專利名稱：：用于藥物傳遞的胞轉載體和增強劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及藥物傳遞。具體地說，本發明涉及能夠傳遞并促使藥物通過含GP60受體的內皮、上皮和間皮的胞轉載體和增強劑。
背景技術：
：對于大部分通過動脈內或靜脈內施用的治療藥物來說，分子活性的預定位點均在脈管外。對于經氣道施用的藥物來說，活性的預定位點通常在肺泡、細支氣管或氣管上皮第一細胞屏障外。在這兩種情況下，都存在藥物介導其作用前所必須跨越的內皮或上皮屏障。對于小的親脂藥物，在屏障細胞的緊密接合處似乎有副細胞(paracellular)途徑。但對于親水藥物和較大的大分子活性藥物如肽、蛋白質、基因或反義核苷酸來說，跨越屏障的唯一途徑是通過細胞。這就給靜脈內施用因迅速降解或肝的第一次通過清除而具有很短半衰期的藥物帶來很特別的問題。為了保持與所述排泄和降解作用平衡的治療水平，經常需要大劑量或輸注。因此，本領域顯然需要能夠更迅速的使藥物跨過細胞屏障的傳遞機制。已經有許多有關介導胞吞過程的特異性受體，在所述胞吞過程中，通過相似的胞飲作用，配體與所述受體結合，然后內部化，并與所述受體復合。這涉及在配體受體復合物區內細胞膜的內陷，然后通過尚未完全了解的過程將配體釋放到細胞中。已經報道了許多胞吞受體系統，包括LDL、胰島素、表皮生長因子、胰島素樣生長因子和tPA-PAI-I(雜種分子)。胞吞作用必須伴有在配體受體復合物周圍的內吞和小泡形成，然后通過在basolateral膜的逆胞吞過程釋放胞吞物。已將轉鐵蛋白受體的單克隆抗體與毒素結合，以便它們可通過胞吞作用跨過血-腦內皮。但本領域仍需要能夠通過受體介導的胞吞作用傳遞或促進藥物通過除血-腦內皮以外的細胞屏障的試劑，所述細胞屏障如脈管系統的內皮、肺泡上皮和腹膜間皮。GP60受體(也稱為albondin)是義獻中報道數種白蛋白結合蛋白質中的一種(SchnitzerandOh，J.Biol.Chem.269(8)6072-6082(1994))。其它的包括SPARC(血清蛋白，酸性，半胱氨酸豐富)，oesteonectin或基膜蛋白40、GP30、GP18和GP60。SPARC和oesteonectin是細胞外蛋白質。如用抗-SPARC抗體確定的，GP60與SPARC有一定的同源性(SchnitzerandOh，Am.J.Physiol.263H1872-1879(1992))。GP18和GP30是在各種細胞中發現的膜糖蛋白，而且在巨噬細胞中特別普遍(Schnitzer等，J.Biol.Chem.26724544-24553(1992))。GP18和GP30是所謂“清除劑受體”，它們通過內吞作用介導除去白蛋白的氧化、糖化或加合形式，并因此認為其在各種器官的白蛋白分解代謝中起作用(SchnitzerandBravo，J.Biol.Chem.268(10)7562-7570(1993))。與GP18和GP30相反，已發現GP60受體只在脈管系統的連續內皮(Schnitzer，Am.J.Physiol.263H246-H254(1992))、肺泡上皮(Kim等，Am.J.Resp.andCrit.CareMed.151；A190(1994))以及推理上在腹膜間皮(GotloibandShostak，KidneyInternational.471274-1284(1995))中排外地表達。GP60在微泡內皮中特別豐富，但令人感興趣的是，在幾乎觀察不到白蛋白流的的血液-腦屏障中則沒有GP60(Rousseaux等，MethodsinEnzymology121163(1986))。已表明內皮GP60的多克隆抗體也與肺泡上皮GP60結合(Kim等，同上文)。GP60受體還涉及受體介導的白蛋白跨上皮和內皮細胞屏障的胞吞作用(Kim等，同上義；Tirrupathi等，細胞分子生物學4(Supp)338aAbstractNo.1964(1993))。GP60的氨基酸序列是本領域已知的(Yamauchi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1461485(1987))。發明概述本發明提供了能夠運輸生理學活性劑跨過含GP60受體的上皮、內皮和間皮的胞吞載體和增強劑。GP60受體還參與受體介導的白蛋白跨細胞屏障胞吞作用。利用本發明，可研究GP60受體介導的胞吞作用以用于不僅運輸白蛋白，而且運輸天然不能經GP60系統跨過上皮、內皮和間皮的生理學活性劑。本發明的胞吞載體和增強劑包括白蛋白、白蛋白片段、抗GP60多克隆和單克隆抗體、抗-GP60多克隆和單克隆抗體片段和GP60肽片段。此外，還包括PDI(蛋白質二硫化物異構酶)和其片段(下文提到GP60片段也可解釋為之PDI片段)。在PDI和GP60的至少T1-44片段中發現一個共有因子是CGMC基元。如果胞吞載體或增強劑是GP60肽片段，優選可與本發明的其它胞吞載體或增強劑如白蛋白或白蛋白片段一起施用。用溴化氰在甲硫氨酸殘基裂解可產生14、20和32kDa的適宜白蛋白片段，并通過二硫鍵的還原進一步降低大小。根據本發明可作為胞吞載體和增強劑的抗-GP60多克隆和單克隆抗體片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。優選的GP60肽片段包括對應于GP60蛋白質N末端的18個氨基酸的T3118肽。根據本發明，當將上述化合物與生理學活性劑結合時，將其稱為“胞吞載體”。當與生理學活性劑一起施用，但不結合時，將上述化合物稱為“胞吞增強劑”。在優選的實施方案中，本發明的胞吞載體和增強劑用于傳遞或促進生理學活性劑跨過脈管系統的內皮、肺泡上皮和腹膜間皮。本發明詳述正如其名稱所表明的，本領域已報道了分子量為約60kDa的GP60蛋白質。在進行了更仔細的分析后，發現該蛋白質的“真正”分子量可能是約57kDa。認為分子量上的這種差異歸因于蛋白質制備和凝膠條件的不同。但是，與本領域一致，本文(除下文實施例1外)也將該蛋白質稱為GP60受體。已發現可研究GP60受體介導的胞吞作用以用于不僅運輸白蛋白，而且運輸大量天然不能經GP60系統跨過上皮、內皮和間皮的治療上重要的生理學活性劑。因此，本發明提供了一種改進的方法，該方法用于運輸如具有相對大的分子量，如50、100、150kDa或更大的生理學活性劑跨過脈管系統內皮、肺泡、細支氣管和氣管上皮以及腹膜間皮的細胞屏障。能夠傳遞或促進生理學活性劑跨過含GP60的內皮、上皮和間皮的胞吞載體和增強劑包括白蛋白、白蛋白片段、抗-GP60多克隆和單克隆抗體、抗-GP60多克隆和單克隆抗體片段、以及GP60肽片段。