用于改性有毒性和/或有臭味化合物的方法

專利名稱：用于改性有毒性和/或有臭味化合物的方法
技術領域：
本發明涉及用于改性尤其是在植物來源的材料中的不希望有的化合物的酶促方法。
背景技術：
種類繁多的植物含有被聲稱提供抵抗霉菌、細菌、昆蟲和鳥類侵襲的天然保護的所謂抗營養因子(ANF)。熟知的抗營養因子包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制劑，凝集素、丹寧、皂苷和(配糖)生物堿。
在具有商業重要性的作物，如大豆、苜蓿和馬鈴薯中，由于這些化合物具有毒性且味苦，非蛋白抗營養因子如皂苷和配糖生物堿的存在產生了值得注意的問題。不幸的是，這些化合物還對熱非常穩定，并且由于它們的疏水性而難于提取，例如，包括馬鈴薯和蕃茄的茄科已知含有幾種類型的配糖生物堿。這些配糖生物堿通常以低水平存在于馬鈴薯中，但在發綠和受損傷的馬鈴薯中可積累至高水平。最高水平產生在塊莖的皮中。
在淀粉中生產釋放的馬鈴薯汁含有相當大量的水溶性有機化合物，其中25-30％為蛋白質。在相對富含賴氨酸的意義上來說，馬鈴薯的蛋白質具有非常好的氨基酸組成。因此，馬鈴薯蛋白可補償在谷類中發現的相對低的賴氨酸水平。而且，由于它們的熱膠凝和乳化性質，純的未變性的馬鈴薯蛋白的功能性質令人感興趣。不幸的是，由于存在大量可導致胃腸紊亂，甚至死亡的配糖生物堿的存在，嚴重局限了馬鈴薯蛋白的經濟重要性。由配糖生物堿引起的苦味，較低水平的收斂劑意味著一個嚴重的缺陷。由于人類比動物看來對配糖生物堿的毒性更為敏感，因此，擁有一種選擇性降低存在于馬鈴薯蛋白質制備物中的配糖生物堿水平的方法極為重要。
茄堿是用來描述存在于馬鈴薯中的配糖生物堿的常規術語。構成茄堿部分的主要化合物為α-茄堿的α-查茄堿。兩種物質具有共同的甾族生物堿部分，所謂的糖苷配基，更具體地說，為茄啶，但它們在它們的糖部分不同。據報道，糖苷配基茄啶的毒性被認為小于糖苷(Nishie等(1971)，毒理學和實用藥學1981-1992)。
為了從植物材料，例如馬鈴薯中除去配糖生物堿化合物，可設想一些提取步驟。這一方法中的嚴重的缺陷是配糖生物堿查茄堿和茄堿不溶于許多有機溶劑，并且實際上還不溶于水。已描述的酸提取法具有使蛋白質變性的缺點，以致使蛋白質的功能特性喪失。而且，酸提取法可能提高蛋白質制備物中的金屬離子的水平，提取后配糖生物堿的殘留量仍然可以是足夠高的，足以產生臭味。
因此，需要開發一種用于從植物材料中除去或使毒性和/或有臭味的配糖生物堿化合物失活的方法，該方法產生足夠低水平的所述配糖生物堿化合物。
在柑桔水果的加工中，已描述了用于使苦味糖苷失活的酶促方法。通過兩種糖苷酶，α-鼠李糖苷酶和-β-葡糖苷酶的連續作用，可將柚皮苷這一苦味配糖類黃酮化合物轉化為無味的柚苷配基(Askar和Bielig(1976)，食物15，155-159)。而且，在歐洲專利EPO332 281中指出從它們的糖苷前體(糖基化萜烯醇)產生香味化合物(在酒中)也需要幾種酶的連續作用。因此，在上述酶促方法中，需要幾種酶來用于順序除去單體糖殘基。
發明概述本發明公開了用于降解包含與配糖部分共價連接的糖苷配基部分的化合物的方法，該方法通過將所述化合物與能酶切所述糖苷配基與配糖部分之間的共價鍵的酶接觸來完成。
優選地，該方法用于將毒性化合物除解為毒性較小的產物，或用于將有臭味化合物降解為臭味較小的產物。
優選地，該化合物為來源于植物的材料的一部分。來源于植物的材料優選來自于茄科，更優選來自于馬鈴薯。
化合物優選為配糖生物堿，更優選為α-查茄堿。本發明的方法適用于，例如在淀粉去除后，從馬鈴薯中回收蛋白質。
本發明還涉及可用于產生用來降解化合物的酶的核酸。發明詳述因此，本發明首次提供了基本上純的能酶切糖苷配基和糖苷之間的共價鍵的酶，即不特別需要其它的酶。迄今，僅發現兩種或多種酶的混合物能酶切糖苷化合物。很顯然這在生產和應用方面提供了很大的優點。例如，可在沒有或基本上沒有其它酶被誘導的條件下，通過能產生該酶的微生物來產生該酶。在生產過程的生產率以及所產生酶的比活方面，這都是有利的。根據本發明的一個具體實施方案，通過在用編碼所述酶或其前體的DNA轉化的宿主細胞中表達來產生本發明的酶，所述宿主細胞為例如動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或細菌。可接著從細胞或從培養基中(如果被宿主細胞分泌)大量地并且基本上沒有任何其它活性地回收本發明的酶。
