幽門螺桿菌抗原和疫苗組合物的制作方法

專利名稱：幽門螺桿菌抗原和疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供組成幽門螺桿菌抗原的重組多肽，所述抗原在分裂(桿狀)形式及靜止(球狀)形式的幽門螺桿菌的表面表達(dá)，并導(dǎo)致抗體的全身性和局部性(粘膜)的產(chǎn)生。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼所述多肽的核酸分子，以及載體和包含所述核酸分子的宿主細(xì)胞。所述重組多肽可用于診斷幽門螺桿菌感染以及用于生產(chǎn)引起抗所述感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，所述疫苗組合物適宜于治療和預(yù)防用途。
背景技術(shù)：
革蘭氏陰性菌幽門螺桿菌是一種參與多種胃十二指腸疾病的重要人類病原體。細(xì)菌在胃上皮的集群導(dǎo)致活性炎癥和進(jìn)行性慢性胃炎，并伴隨有大大增加的進(jìn)展為胃潰瘍疾病的危險(xiǎn)性。
為了在胃粘膜集群，幽門螺桿菌使用了許多毒性因子。這些毒性因子包括幾種粘附素，通過它細(xì)菌與粘膜相聯(lián)和/或與上皮細(xì)胞結(jié)合；脲酶，它幫助中和酸性環(huán)境；以及使粘膜變得更為流體化的蛋白水解酶。
盡管通過產(chǎn)生局部(粘膜)以及全身性抗體對(duì)幽門螺桿菌產(chǎn)生強(qiáng)而明顯的宿主免疫應(yīng)答，病原體仍存在于胃粘膜中，通常伴隨宿主終生，它的原因可能是自發(fā)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不足或指向了抗原的錯(cuò)誤表位。
為了弄清楚幽門螺桿菌感染的致病原因和免疫學(xué)，鑒定該細(xì)菌的抗原結(jié)構(gòu)是非常重要的。尤其是，需要表征表面暴露(如粘附素)和分泌蛋白，它在許多細(xì)菌病原體中已被顯示出組成主要的毒性因子，并它可用于診斷幽門螺桿菌和生產(chǎn)疫苗組合物。
Evans等(1993)細(xì)菌學(xué)雜志175，674-683公開了基因hpaA的克隆，該基因編碼幽門螺桿菌的結(jié)合N-乙酰神經(jīng)氨酸乳糖的原纖維血凝集素的20kDa受體結(jié)合亞基。
幽門螺桿菌的膜制品的單克隆抗體(MAbs)已被Blin等(1985)臨床微生物學(xué)雜志33，381-384所公開。其中MAbs的一種，稱為HP 30-1∶1∶6，與看來暴露于完整細(xì)菌表面并具有類似于粘附素性質(zhì)的30kDa蛋白質(zhì)反應(yīng)。
當(dāng)處于應(yīng)激或危險(xiǎn)狀態(tài)時(shí)，幽門螺桿菌細(xì)胞從桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙钚问健榍驙钚问綍r(shí)，幽門螺桿菌細(xì)胞對(duì)抗生素和其它抗細(xì)菌試劑不敏感。環(huán)境證據(jù)表明幽門螺桿菌可能借助于水或直接接觸以這種形式在各個(gè)體中傳播。因此，有效的疫苗組合物應(yīng)該引發(fā)針對(duì)球狀和桿狀幽門螺桿菌的免疫應(yīng)答。由于全身性免疫可能僅在抗粘膜感染的保護(hù)中起有限的作用，因此增強(qiáng)胃局部的保護(hù)性免疫機(jī)制的疫苗組合物也是非常重要的。
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供一種抗原性幽門螺桿菌多肽，它可用于引發(fā)針對(duì)幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答并用于診斷幽門螺桿菌感染，這一目的已通過重組克隆編碼表面暴露蛋白的幽門螺桿菌基因而實(shí)現(xiàn)。這一基因的核酸序列類似于由Evans等(1993)在細(xì)菌學(xué)雜志卷175，674-683中所公開的hpaA基團(tuán)。然而，雖然hpaA基因被報(bào)道編碼20kDa蛋白質(zhì)，但驚奇地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的DNA分子編碼分子量為29kDa的多肽。
29kDa多肽被表明為一種在幽門螺桿菌所有菌株，同時(shí)也在球狀細(xì)菌中表達(dá)的抗原性蛋白，并且它能在確定為產(chǎn)生抗體的宿主中引導(dǎo)粘膜及全身性免疫應(yīng)答。29kDa多肽在所有試驗(yàn)的幽門螺桿菌菌株中表達(dá)，針對(duì)此蛋白產(chǎn)生的抗體不與其它種類的通常內(nèi)源性人細(xì)菌或包括胃粘膜的被選擇的人組織發(fā)生交叉反應(yīng)。因此作為具有免疫原性特性的必需，非常保守的粘附素，29kDa多肽可用于檢測(cè)幽門螺桿菌感染以及用于生產(chǎn)疫苗組合物，當(dāng)該疫苗組合物以適宜的藥物制劑的形式提供時(shí)，將引發(fā)針對(duì)所述感染的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。
因此下面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明由于29kDa蛋白的單克隆抗體的結(jié)合導(dǎo)致小鼠中幽門螺桿菌集群的完全抑制，所以29kDa幽門螺桿菌蛋白對(duì)于幽門螺桿菌的感染和/或感染的持久性是非常重要的。而且，當(dāng)它被用作口服免疫原時(shí)，29kDa幽門螺桿菌蛋白起免疫應(yīng)答刺激劑的作用，其中免疫應(yīng)答在免疫前1個(gè)月被幽門螺桿菌感染的小鼠中導(dǎo)致幽門螺桿菌集群的明顯降低。
附圖簡(jiǎn)述

圖1包含編碼29kDa多肽的1.7kb幽門螺桿菌的1.7kb片段的質(zhì)粒pAE1的限制酶圖譜。陰影棒圖表明結(jié)構(gòu)基因的位置。T3和T7啟動(dòng)子序列的位置示于表明載體的黑色棒圖的上面。
圖2pS860，pS861，pS862和pS863的質(zhì)粒圖譜。實(shí)心箭頭lac操縱子啟動(dòng)子(Plac)或噬菌體T7RNA聚合酶啟動(dòng)子(T7啟動(dòng)子)?；疑珜?shí)心PCR產(chǎn)生的29kDa基因的5′-末端和3′-末端。終止子T7轉(zhuǎn)錄終止子。起點(diǎn)pBR322質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。
圖3單克隆抗體對(duì)幽門螺桿菌在BALB/c小鼠中的集群的作用。
圖4對(duì)幽門螺桿菌感染的BALB/c小鼠的治療性口服免疫。
發(fā)明的公開在本說明書全文，尤其是下面實(shí)施例中，術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)方案”和“標(biāo)準(zhǔn)方法”，當(dāng)其被用在分子克隆技術(shù)的內(nèi)容中，應(yīng)理解為在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中可找到方案和方法，如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約。
在第一重要方面，本發(fā)明提供了一種重組多肽，該多肽具有與分子量為約29kDa的幽門螺桿菌表面暴露抗原相同或基本上相似的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的所述表面暴露抗原尤其具有下面重要的特性·它為一種粘附素，對(duì)于胃粘膜集群非常重要·它在分裂(桿狀)形式以及靜止(球狀)形式的幽門螺桿菌的表面表達(dá)；·它是一種強(qiáng)的導(dǎo)致全身性和局部(粘膜)抗體產(chǎn)生的抗原；·它在所有試驗(yàn)的幽門螺桿菌菌株中是保守的；·29kDa的抗體不與多種不同的非螺桿菌細(xì)菌或與選擇的人組織，包括胃粘膜發(fā)生交叉反應(yīng)；·29kDa多肽被進(jìn)行了脂化和翻譯后修飾。多肽的這一特點(diǎn)對(duì)于它的免疫原性和它的幽門螺桿菌表面的適當(dāng)暴露可能是重要的?，F(xiàn)有技術(shù)業(yè)已知脂化修飾對(duì)于細(xì)菌脂蛋白的免疫性質(zhì)是必需(參見Weis，J.J.等(1994)感染和免疫，卷62，4632-4636)?！に煌茰y(cè)為毒性因子，其中術(shù)語“毒性因子”應(yīng)理解為特定地參與幽門螺桿菌與胃粘膜上皮表面的粘附和/或幽門螺桿菌感染的建立和維持的分子。
在一個(gè)優(yōu)選的形式中，所述多肽具有與序列表的SEQ ID NO2或4中位置1-260或28-260一致的氨基酸序列。如在實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)一步描述的。認(rèn)為SEQ ID NO2和4中的位置1-260代表未被酶切的蛋白質(zhì)，而位置1-27代表信號(hào)序列，位置28-260代表成熟多肽。SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的唯一不同在于SEQ IDNO2在位置222具有Ser殘基，而SEQ ID NO4在相同位置具有Arg殘基。
然而，根據(jù)本發(fā)明的多肽不嚴(yán)格限制在具有與序列表中SEQ IDNO2或4中的上述位置相同的氨基酸序列的多肽。而且本發(fā)明包括帶有如取代，小的缺失，插入或倒位的修飾的多肽，該多肽盡管如此仍基本上具有根據(jù)本發(fā)明的29kDa多肽的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括能在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)抗幽門螺桿菌和粘膜以及全身免疫應(yīng)答，能起粘附素的作用；和該多肽存在于桿狀和球狀幽門螺桿菌中。
本發(fā)明因而包括多肽，其中該多肽的氨基酸與序列表中SEQ IDNO2或4的位置1-260或位置28-260所示的氨基酸序列至少90％同源，優(yōu)選至少95％同源，而且該多肽基本上具有根據(jù)本發(fā)明的29kDa的生物活性。