如果胞吞載體或增強劑是GP60肽片段，則優選與本發明的其它胞吞載體或增強劑如白蛋白或白蛋白片段一起施用。哺乳動物白蛋白是本領域已知的并很容易得到。優選所用的白蛋白來自與患者相同的哺乳動物種。例如，如果患者是人，則優選用人血清白蛋白作為胞吞載體或增強劑。同樣，如果患者是馬或牛，分別優選使用馬或牛血清白蛋白。生產白蛋白片段的方法是本領域熟知的。例如用溴化氰在甲硫氨酸殘基裂解白蛋白可得到3個特別適宜的14、20和32kDa肽，所述肽可通過還原二硫鍵來進一步降低大小，得到3.3-20kDa的肽。或者可用蛋白酶消化來得到白蛋白肽片段。用作本發明胞吞載體或增強劑的任何特定白蛋白片段可按照下述常規篩選試驗進行確定。如下文實施例中所說明的，現已表明牛和人血清白蛋白均可作為胞吞增強劑，刺激生理學活性劑的攝入比對照多2.5-4倍。可從內皮、上皮或間皮純化的GP60受體產生抗-GP60多克隆和單克隆抗體。如上所討論的，表達GP60受體的內皮、上皮和間皮細胞包括脈管系統的內皮(包括毛細管內皮(Ghinea等，J.CellBiol.107231-239(1988))；動脈內皮(Silflinger-Birnboim等，J.CellularPhysiology149575-584(1991))；主動脈和靜脈內皮(SchnitzerandOh，Am.J.Physiol.(1992)，同上文)；肺泡組織上皮(Kim等，同上文)；和腹膜間皮(GotloibandShostak，同上文)。按照本領域已知的方法(參見例如SchnitzerandOh，J.Biol.Chem.(1994))并按下文實施例1所述，可從上皮、內皮和間皮中純化GP60。按照本領域已知的技術，可在小鼠、兔或山羊中生產抗純化GP60或GP60肽片段(如下文所討論的T3118肽)的多克隆抗體。在下文實施例1中，從制備性SDS-PAGE上洗脫GP60受體以免疫兔。在與等體積的弗氏完全佐劑混合后，每只兔肌肉內注射約50μg蛋白質。第二次注射是在兩星期后。在第二次注射后4到6星期取兔血，檢測免疫反應。然后用ProteinA-Sepharose柱純化抗血清IgG。按照已知技術(Goding，J.Immunol.Methods39285(1980)；OiandHerzenberg，SelectedMethodsinCellularImmunology，p.352，Freeman，SanFrancisco，1979)也可制備單克隆抗體。例如，經腹膜內給Balb/c小鼠注射50-150μgGP60或GP60肽片段。融合前3-5天，陽性小鼠接受抗原的加強(booster)注射(50-150μgGP60或GP60片段)，然后每天注射10μg(靜脈內和腹膜內)直到取出脾。基本上按照St.Groth等，J.ImmunologyMethods351-21(1980)所述的方法，將脾細胞與Sp2/0-Ag14骨髓瘤細胞融合。用未結合的GP60或GP60片段作為抗原，通過ELISA篩選培養上清液。然后按Lutz等，ExperimentalCellResearch175109-124(1988)所述，通過免疫熒光檢測陽性培養物并Western印跡到cDNA-轉染的COS-1細胞上。在軟瓊脂上將分泌特異性抗體的雜交瘤克隆兩次。在無血清培養基SFRI-4中適應各雜交瘤。為了進行腹水生產，將約2×106個細胞注射到pristine-primedBalb/c小鼠中。用Isotyping試劑盒進行型和亞型確定。SFRI培養上清液和腹水均可用作單克隆抗體源。正如所討論的，本發明的抗-GP60多克隆和單克隆抗體以及抗體片段可用作能夠傳遞或促進生理學活性劑跨過含GP60受體的內皮、上皮和間皮的胞吞載體和增強劑。可用作本發明胞吞載體或增強劑的抗-GP60抗體片段包括含有通過木瓜蛋白酶消化產生的單(Fab)抗原結合結構域的片段；或通過有限的胃蛋白酶消化(OlssonandKaplan，MethodsinEnzymology923(1983))而產生的F(ab’)2片段。其它適宜的片段包括Fab’和Fv。用作本發明胞吞載體或增強劑的特定白蛋白片段可按照下述常規篩選試驗進行確定。在下文實施例3中，表明37℃施用抗-GP60多克隆抗體可使攝入的生理學活性劑比免疫前的血清對照攝入增加1.6-2倍。根據本發明，在除人以外的動物如小鼠和大鼠中產生的抗-GP60抗體，由于對外源抗體熟知的不利反應而僅適宜于短期施用(即非慢性藥劑)。但可用本領域描述的方法生產GP60受體的人單克隆抗體，以克服給人施用鼠克隆抗體產生的間題(OlssonandKaplan，同上文)，由此提供于長期或慢性給予的抗體。此外，通過嵌合或CDR移植，可將本發明的鼠抗體“人化”。將鼠抗體的識別區移植到人抗體的適宜區，以避免或限制患者中的有害免疫反應。GP60肽片段還可用作本發明的胞吞載體和增強劑。特別適宜的GP60肽片段包括GP60N-末端的前18個氨基酸；發現該片段與牛的一段區域，膜結合的甲狀腺激素(T3)結合蛋白有至少80％的同源性。按照任何已知的酶促或物理技術，包括蛋白水解降解，可生產所述GP60肽片段。或者，可合成GP60肽片段。如在下文實施例5中所說明的，通過固相合成法可生產對應于前18個殘基的GP60合成N-末端肽(T3118)。作為胞吞作用的激動劑，該肽刺激人白蛋白的攝入比對照多5倍。將本發明胞吞載體與生理學活性劑結合的方法對于本領域專業人員來說是顯而易見的，包括但不限于涉及希夫堿形成的戊二醛結合；蛋白質與羧酸間的碳化二亞胺反應；含胺藥物的酸酐激活，隨后形成碳化二亞胺鍵；用3-(2-吡啶基二硫代)丙酸-N-琥珀酰亞胺基酐激活含伯胺的藥物，然后與蛋白質的半胱氨酸基團相連；用氰尿酰氯將糖醇與蛋白質相連；經雙過氧化作用結合胺和羥基。例如，按照Hurwitz等，CancerRes.351175-1181(1975)描述的方法，通過高碘酸鈉處理可氧化生理活性劑的氨基糖部分并經希夫堿形成直接與本發明胞吞載體上的賴氨酸殘基相連。或者，按照Hurwitz等，Int.J.Cancer21747-755(1978)描述的方法，通過碳化二亞胺介導的活性劑的氨基與載體上的羰基或氨基烷基相連而將生理活性劑與本發明的胞吞載體相連。按照Belles-Isles等，Br.J.Cancer41841-842(1980)描述的方法，通過用戊二醛將活性劑的氨基糖與載體上的氨基交聯，可將生理活性劑與本發明的胞吞載體相連。可通過實驗常規確定用于將生理活性劑與本發明胞吞載體相連的其它適宜結合位點。例如，在與生理活性劑如胰島素結合前或后，可用熒光素或125I標記本發明的胞吞載體。結合并標記后，可用如在下列實施例中描述的篩選試驗來確定任何候選載體/活性結合物的內皮細胞攝入，上皮細胞流或間皮細胞流。