本發明描述了一種改性存在于植物來源的材料中的有毒性和有臭味化合物的方法。該方法的特征在于它包括酶的使用。將植物來源的材料用酶處理，其中酶改性所述有毒性和/或有臭味的化合物，以這種方式降低了所述化合物的毒性和/或臭味。另外，酶改性的產物的性質被改變，這樣方便了它們從植物來源的材料中的去除。
當經過本發明方法處理的植物來源的材料或包含植物來源的材料的產物不再具有通常的臭味并且進一步符合了相關產物中所述化合物的“最大耐受水平”的立法條例時，則達到了足夠低水平的有毒性和/或有臭味化合物。
植物來源的材料包括來自植物或植物某部分的任何物質或產物，或植物或植物本身的某部分，其中所述植物或植物部分包含毒性和/或有臭味化合物。
包含毒性和/或有臭味化合物的植物來源的材料可來自任何植物，只要所述化合物存在于起始植物或植物某部分或所述化合物在植物或植物某部分的工業加工中形成。優選地，植物來源的材料來自于屬于茄科的植物，更優選，它來自于馬鈴薯或蕃茄。
接受本發明方法的毒性和/或有臭味化合物的特征在于所述化合物在用酶處理時被改性，這樣它們的有毒性和/或它們的臭味被降低。優選地，當酶促去糖基化時，所述毒性和/或有臭味化合物被改性。
同時，與糖苷相比，產生的去糖基化化合物的可溶性被降低，從而方便了完全除去所述去糖基化化合物。
糖基化的有毒性和/或有臭味化合物優選選自配糖生物堿、配糖類萜和配糖類固醇。更優選地，它們選自茄堿，最優選地，它們為α-茄堿和/或α-查茄堿。
優選地，本發明的方法用于來自馬鈴薯的包含配糖生物堿α-茄堿和α-查茄堿的植物材料。
可適用于本發明方法的酶為能水解存在于配糖生物堿、配糖類萜和/或配糖類固醇中的糖苷鍵的糖苷酶。
在本發明的方法中，配糖生物堿，配糖類萜和/或配糖類固醇的水解優選通過單一糖苷酶的作用來進行。糖苷酶通過除去全部糖的部分來而作用于糖苷前體。
這里定義的術語“酶”或“糖苷酶”指任何能獲得相應酶活性的酶。用于本發明的方法中的酶可為任何來源的細菌、真菌、酵母、植物、動物或合成的。優選地，采用的酶來源于真菌，更優選它們來源于曲霉屬，最優選來源于黑曲霉。
用于本發明方法中的酶可為復合酶制劑的一部分，所述復合酶制劑包含對于本發明的方法并非關鍵性的其它酶。
用于本發明方法中的酶可通過本領域技術人員熟知的分級分離技術，從所述復合酶制劑中純化。由此純化的酶可在隨后面被詳細表征。此外，純化酶的獲得能夠使本領域技術人員得以分離相應的基因或cDNA。
本發明優選包括使用宿主微生物通過遺傳工程產生的酶。可通過本領域技術人員已知的方法來改造微生物以產生可用于本發明方法的酶。由于優選單一種酶參與從芳香糖苷配基分離糖部分，需要制備(過量)表達僅僅一種所需酶的生產菌株。使用這些菌株導致費用降低和副反應減小。
本發明的方法可用于從植物獲得產物的方法中，其中所述植物包含毒性和/或有臭味化合物，以降低所需產物中的所述毒性和/或有臭味化合物的水平。
由于糖苷配基顯示較低的毒性和/或減少的臭味，和/或可被較容易地提取，因而本發明的方法用于處理例如馬鈴薯蛋白質的經濟優勢是顯而易見的。
優選地，本發明的方法可用于從在淀粉顆粒分離后獲得的馬鈴薯汁中回收富含蛋白質的產物。
實施例1α-查茄堿的糖苷配基-糖鍵的水解將α-查茄堿(從Sigma化學品公司獲得)以1g/ml的濃度溶解在以100mmol/l乙酸鈉pH5緩沖的D2O中。向該溶液中加入幾種商業上可購得的酶制劑。
每毫升查茄堿溶液加入15μl液體酶制劑和2mg粉狀酶制劑。37℃下，保溫8小時。
通過600MHz1HNMR確定各種酶制劑對α-查茄堿的糖部分的影響。在以這種方法檢測的多種酶制劑中，僅有兩種制劑(即曲霉制劑AR2000TM和CytolasePCL5，兩者可從Gist-brocades獲得，Seclin-法國)顯示出對糖-糖苷配基鍵非常有效的酶切。在與這兩種酶制劑保溫后，可檢測到的僅有的還原糖共振來自末端葡萄糖部分。由于未能檢測到鼠李糖的β-共振，推斷全部以及完整的三糖已被這兩種酶制劑切下。
為了證實這個實驗的結果，將反應混合物的pH值調至pH10，接著用氘化氯仿萃取。萃取液的NMR譜顯示出與純的糖苷配基茄堿(從Sigma化學品公司獲得)的圖譜相同，這表明在酶促水解時，α-查茄堿已被酶切為茄堿和三糖。
