解蛛絲蛋白質。這些不需要的代謝作用在低溫時最小。這可能是由于在低溫時誘導出休克蛋白質。
還發現發酵培養基的成分影響蛋白酶活性。例如，兩天培養物的尿素SDS凝膠沒有顯示出在LB培養基中生長時的蛋白質降解，但當培養物在補充了葡萄糖(10克葡萄糖，10克蛋白胨和5克酵母膏并蒸餾水到一升)的LB培養基上生長時，24小時后有大量的蛋白質降解。經補充的LB培養基和LB肉湯的唯一不同是LB肉湯含10克/升的氯化鈉，而經補充的培養基含等量的葡萄糖。
由于這個蛋白酶的問題的發現，對蛋白酶抑制劑做了研究。人們認為若一種便宜的蛋白酶抑制劑能夠被發現并攙入培養基，對發酵物的增加是有益的。被測試的化合物包括氯化鋅，硫酸銅，EDTA二鈉，氯化鈉，硼酸，聚乙二醇(B-二氨基乙酯)，苯甲基磺酰氟，N，N，N′，N′-四乙酸，1，10啡咯啉，1，10啡咯啉鐵復合物，蔗糖，葡萄糖，乳糖，果糖，甘油，胨和酵母膏。所發現的最有效的抑制劑是氯化鈉或氯化鉀的鹽添加物。硼酸也被發現是良好的抑制劑。其他化合物是無效的。事實上，簡單的蔗糖，特別是乳糖和葡萄糖，促進蛋白酶活性。胨和酵母膏不影響蛋白酶活性。用AOAC官方方法969.11，即用于測試啤酒中蛋白水解防凍酶的一種方法，測試這些化合物。為進行此測試，取1毫升培養物進行測試。活性蛋白酶存在時，僅數秒內該溶液變清。蛋白酶陰性的樣品在60℃半小時或20℃過夜后顯出渾濁。此測試被用做快速質量控制工具，篩選各種培養基的產蛋白水解酶能力。
試圖使用各種培養基發酵。業已發現復合培養基表現出色。然而，使用比LB肉湯中所含低10倍的胨和酵母膏達到可接受的蛋白質產量。這種較簡單的并且便宜的培養基產生出可觀的蛋白質。這種培養基含下列成分1.2克磷酸氫二鉀，1.1克磷酸二氫鈉，4.0克氯化鈉，0.45克硫酸鎂，2.0克硫酸銨，0.04克硝酸鈉，0.03克氯化鈣，0.02克硫酸鐵，0.01克硫酸錳，0.01克硼酸，0.0005克鉬酸鈉，0.005克氯化鈷，0.5克甘氨酸，1.0克丙氨酸，1.0克酵母膏，10克甘油，蒸餾水到1升，pH調到7.0。寬范圍的培養基成分被用于本發明的發酵。這些培養基成分的范圍可包括鹽，甘油(或其他碳源)和酵母膏或其他礦物營養成分。若培養基比較便宜，它一般產生低水平的絲蛋白。
其他主要必須的最佳化發酵條件是氧，營養物水平和溫度。30℃時的厭氧條件被發現是優選的。此外，碳源應以相對高的水平被加入以使生長和蛋白質表達最大化。例如，每升使用10克葡萄糖和10克甘油。
抗體測試抗體測試被開發出以確定是否蛛絲蛋白質正在E.coli宿主中表達，用蠶絲和蜘蛛大的ampulate分泌腺絲以三種動物宿主進行抗體測試。
為生成這些抗體，蠶絲蛋白質取自做繭前第五星級的Bombyx mori蛆。通過挑選這類蛆，得到的絲是粘性的并且這類蛆看上去是透明的而可辨認。用無菌技術解剖取出黏液絲。然后將絲直接加入到佐劑中。另外，可抽出來自蜘蛛的大的ampulate分泌腺之蛛絲。然而，有必要溶解該蛛絲。通過將其懸浮在8摩爾的溴化鋰在95℃加熱5分鐘進行溶解。該蛛絲和蠶絲被用于制造絲的抗體。
為生成該抗體，用8摩爾的尿素取代溴化鋰并通過離心最終置于2摩爾的尿素中。一旦該樣品置于尿素中，將兩種絲任何之一與10毫升(1∶10)Freund′s完全佐劑混合。將其腹膜內注射給小鼠，兔或山羊以生成抗體。在第21天到28天，用該絲和Freund′s不完全佐劑增強免疫動物。到第五周，可以每周采血并收集血清中的抗體。該血清被用于血凝實驗或Western雜交。對小鼠，兔和山羊使用這個方法，采血并分離血清。這樣從每種動物中產生抗蠶絲和蛛絲的多克隆抗體。用標準的血凝實驗對這些血清做抗體滴定并發現所有的血清至少有256滴度。
血凝實驗通過包被1％RBCs(Sigma Cat#R-3378)進行血凝實驗。溶解的絲(1毫克)被加入到1毫升的1％RBCs中。在室溫將其渦流混合數次并于冰箱中過夜。次日晨，通過在磷酸緩沖的生理鹽水(pH7.2)中離心洗RBCs三次以除去任何非吸附蛋白質。然后將敏化的RBCs穩定在冰箱中2周或更長時間。