本發(fā)明還包括長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸的肽，它包含根據(jù)本發(fā)明的29kDa多肽的免疫原性表位，并且保留了在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)抗幽門螺桿菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答的能力。該表位可單獨(dú)出現(xiàn)或以融合蛋白形式出現(xiàn)，其中表位被融合到無活性或免疫活性載體多肽上。這些表位的鑒定是根據(jù)針對(duì)29kDa多肽的不同片段的宿主產(chǎn)生的抗體的存在來進(jìn)行的。
獲得關(guān)于29kDa多肽的表位的結(jié)構(gòu)信息的一種方法是制備和表征與該多肽結(jié)合的單克隆抗體，接著通過如Pepscan分析對(duì)表位進(jìn)行酶譜分析?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法，如De St.Groth(1980)在免疫學(xué)方法雜志，卷35，1-21中描述的那些來制備單克隆抗體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有編碼上面定義的多肽的核苷酸序列的分離和純化的核酸分子。在本發(fā)明的一種優(yōu)選形式中，所述核酸分子為具有與序列表中SEQ ID NO1或3相同的核苷酸序列的DNA分子。然而，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子不嚴(yán)格局限于SEQ ID NO1或3所示序列。而且本發(fā)明還包括帶有如取代，小的缺失，插入或倒位的修飾的DNA分子，盡管如此該DNA分子仍編碼基本上具有根據(jù)本發(fā)明的29kDa多肽的生物活性的多肽。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，對(duì)于氨基酸序列沒有影響的AG和TC的取代，在幽門螺桿菌中不是不常見的。SEQ ID NO1和SEQ ID NO3之間唯一的不同在于SEQID NO1在位置1458具有一個(gè)A殘基，而SEQ ID NO3在相同位置具有一個(gè)C殘基。
本發(fā)明還包括由于遺傳密碼，其核苷酸序列被簡(jiǎn)并為SEQ IDNO1或3所示核苷酸序列的DNA分子。由于存在64個(gè)可能的密碼子，但只有20種天然氨基酸，因此，大多數(shù)氨基酸被多于1個(gè)的密碼子所編碼。在本領(lǐng)域中熟知遺傳密碼的這種天然的“簡(jiǎn)并性”或“豐余性”。因此應(yīng)理解示于序列表中的DNA序列僅僅是編碼上述多肽的大的但為確定的一組DNA序列中的一個(gè)實(shí)例。
因此，本發(fā)明包括選自下面的核酸分子(a)包含與序列表中的SEQ ID NO1或3的位置796-1572或874-1572相同或基本上相似的核苷酸序列的核酸分子；(b)包含能與(a)上定義的DNA分子的多肽編碼區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列的核酸分子，并且它編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能相當(dāng)?shù)男揎椥问?；?c)包含由于遺傳密碼的原因，被簡(jiǎn)并為如(a)和(b)中所定義的核苷酸序列的核酸序列的核酸分子，并且它編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能相當(dāng)?shù)男揎椥问健?br> 本發(fā)明的另一方面是包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體。該載體可優(yōu)選為質(zhì)粒載體pAE1(根據(jù)布達(dá)佩斯條約已保藏，保藏號(hào)為NCIMB40732)。
根據(jù)本發(fā)明的載體還可為可復(fù)制的表達(dá)載體，它帶有并且能介導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)。在本文中，術(shù)語“可復(fù)制”指載體可在其被導(dǎo)入其中的給定類型的宿主細(xì)胞中復(fù)制。載體的實(shí)例為病毒，如噬菌體，粘粒，質(zhì)粒和其它重組載體。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將核酸分子插入到載體基因組中。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體可優(yōu)選為pAL 301，pAL 302，pAL 303，pAL 304中的任何一種，較優(yōu)選pS863。
本發(fā)明還包括含有根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞，單細(xì)胞真核細(xì)胞或來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可因此為，例如細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞；來自啤酒糖酵母或巴斯德畢赤氏酵母的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞所采用的方法為熟悉重組DNA分子的人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制備上面所定義的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)用上面所定義的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，在一定條件下產(chǎn)生所述多肽，并回收所述多肽。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可為適宜于此目的的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適宜載體可為上述任何載體，并且適宜宿主細(xì)胞可為上面所列舉的任何細(xì)胞類型。構(gòu)建載體并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞所采用的方法可為在重組DNA領(lǐng)域公知用于此目的的任何方法。取決于細(xì)胞的類型和載體的組成，細(xì)胞表達(dá)的重組多肽可被分泌出來，即通過細(xì)胞膜被排出。
如果重組宿主在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多肽，即它不被細(xì)胞分泌，則它可通過標(biāo)準(zhǔn)方法來回收，這些方法包括通過機(jī)械方式進(jìn)行細(xì)胞破裂，如超聲處理或勻漿，或通過酶或化學(xué)方法，接著進(jìn)行純化。為了能被分泌出來，在編碼多肽的DNA序列之前應(yīng)有編碼信號(hào)肽的序列，它的存在確保多肽從細(xì)胞中分泌，這樣至少表達(dá)的大部分多肽被分泌到培養(yǎng)基中并被回收。
本發(fā)明的另一方面為根據(jù)本發(fā)明的多肽在治療中的應(yīng)用，在診斷哺乳動(dòng)物，包括人類中的幽門螺桿菌感染中應(yīng)用，以及在治療或預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一個(gè)重要方面是用于在哺乳動(dòng)物，包括人類中誘導(dǎo)抗桿狀和/或球狀幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物。該疫苗組合物包含免疫原性有效量的上述多肽，包括包含免疫原性表位的29kDa多肽的至少一部分，或保持誘導(dǎo)抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫能力的修飾形式的所述多肽。術(shù)語“修飾形式”包括，但不局限于為翻譯后修飾，例如脂化形式的多肽，已認(rèn)為29kDa蛋白為脂化形式，參見下面實(shí)施例4。
疫苗組合物任選還包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，或其它用于預(yù)防或治療目的的免疫活性抗原。生理上可接受的載體和稀釋劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括如磷酸緩沖生理鹽水(PBS)，或在為口服疫苗時(shí)，HCO3-為基本組分的制劑或腸衣包被的粉劑。
該疫苗組合物任選包括或與酸分泌抑制劑，優(yōu)選質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，例如奧美拉唑一起服用。該疫苗可被配制在已知的運(yùn)輸系統(tǒng)中，例如脂質(zhì)體，ISCOMs，螺旋體(cochleates)等中(參見如Rabinovich等(1994)科學(xué)265，1401-1404)或與具有可降解或不可降解性質(zhì)的聚合物微球相連或包括在其中?？乖膳c活的減毒細(xì)菌，病毒或噬菌體或與相同種類的被殺死的載體相連。
如下面實(shí)驗(yàn)部分所證實(shí)的，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可用于治療和預(yù)防目的。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選對(duì)哺乳動(dòng)物的粘膜給藥，例如頰，鼻，扁桃體，胃，腸(小和大腸)，直腸和陰道粘膜。粘膜疫苗可與用于此目的的適宜的佐劑一起給藥。疫苗還可通過皮下，皮內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑任選與適宜佐劑一起經(jīng)胃腸外給藥。