這些數據說明酶制劑AR2000TM和CytolasePCL5含有能酶切葡萄糖和茄堿之間的β-1，3鍵的酶活性。這一發現進一步表明通過與所選酶保溫可將存在于馬鈴著中的主要毒性配糖生物堿部分改性為相對毒性較小的糖苷配基。實施例2對α-查茄堿的乳化作用加入酶制劑AR 2000TM以及Emulsin進行進一步酶保溫，其中Emulsin為來自杏核的已知的β-葡糖苷酶來源，可從Sigma化學品公司購得。實驗條件與實施例1中描述的那些相同。
存在于杏核提取液Emulsin中的β-葡糖苷酶活性不能切下α-查茄堿的三糖部分。這一發現證實了AR 2000TM和Cyto lasePCL5中存在于參與α-查茄堿水解的特定種類的酶。實施例3從曲霉制劑AR 2000中純化查茄堿酶將AR 2000(可從Gist-brocades購得，Seclin，法國)溶解在緩沖液A中(20％乙醇，25mM檸檬酸鈉pH3.4)(800ml體積中40g)。離心除去不容物后，將上清上樣至220×50mm陽離子交換柱(SSepharoseFast Flow，Pharmacia)；流速為5ml/分鐘。將柱用緩沖液A洗滌，直至280nm處的吸收大約為零。將2400ml其中NaCl梯度為0-0.3M的緩沖液A上柱洗脫。收集不同大小的級分，測定280nm處的吸光度。
在80mM乙酸鈉pH5.0中以80μgα-查茄堿(Sigma)作為底物用Kudou等(農業生物化學(1990)541341-1342)描述的方法的改進方法在37℃下100μg體積中分析不同級分中的查茄堿酶活性。30-90分鐘后，用30μl氯仿萃取反應產物。在具有氯仿-甲醇-水(65∶35∶10，V/V底層)的溶劑系統和硅膠60F 254板(Merck)進行TLC分析。將20μl氯仿層上樣至硅膠平板上。將純的茄堿(Sigma)用作參照。
合并活性級分(700ml)。用緩沖液A將合并的級分的一半稀釋5倍并上樣至第二個S SepharoseFast Flow柱中(110×26mm，流速2ml/分)。將NaCl梯度為0-0.3M的300ml緩沖液A上柱洗脫，并收集級分。如上所述測定活性。
合并所有活性級分并濃縮至約8.5ml(Amicon YM10濾器)，上樣至50mM乙酸鈉pH5.0中的凝膠過濾柱上(SephacrylS300，Pharmacia)；550×50mm，流速為5ml/分。從2800nm處信號增強時收集級分。測定查茄堿酶活性，并將顯示出最大活性的級分進一步濃縮至約1.5ml。將500μl這一溶液上樣至50mM乙酸鈉pH5.0中的陰離子交換柱中(Mono QHR Pharmacia；50×5mm，流速為1ml/分)。用NaCl梯度為0-0.3M的乙酸鹽緩沖液上柱洗脫上并收集級分，每級分1ml。如上所述測定查茄堿酶活性。顯示這種活性的級分在蛋白質主體之前被洗脫。實施例4存在于曲霉制劑AR 2000中的查茄堿酶的性質在SDS-PAGE中包含查茄堿酶活性的蛋白級分顯示為單一條帶。使用包含已知分子量蛋白質的蛋白質混合物，測得純化的查茄堿酶的分子量為120kDa。
用EUROSEQUENCE(Groningen，荷蘭)測定查茄堿酶的內部序列。
在與分析乙內酰苯硫脲(PTH)氨基酸的HPLC(型號120A ABI)相連的自動測序儀(型號477A，Applied Biosystems)上進行Edman降解。查茄堿酶具有下面的內部氨基酸序列(SEQ ID NO1)Gln-Leu-Gly-Ser-Leu-Tyr-Trp-Gln-Leu-Glu-Asp-Ile-(Trp)-Gln-Ala-Pro-Ser-Trp-Ala-Gly-(Ile)在存在茄堿和存在包含大豆皂苷的物質時，將查茄堿酶在如實施例1所述的條件下保溫。未能檢測到保溫混合物的茄堿。這證明了純化酶的底物特異性。
分別使用對硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷和對硝基苯基-β--D-吡喃半乳糖苷作為底物，在純化步驟中測定β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性。純化的查茄堿酶未顯示出β-葡糖苷酶活性或β-半乳糖苷酶活性。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Gist-Brocades B.V.
