核酸的銜接線性擴增的制作方法

專利名稱：核酸的銜接線性擴增的制作方法
相關申請的交叉參考本申請是1993年7月23日提交的申請08/095,442的部分繼續申請。
背景技術：
技術領域：
本發明涉及核酸的體外復制。更具體地說，本發明涉及一種用于復制感興趣核酸序列的方法，大量所需的序列最終由銜接的引物延伸反應產生，其中的感興趣序列以數學線性方式積累。
2、背景技術簡述當今稱為(并在本文稱為)核酸“擴增”的大量核酸復制無論在實踐上，還是在理論上都在多種方面發現有廣泛的應用。H.G.Khorana和其合作者們首先提出用體外DNA擴增方法以增加通過酶連接合成DNA而產生的雙鏈DNA(主要酵母丙氨酸t-RNA基因的部分序列)的可得到的數量。見K.Kleppe等；分子生物學雜志56341-361(1971)。后來，體外擴增作為現在稱為聚合酶鏈式反應或＂PCR＂的技術應用于基因組DNA的擴增(Saiki等，科學，2301350-1354(1985))。通過合成寡核苷酸引物，耐熱DNA聚合酶和自動化溫度循環儀的廣泛可用性，PCR成為分子生物學家廣泛利用的工具。
PCR方法在文獻中稱為“指數擴增”方法。在每輪或“每個循環”的引物延伸中，合成了另外一個引物的引物結合位點。因此，在任一以前循環中產生的每個合成DNA分子可用作引物依賴性復制的模板。該方法的此方面，與存在足夠大量的引物分子一起導致合成的DNA隨著反應的進行以數學指數方式積累。
雖然已證明PCR是分子生物學家有用的技術，并且已廣泛應用于人類遺傳研究、診斷和法醫學的領域，且甚至用于抗體的檢測，不過已認識到一些不足。PCR方法難以準確定量，主要因為隨著每輪擴增擴增產物是指數增加。PCR產物，即，雙鏈DNA分子本身難以分析或測序。一般地在測序或需要單鏈核酸的其它下游方法(如與能檢測感興趣序列的探針的雜交)之前必需進行鏈的分離。
PCR方法也已證明對經過轉移以前擴增的DNA序列至一個新的反應中產生的污染很敏感。此問題似乎由下面的事實所引起(1)在任何給定的反應循環中產生很大量的DNA且(2)此方法用所有的產物DNA鏈作為隨后循環的模板。即使微量的污染DNA也可被指數擴增并導致錯誤結果。見Kwok和Higuchi，自然339237-238(1989)。隨著這些污染問題被廣泛認識，在文獻中已報導了各種減少這種污染的方法(如.化學去污染、物理處理、酶處理及利用封閉系統)，見John B.Findlay，“用于體外診斷PCR的開發”，出于“遺傳識別”，1992年，11月20日，San Diego，CA。
仍然存在對新的核酸(DNA)擴增方法的需要，該方法應能提供大量DNA并僅選擇性擴增感興趣的特異序列，并避免現在與“PCR”反應有關的問題。具體地說，仍然需要最終產生大量感興趣的核酸分子，或大量含有感興趣的核酸序列的分子，但對存在的污染核酸相對不敏感的核酸擴增方法。也存在對產生單鏈產物的核酸擴增方法的需要。
發明小結前述的和其它的需要通過本發明得到滿足，其一方面提供了擴增樣品含有的互補核酸鏈中特異性感興趣核酸序列的方法，該方法包括下面的步驟(a)在適當條件下將鏈與含有不可復制因子的引物接觸，使第一代引物延伸產物用所述的鏈作為模板而合成，并且其中用于鏈的引物的選擇是使以其合成的第一代引物延伸產物在與鏈分離后，可用作互補鏈引物的模板用于合成第二代引物延伸產物；(b)將第一代引物延伸產物從其模板上分離以制備單鏈分子；和(c)在適當條件下用步驟(a)的引物處理第一代引物延伸產物從而使用第一代引物延伸產物作為模板而合成第二代引物延伸產物；其中的第二代引物延伸產物至少含有感興趣核酸序列的部分序列，并且不能夠用作延伸后合成其模板的引物合成延伸產物的模板。
在本發明的另一方面，步驟(c)的產物被分離以制備單鏈分子，并且整個過程至少重復一次。步驟(c)優選在可程控熱循環儀的控制下以自動方式完成，步驟(c)的方法重復多次。