產(chǎn)生針對(duì)29kDa多肽的免疫應(yīng)答的另一個(gè)方法是使用已知為“核酸接種”或“裸露DNA”接種的方法?，F(xiàn)有技術(shù)已知將編碼感興趣抗原的質(zhì)粒DNA注射到肌肉中可導(dǎo)致抗原的持續(xù)表達(dá)和免疫應(yīng)答的產(chǎn)生(參見如Rabinovich等，上文)。幾種給藥途徑是可能的，例如胃腸外，粘膜或借助于運(yùn)送少量DNA被包被的金粒的“基因槍”(Fynan等(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，90，11478-11482)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可在包含適宜真核啟動(dòng)子的質(zhì)粒中表達(dá)，接著可將“裸露DNA”進(jìn)行肌肉內(nèi)注射或借助于“基因槍”進(jìn)行真皮內(nèi)給藥。表達(dá)蛋白的表位通過細(xì)胞表面的MHC分子表達(dá)，并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是前面段落公開的核酸分子和載體在治療中的應(yīng)用，尤其是作為疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面還有是該核酸分子和載體在制備用于治療，預(yù)防或診斷幽門螺桿菌感染的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是如上面所定義的多肽，或保持誘導(dǎo)抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫能力的修飾形式的所述多肽在制備用于治療，預(yù)防或診斷幽門螺桿菌感染的組合物中的應(yīng)用。該組合物尤其包括引發(fā)抗桿狀和/或球狀形式的幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物。本發(fā)明還包括在生產(chǎn)用于診斷幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒中的應(yīng)用。下面將進(jìn)一步描述該診斷試劑盒。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物，包括人類中引發(fā)抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用免疫有效量的上面定義的疫苗組合物。術(shù)語“免疫有效量”指引發(fā)顯著的保護(hù)性幽門螺桿菌應(yīng)答，除去被感染的哺乳動(dòng)物中的幽門螺桿菌感染或預(yù)防易感哺乳動(dòng)物感染的量。通常，對(duì)于口服給藥，免疫有效量將包含約1μg-100mg，優(yōu)選約10μg-10mg的幽門螺桿菌抗原，或?qū)τ谖改c外給藥，約小于100μg。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種體外診斷幽門螺桿菌感染的方法，包括至少使用上面所定義的，包括29kDa多肽的一部分，其中該部分包含免疫原性表位的多肽這一步驟。可任選將多肽標(biāo)記和/或偶聯(lián)至固相載體上。診斷的方法可如包括步驟(a)將任選與固相載體結(jié)合的所述多肽與從哺乳動(dòng)物提取的體液接觸，和(b)檢測(cè)來自所述體液，與所述多肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的檢測(cè)抗體的方法為現(xiàn)有技術(shù)中熟知的ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)。
在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物，包括人類中的幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒，該診斷試劑盒包含使得上面說明的診斷方法得以進(jìn)行的組分。
實(shí)施例實(shí)施例1來自幽門螺桿菌的29kDa多肽的克隆和表達(dá)1.1.細(xì)菌菌株，載體和生長(zhǎng)條件在微需氧的空氣下，將幽門螺桿菌CCUG 17874(＝NTCC 11637)培養(yǎng)在馬血瓊脂平板上。大腸桿菌菌株XL1-Blue MRF′和XLOLR(Stratagene，La Jolla，加利福尼亞)被用作克隆實(shí)驗(yàn)的宿主菌株，并且當(dāng)被用于λ感染時(shí)，將其培養(yǎng)在Luria-Bertani肉湯(LB)或補(bǔ)充有0.2％麥芽糖和10mM MgSO4的NZY培養(yǎng)基中。從Stratagene獲得λ表達(dá)載體ZAP ExpressTM和它的噬粒衍生物pBK-CMV。1.2.DNA技術(shù)通過將來自保溫48小時(shí)平板的細(xì)菌懸浮于50mM Tris-HCl，pH8.0，25％蔗糖，含有10mg/ml溶菌酶，和5ng/ml無DNA酶的RNA酶(Boehringer Mannheim Scandinavia AB，Bromma，瑞典)的50mMEDTA中從幽門螺桿菌制備染色體DNA。37℃下，將懸浮液保溫10小時(shí)。加入等體積的溶菌緩沖液(在50mM Tris-HCl，pH8.0中0.4％Triton X100；和62.5mM EDTA)，室溫下保溫懸浮液，直至產(chǎn)生顯著的細(xì)菌溶胞。然后以三個(gè)步驟分別用緩沖的苯酚(pH8.0)，苯酚/氯仿和氯仿抽提懸浮液。將DNA從水相中沉淀并溶解在TE緩沖液中(10mM Tris-HCl，pH8.0；和1mM EDTA)。
限制酶購自Boehringer Mannheim Scandinavia AB，并按照制造商說明來使用。
用Wizard盒(Promega，Madison，Wisconsin)純化質(zhì)粒和λNDA。使用Sequenase 2.0盒(Amersham，Sweden AB Solna，瑞典)進(jìn)行序列測(cè)定。寡核苷酸購自Innovagen，Lund，瑞典。使用Taq DNA聚合酶(Boehringer-Mannheim Scandinavia AB)進(jìn)行PCR。1.3.幽門螺桿菌基因組文庫的構(gòu)建從部分Sau3A酶切的幽門螺桿菌17874 DNA純化大小為2-12kb的染色體DNA片段，并如Stratagene方法中所描述的將其克隆至BamHI消化的ZAP ExpressTM載體中。體外包被后，通過感染菌株XL-1BlueMRF，并被接種到包含異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的指示平板上來滴定文庫。文庫的效價(jià)為1.2×106PFU/ml，具有85％重組體。
通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，使用MAb HP30-1∶1∶6(Blin等(1995)臨床微生物學(xué)33，381-384)的免疫篩選檢測(cè)表達(dá)29kDa多肽的噬菌斑。分離陽性噬菌斑，重復(fù)接種和使用MAb的篩選，直至獲得純的噬菌斑。使用ExAssist方法(Stratagene)完成向噬菌體質(zhì)粒嵌合體形式的ZAP表達(dá)克隆的轉(zhuǎn)化。1.4.免疫印跡和斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)將包含具有圖1描繪的來自幽門螺桿菌17874的克隆插入片段的質(zhì)粒的大腸桿菌XLOLR的過夜培養(yǎng)物以1∶100稀釋在5ml具有50mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在37℃下保溫，直至600nm的OD為0.7。加入IPTG至最終濃度為1mM，將細(xì)菌再培養(yǎng)2小時(shí)。類似地培養(yǎng)沒有IPTG的培養(yǎng)物。離心培養(yǎng)物并重新懸浮于1/10的體積中。將10μl懸浮液與等體積的2×樣品緩沖液混合，煮沸并用SDS-PAGE分析。將以相同方式，但沒有卡那霉素培養(yǎng)的菌株XLOLR用作陰性對(duì)照。幽門螺桿菌17874在PBS中的懸浮液(OD＝1.0，600nm)被用作陽性對(duì)照。
在固定分布于硝酸纖維素片上的蛋白后，如前所述(Blin等，1995)進(jìn)行與以1∶10稀釋的29kDa多肽特異性MAb HP30-1∶1∶6的反應(yīng)，通過使用用過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG檢測(cè)結(jié)合的抗體。用過氧化氫底物和4-氯萘酚色素原(BioRad Svenska AB)使濾膜顯色。
使用上述菌株的過夜培養(yǎng)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)。將2μl懸浮液放在硝酸纖維素過濾器上，空氣干燥并與以1∶10稀釋的MAb HP30-1∶1∶6保溫1小時(shí)。如免疫印跡所描述的進(jìn)行后面的步驟。1.5.分子克隆將來自幽門螺桿菌菌株17874的部分消化的染色體DNA克隆至λ表達(dá)載體中(ZAP ExpressTM)。在篩選24000個(gè)噬菌斑與29kDa多肽特異性MAb的反應(yīng)后，檢測(cè)到4個(gè)表達(dá)29kDa多肽的噬菌斑。純化陽性噬菌斑，克隆片段的大小通過對(duì)DNA制備用XbaI和SalI進(jìn)行消化來測(cè)定。插入片段的大小為3.7-1.78kb。在從4個(gè)陽性噬菌斑體內(nèi)切除pBK-CMV噬菌體質(zhì)粒嵌合體之后，構(gòu)建限制性酶圖譜并與λ載體中的插入片段比較。噬菌體質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)包含與λ載體中的相同大小的重疊DNA片段。除開SmaI和NheI，試驗(yàn)的大多數(shù)限制酶不酶切克隆片段。