(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(D)州Zuid-Holland(E)國家荷蘭(F)郵編NL-2611 XT(G)電話31.15.2799111(H)傳真31.15.2793957(ii)發明題目用于改性有毒性和/或有臭味化合物的方法(iii)序列數目1(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(vi)優先申請數據(A)申請號EP 95201980.0(B)申請日1995年7月18日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內部(vi)初始來源(A)生物黑曲霉(ix)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置13(D)其它信息/注意＝“不確定”(ix)特點(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置21(D)其它信息/注意＝“不確定”(xi)序列描述SEQ ID NO1Gln Leu Gly Ser Leu Tyr Trp Gln Leu Glu Asp Ile Trp Gln1 5 10Ala pro Ser Trp Ala Gly Ile15 20
權利要求
1.一種用于降解包含與配糖部分共價連接的糖苷配基部分的化合物的方法，該方法通過將所述化合物與能酶切所述糖苷配基和配糖部分之間的共價鍵的酶接觸來進行。
2.根據權利要求1的方法，其中所述化合物為毒性化合物，并且所述糖苷配基毒性較小。
3.根據權利要求1的方法，其中所述化合物為有臭味化合物，并且所述糖苷配基部分臭味較小。
4.根據權利要求1-3的方法，其中所述化合物為植物來源的材料的一部分。
5.根據權利要求4的方法，其中所述植物來源的材料來自茄科。
6.根據權利要求5的方法，其中所述植物來源的材料來自馬鈴薯。
7.根據權利要求1-7的方法，其中所述化合物為配糖生物堿。
8.根據權利要求7的方法，其中所述化合物為α-查茄堿。
9.根據權利要求1的方法，其中所述的降解為用于制備富含蛋白質產物的方法的一部分。
10.富含α-查茄堿酶活性的制劑。
11.具有α-查茄堿酶活性的基本上純的多肽。
12.根據權利要求11的基本上純的多肽，包含相當于SEQ ID NO1的內部氨基酸序列。
13.編碼根據權利要求11或12的多肽的分離的核酸。
14.包含根據權利要求13的核酸的重組核酸。
15.包含根據權利要求14的重組核酸的宿主細胞。
16.能酶切化合物的糖苷配基和配糖部分之間的共價鍵的酶在降解配糖生物堿、配糖類萜或配糖類固醇中的應用。
17.根據權利要求16的酶的應用，其中所述酶能酶切α-查茄堿。
18.酶在降解配糖生物堿中的應用。
全文摘要
本發明描述了一種在用單一種酶水解時將有毒性和/或有臭味化合物改性的方法。改性導致所述化合物的毒性和/或臭味降低。毒性和/或有臭味化合物優選來自茄屬,為糖苷。該酶在糖苷配基和配糖部分之間的共價鍵處酶切所述化合物。較優選該酶具有α－查茄堿酶活性,降解α－查茄堿,釋放茄堿糖苷配基和三糖,并且來自黑曲霉。本發明的酶促水解可用于,例如在分離淀粉顆粒后,從馬鈴薯汁中回收蛋白質。
文檔編號C12P17/18GK1191571SQ96195673
公開日1998年8月26日 申請日期1996年7月18日 優先權日1995年7月18日
發明者L·伊登司, J·蘇彼, D·施比, H·M·楠 申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司