所述常規篩選試驗可使本領域專業人員確定，本發明的哪個胞吞載體在特定位點與生理活性劑結合后，仍保持胞吞能力。所述試驗也用于常規篩選候選白蛋白片段、抗-GP60抗體片段和GP60肽片段以確定哪個適用作本發明胞吞載體和增強劑。生理活性劑與本發明胞吞載體的結合特別適用于靜脈內傳遞血清半衰期極短的低分子量藥物，或在血液內很容易被降解或通過肝中的第一次排泄被除去的肽藥。當然，在生理活性劑與本發明胞吞載體之一結合的情況下，結合后必須評估治療劑的殘留活性。檢測治療劑活性的技術是本領域熟知的，而且已成功地結合了許多治療劑并保持了基本的活性。例如，文獻中描述受體配體，或其片段，與藥物的結合物以促進跨血液腦屏障的胞吞作用。Fukta等，Pharm.Research11(12)1681(1994)描述了辣根過氧化物酶(HRP)與胰島素的結合，這樣能夠使HRP跨過血液、腦屏障。研究人員繼續生產胰島素片段，篩選其與培養物中牛腦微管內皮細胞的結合能力。同樣，其它胞吞系統可以傳遞與活性藥物結合的抗體，其中包括靶向轉鐵蛋白受體(Friden等，Proc.Natl.Acad.USA884771(1991))的抗體-氨甲蝶呤，和靶向表皮生長因子受體(Chen等，FEBSLett.338167(1994))的抗體-多賴氨酸。與胞吞載體相反，本發明的胞吞增強劑不與生理活性劑結合。已發現在含GP60受體的上皮、內皮和間皮上，本發明胞吞增強劑之一與生理活性劑的共存就足以增強所述活性劑跨細胞屏障的攝入和通過。理論上不希望結合，本發明的胞吞增強劑顯然“引發”了GP60-介導的胞吞機制，由此增強了共存大分子包括治療劑的攝入。可用本發明的任何胞吞增強劑單獨或結合來誘導或增強生理活性劑通過或跨上皮、內皮和間皮的攝入或通過。例如，下列試驗表明作為胞吞激動劑，GP60肽T3118使人白蛋白的攝入比對照多5倍。在本發明的其它實施方案中，當上述討論的胞吞載體結合物之一與本發明的一種或多種胞吞增強劑一起施用時，就可傳遞活性劑。可將本發明的胞吞載體結合物和胞吞增強劑組合物(包括活性劑)與不會同結合物或組合物發生有害反應的可藥用載體或賦形劑即適用的可藥用有機或無機物質一起施用。適宜的可藥用物質包括但不限于水、鹽溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘石蠟、芳香油、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、petroethral脂肪酸酯，羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。可將藥物制劑滅菌，如果需要與不同結合物有害反應的輔料如乳化劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、改變滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、調味劑和/或芳香物質混合。對于胃腸外給藥，特別適宜的制劑是溶液，優選油或含水溶液，以及懸浮液、乳液或植入物，包括栓劑。安瓿是常用單位劑量。對于經腸給藥，特別適宜的制劑是含有載體粘合劑如滑石和/或碳水化合物的片劑、糖衣丸或膠囊，所述載體優選是乳糖和/或玉米淀粉和/或馬鈴薯淀粉。也可使用其中使用增甜載體的糖漿、酏劑等。可配制緩釋組合物，其中用差異降解的包衣如通過微被膜、多層包衣等保護活性組分。可以按照任何本領域已知的技術包括注射或經肺氣管來施用含一種或多種生理活性劑和一種或多種本發明胞吞載體或增強劑的結合物或共軛物。注射特別適合于脈管系統和腹膜給藥，而肺氣管特別適合于肺泡給藥。適合于肺給藥的適宜制劑包含與生理活性劑混合的一種或多種本發明的胞吞增強劑。或者適合于肺給藥的制劑包含與所述試劑結合的胞吞載體。例如，可以用噴霧裝置如Acorn或DeVilbiss噴氣噴霧器制備制劑，其中在噴霧器的儲藥器中，試劑和胞吞增強劑以及載體作含水溶液而存在。或者，在用于肺給藥的優選實施方案中，從干燥粉末吸入器(DPI)制備制劑。Sutton等在美國專利申請08/487420和WO/9609814中描述了DPI裝置。它們要求將制劑噴霧干燥成適于肺泡透過的2-5μm的微顆粒。具體地說，優選以約20％w/v的濃度將本發明的胞吞增強劑或載體或其混合物用于噴霧干燥。待噴霧的制劑可含有除胞吞增強劑或載體以及溶劑或載體液體以外的物質。例如，含水相可含有1-20％(重)水溶性親水化合物如糖和聚合物作為穩定劑，如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、明膠、多谷氨酸和多糖如淀粉、葡聚糖、瓊脂、植物黃素等。可用相似的含水相作為載體液體，其中在使用前，最終的微球產物是懸浮的。可以用乳化劑(0.1-5％重)，包括大多數生理學可接受的乳化劑例如蛋卵磷脂或大豆卵磷脂或合成的卵磷脂如飽和的合成卵磷脂，如二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿或二硬脂酰磷脂酰膽堿或不飽和的合成卵磷脂，如二油酰磷脂酰膽堿或二亞油酰磷脂酰膽堿。乳化劑還包括表面活性劑如游離的脂肪酸、脂肪酸與聚氧化烯類化合物如聚氧丙二醇和聚氧乙二醇形成的酯；脂肪醇與聚亞氧烷基乙二醇形成的醚；脂肪酸與聚氧烷基化的脫水山梨醇形成的酯；皂；甘油-聚氧乙烯蓖麻醇酸酯；聚亞烷基二醇的均聚物和共聚物；聚乙氧基化的豆油和蓖麻油以及氫化的衍生物；蔗糖或其它碳水化合物與脂肪酸、脂肪醇形成的醚或酯，可將其任選地多氧烷基化；飽和或不飽和脂肪酸的單、二和三甘油酯、甘油酯或豆油和蔗糖。可將添加劑摻入到微球的壁中以改變物理特性如分散性、彈性和水滲透性。其中有用的添加劑包括可使壁“疏水化”以降低水滲透性的化合物，如脂肪、蠟和高分子量碳水化合物。改進微球在可注射液體-載體中的分散性的添加劑是兩親化合物，如磷脂；它們還可提高水滲透性和生物降解率。可提高壁彈性的添加劑包括增塑劑如肉豆蔻酸異丙酯等。摻入到壁中的添加劑量是極其可變的并可隨需要改變。在某些應用中，根本不用使用添加劑；在其它情況下，添加劑的量可達壁重的約20％。可用任何適宜的技術將含本發明一種或多種胞吞增強劑或載體以及如果有的活添加劑的溶液霧化并噴霧干燥，以得到上述2-5μm的分散微球或微膠囊。如本文所用的，“微膠囊”指封閉了一定空間的中空顆粒，用氣體或蒸汽填充所述空間，但不用任何固體物質。例如，在壓力下使制劑通過至少一個小孔，或在含熱空氣或其它惰性氣體的室中通過離心霧化器霧化形成胞吞載體或增強劑制劑的氣霧劑。所述室應足夠大，以使最大的噴出的液滴不會在干燥前撞到室壁上。