檢測調節肥胖癥蛋白作用的化合物的方法

專利名稱：檢測調節肥胖癥蛋白作用的化合物的方法
技術領域：
本發明涉及一種新方法，更具體說涉及一種檢測模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白(ob protein)的生理作用的化合物的方法。
肥胖癥蛋白(即leptine)是作為從脂肪組織到其他器官的信號以調節體重和能量平衡的一種分泌激素(Zhang等，Nature，1994，372，425)。具推測肥胖癥蛋白還在造血和生殖功能中起作用(Cioffi等，NatureMedicine，1996，2(5)，585)。含有一個包括四個α螺旋，形成一束具有上上下下up-up-down-down)拓撲結構的核心的蛋白質分子包括細胞因子和生長因子的一個家族。這個家族的蛋白質引起已知激活導致基因轉錄的激酶級聯反應的膜受體同型-和異型-寡聚合反應。被寡聚合反應激活的該家族受體分成兩類；即如表皮生長因子類，它們在其細胞內的功能域具有完整的酪氨酸激酶活性(A.Ullrich & J.Schlessinger，Cell，1990，61，203-212)，以及如IL4和促紅細胞生成素類，它們缺乏這種活性并通過一種結合的蛋白質酪氨酸激酶途徑介導其反應(J.N.Ihle等，TIBS，1994，19，222-227)。兩種受體亞型均受細胞因子激活，但4螺旋束蛋白只激活非完整酪氨酸激酶亞型。這種非完整蛋白質酪氨酸激酶受體一般通過與Janus激酶(JAK)以及這些受體結合的信號轉導物和轉錄激活劑(STAT)蛋白有關的途徑起作用。激活過程中，STAT蛋白結合到DNA反應元件上從而控制基因轉錄。包括一般序列TT(N)nAA的DNA調節元件的寡核苷酸序列已被鑒定為STAT反應元件(Seidel等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1995，92，3041)。在對信號分子如細胞因子起反應時，這些元件與STAT蛋白結合。
在共同未決的聯合王國專利申請號9509164.1中我們已經描述了我們的發現即肥胖癥蛋白以四螺旋束三級結構為特征。現在我們認為肥胖癥蛋白與激活JAK-STAT激酶級聯反應的膜結合受體相互作用并由此構成用于檢測模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物的分析系統的基礎。這種檢測在選擇化合物以治療體重、能量平衡、造血、生殖以及其他受“肥胖癥蛋白”介導的疾病方面有用。該檢測對選擇化合物以治療與肥胖、厭食、極度瘦弱和糖尿病有關的疾病特別有用。
因此，本發明提供一種檢測模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白生理作用的化合物的方法，該方法包括(a)針對模擬肥胖癥蛋白生理作用的化合物，評估該化合物對與報道基因偶聯的肥胖癥蛋白激活信號轉導物和轉錄激活劑(STAT)DNA反應元件的作用；或(b)對增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物，評估該化合物對由肥胖癥蛋白提供的、對于與報道基因偶聯的肥胖癥蛋白激活的STATDNA反應元件的反應的作用；反應元件和報道基因在肥胖癥蛋白反應細胞系中表達。
該反應元件適合與報道基因，最好與小啟動子偶聯。
一種適合的反應元件是核苷酸分子式TT(N)nAA，其中N是任何核苷酸并且n是4、5或6。
由與其受體相互作用的肥胖癥蛋白介導的細胞內事件選擇性激活優選的反應元件。這種選擇性反應元件可通過在用一些反應元件-報道基因構建體轉染肥胖癥反應細胞系時，檢測受到肥胖癥蛋白相對于其他細胞因子的相對激活作用來確定。
優選反應元件是核苷酸分子式TT(N)nAA，其中N是任何核苷酸且n是5。
進一步適合的反應元件是TTCCCGGAA。
進一步適合的反應元件是受肥胖癥蛋白調節的基因的啟動子區，它是STAT相互作用所需要的。該基因取決于通過此檢測選擇的化合物的具體治療用途。
適合的報道基因是螢火蟲熒光素酶或氯霉素乙酰轉移酶。