第二代引物延伸產物積累之后，其中的每一個均不能夠用作延伸以制備其第一代模板的引物的模板，可利用新的一套含有不可復制因子的引物。該套新引物優先結合到第二代合成產物上，與待擴增的感興趣序列鄰接。線性復制過程又一次通過多輪循環完成。這種“銜接在一起”的多輪引物延伸反應最終導致最初感興趣的核酸序列千倍或百萬倍的擴增。因此，本方法命名為“銜接的線性擴增”或“LLA”。
在本發明的另一方面，含有不可復制因子的多重(嵌套)引物組可以單個擴增反應混合物提供。挑選這些引物組從而在嚴格程度遞減的條件下能夠結合到它們各自的模板上。因此，完成幾個銜接線性擴增所必需的所有成份可以單個反應混合物提供。
在本發明的另一方面，等位基因特異性的核酸復制通過使用針對模板上的已知表示遺傳疾病或紊亂，如鐮刀形細胞疾病的特異性多態位點的引物根據本發明而完成。設計含有不可復制因子的等位基因特異性引物從而使它們僅引導那些含有所需等位基因的模板的核酸合成。
本方法產生的合成核酸分子可用于遺傳紊亂或疾病的診斷，作為進一步技術如基因克隆的試劑、用于法醫鑒定等。
本文描述的方法也可用單核酸鏈作為起始材料而完成。這種方法包括(a)將該鏈與含有不可復制因子的第一種引物在適當條件下接觸，用該鏈作為模板合成第一代引物延伸產物；(b)將第一代引物延伸產物從其模板上分離以制備單鏈分子；和(c)將第一代引物延伸產物與第二種含有不可復制因子的引物在適當條件下接觸從而用第一代引物延伸產物作為模板而合成第二代引物延伸產物；其中引物的選擇是使第二代引物延伸產物不能用作第一種引物延伸的模板。步驟(a)-(c)可重復多次，導致大量的核酸合成，然后將該反應銜接到使用新的一套引物的隨后的反應中。
本文描述的方法也可用含有可切割因子的引物來完成。此方法包括(a)將核酸模板鏈與含有可切割因子的第一種引物在適當條件下接觸從而使第一代引物延伸產物用該鏈作為模板而合成；
(b)從其模板中分離第一代引物延伸產物以制備單鏈分子；(c)處理該單鏈分子從而使第一代引物延伸產物在可切割因子的位置被切割；(d)將第一代引物延伸產物與第二種引物在適當條件下接觸從而使第二代引物延伸產物用第一代引物延伸產物作為模板而合成；其中引物的選擇是使當第一代引物延伸產物在可切割因子處被切割時，第二代引物延伸產物不可用作第一個引物延伸的模板。步驟(a)-(d)可重復多次，導致大量的核酸合成，然后將該反應可與使用新一套引物的隨后的反應銜接。此外，第二個引物可任選地含有可切割因子從而使銜接的線性擴增反應可用雙鏈或單鏈起始模板來完成。
本發明也涉及用于擴增特定核酸序列的試劑盒。這樣的試劑盒包括如，DNA聚合酶，兩種或更多種用于待擴增的每一序列的引物，其中所述的每種引物包括不可復制因子或摻入可切割因子，以及，任選地，能由引物和DNA聚合酶復制的對照核酸序列。該試劑盒也可含有能夠顯示特定序列擴增產物存在與否的核酸探針。如果試劑盒含有摻入可切割因子的引物，其也可含有在可切割因子處切割引物的試劑。
附圖簡述

圖1-4為本發明核酸擴增方法的圖解。
圖5-6為與圖1-4中描述方法相連接的核酸擴增方法的圖解。
圖7為用兩種引物進行的本發明的核酸擴增方法的更為詳盡的圖解。
圖8-10給出了用四種引物進行的本發明的銜接線性核酸擴增方法的詳細圖解。
圖11為通過PCR方法及通過本發明的方法而制備的核酸分子的圖解。
圖12為人類β-珠蛋白基因序列(Gen Bank基因座HUMHBB)及本文描述的幾種引物的圖解。
圖13為實施例7中擴增的人類生長激素序列的序列。在本實驗中使用的寡核苷酸的相對位置下面劃線。寡核苷酸GHl與所示的人類生長激素序列的互補鏈雜交。