室中的氣體或蒸汽是干凈的(優選無菌和無熱原的)并且以與微膠囊同時給藥的量施用到血液中時是無毒的。液體從制劑中蒸發的速率應足夠高以形成中空的膠囊，但又不能高到使微膠囊破裂的程度。可通過改變氣體流速、制劑中的胞吞載體或增強劑的濃度、液體載體的性質、溶液的給料速率以及更重要的是氣霧劑所接觸的氣體溫度來控制蒸發速率。例如，濃度為15-25％的白蛋白或白蛋白片段的水溶液、至少約100℃的氣體入口溫度，優選至少110℃，足以確保中空并且溫度可以高達250℃而不會使膠囊破裂。約180-240℃，優選約210-230℃，并更優選約220℃。由于氣霧劑所接觸的氣體溫度還取決于氣霧劑的釋放速率和制劑中的液體含量，必須對出口溫度進行監測以確保足夠的室內溫度。40-150℃的出口溫度是適宜的。控制流速可以控制其它參數如完整中空顆粒的數量。微粒可含有至少50％(重)，優選70％(重)或80％(重)，并最優選90％(重)的胞吞增強劑。為了用于吸入裝置，可將微粒與常規賦形劑如乳糖或葡萄糖配制在一起。生理活性劑的量依據其性質和活性、給藥方式以及本領域技術人員已知的其它因素進行選擇。例如，施用的顆粒數是可以傳遞100mg/天α-1抗胰蛋白酶，或0.1mg/天活性劑如氯地米松的數量。下面給出可通過微粒進行給藥的其它可能的生理活性劑。本發明的另一實施方案是將生理活性劑與胞吞增強劑共噴霧干燥以利于在配制、包裝過程中，更重要的是在停留在肺泡內膜上時穩定所述活性劑。在這種情況下，它們可以有強蛋白水解活性。在該或另一實施方案中，可將活性劑與胞吞載體在噴霧干燥前通過可裂解的鍵共價連接。該實施方案代表了可將活性劑從裝置攜帶到血液，并可能帶到體內靶位點上的方法。形成具有最佳空氣動力學大小的顆粒意味著“物理”載體將活性劑傳遞到吸收位點。在沉積到肺泡上后，經GP-60介導的胞吞系統，“分子”載體就可以保護并促進進入血液的傳遞過程，在進入血液后，可進一步提高循環半衰期，甚至將活性劑導向含有GP60受體的特定位點。以上討論了適宜的連接技術；此外，WO-A-9317713記載了酯酶敏感性的多羥基酸連接物。在噴霧干燥前用于衍生胞吞載體的所述技術可以產生用于將活性劑傳遞到全身脈管系統的共價載體系統。這利用了胞吞載體這樣的潛力，即可跨過肺泡并較長時間攜帶活性劑同時保護可能不穩定的整體。盡管可以在微粒配制后將本發明所用的生理活性劑嵌入微粒或與微粒締合，但優選與胞吞載體或增強劑一起配制。微粒可至少用疏水或水不溶性材料如脂肪酸進行部分包衣，以延緩其溶解速率并防止其吸濕。用于噴霧干燥并產生微粒(例如用于干粉吸入裝置)的方法和設備更詳細地記載于WO-A-9609814和美國專利申請08/487420，其內容引入本文作為參考。可根據任何適宜的方法確定在用于肺傳遞的制劑中藥物與胞吞增強劑的最佳比例。如下列實施例所述，制劑的一種體外最優化方法需要使用初級人上皮細胞單層細胞或在多孔濾紙上生長為單層細胞的不死的人上皮細胞。然后將藥物和增強劑的混合物應用到下述跨孔流(transwellflux)系統的上層室中。用標記的示蹤物和免疫檢測，可確定藥物或基因到達下層的流速。將最佳制劑定義為有最大速率并可最大程度通過限制性單層細胞的制劑。優化制劑的另一種方法需要體內確定在研究條件下的肺到血液的藥物流通量。已經報道了許多用大鼠、豬和綿羊進行的研究(Patton等，JournalofControlledRelease2879(1994)，Folkesson等，Acta.Physiol.Scand.14773(1993)，Schreier等，Pharm.Res.111056(1994))，這些研究描述了將藥物制劑滴注或霧化到氣管和細支氣管的方法以及通過免疫檢測評估藥物的血液中的出現或藥理學活性的方法。優化需要用不同比例的藥物和增強劑制成的一系列動物制劑，將與所希望的藥物藥理學分布匹配的曲線下的最有利的面積定義為最佳制劑。例如，只需簡單地表明藥物的最大生物利用度或者表明延長的或緩釋分布。對于各種情況來說，可能需將不同量的增強劑摻入到制劑中。對于要求最大利用度的藥物來說，需要利用最大量的增強劑和/或對GP60受體有最大激活作用的增強劑。對于因跨肺而需要呈現期較長的藥物來說，需要利用較低量的增強劑和/或對胞吞GP60受體有較低激活潛力的增強劑。可將增強劑或載體的“強度”定義為存在GP60受體-結合的配體、抗體或類似物(mimetic)的情況下與不存在配體時的胞吞作用的程度相比特定示蹤物的胞吞作用可以被增強的程度。增強劑的“強度”在某種程度上也就是藥物依賴性。標記物攝入的增加可隨標記物和胞吞增強劑的性質而改變。下面列表的是標記物、增強劑、細胞系統的對照表以及高于不同標記物、細胞系統和試驗類型的對照的增強程度。所用的縮寫125I-BSA125I-標記的牛白蛋白125I-IgG125I-標記的免疫球蛋白GHSA人白蛋白BSA牛白蛋白FITC-胰島素熒光素標記的胰島素GP60Ab抗-GP60多克隆抗體T3118從GP60的N-末端的18個殘基衍生的合成肽</tables>“生理活性劑”指包括核酸分子、藥用肽和蛋白質的藥物。本文中，可與“生理活性劑”互換的是“藥物”、“活性成分”、“活性劑”和“治療劑”。可得益于更迅速的跨內皮和上皮胞吞作用的藥物包括黃體化激素(LH)、絨膜促性腺激素、心房肽、干擾素、各種淋巴因子如白細胞介素(I、II、III、IV、V、VI和VII)以及集落刺激因子。適用于本發明的其它藥物包括生長激素釋放因子、促皮質素釋放因子、黃體化激素釋放激素(LHRH)、生長激素、降鈣素、促甲狀腺激素釋放激素、降鈣素基因相關肽(CGRP)、蛋白質如酶，包括轉移酶、水解酶、異構酶、蛋白酶、連接酶、氧化還原酶、酯酶和磷酸酶、以及各種生長和神經營養因子如生長激素調節因子、表皮生長因子、尿抑胃素、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、腦衍生的神經營養因子(BDNF)、膠質衍生的神經營養因子(GDNF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子、腫瘤壞死因子(TNF)和轉化生長因子(TGF)。其它藥物包括內源性的阿片激動劑，例如腦磷脂和內啡肽；下丘腦激素如促性腺激素釋放激素、促黑激素抑制素、促黑激素釋放激素、生長激素釋放抑制因子、促甲狀腺激素釋放激素、P物質和神經緊張素；腺垂體激素，例如促腎上腺皮質激素、親脂素、促黑細胞激素、促黃體素、促甲狀腺激素、催乳素和生長激素；神經垂體激素；calcitrapic(甲狀腺)激素，例如甲狀旁腺激素和降鈣素；胸腺因子例如胸腺素、促胸腺生成素、循環胸腺因子和胸腺體液因子；胰腺激素，例如胰島素、高血糖素和生長激素釋放抑制因子；胃腸道激素，如胃泌素、縮膽囊肽、分泌素、胃液抑制多肽、血管腸肽和胃動素；卵巢激素，例如松弛素；血管活性組織激素，如血管緊張素和緩激肽；以及人工肽或假肽如deferoxamine；和LHRH類似物如buserelin、deslorelin、gonadorelin、goserelin、histrelin、leuprorelin、nafarelin或triptorelin。