適合的啟動子是小啟動子如單純皰疹病毒胸苷激酶或SV40啟動子。
“肥胖癥反應的”細胞系的一個實例是肝或肝癌衍生的細胞系。肝或肝癌細胞系從American Type Culture Collection(ATCC)或EurpeanCollection of Animal Cell Cultures(ECACC)獲得。這類細胞系的一個實例是Hep G2(人肝細胞癌)從ATCC(HB8065)獲得。該Hep G2細胞系通過美國專利4393133公開并提出權利要求的。
進一步的“肥胖癥反應的”細胞系實例是大鼠-1成纖維細胞(Kroder等，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes，1996，104(suppl2)，66)。大鼠1成纖維細胞系從ATTCC(CRL-2210)獲得。
可用置換結合檢測鑒定其他反應細胞系。雖然結合可能不是受體功能的持久形式，它是將信號傳遞到細胞質的形式。可通過PCR或Northern印跡分析(例如人肥胖癥蛋白Tartaglia等，Cell，1995，83，1263)鑒定受體功能的持久形式。最終通過監測leptin以不同濃度存在時的細胞活動檢測反應細胞。鑒定侯選細胞系或監測這些細胞活動的可能方法包括如下方法1.微生理測量儀(Microphysiometer)這種方法檢測細胞內生物化學變化所導致的pH的微小變化。受刺激時肥胖癥蛋白反應細胞可經歷生物化學變化從而引起細胞外酸化速率的微小改變，酸化速率可通過硅氧烷微生理測量儀檢測。該微生理測量儀生物傳感器方法已由McConnell，Science，1992，257，1906中做了綜述。
2.電泳遷移率移位檢定(EMSA)將來自用肥胖癥蛋白處理過的細胞的核提取物與含混雜的或專一的STAT反應元件DNA序列相混合。來自對肥胖癥蛋白起反應的細胞的提取物可引起SATA反應元件寡核苷酸凝膠移位。
參見書“重組DNA”，第二版，Watson等，1992，158頁；Lamb等，Blood，1994，83，2063；3.蛋白質磷酸化檢定測量法通過使用識別磷酸化酪氨酸的抗體可檢定受體激活反應通過細胞內蛋白質酪氨酸磷酸化與終反應的偶聯。更具體說，由于leptin受體可刺激JAK/STAT途徑的酪氨酸磷酸化，該方法提供了一種檢測leptin反應細胞系的方法。專一性JAK/STAT抗體可與酪氨酸磷酸化抗體并列使用以檢測leptin反應細胞系中的leptin激活。可能發生蛋白質磷酸化的抑制以及刺激。特別是，已在過表達(overpress)胰島素受體的大鼠-1成纖維細胞中已經顯示出由肥胖癥蛋白產生的對膚島素受體和胰島素受體底物-1的胰島素刺激的磷酸化過程中的抑制作用(Kroder等，1996，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes，104，suppl 2，p66)。
4.置換結合與放射標記的leptin，例如[125I]-leptin一起溫浴細胞系后，可通過加入非標記的leptin研究與相對于非專一性結合的leptin的專一性結合。專一性/非專一的高比例結合提示該細胞系可能含有leptin受體。
5.通過使用選擇性抗體檢測肥胖癥蛋白受體的蛋白質功能形式，最好檢測蛋白質的功能持久形式。
6.通過Northen，RT-PCR或“狹縫印跡”分析檢測肥胖癥蛋白受體的mRNA功能形式，最好檢測mRNA的功能持久形式。
優選已知涉及控制那些正為之尋求化合物的特殊疾病狀態方面的細胞系。
從肝、腦或胰臟組織得到的細胞和成纖維細胞對適合于檢定針對肥胖癥和糖尿病的化合物的“肥胖癥反應”細胞特別有用。腦的某些區域是調節肥胖癥蛋白的作用的體重控制和能量平衡中心。肝控制許多調整脂肪和糖水平的代謝過程。從那些含適當內源性JAK，STAT蛋白和其他為介導leptin功能所必需的細胞內蛋白質的器官的特定區域衍生的細胞被優先考慮。
將所述反應元件、報道基因并優選啟動子適當的參入到能轉染肥胖癥反應細胞系的載體中。
適合的載體是市售載體如pGL-2為基礎的熒光素酶載體(Promega)。