優選實施方案的詳述本發明的核酸復制方法能夠制備大量感興趣的特異性核酸序列。該方法優選形式包括系列銜接的多輪引物延伸反應。在每個多輪循環引物延伸反應中，引物依賴性核酸復制經過許多循環來完成，其引物延伸產物以數學線性方式通過循環逐步積累。將一種獨特的引物或一套獨特的引物提供給含有待擴增序列的起始樣品的每條核酸鏈。引物延伸產物從循環到循環的線性積累通過使用含有不可復制因子的引物加以保證-該成分終止引物延伸反應，阻止核酸聚合酶復制引物全序列。或者，所需引物延伸產物的線性積累通過使用含有可切割因子的引物加以保證，其中第一代引物延伸產物的切割產生缺乏第一種引物有功能的結合位點的第二代引物延伸產物。通過選擇含有這樣不可復制或可切割因子的適當引物，及適當的引物退火條件，保證了以最大豐度積累的引物延伸產物(本文稱為“第二代引物延伸產物”)不能自己用作以相同引物的隨后輪引物延伸的模板。因此，與利用每輪引物延伸產物作為隨后輪模板的核酸擴增方法(如＂PCR＂)不一樣，“指數擴增”不會從循環到循環中發生。
本發明方法采用并利用了寡核苷酸雜交及引物延伸反應的許多重要特性。本發明利用了下面的優點·DNA聚合酶通過變性及引物依賴性延伸的順序循環能夠拷貝模板DNA許多次。
·引物依賴性延伸可在適當的條件下，甚至引物與模板不完全互補時發生。
·引物延伸可利用在前輪引物延伸中產生的模板。
·當模板中存在非堿基位點或非核苷酸殘基時，引物延伸反應被抑制。或者，引物延伸可通過在摻入引物延伸反應所用引物中的可切割位點切割該代引物延伸產物分子而物理去除其中一部分加以抑制。
·引物長度和組成以已知的方式影響引物“引導”模板上聚合酶誘導的延伸的條件(如溫度)。
·引物延伸反應可利用熱循環儀進行快速循環。
本方法優選利用一系列線性擴增反應，其可連續地或平行地(即，同時地)(銜接)進行以產生大量拷貝的感興趣的核酸序列。感興趣的核酸序列可基本上包括全長的模板鏈，或僅包括其很小的一部分。含有感興趣序列的模板鏈可存在于基本上均一的樣品中或作為核酸混合物的一部分(甚至是極少的一部分)。
根據本發明，將含有不可復制或可切割因子的引物提供給含有待擴增序列的每條鏈。在雙鏈模板情況時，引物在模板變性之前或之后加入。使引物與其各自的起始模板退火，并在適合酶功能的條件下在聚合酶存在下使之延伸以形成第一代引物延伸產物。該方法通過變性得到的雙鏈核酸，使引物與鏈退火及再次完成引物延伸反應而加以重復。在第一引物延伸產物上的引物延伸產生第二代引物延伸產物，其由于存在不可復制因子，不能夠用作那些相同的引物在隨后循環中的模板。或者，如果引物含有可切割因子，第一代引物延伸產物在可切割因子的位置被切割，從而當第一代引物延伸產物退火到適當的引物上并延伸時，形成的第二代引物延伸產物將缺乏用于產生第一個引物延伸產物的引物的結合位點。
圖1-5給出了根據本發明方法用DNA模板完成的一系列引物延伸反應(即，一種線性擴增反應)的圖解。該方法以步驟(a)中利用具有明確末端的雙鏈DNA分子開始加以說明。起始DNA鏈在圖1-4中以實心(——)線表示。
起始雙鏈優選通過在含有其的緩沖液中加熱變性，且得到的單鏈與一對引物接觸(步驟(b))。每種引物優選以基本上超過起始模板鏈的摩爾數提供并在其序列內部含有不可復制或者可切割因子，在引物序列中以(X)或(O)表示。在適當的條件下，引物與其各自的模板退火并在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸的存在下根據引物延伸反應延伸(步驟(c))。合成的DNA以點劃線(……)表示在圖1-4中，以起始雙鏈DNA作為模板合成的DNA表示為“第一代”DNA。得到的模板再次變性，并且與引物退火(步驟(d))。
如圖2中步驟(e)中所見到的，用第一代DNA作為模板的引物延伸導致制備了第二代DNA并且沒有跨過摻入到第一代合成DNA中的不可復制因子。因此，合成了標號為10和20的DNA分子。這些第二代分子不參與進一步的引物延伸反應，因為，如圖中所示，分子10沒有摻入含有不可復制或可切割因子(X)的引物的有效結合位點，并且分子20沒有摻入含有不可復制或可切割因子(O)的引物的有效結合位點。因此，如步驟(F)和(g)中所見到的，第二代分子在隨后輪的引物延伸中以數學線性方式積累。