以上已對本發明進行一般性描述，參照以下實施例可以更容易地理解本發明，所述實施例是說明性而非限定性的。實施例1內皮和上皮單層細胞的生長按所述方法(DelVecchioetal.，InVitro.Cell.Dev.Biol.28A711-715(1992))分離并培養牛肺微管內皮細胞(BPMVEC)和(BPAEC)牛肺動脈內皮細胞。用含20％FBS的DMEM常規培養內皮細胞。為了分離質膜，在850cm3的旋轉瓶中培養內皮細胞。向各旋轉瓶中加入75ml培養基。導入空氣-CO2混合物。然后將細胞轉移到37℃的旋轉瓶保溫箱中，使其生長10-12天。按照Uhaletal.，Am.J.Physiol.257C528-C536(1989)中所述的方法分離初級大鼠肺泡上皮細胞(AEC)。將細胞在含10％FBS的DMEM中培養2或4小時，此時它們分別顯示出II型或I型細胞樣表型。按照Uhal等，Am.J.Physiol.Suppl.261110-117(1991)的方法檢驗該表型。內皮細胞膜的分離用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌生長在旋轉瓶中的內皮細胞兩次。從旋轉瓶中刮下細胞并懸浮在Buffer-A(20mMHEPES/Tris，0.15MNaCl，0.1mMPMSFpH7.4)中，以700xg離心10分鐘，洗滌兩次。將從6-8個旋轉瓶中得到的細胞懸浮在75mlBuffer-A中，用Polytron勻漿器全速勻漿1分鐘。以3000xg將勻漿物離心10分鐘。收集上清液并以40000xg離心60分鐘。然后將所得沉降物懸浮在buffer-A中，再以40000xg離心60分鐘。將最終的膜沉降物懸浮在小體積含0.2mMEDTA的buffer-A中并測定蛋白質濃度(Lowryetal.J.Biol.Chem.193265-275(1951))。測定質膜標記物的酶活性并將樣品在-70℃貯存直到使用。配體印跡將內皮細胞膜與1mMPMSF和0.5mMEDTA在22℃預保溫20分鐘，然后通過與1.5體積的增溶緩沖液(9M脲，2％SDS，2％β-巰基乙醇，0.1MTris，0.02％溴酚蘭pH6.8)混合使其增溶。將混合物在22℃培養30分鐘。用平板凝膠電泳系統，通過SDS-PAGE(Laemmli，Nature(London)227680-685)分離溶解的蛋白質，所述電泳系統在積層凝膠中含3％丙烯酰胺，在分離凝膠中含10％丙烯酰胺。電泳后，將蛋白質轉移到PVDF或硝酸纖維素膜上。用25mMTris，192mM甘氨酸和20％甲醇作為轉移緩沖液，在150伏2小時完成轉移。通過與5mMCaCl2的TBS(20mMTris，0.5MNaClpH7.5)溶液一起保溫10分鐘，然后與0.5％吐溫20的TBS保溫過夜來阻斷非特異性結合。該步驟后，洗滌膜并切成兩條。一條與含1.5％明膠的0.6mg/ml無球蛋白的BSA的TBS一起保溫2小時，另一條不與BSA一起保溫。洗滌所述條并與抗牛BSA在含1.5％明膠的TBS中一起保溫60分鐘。將膜洗滌兩次并與同堿性磷酸酶結合的二級抗體(山羊抗兔IgG)一起保溫。加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮藍四唑鹽后確定蛋白質帶的位置。蛋白質純化用BPMVEC膜分離57kDa的白蛋白結合蛋白。進行配體印跡以評估在各步驟中是否存在該蛋白質。將BPMVEC膜(100mg)與1mMPMSF和0.5mMEDTA在22℃預保溫30分鐘。在4℃用終濃度為2.5％膽酸鈉和4M脲將該膜溶解3小時，同時緩慢攪拌。在溶解過程中將蛋白質濃度調整到4mg/ml。該處理后，將懸浮液以100000xg離心60分鐘。收集上清液并用5mMHEPES/Tris(pH7.2)透析。在上清液中回收了80％以上的膜蛋白。4℃用60％乙醇沉淀來濃縮透析的懸浮液。4℃以10000xg離心30分鐘來收集乙醇沉淀并懸浮在Buffer-A中。4℃用2.5％TritonX-100溶解沉淀過夜，同時緩慢攪拌。將懸浮液以100000xg離心60分鐘。收集上清液并用4升50mMTris-HCl，0.2mMEDTA，0.15％TritonX-100和0.1mMPMSF，pH8.0(buffer-B)透析。將透析的提取物加到DEAE-52柱(10×13cm)上。該柱用buffer-B預先平衡。上樣后，用50mlbuffer-B洗滌該柱。用80ml在buffer-B中0-500mM的線性NaCl梯度，以15ml/小時的流速從該柱上洗脫結合的蛋白質。分別合并來自各峰的餾分并用50％丙酮沉淀濃縮。將丙酮沉淀用于配體印跡。只有峰I有白蛋白結合活性。用制備性SDS-PAGE(16cm×16cm，3mm厚的平板凝膠)進一步分離峰I中的蛋白質，將從凝膠中洗脫的57kDa蛋白質用于進一步的研究。抗體生產和純化用從制備性SDS-PAGE洗脫的57kDa白蛋白結合蛋白免疫兔。在與等體積的弗氏完全佐劑混合后，肌肉內注射約50μg蛋白質(每只兔)。在兩周后進行第二次注射。在第二次注射后，將兔喂養4到6星期，然后檢測免疫反應。用蛋白質A-Sepharose柱純化預免疫血清IgG和抗血清IgG。免疫印跡對內皮細胞膜進行SDS-PAGE(Laemmli，同上文)，然后電泳轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上。22℃用3％明膠的TBS經5小時阻斷非特異性結合。用0.5％在TBS中的吐溫20洗滌將該膜兩次并與用含1％明膠的TBS稀釋的抗血清一起保溫。保溫4-6小時，洗滌兩次，然后與二級抗體(與堿性磷酸酶結合的山羊抗兔IgG)保溫60分鐘。保溫后，將膜洗滌兩次，按照“配體印跡”中所述確定蛋白質帶的位置。用已知標記蛋白確定蛋白質的分子量。單層細胞結合研究將BPMVEC接種(3×105細胞/孔)在6孔Corning組織培養皿中并生長至匯合。用無血清培養基(20mMHEPE/DMEMpH7.4)將單層細胞洗滌兩次，然后在組織培養保溫箱中與無血清培養基保溫15-20小時。該保溫后，用結合緩沖液(20mMHEPE/TrisHBSSpH7.4)將單層細胞洗滌兩次，通過加入1ml1μM125I-BSA的結合緩沖液來啟動結合。