被進(jìn)一步分析的最小的被克隆的1.7片段(pAE1)的限制圖譜示于圖1中。一種克隆插入片段與載體啟動(dòng)子的方向相反。當(dāng)包含這些質(zhì)粒的大腸桿菌菌株的全細(xì)胞提取物被用MAb HP30-1∶1∶6進(jìn)行免疫印跡分析時(shí)，它們被發(fā)現(xiàn)均表達(dá)具有與幽門螺桿菌17874相同分子量的多肽。當(dāng)載體啟動(dòng)子用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，在29kDa多肽表達(dá)中未發(fā)現(xiàn)有不同。這表明該基因從它本身的啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建三個(gè)包含圖1說明的DNA片段的亞克隆并檢測(cè)29kDa多肽的表達(dá)。沒有克隆表達(dá)多肽。當(dāng)XLOLR(pAE1)被在斑點(diǎn)印跡測(cè)定(Blin等，1995)中檢測(cè)并與幽門螺桿菌進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)為弱陽性，表明一些表達(dá)多肽可能暴露于表面。1.6.DNA序列分析使用T3-和T7-特異性引物對(duì)pAE1的1.7kb插入片段的兩條鏈和亞克隆進(jìn)行序列測(cè)定，并當(dāng)必要時(shí)，輔以特定引物以覆蓋用標(biāo)準(zhǔn)引物不能得到的序列區(qū)。計(jì)算機(jī)分析表明序列(SEQ ID NO1)一條鏈上包含覆蓋用于亞克隆的限制性酶位點(diǎn)(圖1)的780bp的開放讀框(ORF)。可鑒定推測(cè)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SEQ ID NO1的位置782-785)。ORF編碼分子量為29，126Da的多肽的260個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)。氨基酸序列被發(fā)現(xiàn)包含27個(gè)氨基酸的可能的信號(hào)序列。序列Leu-Val-Gly-Cys(SEQ ID NO2和4中的位置25-28)為選定為酶信號(hào)肽酶II的識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)共有序列(Leu-X-Y-Cys)。信號(hào)肽酶II酶切脂蛋白原中的半胱氨酸殘基前的信號(hào)序列。信號(hào)肽的表征由于表明29kDa蛋白為脂蛋白，成熟蛋白包含氨基酸28-260。1.7.重組29kDa多肽在大腸桿菌中的表達(dá)重組29kDa多肽在大腸桿菌N4830-1中，從表達(dá)載體構(gòu)建物pAL30高濃度產(chǎn)生，其中該表達(dá)載體構(gòu)建物包含29kDa多肽的全部基因(SEQ ID NO1和3中的位置771-1667)。用于構(gòu)建物的載體為包含強(qiáng)λPL的啟動(dòng)子的pML-LCTBλ7(從Michael Lebens獲得，Gothenburg大學(xué)，瑞典)。載體還包含產(chǎn)生氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因。插入在載體中λPL啟動(dòng)子和終止區(qū)之間的LCTB基因(編碼霍亂毒素和它的信號(hào)肽)被通過用限制酶SmaI和HindIII酶切從載體中切除。
通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼29kDa多肽，包括其信號(hào)序列的結(jié)構(gòu)基因。使用的引物為結(jié)合ATG起始密碼子上游271bp的HP30N(GGC GTA GAA ATG GAA GCG C；對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1和3的位置522-540)和識(shí)別起始密碼子下游855bp的DNA片段(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1和3中的位置1648-1667)的HP30C(CCC AAGATT CAT CAG CCC TTA AAT ACA CG)。HP30C引物包含HindIII酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)通過PCR反應(yīng)被加至29kDa多肽基因的序列中。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為1.1kb。將該DNA片段用產(chǎn)生與載體片段(2.7kb)相連的0.9kb片段的SspI和HindIII酶切。通過電穿孔將現(xiàn)稱為pAL30(3.6kb)的載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌N 4830-1中。找到4個(gè)陽性克隆(pAL301，2，3，4)。
為了誘導(dǎo)重組多肽的表達(dá)，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的1×LB中，將包含pAL301-4的N 4830-1細(xì)胞在30℃培養(yǎng)過夜(在此溫度下λcI阻遏物抑制轉(zhuǎn)錄)。將少部分這種過夜培養(yǎng)物接種在含有氨芐青霉素的5ml 1×LB中，30℃下培養(yǎng)細(xì)胞，直至600nm處的OD為約0.7。接著將溫度升至+42℃，其中阻遏物失活，并再保溫2小時(shí)。
在14％SDS-PAGE和通過使用對(duì)29kDa多肽特異性的單克隆抗體HP30-1∶1∶6的免疫印跡分析在保溫前和后取樣的樣品。在誘導(dǎo)后，用于免疫印跡的三種被誘導(dǎo)克隆(pAL301，3和4)均表達(dá)大量的重組多肽。來自未誘導(dǎo)細(xì)胞的懸浮液僅包含少量的29kDa多肽。
選擇克隆pAL301用于進(jìn)一步分析。為了證實(shí)克隆確定包含編碼29kDa多肽的基因，對(duì)插入載體中的片段的末端進(jìn)行序列測(cè)定。證實(shí)插入到表達(dá)載體中的序列對(duì)應(yīng)于克隆的PCR片段的預(yù)期序列。實(shí)施例2在各種培養(yǎng)條件下，表達(dá)29kDa多肽的動(dòng)力學(xué)使用幽門螺桿菌的兩個(gè)菌株，即CCUG 17874(實(shí)驗(yàn)室菌株)和Hel73(最近從患有十二指腸潰瘍的病人中分離)。在血液瓊脂平板以及補(bǔ)充有環(huán)狀糊精的Brucella Broth中進(jìn)行培養(yǎng)。將所有培養(yǎng)物保溫在由5％O2，10％CO2和85％N2組成的微氧空氣中。2、4和7天后收獲細(xì)菌，在PBS中洗滌一次，并置于-20℃下用于后面的分析。通過采用如前所述的用于檢測(cè)針對(duì)多肽的大腸桿菌表面抗原(Lopez-Vidal，Y和Svennerholm，A-M.，臨床微生物學(xué)雜志28，1906-)的特異性的單克隆抗體的抑制ELISA來分析29kDa表面多肽的表達(dá)。這些抗體還用于免疫電鏡中。
當(dāng)CCUG 17874在血液瓊脂平板以及brucella肉湯中培養(yǎng)7天時(shí)，約70％的細(xì)菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀。這種轉(zhuǎn)變?cè)贖el 73中在3天后即已發(fā)生。抑制ELISA顯示在7天中，在來自平板和肉湯培養(yǎng)物的樣品中具有相當(dāng)恒定濃度的29kDa多肽。通過免疫電鏡證實(shí)了多肽的存在。發(fā)現(xiàn)29kDa多肽被很好地保存在棒狀形式的幽門螺桿菌中。發(fā)現(xiàn)29kDa多肽在Hel 73中多于CCUG 17874。實(shí)施例3針對(duì)29kDa多肽的抗體應(yīng)答用來自患有十二指腸潰瘍(n＝19)，無癥狀幽門螺桿菌攜帶者(n＝18)和未感染年齡匹配的對(duì)照(n＝20)中的血清和胃提出物測(cè)定針對(duì)29kDa多肽的抗體應(yīng)答。
通過不同的ELISA方法用來自三組個(gè)體的胃提出物和血清檢測(cè)針對(duì)29kDa多肽的抗體水平。與健康的對(duì)照個(gè)體相比，大多數(shù)感染個(gè)體在血清和胃提出物中具有明顯較高水平的針對(duì)29kDa多肽的特異性抗體。無癥狀攜帶者的抗體效價(jià)與有癥狀的病人類似。實(shí)施例4用[3H]棕櫚酸標(biāo)記多肽由于29kDa多肽的氨基酸序列包含在脂蛋白中常見的可能的信號(hào)肽，研究了對(duì)蛋白用放射性棕櫚酸標(biāo)記。
30℃下，將缺少或帶有pAL301的大腸桿菌N 4830-1培養(yǎng)在補(bǔ)充有50μg羧芐青霉素的LB肉湯中。在細(xì)胞密度為108細(xì)菌/ml時(shí)，加入[3H]棕櫚酸(5mCi/ml；DuPont NEN，Boston，MA)直至最終濃度為50μCi/ml，將溫度升至+42℃，并將培養(yǎng)物再培養(yǎng)12小時(shí)。離心收集細(xì)胞，并在SDS-PAGE溶菌緩沖液中溶菌。電穿孔后，通過將凝膠浸沒在AmplifyTM(Amersham International，UK)30分鐘加工用于flougraphy，在玻璃紙片間干燥，并在-70℃下，將凝膠對(duì)X-射線膠片曝光36小時(shí)。
結(jié)果表明29kDa多肽被脂化，從而被進(jìn)行了翻譯后修飾。實(shí)施例5表達(dá)重組29kDa多肽的大腸桿菌的Triton X-114分配在30℃下，將帶有pAL301的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有50μg羧芐青霉素/ml的LB肉湯中。在細(xì)胞密度為108細(xì)菌/ml時(shí)，將溫度升至42℃，并將培養(yǎng)物再保溫3小時(shí)。離心(11,3000×g，10分鐘，+4℃)收集細(xì)胞，并以每克細(xì)胞沉淀對(duì)應(yīng)于25ml PBS的量重新懸浮于PBS中。冷凍懸浮液并隨后在室溫下融化，并加入25μl DNAse(10μg/μl)。室溫下，通過倒轉(zhuǎn)30分鐘輕輕搖振樣品，冷卻至8-12℃，接著加入Triton X-114(最終濃度為0.3％)。在4℃，通過輕輕倒轉(zhuǎn)保溫3小時(shí)后，通過離心收集不溶物(18,900×g，10分鐘，+25℃)。
通過SDS-PAGE分析各相體，29kDa多肽的鑒定通過使用MAbHP30-1∶1∶6的Western印跡來證實(shí)。結(jié)果表明29kDa多肽出現(xiàn)在去污劑相中，它被證實(shí)為脂蛋白。現(xiàn)有技術(shù)中已知通常在去污劑相中回收內(nèi)在膜蛋白(Bordier，C.(1981)生物化學(xué)雜志，卷256，1604-1607)。