為進行血清血凝實驗，25微升抗血清被連續稀釋(2倍稀釋)并加入25微升的敏化RBCs。對照孔也類似連續稀釋并加入非敏化的(25微升)RBCs。室溫中輕搖微量滴定板10分鐘并將板溫孵在室溫90分鐘，不要攪動。用Rose和Friedman方法(臨床免疫學手冊，第二版，美國微生物學會(1980))評估它們。因為其重復單位的類似性，許多絲有類似的折疊結構。因此，認為由于三級結構的類似性，可能存在一些交叉反應。業已發現蠶絲抗血清與蛛絲蛋白質敏化的RBC′s有交叉反應并發現蛛絲蛋白抗血清與蠶絲蛋白RBC′s有交叉反應。這類交叉反應成為主要工具以至可以對兩組抗體測試一個培養物確證該絲不是由于另外的E.coli蛋白造成的。
我們還發現了另外的篩選方法，它基于用絲抗原包被RBC′s。已發現如果我們超聲洗細胞，分離細胞膜并取其上清夜，我們可通過2倍連續稀釋用它代替血清。在將25微升絲敏化的細胞鋪在RBC′s上時，它們呈現典型的血凝實驗，這可被用于轉化子的第一次篩選。據推論，絲蛋白有粘性末端，它在溶液中會粘連到其他絲蛋白并交聯到RBC′s。本實驗使用同樣機制，依此機制絲蛋白連接并從溶液中沉降出來。我們沒有發現任何其他基于此機制的蛋白質檢測參考資料。因此，我們期望這是一個很特異的絲和絲樣蛋白質的檢測。
為在菌落上進行血凝實驗，用在PBS中離心洗細菌培養物3次并最終到100微升PBS中。用Brason 450超聲儀在冰浴中以1/8英寸管尖，40％功率和20％負載周期對其超聲處理2分鐘。該溶液用于敏化PBC′s。檢測在與上面相同的方法進行不同的是每次對一個不同的細菌分離物。在所有情況下，成功的產生絲蛋白的培養物有至少16的滴度并通常是256滴度。該方法被用于篩選上述質粒瓊脂糖凝膠和雜交所發現的10個最有希望的分離物。在2Kb插入的情況，保留少數最好的分離物供進一步使用。
絲蛋白質的純化本發明還包括純化和精紡絲蛋白的技術。這些步驟對加工該蛋白質成其終產品形式是必要的。該蛋白質可被用做涂層深入到纖維中，或制成一種聚合膜。
從發酵培養基純化絲蛋白可通過兩步工序完成。首先，通過連續離心可除去細菌細胞和沉淀的蛋白質。留在肉湯中的其余物質通過超濾被分離，因為大多數分子量在80,000之上的蛋白質是絲。然后可將得自連續離心的蛋白質絲系列與超濾方法結合。在細胞膜上可發現大批的其余蛋白質。通過用超聲破細胞，所述細胞破碎并且其內的蛋白質被移出。
本發明的一個重要發現是使用超聲溶解蛛絲，使其不用被清洗和完全干燥。然后此再溶解的絲蛋白質溶液可被離心以除去細胞膜。除去細胞膜后，蛋白質既可通過超離心被進一步純化也可精紡。為精紡絲，保持絲在溶液中是重要的。然而，先前的方法使用十分粗糙的化學品保留絲的溶解性用于精紡操作。
各種化合物將保持絲蛋白在精紡加工前不沉淀。這些化合物包括各種鹽，鋰鹽，鈉和鉀的氫氧化物，磷酸脲，鹽酸胍，尿素，和六氟異丙醇--他們全都溶解絲。通過本發明還發現超濾純化后，通過加入乙醇，甲醇，其他醇或類似溶劑可進一步進行純化。這種純化的絲蛋白物質通過超聲或通過加入一種或多種上述鹽化合物可被重新溶解。由絲蛋白溶解中成本和環境因素所決定的優選化合物是鈉和鉀的氫氧化物，氯化鈉，氯化鉀和氯化鋰或結合超聲或蛋白質純化用醇類一起使用的溴化鋰。
類似于其他絲蛋白質，蛛絲蛋白不易溶解。雖然有資料表明蛛絲可溶于粗化合物如甲酸(88％)，本發明者發現它會引起全長蛋白質的降解。然而，本發明者發現絲纖維可被再溶于LiSCN，LiBr，LiCI，尿素，六氟異丙醇，鹽酸胍和類似的變性劑。一旦絲蛋白被溶解，較少的蛋白質變性劑包括尿素可被用于防止蛋白質再沉淀。在不可逆精紡成絲線前最可能推薦的是使用可溶性蛋白質。因此已經被從完全干燥的絲蛋白再溶解的絲蛋白和從發酵過程回收后還從未被完全干燥的絲蛋白被推薦用于精紡加工。
進一步加工絲蛋白成纖維絲的一般加工蠶絲蛋白一般以下面方式被加工。為使絲纖維的強度足以用于紡織，多至5個纖維被絞在一起。第一次繅絲后，絲被重繞成絞在一起的絲束。