4℃保溫60分鐘。通過用結合緩沖液將單層細胞洗滌3次來終止結合。在用1NNaOH溶解細胞后確定與單層細胞有關的放射性(Tiruppathietal，Am.J.Physiol.(Lung.Cell.Mol.Physiol.)L595-L601(1992))。。通過在結合過程中包含的未標記的BSA(40mg/ml)來確定非特異性結合。在加入125I-BSA前，將試驗組分、預免疫血清-IgG和抗57kDa-IgG預保溫30分鐘。跨細胞流試驗用在培養內皮單層細胞中的多個跨內皮125I-白蛋白流速率來評估跨內皮白蛋白運輸。以前已描述了用于該研究的系統(Cooperetal.，J.appl.Physiol.621076-1083(1987)；Garcia，etal.，J.Cell.Physiol.12896-104(1986)；DelVecchioetal.，Vitro.Cell.Dev.Biol.28A711-715(1992)和Siflinger-Birnboirnetal.，J.Cell.Physiol.132111-117(1987))。在不存在流體靜壓和oncotic壓梯度的情況下，該系統測量了示蹤大分子的跨內皮運動。該系統由通過聚碳酸酯微孔濾紙(孔直徑為0.8μm)分開的發光和白蛋白隔室分開的隔室組成。以105細胞/濾紙接種BPMVEC，然后生長3-4天以至匯合。在體積分別為600ml和25ml的隔室中含有相同的培養基(20mMHEPES-DMEM，pH7.4)。發光隔室配有Styrofoam外環，并“浮”在白蛋白培養基中以便在從白蛋白隔室重復去樣后液體水平仍保持相同。連續攪拌白蛋白隔室并通過恒溫調節的水浴將整個系統保持于37℃。將125I-白蛋白的跨內皮清除率確定為清除到白蛋白隔室中的發光隔室放射性的體積。通過稱重的最少面積非線性回歸分析(BMDP統計軟件，Berkeley，CA)確定體積隨時間的改變，得到以/分鐘計的125I-白蛋白清除率。在試驗開始，發光隔室浮在白蛋白介質中，并用含約6μCi/ml125I-白蛋白的介質填充。以10分鐘的間隔收集白蛋白樣品，400μl，共收集60分鐘，然后用γ計數器測量放射性。在試驗結束時，用12％TCA沉淀確定發光和白蛋白隔室中的125I，并對無125I校正跨內皮125I-白蛋白流速。試驗前一天，用20mMHEPES-DMEMpH7.4(無血清培養基)將BPMVEC單層細胞洗滌2次，然后37℃在細胞培養保溫箱中與無血清培養基一起保溫12-15小時。該保溫過程后，用無血清培養基稀釋試驗組分(預免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG)，并與單層細胞保溫所希望的時間。然后用這些單層細胞進行跨內皮白蛋白運輸測量。用稍加改變的用于內皮細胞的方法測量跨上皮流速。按對跨孔濾紙的描述(Costar)(Evansetal，Exper.CellRes.184375-387(1989))，確定初級AEC或培養的A549人肺癌細胞系的流速。通過跨上皮電阻來定義單層細胞的完整性，結果大于500ohms/cm2。將帶完整單層細胞的濾紙放在每孔含1ml無血清DMEM的24孔培養板上(白蛋白室)。用含所需示蹤分子(FITC-胰島素)的200μl無血清DMEM填充發光室。在兩個隔室中的液體水平是相同的，從而消除了靜壓。將過濾系統預保溫(30分鐘)，然后在整個流量試驗過程中，均將其保溫在37℃的CO2保溫箱中。在1和2小時，從白蛋白室中取出300μl的樣品并且立即用無血清DMEM代替。在平板閱讀儀上記錄胞吞物質的熒光，通過白蛋白樣品的凝膠過濾色譜來確定結合的對游離FITC的比例。肌動蛋白絲的分布在與用于測量125I-白蛋白清除率相同的條件下研究在生長于濾紙上的內皮單層細胞中肌動蛋白絲分布與細胞骨架的變化。在用試驗組分預處理的所需的時間后，用10％緩沖的福爾馬林(PallescencesInc.，Warrington，PA)固定在濾紙上的單層細胞，并用1％NonidetP40(Sigma)滲透，然后按PhillipsandTsan，J.Histochem.Cytochem.36551-554(1988)所述用若丹明鬼筆環肽(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)染色。從孔中取出含單層細胞的完整濾紙，并固定在蓋玻片上，用1∶1的甘油在磷酸緩沖鹽中的溶液覆蓋，然后用圓蓋玻片覆蓋并密封。用NikonLabDiaphot熒光顯微鏡(NikonInc.，Melville，NewYork)分析玻片，并用TRIXPan400ASA柯達膠片拍照。鑒定白蛋白結合的蛋白質用示差離心從BPMVEC中分離質膜，并用配體印跡(見上述)鑒定該膜餾分中白蛋白結合的蛋白質。研制了一種簡單的方法以鑒定在內皮細胞膜中天然白蛋白結合的蛋白質。用SDS-PAGE分離膜蛋白，然后轉移到PVDF或硝酸纖維素上。通過將膜條與吐溫20一起保溫來阻斷非特異性結合，然后用無球蛋白單體天然BSA處理。用抗天然BSA的多克隆抗體鑒定BSA結合的區。在不將膜條暴露于天然BSA的情況下，抗BSA僅識別67kDa多肽，表明存在大量與內皮細胞膜結合的BSA。但是，當用BSA處理所述條帶時，抗BSA抗體與3種另外的多肽(110kDa，、57kDa和18kDa)反應。在這些多肽中，抗體與57kDa的反應最強，這表明57kDa多肽是主要的天然白蛋白結合的多肽。另外還制備了總內皮細胞膜餾分(來自BPMVEC和BPAEC的100000xg顆粒餾分)并用于配體印跡。這些顆粒餾分表明BSA與57kDa多肽有主要的相互作用。分離57kDa白蛋白結合的蛋白質由于發現天然白蛋白主要與57kDa蛋白結合，所以研制了從BPMVEC膜中分離該蛋白質的方法。用配體印跡評估純化過程中是否存在該蛋白質。開始用2.5％膽酸鈉和4M脲溶解BPMVEC膜，然后透析提取物并用60％乙醇沉淀濃縮。用Tritonx-100(見上述)再提取該沉淀物。在DEAE柱上對Tritonx-100溶解的提取物進行色譜，用線性梯度(O-500mMNaCl)洗脫結合的蛋白質。蛋白質洗脫出3個峰。收集來自各峰的餾分并用配體印跡試驗篩選白蛋白結合。只有一個峰(I)與57kDa蛋白區有白蛋白結合。用考馬斯亮蘭R-250染色后，用來自天然BPMVEC膜和DEAE柱峰I的蛋白質進行SDS電泳。在天然膜和DEAE峰I中均用配體印跡觀察到存在對應于白蛋白結合的57kDa蛋白。還在非還原條件下(不存在βME)完成SDS-PAGE，只于57kDa蛋白區觀察到白蛋白結合，這表明在該蛋白質中不存在二硫化物鍵。