該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)插入到大腸桿菌中的質(zhì)粒可表達(dá)和產(chǎn)生29kDa蛋白。由于幽門螺桿菌生長(zhǎng)不是太好或太快，這對(duì)于今后大規(guī)模生產(chǎn)疫苗是很重要的。實(shí)施例6構(gòu)建用于產(chǎn)生高水平的幽門螺桿菌29kDa蛋白的表達(dá)載體pS8636.1.pS860的制備為了產(chǎn)生29kDa基因5′-末端的方便的限制性位點(diǎn)，合成了兩個(gè)用于PCR擴(kuò)增的合成寡核苷酸。質(zhì)粒pS852(等于實(shí)施例1.7中描述的質(zhì)粒pAL301)被用作PCR擴(kuò)增的模板。這兩個(gè)寡核苷酸的序列列在下面EcoRI NdeI5′-CGGAATTCCATATGAGAGCAAATAATCATTTTAAAG-3′BamHI XmaI NheI5′-GCGGATCCCCCGGGGCTAGCTGGATGGTAATTCAATTTC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將169bp擴(kuò)增片段連接到TA載體中(Mead，D.A等(1991)生物/技術(shù)9，657-663)。構(gòu)建的質(zhì)粒稱為pS860(圖2)。構(gòu)建的序列通過雙脫氧序列測(cè)定來證實(shí)(Sanger等(1977)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊74，5463-5467)。6.2.pS861的制備為了改變29kDa的3′-末端的限制性位點(diǎn)，合成了兩個(gè)用于PCR擴(kuò)增的合成寡核苷酸。質(zhì)粒pS852(pAL301)被用作PCR擴(kuò)增的模板。兩個(gè)寡核苷酸的序列列于下面EcoRI XmaI5′-CGGAATTCCCCGGGTTATTATTCTCCACCGG-3′PstI BamHI5′-CGCTGCAGGGATCCTTATTATCGGTTTCTTTTGCCTTTTAA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用產(chǎn)生357bp片段的XmaI和BamHI消化擴(kuò)增片段。將該片段克隆至pUC19中，構(gòu)建的質(zhì)粒稱為pS861(圖2)。通過雙脫氧序列分析證實(shí)構(gòu)建的序列(Sanger等(1977)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊74，5463-5467)。6.3.質(zhì)粒pS862的制備通過凝膠電泳，從質(zhì)粒pS852(pAL301)中，以280bp NheI/XmaI片段分離編碼29kDa中間部分的cDNA。將該片段與來自pS861的357bp XmaI/BamHI片段和來自pS861的4061bp NheI/BamHI片段連接在一起。產(chǎn)生的質(zhì)粒作為pS862(圖2)。6.4.質(zhì)粒pS863的制備此后，從pS862中分離795bp NdeI和BamHI限制性片段，并將其與來自T7載體pS637的4kb NdeI/BamHI片段相連(Studier，F(xiàn).W.等(1990)酶學(xué)方法185，60-89)。產(chǎn)生的表達(dá)載體稱為pS863(圖2)。實(shí)施例7重組幽門螺桿菌29kDa脂蛋白的純化7.1.宿主菌株和細(xì)菌培養(yǎng)物將表達(dá)載體pS863轉(zhuǎn)化到下面大腸桿菌宿主菌株中；BL21(DE3)；BL21(DE3)pLysS；和BL21(DE3)pLysE?；旧先鏢tudier等描述的(酶學(xué)方法，185，60-89，1990)進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞培養(yǎng)在包含50μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中(Ausubel，F(xiàn).M.等(編)現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons，New York，1992)。此外，當(dāng)使用BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3)pLysS，在培養(yǎng)基中添加30μg/ml氯霉素。為了誘導(dǎo)T7表達(dá)系統(tǒng)，讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)至OD600大約密度＝0.5，并接著添加0.4mM IPTG用于誘導(dǎo)。誘導(dǎo)約180分鐘后收獲細(xì)胞。產(chǎn)生最高表達(dá)水平的宿主菌株為BL21(DE3)pLysS。7.2.幽門螺桿菌29kDa脂蛋白的純化如上所述培養(yǎng)用質(zhì)粒pS863轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS培養(yǎng)物，通過離心收集細(xì)胞，并重新懸浮于冷緩沖液中(500mM Tris-HCl，2mM EDTA，10mM NaCl，pH 8.0)。每克沉淀(濕重)加入35ml緩沖液。7.2.1.Triton X-114提取為了提取脂蛋白，加入Triton X-114(TX-114)至最終濃度為1.5％(v/v)，并在0℃下，將懸浮液攪拌1小時(shí)。通過以18,900×g離心10分鐘沉淀不溶于Triton的物質(zhì)。在一些情況下，用包含緩沖液的一半體積的TX-114將沉淀再提取一次。第二次TX-114提取后，棄去沉淀。
通過在+30℃下，伴隨偶爾攪拌將它保溫15分鐘，獲得來自TX-114提取的上清的相分配。收集下層的去污劑相，并用冷緩沖液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，10mM NaCl，pH 8.0)稀釋至1％TX-114。7.2.2.Q-瓊脂糖，pH 8.0將稀釋的TX-114-相上樣至用緩沖液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，10mM NaCl，0.1％Triton X-100，pH 8.0)平衡的Q-瓊脂糖柱上(Pharmacia)(20ml/3g細(xì)胞沉淀)。收集作為非結(jié)合級(jí)分的29kDa脂蛋白。通過30℃下，伴隨偶爾攪拌將其保溫直至溶液變?yōu)榛鞚?，將該?jí)分進(jìn)行相分配。通過30℃下，以31,300×g離心30分鐘分離兩相。收集下層的去污劑相，并用冷緩沖液(10mMTris-HCl，2mM EDTA，pH 8.6)稀釋至TX-114濃度為1％。7.2.3.Q-瓊脂糖，pH 8.6將稀釋的TX-114-相上樣至用緩沖液(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH 8.6)平衡的100ml Q-瓊脂糖柱上(Pharmacia)。未結(jié)合級(jí)分包含TX-114。將柱用緩沖液A(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH 8.6)洗滌。通過緩沖液B(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，1MNaCl，pH 8.6)的鹽梯度來收集29kDa脂蛋白。梯度如下；0-50％B，40ml；50-100％B，100ml。在60-70％B之間洗脫29kDa脂蛋白。7.2.4.SDS-PAGE和蛋白質(zhì)電泳印跡法將來自不同純化步驟的蛋白樣品溶解在樣品緩沖液中(50mMTris-HCl，pH 6.8，8％甘油，1.6％SDS，4％β-巰基乙醇，0.02％溴酚蘭)，并在Novex預(yù)制梯度凝膠(4-20％聚丙烯酰胺)或BioRad預(yù)制梯度凝膠(10-20％聚丙烯酰胺)上分離。電泳分離緩沖液包含25mM Tris，192mM甘氨酸，0.5％SDS，pH 8.3。將凝膠用0.1％考馬斯亮蘭R-250的40％甲醇，10％乙酸溶液染色，用10％甲醇，10％乙酸脫色。
將用于半干燥電泳印跡法的凝膠不被染色但浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中(48mM Tris，38mM甘氨酸，0.075％SDS，20％MeOH)，并通MeOH過SemiDry電泳印跡裝置(BioRad)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Immobilon，Millipore，USA)。通過首先將PVDF膜在BSA為2％的TBS中(50mM Tris-HCl，2.5M NaCl，pH 8.2)封閉1小時(shí)，接著將膜與被其中BSA為1％的TBS以1∶10稀釋的抗29kDa脂蛋白的特異性單克隆抗體(IgG1)一起保溫1小時(shí)來完成免疫檢測(cè)。在用TBS進(jìn)行洗滌步驟之后，將膜與堿性磷酸酶結(jié)合的抗小鼠IgG抗體(Dakopatts，丹麥)一起保溫1小時(shí)。再洗滌一次后，將膜用適宜底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和氮藍(lán)四唑(NBT)(Sigma)顯色。7.2.5.蛋白質(zhì)濃縮和熱原性通過二辛可寧酸方法(BCA蛋白質(zhì)分析，Pierce化學(xué)公司，美國(guó))測(cè)定總的蛋白濃度。
通過色素原鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)試驗(yàn)(LAL COAMATIC內(nèi)毒素，Endosafe Inc美國(guó))分析內(nèi)毒素含量。
掃描染色的SDS-凝膠(RioRad Imager GS-)以確定在最終制備物中的蛋白污染物的相對(duì)量。制備物包含＜10％蛋白污染物。實(shí)施例8用作疫苗的幽門螺桿菌29kDa蛋白的分析8.1.材料和方法8.1.1.動(dòng)物雌性SPFBALB/c小鼠購自Bomholt飼養(yǎng)中心(丹麥)。將它們飼養(yǎng)在自由供給水和食物的普通聚碳酸酯籠子中。到達(dá)時(shí)動(dòng)物為4-6周齡。8.1.2.感染在適應(yīng)環(huán)境最少一周后，將動(dòng)物用一種類型的幽門螺桿菌的2個(gè)菌株(菌株244，最初從潰瘍病人中分離)感染。該菌株已較早地被證實(shí)為是小鼠胃的良好的集群者。37℃下，在微氧空氣中(10％CO2，5％O2)，將細(xì)菌在補(bǔ)充有10％胎牛血清的Brucella肉湯中培養(yǎng)過夜。對(duì)動(dòng)物施用口服劑量的奧美拉唑(400mmol/kg)，并在3-5小時(shí)后口服接種幽門螺桿菌(約108cfu/動(dòng)物)。接種2-3周后，檢查對(duì)照動(dòng)物中的感染。8.1.3.免疫在34天期間將動(dòng)物免疫4次(第1，15，25和35天)。以100μg/小鼠的劑量施用純化的抗原，并以0.5mg/劑的劑量施用膜蛋白。膜蛋白通過在PBS超聲破碎細(xì)菌來制備。通過4℃下，以2000rpm將超聲破碎物離心5分鐘除去碎片。將上清轉(zhuǎn)移至一新的試管中，4℃下，以15,000rpm離心20分鐘?；厥粘恋聿①A存于-70℃，直至使用。