然后生絲經過幾道叫做拈絲的工序。絲束被清洗和纏繞在大線軸或筒管上。這些筒管被放在并絲架上，在那里單絲線被并絲和纏在一起以得到需要的絲線大小。然后該絲線被纏繞并用拈絲架的錠子抽出然后拈絲架的絲筒管被放在水中并且絲在滾筒之間被伸展開。在拈絲架上的伸長程度影響纖維的直徑。在伸展架上，絲線被制作得光潔而平滑。在最終被織成布料前，拈絲的絲線被煮沸以除去任何殘余水溶性蛋白或其他粘性物質。因為煮沸步驟降低絲的重量，絲被沾入鐵或錫的鹽中以重獲得失去的重量。在此沾入步驟中，絲纖維吸收一些這類鹽而加重但不失其光澤。
蛛絲蛋白的專門加工上述方法產生的蛛絲蛋白質以蠶絲蛋白質相同的方式可被加工成纖維。這需要精紡或擠壓蛋白質或蛋白溶液以得到直徑范圍可在5微米到200微米或以上的絲線。在該加工的第一步是從發酵液濃縮絲蛋白。濃縮步驟可通過數種方法來完成，方法包括使用只容許給定分子量范圍的物質通過的膜技術。用這些膜的一個缺點是成本。其他更具成本效益的濃縮絲蛋白質和除去宿主載體的方法包括連續離心或分批離心。此外，然后可用超聲能量裂解細菌細胞壁并使細胞壁內產生的絲蛋白質挽出到液體培養基。為使絲蛋白質與細菌細胞壁分開，高濃度鹽是有幫助的。
這時，蛋白質溶液通過各種醇可被沉淀出培養基。有用的醇包括甲醇，異丙醇和乙醇。以前的技術達到在加工中的這一步絲蛋白可被溶解于鋰鹽和含氟的有機溶劑。然而，這個方法是昂貴的并且有嚴重的環境問題。在本發明的一個更優選的實施方案中，用醇類或濾器濃縮蛛絲蛋白質然后通過使用氯化鈉水溶液結合超聲使其在溶液中保持粘性直到它們被擠壓成絲。如有必要，可加入尿素，鈉或鉀的氫氧化物或鋰鹽如前述技術加工中公開的那樣。然而，因為氯化鈉和超聲，可能僅需要使用很低濃度的這些物質。應注意的是，在純化時使用過高的超聲能量，延長的超聲或高克分子濃度的鋰鹽可降低絲蛋白質的分子量。
一旦用小直徑管或其他產生小直徑纖維的方法擠壓該蛋白，該蛋白可以類似于蠶絲的方式被加工。一旦該蛋白被暴露于空氣和被干燥，它就不再溶于氯化鈉或被超聲處理。
然后可用類似于對蠶絲所使用的設備對該絲蛋白預伸展或拈絲。類似于對蠶絲所使用的，也可用煮沸方法。煮沸失去的大多數重量不是如蠶絲纖維加工時的水溶性蛋白質，而是殘留鹽份和發酵培養基的水溶性營養成分。若在此加工步驟期間失去的20-25％的重量通常是來自生蠶絲的話，則預期當經受煮沸水以清潔最終的絲或以準備其用于染色時失去的不到5％的重量是來自于本發明的蛛絲。
通過使用本發明的方法，絲蛋白的天然顏色可通過篩選編碼進一步進入基因組DNA的引物而得到。本發明克隆和方法中產生的蛛絲蛋白質所觀察到的有白色，黃色，粉紅色和淺紫色。天然顏色的選擇對編排紡織纖維的生產是有價值的，因為在許多情況下它將減小顏色印染的需要和相關的成本。
通過卷或纏繞兩股或兩股以上的線在一起制造較大的紗線蛛絲蛋白長絲可被以蠶絲類似的方式處理。此外，這些紗線可與碳或石墨纖維，硼或硼鍍石墨纖維，或Kevlar混紡以制造驚人高強度紡織材料用于防彈服或其他應用中。相反，通過使用較小的紗線(包含三到五股纖維并且只含純蛛絲)可生產有非常平滑感覺和光澤的纖維。該最終紡織品的彈性和其他性質可部分的通過擠壓和精紡加工后對長絲或纖維的加工來控制。在蠶絲業的拈絲加工標準方面，與蠶絲加工不同的加工參數的主要改變是當它們被從初始蛋白質溶液抽絲或擠壓出絲或以后的加工時，單股長絲的前延伸或伸展的程度。
除上述之外，蛛絲蛋白長絲的高強度性質容許其他加工改變。一種此類加工變量是絲線的在線涂布，用各種物質引入顏色，增加的強度，光澤，虹彩和增加纖維在外觀，感覺或強度上市場化性能的其他質量。在線涂布可通過數種方法包括在擠壓，纏繞或拈絲步驟中使蛛絲長絲通過各種浴池或槽來完成。在線蒸汽淀積也可被使用。在線蒸汽淀積物質到絲蛋白上時必須考慮到一些殘留的鹽份或其他發酵化合物可能在長絲開始被形成時出現，這些長絲在形成后易于保持濕度除非用烘箱，風扇或其他辦法干燥。在某些情況下，推薦使用擠壓后煮沸以除去全部痕量發酵培養基和再增溶化學物質--兩者在織入纖維時均可引起皮膚的過敏反應。可蒸汽淀積在蛛絲蛋白質上的物質包括錫和鈦的氧化物。這些氧化物在長絲上形成一層，其厚度取決于烘箱的條件。雖然鈦層可產生較高強度的纖維，一些人對二氧化鈦層有過敏反應并且這可能限制其用途在服裝以外的應用中。然而氧化錫對人的皮膚接觸是GRAS(普遍推薦為安全的)并因此可被用于服裝應用方面。