該載體的適合的構型是啟動子和報道基因上游的STATDNA反應元件。所述載體的一種更適合的構型是在胸苷激酶啟動子和熒光素酶報道基因上游的多重串聯重復(2-10)的STAT DNA反應元件。
構建的載體含有一個報道基因例如螢火蟲熒光素酶或氯霉素乙酰轉移酶，與小啟動子例如單純皰疹病毒胸苷激酶或SV40啟動子相連。用位于所述小啟動子上游的適當限制酶位點可將STAT反應元件的DNA片段插入到所述載體中。
用常規表達技術按需要將反應元件、報道基因和啟動子結合到載體中，例如用位于小啟動子上游的適當限制酶位點可將反應元件的DNA片段插入到所述載體中。
按照Lamb等Blood，1994，8，2963和Seidel等，Proc.Nat.Acad.SciUSA，1995，92，3041中所述可構建STAT反應元件-熒光素酶報道基因系統。
采用標準方法例如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用STAT反應元件-小啟動子-熒光素酶報道基因構建體轉染肥胖癥反應細胞。為修正轉染效率的差異，可用表達β-半乳糖苷酶活性的參考質粒共轉染該細胞。在轉染期后(12-24小時)，用不同濃度的化合物處理該細胞然后收獲細胞并溶胞。檢定溶胞產物的熒光素酶活性并若適宜的話檢定β半乳糖苷酶活性。在評估和測定相對于單獨使用肥胖癥蛋白的熒光素酶反應的增強和降低時通過預加入或共加入適當濃度的肥胖癥蛋白到該化合物中可鑒定增強劑或拮抗劑活性。已有鑒定熒光素酶活性的標準方法例如Ow等，″Science，1986，234，856和Wet等，Mol.Cell Biol.1987，7，725以及幾種市售試劑盒。
通過用報道基因構建體和可選擇標記轉染“肥胖癥反應細胞系”可產生穩定的細胞系。常規使用的可選擇標記被用于產生穩定的細胞系如在重組DNA，第二版，J.D.Watson等1992，216頁中的描述。可將這些穩定的轉染細胞系用于產生模擬、增強或阻斷肥胖癥蛋白的生理作用的化合物的高產量檢定。
在用本文公開的方法檢定時，本發明還提供模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物。
本發明還提供適合本文公開的方法中使用的一套試劑盒。
在本文中使用的‘模擬肥胖癥蛋白生理作用的化合物’是指在缺少所述肥胖癥蛋白時能起到刺激肥胖癥蛋白受體以提供基本相同于肥胖癥蛋白的生理學作用或激活該受體下游反應(受體后)的作用的化合物。
在本文中使用的‘增強肥胖癥蛋白的生理作用的化合物’是指增強肥胖癥蛋白潛能和/或最大生理作用的化合物。
在本文中使用的‘抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物’是指降低或基本上阻斷肥胖癥蛋白的生理作用的化合物。
下述實施例解釋本發明實施例一般方法用含有多重串聯拷貝STAT反應元件的報道基因質粒轉染肥胖癥反應細胞，該反應元件位于小啟動子例如單純皰疹病毒胸苷激酶和熒光素酶基因報道基因上游，該質粒構建用標準方法例如磷酸鈣方法(Grahamand Van Der Eb，Virology，1973，53，456)。為修正轉染效率的差異，可用表達-半乳糖苷酶活性的參考質粒共轉染該細胞。轉染一段時間后(12-24小時) 用不同濃度的化合物處理細胞，然后收集并溶胞。檢定溶胞產物的熒光素酶活性，并且若合適時檢定β半乳糖苷酶活性。在評估和測定相對于單獨使用肥胖癥蛋白的熒光素酶反應的增強和降低的條件下通過預加入或共加入適當濃度的肥胖癥蛋白到該化合物中可鑒定增強劑或拮抗劑活性。已有鑒定熒光素酶活性的標準方法例如Ow等，″Science，1986，234，856和de Wet等，1987，7，725以及幾種市售試劑盒。