用制備性SDS-PAGE進一步純化該蛋白質，用從凝膠中洗脫的蛋白質制備抗體。免疫印跡用SDS-PAGE分離BPMVEC和BPAEC膜蛋白并轉移到硝酸纖維素條帶上。用57kDa抗血清免疫印跡該條帶。預免疫的血清不識別BPMVEC和BPAEC膜的任何蛋白質。抗血清識別兩種膜制品中的兩種主要蛋白質(57kDa和36kDa)以及一種少量蛋白質(43kDa)，再用BPMVEC和BPAEC膜的顆粒餾分進行免疫印跡。抗體僅識別顆粒餾分中的這3種蛋白質。這表明已將白蛋白結合的蛋白質純化到了顯著的均一度。為了研究內皮膜相關的白蛋白結合蛋白與分泌的(SPARC)白蛋白結合蛋白之間的結構關系，用抗純化的牛SPARC的抗體進行BPMVEC膜的免疫印跡。抗純化的牛SPARC的抗血清識別BPMVEC膜中的67kDa、61kDa、57kDa、43kDa和36kDa多肽。抗-SPARC-NH2末端肽抗血清與36kDa多肽的反應強，而與43kDa多肽的反應弱。這表明清除劑受體與天然白蛋白受體明顯不同。抗-57kDa-IgG對125I-BSA與BPMVEC單層細胞結合的影響用蛋白質A-Sepharose柱親和純化預免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG。4℃研究IgG餾分對125I-BSA與BPMVEC單層細胞結合的影響40-50％的非特異性結合。預免疫血清-IgG對125I-BSA與BPMVEC單層細胞的特異性結合沒有顯著影響。相反，抗-57kDa-IgG以劑量依賴的方式降低125I-BSA與BPMVEC單層細胞的特異性結合。抗-57kDa-IgG的降低作用在濃度為200μg/ml時最大(40-50％)，在濃度為1000μg/ml時仍保持不變。這些結果表明抗57kDa蛋白質的抗體不會完全識別受體中的白蛋白結合結構域，或天然白蛋白可與內皮細胞表面上的其它結合位點相互作用。不存在內皮細胞形狀改變的情況下，用抗-57kDa-IgG激活跨內皮白蛋白流為了研究抗-57kIDa-IgG對白蛋白跨內皮運輸的影響，測量BPMVEC單層細胞中跨內皮125I-BSA清除率。將單層細胞與預免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG預保溫15分鐘、30分鐘和60分鐘，然后測量60分鐘內的跨內皮的125I-BSA清除率。抗-57kDa-IgG誘導的滲透性增加是時間依賴性的。抗-57kDa-IgG預保溫30分鐘導致125I-BSA清除率比預免疫IgG高2倍。在預保溫15分鐘內，滲透性沒有顯著增加，而當抗-57kDa-IgG與單層細胞預保溫達60分鐘時，有40-50％的改變。預免疫血清-IgG在所有測試的預保溫時間，對跨內皮白蛋白運輸均無影響。4℃抗-57kDa-IgG影響125I-白蛋白滲透性的恢復。用先前所述的技術(PhillipsandTsan，同上文；Siflinger-Birnboimetal.，LabInvest.6724-30(1992))研究用預免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG處理后，內皮細胞形狀的改變。將在核孔濾紙上生長的BPMVEC與預免疫血清-IgG和抗-57kDa-IgG一起預保溫30分鐘，用若丹明鬼筆環肽將單層細胞染色(見上文)。在這兩種情況下，均未觀察到細胞“環”或內皮間缺口。這些結果表明抗-57kDa白蛋白結合的蛋白質抗體激活了白蛋白運輸。還有另一種可能性，即通過擴寬內皮間連接的缺口，該抗體可能非特異性地增加了白蛋白的近細胞(pericellular)運輸。為了描述這種情況，研究抗受體IgG和預免疫血清IgG對內皮細胞形態的作用。用預免疫血清-IgG或抗-57kDa-受體-IgG預處理BPMVEC單層細胞對內皮間連接缺口沒有影響。抗57kDa白蛋白結合蛋白的抗體可激活白蛋白的胞吞作用。在4℃該抗體沒有滲透性增強作用，這支持抗體經小泡的形成激活白蛋白胞吞作用的結論，所述小泡形成是溫度敏感性的(Loetal.，J.Cell.Physiol.15163-70(1992))。實施例2抗GP60抗體按實施例1所述用抗來自內皮細胞的GP60的抗體檢測上皮細胞膜提取物。抗GP60抗體識別在上皮提取物中發現的60kDa蛋白質。這清楚地表明在該系統中存在免疫相關蛋白。按實施例1所述使上皮和內皮細胞生長成單層細胞，以產生匯合單層細胞，表明與溶質流有適宜的反應性。在不存在可能導致GP60內部化的代謝活性的情況下，4℃將抗GP60抗體(200-500μg/ml)與單層細胞一起保溫以使抗體與受體結合。在這些條件下，抗GP60抗體的結合會導致內皮單層細胞的125I-BSA結合降低80-90％。再將上皮單層細胞與抗初級兔抗GP60抗體的二級抗體一起保溫，以交聯受體。洗滌這兩個單層細胞，然后在37℃與上皮細胞的125I-BSA或內皮單層細胞的125I-抗BSA免疫球蛋白一起保溫以使受體-抗體復合物內部化以及125I-標記的示蹤物共胞吞。與抗GP60抗體一起保溫導致攝入與預免疫血清對照高1.6-2倍。因此，抗GP60抗體引起的GP60受體結合會激活胞吞機制，由此提高在凹縮膜附近大分子的攝入。實施例3白蛋白與大分子的使用存在BSA的條件下，4℃保溫內皮單層細胞以引發BSA與GP60的結合，但防止配體受體復合物內部化。充分洗滌除去未結合的BSA后，將細胞與作為大分子示蹤物的125I-標記的抗-BSA免疫球蛋白在37℃一起保溫。用BSA預處理產生的免疫球蛋白示蹤物的胞吞作用比與未標記抗-BSA免疫球蛋白一起預保溫的對照細胞高1.5倍。此外，當洗滌37℃保溫的細胞并用相同的方法立即取出時，未觀察到大分子流；這表明一旦內部化，GP60受體就不可能與配體結合。因此，用GP60系統，可將大(150kDa)分子與HSA共胞吞。實施例4白蛋白與肽的使用按實施例1所述使人和大鼠上皮單層細胞生長匯合。然后37℃將細胞與FITC-胰島素(1mg/ml)或FITC-胰島素和BSA(各1mg/ml)在上述跨細胞流系統中一起保溫。對于人和大鼠上皮單層細胞，FITC-胰島素流比單獨FITC-胰島素的對照有2.5或4倍的增加。因此，白蛋白還刺激小分子量肽跨含GP60受體的上皮細胞的共胞吞作用。實施例5GP60N-末端肽1-18的用途用固相肽合成法生產對應于前18個殘基的GP60的合成N-末端肽(T3118)。該序列(SEQIDNO.1)與牛的膜結合的甲狀腺激素(T3)-結合蛋白(Yamauchietal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.1461485(1987))有80％的同源性。