蛛絲蛋白質的膜可通過包括澆鑄的幾種方法來生產，其中絲蛋白溶液被澆在或灑在板片上或通過使用滾筒。膜在澆鑄或滾壓前還可通過加入化合物到蛋白質中而被修飾。這包括活性分子的摻入，這些活性分子可起香料，調料，吸收劑或對各種生物試劑或武器的反應劑作用。膜可具有在加工中添加的顏色或者來自絲克隆蛋白質的天然顏色可被選擇以引入一種天然色。
權利要求
1.產生編碼絲蛋白的DNA片段的一種方法，包括步驟選擇從產絲蜘蛛收獲的靶DNA，所述靶DNA包括多個重復和非重復區；選擇至少10個核苷酸的單鏈DNA引物，該引物含與所述靶DNA中一個區域互補的DNA序列；和重復結合DNA引物與變性DNA，并將所述結合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和有校讀活性的DNA聚合酶一起溫孵以產生所述DNA片段，其中所述DNA片段與所述靶DNA互補并至少是2Kb。
2.權利要求1的方法，包括使用兩個不同的DNA引物的步驟。
3.權利要求1或2的方法，其中所述靶DNA是通過將編碼蛛絲的全長mRNA反轉錄生成的cDNA；加入一個引物位點到所生成的第一鏈cDNA的氨基末端；和使用該cDNA的多聚dT區作為第一聚合酶引發區。
4. 權利要求1或2的方法，其中第二引物位點通過使用連接盒被創建在DNA的未知末端。
5.權利要求1或2的方法，其中第二引物位點通過使用末端轉移酶被創建在DNA的未知末端以生成一個選自包含多聚dT，多聚dA，多聚dG和多聚dC的引物位點。
6.權利要求1或2的方法，包括選擇Micrathena，Mastophora，Metepeira，Araneus，Argiope，Nephila，或Gasteracantha屬的一種蜘蛛的步驟。
7.權利要求6的方法，包括選擇由序列(i)-(xx)代表的引物DNA(i) GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(ii) GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(iii) GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；(iv) TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；(v) GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；(vi) GAYGAYGGNAAYGCNGT；(vii) TGNTGNCCSGTTCG；(viii) CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；(ix) GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；(x) GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；(xi) TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；(xii) TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；(xiii) TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；(xiv) CCNCGNCCNCTYCC；(xv) GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；(xvi) GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；(xvii) GGWGGACGAGGTGGATTA；(xviii) GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；(xix) CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and(xx) GGNGGNGGNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCCNGGNGCNGGNGGN，其中N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；和R＝A，G。