經過需要的循環數以后，合成的DNA用作(即，銜接到)使用第二套引物的第二系列引物延伸反應的起始材料。如圖5-6中所見到的，選擇含有標記為(a)和(b)的不可復制因子的引物以能夠利用分子10和20(圖1-4的反應產物)作為進一步DNA合成的模板。該系列的引物延伸反應同樣導致圖6步驟(e)中標號為30和40的合成DNA分子的積累，該DNA不能用作用于那些反應中引物的模板。經過所需數目的循環以后，這些合成的分子可銜接到利用又含有不可復制或可切割因子的適當引物進行的進一步復制中。如果引物含有可切割因子，第一個引物延伸反應后接著下面的反應，即第一個引物延伸產物在第二次引物延伸反應之前于可切割因子位置被切割。
因此應很明顯任何一系列循環的合成核酸產物僅當提供新的引物或引物套時它們自身才可用作進一步擴增的模板。因此，如果第一個線性擴增完成100個循環后，該反應產生的100個拷貝可用作在能雜交到合成模板上的新引物對的銜接線性擴增(LLA)反應中的模板。再一次100個線性擴增循環提供了10000倍(100×100)累積擴增。以第三套引物重復該過程產生1×106的累積擴增。通過使用又一套引物及又一次循環的引物延伸完成再一次擴增。
圖7更為詳盡地圖解說明了在本發明的擴增方法中兩種引物的使用。參照該圖，兩種引物用于依次幾輪的引物延伸。每種引物互補于靶序列但含有單個不可復制因子(X)替代其中的一個互補核苷酸。
有4個反應可參考。在反應1中，引物P1產生數拷貝的模板上鏈(第一代核酸；產物I)。在每輪循環中產生1拷貝的產物I，m輪循環導致m個拷貝。以反應2中，引物P2同樣產生數拷貝的模板下鏈(第一代核酸；產物II)。每輪循環中產一拷貝的產物II，n輪循環導致n個拷貝。實際上，n和m一般是相同的。
在反應3中，除了模板II中摻入的不可復制因子以外的部分不能復制外，引物P1產生數拷貝的來自反應2的產物II(第二代核酸；產物III)。因此，產物III不是引物P1或P2的模板。
同樣地，在反應4中，除了模板I中不可復制因子以外的部分未被復制外，引物P2產生數拷貝的模板I(第二代核酸；產物IV)。因此，產物IV不是引物P1或P2的模板。
表1顯示了作為循環數函數的每種產物的積累。正如可以看到的，方程式(n2+n)/2可用于計算反應的產量。如果反應效率不到100％，擴增將更少。
表1在兩種引物LLA反應中產物的積累循環(n)I累積的I III 累積的III 累積的I+III (n2+n)/21 1 1 0 0 1 12 1 2 1 1 3 33 1 3 2 3 6 64 1 4 3 6 10 105 1 5 4 10 15 156 1 6 5 15 21 217 1 7 6 21 28 288 1 8 7 28 36 369 1 9 8 36 45 4510 1 10 9 45 55 5511 1 11 10 55 66 6612 1 12 11 66 78 7813 1 13 12 78 91 9114 1 14 13 91 105 10515 1 15 14 105120 1201001 10099 5,0502001 20019920,1005001 500499125,2501,000 1 1,000 500,500
如果含有不可復制因子并互補于產物III或產物IV的第三種引物包括在反應中，一種短于產物III或產物IV的新產物將會積累。該產物在反應中較任何其它DNA鏈具有更大的豐度并將主要保持為單鏈。
在圖8-10中說明了根據本發明的反應與“銜接”線性擴增反應一起導致大量的DNA合成。在該反應中使用了四種引物，因此連接兩個同時進行的雙引物反應。在此反應中，引物P1和P3互補于靶核酸的上鏈且P2和P4互補于下鏈。引物P3的互補位點為P1互補位點的5’(相對于模板)。同樣地，引物P4的互補位點為P2互補位點的5’(相對于模板)。感興趣的核酸序列將優先位于與2個引物對相鄰的區域之內。