作為佐劑，每次免疫時(shí)還可對(duì)動(dòng)物施用10μg霍亂毒素(CT)/小鼠。作為保護(hù)抗原免受酸降解的方式，可在免疫前3-5小時(shí)給動(dòng)物口服施用Omeprazole(400μmol/kg)。最后免疫4周后，將動(dòng)物殺死。8.1.4.被動(dòng)保護(hù)為了分析單克隆抗體(MAbs)對(duì)幽門螺桿菌在小鼠胃集群的能力的影響，在如上所述的接種之前10分鐘，將具有不同特異性的MAbs與幽門螺桿菌混合物。使用抗29kDa蛋白的單克隆抗體(HP30-1∶1∶6)；抗脲酶的單克隆抗體(Ure8∶1)；和抗大腸桿菌熱穩(wěn)定蛋白的單克隆抗體(ST1∶3)。用ELISA滴定MAbs以使得在實(shí)驗(yàn)中采用等量的各種單克隆抗體。107細(xì)菌/小鼠的量被用于接種。接種2周后，將動(dòng)物殺死。8.1.5.感染的分析用CO2和頸錯(cuò)位殺死小鼠。打開腹部，取出胃。在沿大彎切下胃之后，將其在生理鹽水中漂洗。分別用外科解剖刀從25mm2面積的竇和胃體刮取粘膜。將粘膜的刮取物懸浮于Brucella肉湯中并接種到BloodSkirrow平板上。在微氧條件下將平板保溫3-5天，計(jì)數(shù)集群的數(shù)量。通過脲酶和過氧化氫酶試驗(yàn)以及直接顯微鏡或革蘭氏染色來確定幽門螺桿菌的同一性。8.2.結(jié)果8.2.1.被動(dòng)保護(hù)各組均有10只動(dòng)物的三個(gè)組被施用幽門螺桿菌菌株244和MAb的混合物，一個(gè)組僅被施用幽門螺桿菌。在被接種至小鼠中之前，讓MAb和細(xì)菌的混合物反應(yīng)10分鐘。在體外，采用的MAbs未對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生任何明顯的效果。接種2周后，將動(dòng)物殺死，確定每組的感染比例(圖3)。對(duì)照組所有的小鼠和接種了ST MAb的那些被感染。在脲酶MAb組，所有小鼠被感染，但與對(duì)照相比，程度明顯較低。在接種了抗29kDa蛋白的MAb的組中，沒有小鼠被感染。8.2.2.治療免疫在免疫前1個(gè)月，將本研究中的動(dòng)物用幽門螺桿菌244感染。接著將10組小鼠用霍亂毒素(CT)或CT與膜蛋白，脲酶或29kDa蛋白一起免疫。對(duì)照動(dòng)物接受僅(PBS)的溶液。最終免疫1個(gè)月后，將動(dòng)物殺死并測(cè)定CFU(圖4)。所有對(duì)照動(dòng)物以及僅用CT免疫的那些均被感染。與對(duì)照相比，用脲酶和CT，或用29kDa蛋白和CT進(jìn)行活性免疫的動(dòng)物具有明顯降低的CFU值。僅脲酶免疫組中的一個(gè)動(dòng)物被完全治愈感染。8.3.結(jié)論上面結(jié)果表明由于MAb與該結(jié)構(gòu)的結(jié)合導(dǎo)致集群的完全抑制，所以29kDa幽門螺桿菌蛋白對(duì)于集群和/或感染的維持是非常重要的。
而且，當(dāng)與作為口服佐劑的霍亂毒素結(jié)合被用作口服免疫原性，29kDa幽門螺桿菌蛋白起免疫應(yīng)答刺激劑的作用，該免疫應(yīng)答導(dǎo)致在所采用的動(dòng)物模型中的幽門螺桿菌集群程度的顯著降低。
總之，這些結(jié)果有力地支持了29kDa幽門螺桿菌蛋白在用于治療和預(yù)防人類幽門螺桿菌感染的口服疫苗制劑中的應(yīng)用。微生物的保藏質(zhì)粒pAE1根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在National Collections ofIndustrial and Marine Bacteria(NCIMB)，Aberdeen，蘇格蘭，英國(guó)，保藏號(hào)為NCIMB 40732。保藏日為1995年5月16日。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名ASTRA AB(B)街道Vastra Malarehamnen 9(C)城市Sodertalje(E)國(guó)家瑞典(F)郵編(郵區(qū))S-15185(G)電話+46 8 553 260 00(H)電傳+46 8 553 288 20(I)電報(bào)19237 astra s(ii)發(fā)明名稱細(xì)菌抗原和疫苗組合物(iii)序列數(shù)目4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特性(A)長(zhǎng)度1670堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置793..1575(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置793..1572
(xi)序列描述SEQ ID NO1GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA 60AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG 120GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC 180AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAAAATCAA CCTAAAATGG 240TGGATATAGG GGATAAAGAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CGTATCAGCA 300TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGGGT CCGGTATTAC 360AAACTGCTAT TATTGCTGGG ATTATGGGGG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT 420GCCATCCAAT CATGCTCAAT GGGGTGGATA TTGATATTTT AGAAGAAAAA GAGACTTGTA 480GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC GGGCGTAGAA ATGGAAGCGC 540TAATGAGTGT GAGCGTAGGG CTTTTAACCA TTTATGACAT GGTGAAAGCC ATTGATAAGA 600GCATGACAAT TAGCGGTGTG ATGCTGGAAT ATAAAAGTGG AGGCAAAAGT GGGGATTATA 660ACGCTAAAAA ATAGAAAAAG ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGTAAAAT AACATTTTGA 720CAACAAAAGC GTGTTGGTTG CTTCGGATTT GTTGTTATAG AAGTCTAAAA TATTACAATC 780AAGGATAGAA CG ATG AGA GCA AAT AAT CAT TTT AAA GAT TTT GCA TGG 828Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp1 5 10AAA AAA TGC CTT TTA GGC GCG AGC GTG GTG GCT TTA TTA GTG GGA TGC 876Lys Lys Cys Leu Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys15 20 25AGC CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC GCT TTG AAA TTG AAT TAC 924Ser Pro His Ile Ile Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr30 35 40CAT CCA GCT AGC GAG AAA GTT CAA GCG TTA GAT GAA AAG ATT TTG CTT 972His Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu45 50 55 60TTA AGG CCA GCT TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020Leu Arg Pro Ala Phe Gln Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu65 70 75AAC AAA TTC AAG AAT CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1068Asn Lys Phe Lys Asn Gln Thr Ala Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Gln80 85 90AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGC AGC GAT AAA GAC GAT 1116Asn Gln Gly Tyr Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp95 100 105TTT TCT TTT GCA CAA AAA AAA GAA GGG TAT TTG GCG GTT GCT ATG AAT 1164Phe Ser Phe Ala Gln Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn110 115 120GGC GAA ATT GTT TTA CGC CCC GAT CCT AAA AGG ACC ATA CAG AAA AAA 1212Gly Glu Ile