8.權利要求7的方法，其中所述靶DNA通過被雜交到含序列(i)-(xx)的DNA探針而被篩選，該探針可逆結合到支持物以富集編碼絲DNA片段。
9.權利要求6的方法，其中所述DNA片段是至少5Kb。
10.一個編碼蛛絲蛋白的DNA序列，所述DNA序列包含多個重復和非重復區并有至少2Kb長度。
11.權利要求10的DNA，其中所述DNA序列含至少5Kb長度。
12.權利要求10或11的DNA，其中所述蜘蛛屬于Micrathena，Mastophora，Metepeira，Araneus，Argiope，Nephila或Gasteracantha屬。
13.權利要求11的DNA，其中所述蜘蛛是Nephila clavipes。
14.權利要求12的DNA，其中所述DNA包含圖1說明的序列。
15.一種聚合方法，包括以下步驟篩選編碼從產絲蜘蛛收獲絲蛋白的靶DNA，所述靶DNA包含多個重復和非重復區；選擇第一對不同的DNA引物，所述第一對DNA引物均與所述靶DNA一個區域互補，至少所述第一對DNA引物中之一由序列(i)-(xxvi)代表(i) GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(ii) GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(iii) GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；(iv) TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；(v) GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；(vi) GAYGAYGGNAAYGCNGT；(vii) TGNTGNCCSGTTCG；(viii) CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；(ix) GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；(x) GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；(xi) TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；(xii) TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；(xiii) TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；(xiv) CCNCGNCCNCTYCC；(xv) GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；(xvi) GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；(xvii) GGWGGACGAGGTGGATTA；(xviii) GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；(xix) CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and(xx) GGNGGNGGNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCCNGGNGCNGGNGGN；(xxi) GGCGGATCCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