6個不同的反應可被考慮，每個反應所用的模板不同。并顯示于圖中。反應1A，1B、2A和2B分別導致互補于各自起始核酸模板鏈的第一代合成核酸(分別為產物IA、IB、IIA和IIB)的線性積累。反應3A、3B、4A和4B分別導致第二代合成核酸的線性積累，該第二代核酸由于在反應1A、1B、2A和2B中合成的核酸中存在不可復制因子，所以不能用作引物P1或P2的模板。然而，正如在反應5和6中所見到的，引物P3和P4由于它們互補位點的位置，能夠發揮作用從而分別在原始模板DNA及模板IVA和IIIA中引導DNA合成。當然，產物IIIB和IVB，不是此反應任何引物的模板，但含有感興趣的核酸序列。
很明顯對本文描述的反應的變異將是可能的。例如，線性擴增反應可順序銜接，而不是圖8-10中所述同時進行。因此，引物P3和P4可經n輪引物延伸循環以后添加至反應混合物中，其中的n范圍例如從2到100。
在另一種變異中，引物P1和P2的選擇是使它們能夠與模板DNA退火并在不允許引物P3與P4引導的條件(如溫度)下引導DNA合成。在起始反應混合物中提供引物P1、P2、P3和P4。第一次線性擴增在僅引物P1和P2參與引物延伸的更為嚴格的條件下進行。經過所需次數的循環以后，反應條件變得較為不嚴格，其中的四種引物均參與核酸合成。引物P1和P2用起始模板繼續產生第一代引物延伸產物并且用第一代產物作為模板產生第二代引物延伸產物；引物P3和P4也利用引物P1和P2的第二代引物延伸產物作為模板。又一次，感興趣的核酸序列優選位于以兩種引物對界定的模板鏈的區域之內。
如果第五種含有不可復制因子并互補于產物IIIB或產物IVB的引物包括進反應中，一種短于IIIB或IVB的新產物將積累。此產物在反應中的豐度將大于任何其它的DNA鏈并將主要保持為單鏈。分子生物學領域的技術人員將認識到每當利用奇數的引物實施本發明時，將會得到單鏈DNA的積累。
除了用存在于起始材料中的最初模板核酸鏈合成的引物延伸產物之外(這種引物延伸產物本文稱為“第一代引物延伸產物”)，含有不可復制因子及/或可切割因子的引物的使用確保了在此過程中產生的合成核酸都不能用作隨后輪引物延伸的模板。因此，如在PCR反應環境中所產生的(Kleppe等.，和Saiki等，出處同上)合成的核酸以數學指數方式從循環到循環的積累得以避免。
在分子生物學及DNA化學領域中有經驗的科學家將能夠合成含有不可復制或可切割因子的引物。例如，含有1，3-丙二醇殘基(終止DNA合成)的引物可根據Seela等，核酸研究. 15，3113-3129(1987)中描述的方法進行合成并在商業上可從Glen Research，44901Falcon Place，Sterling VA，20166美國得到。含有1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇殘基的引物，即非堿基位點模型可借助Eritia，核苷及核苷酸6，803-814(1987)進行合成。公開的歐洲專利申請416，817 A2(帝國化學有限公司；1991年3月13日)描述了在引物序列與多聚核苷酸尾部之間含有一個或多個2’脫氧呋喃核糖萘(2’deoxyribofuranosyl naphthalene)成分作為不可復制因子的引物的合成。含有其它終止聚合酶依賴性的模板拷貝的因子，如核糖核苷及脫氧核糖核苷的衍生物的寡核苷酸引物的合成對于本領域有經驗的技術人員將是顯而易見的。不可復制因子優選不位于任何引物的末端殘基。
在分子生物學和DNA化學領域有經驗的科學家同樣能夠合成含有可切割因子的引物。例如，含有核糖核苷的引物一般可通過核酸化學領域中的技術人員已知的標準寡核苷酸合成方法，通過在寡核苷酸合成反應中摻入保護的核糖核苷酸替代脫氧核糖核苷酸由核酸化學領域的技術人員合成。含有適當核糖核苷的引物在商業上是可得到的。