Val Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys125 130 135 140TCA GAA CCC GGG TTA TTA TTC TCC ACC GGT TTG GAC AAA ATG GAA GGG 1260Ser Glu Pro Gly Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly145 150 155GTT TTA ATC CCG GCT GGG TTT ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1308Val Leu Ile Pro Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met160 165 170AGT GGG GAA TCT TTG GAT TCT TTT ACG ATG GAT TTG AGC GAG TTG GAC 1356Ser Gly Glu Ser Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp175 180 185ATT CAA GAA AAA TTC TTA AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404Ile Gln Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly190 195 200TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC 1452Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile205 210 215 220AAG AGC GCT TTG AAT AAG ATT TTT GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC 1500Lys Ser Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gln Glu Ile Asp225 230 235AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC GCC AAA 1548Lys Lys Leu Thr Gln Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys Asp Ala Lys240 245 250GAA TTA AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA 1595Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asn Arg *255 260AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTGTTTTTG AGCGTGTATT 1655TAAGGGCTGA TGATC 1670(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特性(A)長(zhǎng)度261氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu1 5 10 15Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His Ile20 25 30Ile Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser35 40 45Glu Lys Val Gln Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu Leu Arg Pro Ala50 55 60Phe Gln Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys65 70 75 80Asn Gln Thr Ala Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Gln Asn Gln Gly Tyr85 90 95Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala100 105 110Gln Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu Ile Val115 120 125Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Glu Pro Gly130 135 140Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu Ile Pro145 150 155 160Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser165 170 175Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp Ile Gln Glu Lys180 185 190Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr195 200 205Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile Lys Ser Ala Leu210 215 220Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gln Glu Ile Asp Lys Lys Leu Thr225 230 235 240Gln Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly245 250 255Lys Arg Asn Arg *260(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特性(A)長(zhǎng)度1670堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置793..1575(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置793..1572(xi)序列描述SEQ ID NO3GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA 60AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG 120GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC 180AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAAAATCAA CCTAAAATGG 240TGGATATAGG GGATAAAGAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CGTATCAGCA 300TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGGGT CCGGTATTAC 360AAACTGCTAT TATTGCTGGG ATTATGGGGG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT 420GCCATCCAAT CATGCTCAAT GGGGTGGATA TTGATATTTT AGAAGAAAAA GAGACTTGTA 480GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC 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CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG1404Ile Gln Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly190 195 200TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC1452Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile205 210 215 220AAG AGA GCT TTG AAT AAG ATT TTT GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC1500Lys Arg Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gln Glu Ile Asp225 230 235AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC GCC AAA1548Lys Lys Leu Thr Gln Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys Asp Ala Lys240 245 250GAA TTA AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA 1595Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asn Arg *255 260AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTCTTTTTG AGCGTGTATT 1655TAAGGGCTGA TGATC 1670(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特性(A)長(zhǎng)度261氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu1 5 10 15Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His Ile20 25 