(xxii) GGCAAGCTTGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(xxiii) GGCGTCGACGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(xxiv) GGCGGSTCCACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(xxv) GGCAAGCTTACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；and(xxvi) GGCGTCGACACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC通過重復結合DNA引物與變性DNA并將所述結合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和對有校讀活性的DNA聚合酶一起溫孵以產生第一DNA片段，所述第一DNA片段與所述靶DNA互補并至少是2Kb；所述聚合方法進一步包括選擇第二對不同的DNA引物，在與所述第一對DNA引物的兩個序列相比時至少所述第二對DNA引物之一是不同的，并且至少所述第二對DNA引物中之一由序列(i)-(xx)代表通過重復結合所述第二對DNA引物與變性靶DNA并將所述結合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和有校讀活性的DNA聚合酶一起溫孵而產生第二DNA片段，與所述第一DNA片段相比，所述第二DNA片段是不同的并也與所述靶DNA互補，所述第二DNA片段至少是2Kb；限制性酶切所述第一和第二DNA片段；和重組所述第一和第二DNA的限制性片段進被聚合的DNA，所述被聚合的DNA編碼蛛絲蛋白并是至少4Kb。
16.權利要求15的聚合方法，其中所有DNA引物由序列(i)-(xxvi)代表。
17.權利要求16的聚合方法其中所有的DNA引物是不同的。
18.權利要求15-17的聚合方法，其中所述聚合的DNA是至少6Kb。
19.權利要求18的聚合方法，其中所述聚合的DNA是至少8Kb。
20.一種生產絲蛋白的方法，包括步驟篩選權利要求12的DNA，插入所述DNA到一個表達載體中；用所述表達載體轉染宿主細胞；在培養基中發酵所述的被轉染細胞以生產絲蛋白；和回收所述絲蛋白。
21.權利要求20的方法，其中所述培養基含蛋白酶抑制劑。
22.權利要求21的生產絲蛋白的方法，進一步包括步驟應用超聲能量破碎宿主細胞；應用超聲能量重懸浮絲蛋白；和離心所述被破碎的細胞以將細胞膜與所述絲蛋白分開。
23.權利要求22的生產絲蛋白的方法，進一步包括通過超濾或乙醇沉淀純化絲蛋白的步驟。
24.精紡絲蛋白的方法，它包括濃縮權利要求23的被純化的絲蛋白；抽絲被濃縮的絲蛋白纖維；精紡絲纖維以生產絲線；和清洗絲線以除去任何增溶劑的步驟。
25.權利要求24的精紡絲方法，其中增溶劑選自氫氧化鈉，氫氧化鉀，六氟異丙醇，鹽酸胍，尿素，尿素磷酸酯，鋰鹽，有機溶劑，硫酸銨，醋酸，磷酸，二氯乙酸，甲酸和硫酸。
26.權利要求24的精紡方法，進一步包括用錫或鈦涂層所述絲纖維或絲線。
27.一種包含權利要求24所制造的絲線的纖維。
28.權利要求27的纖維，進一步含蠶絲，Kevlar，石墨或碳纖維。
全文摘要
本發明涉及產生編碼來自產絲蜘蛛的絲蛋白質之DNA片段的方法。本發明還涉及編碼該蛛絲蛋白質的DNA序列。本發明還進一步涉及用上述DNA序列產生蛛絲蛋白質的方法。克隆和生產本發明蛋白質的方法可適用于全部產絲蜘蛛。通過這些方法生成的克隆生產商業用量的高分子量絲蛋白質。由于從這類蛋白制造的絲有優越的強度特性,本發明克隆的絲蛋白質具有可觀的產業價值。
文檔編號C12N15/12GK1200145SQ96197771
公開日1998年11月25日 申請日期1996年8月22日 優先權日1995年8月22日
發明者R·M·巴瑟爾, G·R·艾利安 申請人:阿格里科拉技術有限公司