切割第一個引物延伸產物的一種方法利用了與核糖核苷相鄰的磷酸二酯鍵的反應性與同脫氧核糖核苷相鄰的磷酸二酯鍵的反應性的差異。通過用核糖核酸酶(RNase)，如RNase A處理產物可較容易地切割含有核糖核苷酸的引物延伸產物。如果尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)摻入到引物中，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)也可用于切割第一個引物延伸產物以去除其互補引物雜交位點。或者，含有核糖核苷的引物延伸產物可通過以氫氧化物，優選0.5N的NaOH處理產物而被切割。優選的引物將含有一個或更多個核糖核苷，其在引物中的位置應使切割能破壞其中一個用于隨后引物延伸反應引物的雜交位點。核糖核苷可位于引物的3’末端，因為與不可復制因子不一樣，其將不會干擾DNA聚合酶介導的延伸反應。
舉例來說，典型的擴增反應將以雙鏈DNA分子起始來進行，該DNA分子含有待復制的位于較長序列內的序列。對每條鏈特異的寡核苷酸引物退火到各自的鏈上，每條引物含有本文所述的不可復制因子和/或可切割因子。挑選引物從而使它們在待擴增序列的邊界位置結合到各自的模板上。
第一輪引物延伸在所選酶適宜的條件下在DNA聚合酶及四種脫氧核糖核苷酸堿基存在下完成。得到的第一代合成DNA將在其3’末端含有摻入其中的寡核酸引物并在其下游(5’)具有另外引物的完整結合位點。如果引物含有可切割因子，得到的第一代合成DNA將在其3’末端具有摻入其中的含有可切割因子或多個該成份的寡核苷酸引物。
進行第二輪引物延伸循環，其中的第一代合成DNA用作其它引物的模板，即該引物未摻入其3’末端。DNA合成沿著模板進行，但當位于模板中的不可復制因子遇到聚合酶分子時便終止。得到的合成DNA，本文稱為“第二代合成DNA”，具有不連續的末端，在其5’末端由其引物的全部序列所限定，并在其3’末端僅由其它引物的部分序列所限定--該部分序列即在遇到不可復制因子之前由DNA聚合酶所拷貝的序列。
第二代合成DNA將不作為模板參于進一步DNA合成。如上所述，第二代合成DNA僅含部分的必需引物結合位點。在所選的引物退火及延伸的條件下，該部分的引物結合位點不足以令引物結合并用作引物依賴性DNA合成的位點。因此，當第三及隨后輪引物延伸進行時，僅最初的模板DNA及第一代合成DNA作為模板參與。那些模板的持續拷貝導致含有感興趣序列的第二代合成DNA的一輪又一輪地“線性”積累。
經所需輪的引物延伸循環以后，通過提供每條鏈的第二種引物可實現再次的擴增，該第二種引物的選擇是使之在第一套引物界定的區域內結合到最初模板鏈。第二種引物也含有不可復制因子和/或可切割因子，因此確保它們的引物延伸產物不能用作以那些相同引物隨后進行的核酸合成的模板。如果第二種引物含有可切割因子，用這些引物制備的第一個引物延伸產物將在可切割因子的位置被切割，從而使從第一個引物延伸產物制備的第二個引物延伸產物將不含有有功能的可產生與第一鏈引物相同的新的拷貝的結合位點。
已知引物結合條件，尤其是溫度能夠決定是否特異性引物將結合到特異的模板上。見Rychlik等，核酸研究18，6409-6412(1990)；Wu等，DNA細胞生物學10，233-238(1991)。因此，在含有多種堿基組成及/或長度引物的反應混合物中，引物結合溫度的選擇也能用來選擇能夠引導DNA合成的引物。例如，通過在一個擴增反應混合物中提供分別在72℃、62℃和52℃引導合成的第一、第二及第三套引物，在72℃進行第一系列的引物延伸反應將確保僅第一個引物套將發揮功能從而導致引物依賴性的核酸合成。經過所需數的循環以后，引物延伸溫度可降至62℃，此時第一及第二個引物套將指導DNA合成。降低引物延伸反應溫度至52℃允許所有三個引物套參與引物依賴性的DNA合成。在本方法中引物混合物的使用允許該方法以有效的方式進行，無需研究者隨著過程的進行單獨加入每種引物套。