與PDI有97％的同源性。在兔中生產抗T3118抗體，并用于檢測內皮細胞膜提取物，以便按照下述確定與抗GP60抗體識別之蛋白質的交叉反應性。在SDS-PAGE上分離BPMVEC膜蛋白(100μg)并轉移到硝酸纖維素膜條帶上。用5％脫脂干奶粉在Tris緩沖鹽中阻斷非特異性結合。用阻斷溶液稀釋抗血清，在4℃保溫4-5小時，洗滌并用與堿性磷酸酶結合的山羊-抗-兔-IgG處理。用已知分子量的標記蛋白鑒定蛋白質帶。抗T3118抗體只與GP60蛋白有反應性，與抗GP60抗體識別的SPARC肽沒有反應性。然后將T3118肽用于內皮攝入試驗以確定它是否可作為白蛋白識別和攝入的拮抗劑。存在125I-BSA或125I-BSA加T3118肽的情況下，在4℃保溫內皮單層細胞。保溫后，徹底洗滌細胞，溶解并計數示蹤物的攝入。令人驚奇的是，除作為拮抗劑外，T3118肽事實上可使白蛋白的攝入比白蛋白單獨對照高5倍。在T3118肽的濃度為500μM時，增強作用達到飽和。這些數據表明T3118肽作為激動劑可誘導白蛋白構型的改變，這樣可提高GP60的識別，或作為內皮細胞攝入的信號。本領域專業人員可以理解，在組合物、濃度、給藥方式和條件的相同參數的寬范圍內，可以完成本發明而不會偏離本發明或其任何實施方案的精神和范圍。序列表(1)一般資料(I)申請人(A)名稱AndarisLimited(B)街道1MereWay(C)城市Ruddington(D)州Nottingham(E)國家英國(F)郵政編碼(ZIP)NG15AQ(ii)發明名稱用于藥物傳遞的胞吞載體和增強劑(iii)序列數1(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容的(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1的資料(I)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO1LysProAspGluGluAspHisValLeuValLeuValLysGlyAsnPhe151015AspVal權利要求1.含有生理活性劑和胞吞增強劑或載體的組合物或所述組分的結合物，所述生理活性劑在跨過含GP60受體的內皮、上皮或間皮后發揮其作用，所述胞吞增強劑或載體選自白蛋白和其片段、抗GP60抗體和其片段、GP60肽片段和PDI(蛋白質二硫化物異構酶)和其片段。2.根據權利要求1的組合物或結合物，其中所述胞吞增強劑或載體包含CGMC基元。3.根據權利要求1的組合物或結合物，其中所述胞吞增強劑或載體含有白蛋白或白蛋白片段。4.根據權利要求1的組合物或結合物，其中所述胞吞增強劑或載體含有抗GP60抗體或抗GP60抗體片段。5.根據權利要求1的組合物或結合物，其中所述胞吞增強劑或載體含有GP60肽片段。6.根據權利要求1的組合物或結合物，其中所述胞吞增強劑或載體含有白蛋白或白蛋白片段以及GP60肽片段。7.根據權利要求5或6的組合物或結合物，其中所述GP60肽片段是或含有SEQIDNO.1。8.根據前述任一權利要求的組合物或結合物，其中所述生理活性劑選自黃體化激素(LH)、絨膜促性腺激素、心房肽、干擾素、淋巴因子I、淋巴因子II、淋巴因子III、淋巴因子IV、淋巴因子V、淋巴因子VI和淋巴因子VIII、集落刺激因子、生長激素釋放因子、促皮質素釋放因子、黃體化激素釋放激素(LHRH)、生長激素、降鈣素、促甲狀腺激素釋放激素、降鈣素基因相關肽(CGRP)、轉移酶、水解酶、異構酶、蛋白酶、連接酶、氧化還原酶、酯酶、磷酸酶、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、腦衍生的神經營養因子(BDNF)、膠質衍生的神經營養因子(GDNF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子、腫瘤壞死因子(TNF)、轉化生長因子(TGF)、腦磷脂、內啡肽、促性腺激素釋放激素、促黑激素抑制素、促黑激素釋放激素、生長激素釋放抑制因子、促甲狀腺激素釋放激素、P物質、神經緊張素、促腎上腺皮質激素、親脂素、促黑細胞激素、促黃體素、促甲狀腺激素、催乳素、生長激素；神經垂體激素、甲狀旁腺激素、降鈣素、胸腺素、促胸腺生成素、循環胸腺因子、胸腺體液因子、胰島素、高血糖素、生長激素釋放抑制因子、胃泌素、縮膽囊肽、分泌素、胃液抑制多肽、血管腸肽、胃動素、松弛素、血管緊張素、緩激肽、somatomedins、表皮生長因子、尿抑胃素、deferoxamine、buserelin、deslorelin、gonadorelin、goserelin、histrelin、leuprorelin、nafarelin和triptorelin。9.權利要求1-8任一項中限定的生理活性劑和胞吞增強劑用于制備使用所述活性劑進行治療的藥物用途。10.權利要求1-8任一項中限定的結合物用于制備使用所述活性劑進行治療的藥物用途。11.將生理活性劑施用給哺乳動物的方法，改進包括施用權利要求1-7任一項中定義的與胞吞載體或增強劑結合或混合的所述活性劑，其中所述胞吞載體或增強劑傳遞或增強所述生理活性劑跨含GP60受體的上皮、內皮或間皮的傳遞。12.根據權利要求11的方法，其中所述施用是施用給脈管系統、肺氣管或腹膜。13.根據權利要求12的方法，其中經注射施用給脈管系統或腹膜。14.根據權利要求12的方法，其中經干粉吸入施用到肺氣管。15.根據權利要求11的方法，其中所述生理活性劑是權利要求8所定義的。16.根據權利要求11的方法，其中所述生理活性劑通過下列方法與所述胞吞載體結合利用希夫堿形成的戊二醛結合、蛋白質和羧酸間的碳化二亞胺反應、含胺藥物的酸酐激活和隨后的碳化二亞胺連接、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸-N-琥珀酰業胺基酐活化含伯胺的藥物，然后與蛋白質的半胱氨酸基團相連、用氰尿酰氯將糖醇與蛋白質相連以及經雙過氧化作用結合胺和羥基。17.權利要求11的方法，其中所述哺乳動物是人。全文摘要通過與選自白蛋白和其片段、抗－GP60抗體和其片段,GP60肽片段和PDI(蛋白質二硫化物異構酶)和其片段的胞轉增強劑或載體形成或結合來增強生理學活性劑的胞轉作用,所述生理學活性劑是通過含GP60受體的內皮、上皮或間皮后發揮其作用。文檔編號C12N5/08GK1195995SQ96196859公開日1998年10月14日申請日期1996年9月20日優先權日1995年9月21日發明者A·D·蘇頓,A·B·馬利,C·蒂魯帕思,R·H·約翰森申請人:安達里斯有限公司