30Ile Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser35 40 45Glu Lys Val Gln Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu Leu Arg Pro Ala50 55 60Phe Gln Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys65 70 75 80Asn Gln Thr Ala Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Gln Asn Gln Gly Tyr85 90 95Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala100 105 110Gln Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu Ile Val115 120 125Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Glu Pro Gly130 135 140Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu Ile Pro145 150 155 160Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser165 170 175Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp Ile Gln Glu Lys180 185 190Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr195 200 205Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile Lys Arg Ala Leu210 215 220Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gln Glu Ile Asp Lys Lys Leu Thr225 230 235 240Gln Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly245 250 255Lys Arg Asn Arg *260
權(quán)利要求
1.一種重組多肽，它具有與分子量約為29 kDa的幽門螺桿菌表面暴露抗原相同或基本上相似的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，它的氨基酸序列與序列表中的SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的位置1-260或28-260相同或基本上相似。
3.具有長(zhǎng)度至少為5個(gè)氨基酸的肽，包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的免疫原性表位。
4.一種分離的核酸分子，它具有編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽的核苷酸序列。
5.一種分離的核酸分子，選自(a)包含與序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的位置796-1572或874-1572相同或基本上相似的核苷酸序列的核酸分子；(b)包含能與(a)中定義的核酸分子的多肽編碼區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列的核酸分子，并且它編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，或其功能相當(dāng)?shù)男揎椥问?；?c)包含為如(a)或(b)中定義的核苷酸序列的遺傳密碼的簡(jiǎn)并結(jié)果的核酸序列的核酸分子，并且它編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，或其功能相當(dāng)?shù)男揎椥问健?br> 6.一種載體，它包含根據(jù)權(quán)利要求4或5的核酸分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的載體，它為質(zhì)粒載體pAE1(NCIMB 40732)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的載體，它為能介導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求4或5的DNA分子的表達(dá)的表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，它為質(zhì)粒載體pS 863。
10.含有根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的載體的宿主細(xì)胞。
11.一種制備為幽門螺桿菌表面暴露的29kDa抗原的多肽的方法，它包括在產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)用根據(jù)權(quán)利要求8或9的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并回收所述多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽或肽在治療中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽或肽在診斷幽門螺桿菌感染中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽或肽作為疫苗的應(yīng)用。
15.一種用于誘導(dǎo)針對(duì)幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，包含免疫原性有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽，或保持抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述多肽，任選包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗組合物。在用作保護(hù)幽門螺桿菌感染的哺乳動(dòng)物，包括人類的治療性疫苗中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗組合物在用作保護(hù)哺乳動(dòng)物，包括人類免于幽門螺桿菌感染的預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽，或保持抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的多肽抗原在制備用于治療、預(yù)防或診斷幽門螺桿菌感染的組合物中的應(yīng)用。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一次的多肽，或保持抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的多肽在制備用于診斷幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽，或保持抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫誘導(dǎo)能力的修飾形式的所述多肽在制備用于引發(fā)抗幽門螺桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗中的應(yīng)用。
21.一種在哺乳動(dòng)物中引發(fā)抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用免疫原性有效量的根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的疫苗組合物這一步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人類。
23.一種在體外診斷幽門螺桿菌感染的方法，至少包括在其中使用任選被標(biāo)記或偶聯(lián)至固相載體上的根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽這一步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，包括步驟(a)將任選與固體載體結(jié)合的所述多肽與從哺乳動(dòng)物提取的體液接觸；和(b)檢測(cè)來自于所述體液，與所述多肽結(jié)合的抗體。
25.用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物，包括人類幽門螺桿菌感染的診斷試劑盒，包含能使根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法得以實(shí)現(xiàn)的組分。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子量為約29kDa,組成幽門螺桿菌表面暴露的抗原的重組多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼所述多肽的核酸分子,以及載體和包含該核酸分子的宿主細(xì)胞。所述重組多肽可用于診斷幽門螺桿菌感染和用于制備引發(fā)抗所述感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合物,所述疫苗組合物適用于治療和預(yù)防用途。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1191544SQ9619568
公開日1998年8月26日 申請(qǐng)日期1996年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月1日
發(fā)明者I·波林, A·M·斯文納霍姆 申請(qǐng)人:阿斯特拉公司 被以下專利引用 (1),