實施例采用標準方法例如磷酸鈣法(Graham and Van Der Eb，Virology，1973，52，456)，以報道基因質粒，即含有一插入寡核苷酸的pGL2為基礎的熒光素酶載體(promega)轉染從肝癌衍生的細胞系，該寡核苷酸對應于單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10)小啟動子上游的STAT反應元件，TTCCCGGAA的四重串聯重復序列。為修正轉染效率的差異，可用表達半乳糖苷酶活性的參考質粒共轉染該細胞。轉染一段時間后(12-24小時)用不同濃度的化合物處理細胞，然后收集并溶胞。檢定溶胞產物的熒光素酶活性，若合適時檢定β半乳糖苷酶活性。在評估和測量相對于單獨使用肥胖癥蛋白的熒光素酶反應的增強和降低時，通過預加入或共加入適當濃度的肥胖癥蛋白到該化合物中可鑒定增強劑或拮抗劑活性。已有檢定熒光素酶活性的標準方法例如Ow等，″Science，1986，234，856和de Wet等，Mol.cell biol，1987，7，725以及幾種市售試劑盒。
權利要求
1.一種檢測模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物的方法，該方法包括(a)針對模擬肥胖癥蛋白生理作用的化合物，評估該化合物對肥胖癥蛋白激活的信號轉導物和與報道基因偶聯的轉錄激活劑(STAT)DNA反應元件的作用；或(b)對增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物，評估該化合物對由肥胖癥蛋白提供的、對于與報道基因偶聯的肥胖癥蛋白激活的STATDNA反應元件的反應的作用；反應元件和報道基因在肥胖癥蛋白反應細胞系中表達。
2.一種符合權利要求1的方法，其中反應元件與啟動子基因偶聯，最好是小啟動子。
3.一種符合權利要求2的方法，其中反應元件是式TT(N)nAA的核苷酸，其中N是任一核苷酸并且n是4，5或6，最好是5。
4.一種符合權利要求2的方法，其中所述反應元件是式TTCCCGGAA核苷酸。
5.一種符合權利要求1的方法，其中報道基因是螢火蟲熒光素酶或氯霉素乙酰轉移酶。
6.一種符合權利要求1的方法，其中所述啟動子是單純皰疹病毒胸苷激酶或SV40啟動子。
7.一種符合權利要求1的方法，其中所述肥胖癥反應細胞系是肝或肝癌衍生的細胞系。
8.一種符合權利要求1的方法，其中所述反應元件，報道基因和啟動子被參入到能轉染肥胖癥反應細胞系的載體中。
9.一種符合權利要求8的方法，其中所述載體是pGL2為基礎的熒光素酶載體(Promega)。
10.一種符合權利要求8或權利要求9的方法，其中所述載體的構型是這樣的，即STAT DNA反應元件在啟動子和報道基因的上游。
11.適合在檢測模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白生理作用的化合物的方法中使用的一套試劑，所述方法包括(a)針對模擬肥胖癥蛋白生理作用的化合物，評估該化合物對肥胖癥蛋白激活信號轉導物和與報道基因偶聯的轉錄激活劑(STAT)DNA反應元件的作用；或(b)對增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物，評估該化合物對由肥胖癥蛋白提供的、對于與報道基因偶聯的肥胖癥蛋白激活的STATDNA反應元件的反應的作用；反應元件和報道基因在肥胖癥蛋白反應細胞系中表達。
全文摘要
一種模擬、增強或抑制肥胖癥蛋白生理作用的化合物的檢測方法,它包括:(a)針對模擬肥胖癥蛋白生理作用的化合物,評估該化合物對肥胖癥蛋白激活的信號轉導物和與報道基因偶聯的轉錄激活劑(STAT)DNA反應元件的作用;或(b)對增強或抑制肥胖癥蛋白的生理作用的化合物,評估該化合物對由肥胖癥蛋白提供的、對于與報道基因偶聯的肥胖癥蛋白激活的STAT DNA反應元件的反應的作用;在肥胖癥蛋白反應性細胞系中表達的反應元件和報道基因;適合用于此方法的一套試劑盒以及用此方法鑒定的一種化合物。
文檔編號C12Q1/68GK1192248SQ96195983
公開日1998年9月2日 申請日期1996年5月28日 優先權日1995年5月30日
發明者L·J·比萊, R·A·G·史密斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司