通過使用市售的，可程序化的熱循環儀，上述的所有三種引物套可提供在單個擴增反應混合物中。挑選引物從而使那些在最嚴格的條件下指導DNA合成的引物在模板上結合到其它引物的3’。同樣地，在最不嚴格的條件下引導的那些引物結合到模板上其它引物的5’。第一系列引物延伸反應(循環)在最嚴格的(最高溫度)引物退火條件下進行，其中僅第一種引物套參與含有感興趣序列的DNA的合成。經過事先選定數目的引物延伸循環以后，使引物退火條件變得較不嚴格。第二個引物套將在選定條件下通過指導在第一系列引物延伸循環過程中產生的第二代合成DNA的線性拷貝而起始進一步DNA擴增。當該條件被進一步調整以使第三個引物套能參與引物依賴性的DNA合成時，在第一及第二系列引物延伸反應中產生的第二代合成DNA用作DNA復制的模板。
在預先選定的溫度下結合的引物的設計在分子生物學家的技術范圍之內。特異性引物發揮作用的溫度可通過已有計算方法(Wu等，DNA細胞生物學，10，233-238(1991)及通過計算機程序(Rychlik等，核酸研究，18，6409-6412(1990))，根據引物長度及堿基組成來預測。體外DNA擴增適宜的溫度循環可手工或通過商業上可得到的可程序化的熱循環儀來完成。用熱空氣循環儀可獲得很快的循環時間(Wittwer等，核酸研究。17，4353-4357(1989))；短至30秒的循環時間是可能的(Wittwer等，生物技術10，76-83(1991))。因此一百個引物延伸循環可在少至約50分鐘內完成。
失活用于切割第一個引物延伸產物的試劑的適宜溫度循環可摻入到用于完成所需擴增反應的可程序化熱循環儀的程序中。例如，大多數RN ase的活性通過加熱含有RNase的反應混合物至100℃，3至5分鐘而失活。等位基因特異性線性擴增在本發明的一個實施方案中，設計引物使其3’核苷酸與模板中的已知可變異的(多態的)特定核苷酸互補。該可變異的核苷酸可以是涉及遺傳疾病如鐮刀型細胞貧血的核苷酸，或在已知具有多態性的另一位點的核苷酸。如果在引物的3’核苷酸和模板DNA的相應核苷酸之間存在錯配，引物設計保證其將很少延伸，或者，優選地完全不延伸。見Petruska等，美國科學院院報美國85，6252-6256(1988)。因此，這樣的引物是“等位基因特異性的”并能夠在感興趣核酸序列內識別單個堿基的存在與否。因此在本發明方法中使用等位基因特異性引物之后存在合成DNA則表示在最初DNA模板中感興趣的等位基因的存在。
此寡核苷酸引導的等位基因特異性特征已用于進行等位基因特異性PCR。見，例如，Newton等，核酸研究17 2503，2516(1989)。然而，與一般PCR一樣，等位基因特異性PCR反應的指數行為與運行反應的困難相關聯(見Ugozzoli等，方法2，42-48(1991))。然而，本擴增方法的循環的線性行為由于在等位基因特異性引物內存在不可復制因子而避免了這樣的困難。擴增產物的檢測本發明擴增方法的主要產物為具有限定長度的單鏈合成DNA。產物鏈的長度由最后使用的引物位置所決定并等于引物自身長度和可從引物3’末端至模板不可復制因子之間摻入的核苷酸數目的總和。產物可通過已知的核酸檢測技術加以檢測，包括用放射性、螢光成分或酶等標記的引物或探針，電泳，高壓液相色譜等。
本發明在人類及其它動物遺傳疾病的診斷中將具有重要的應用。已知許多人類遺傳疾病由已知序列的基因中的特異性改變所致。對于這些特異性突變，用雜交或其它等位基因特異性技術(見上)測定各種基因序列中哪個存在于具有疾病風險的病人DNA中來進行基于DNA的診斷是可能的。很明顯，靶DNA的擴增在開發這些技術中是很有幫助的。該模板擴增的主要優勢為可用較小的樣本量，檢測系統的信噪比提高，存在真正自動化的可能且擴增系統自身可以是檢測系統。
本發明方法提供了由其它擴增反應所提供的所有相同的優勢，且還有其它的好處。產物為單鏈并且因此在檢測之前不必變性。如果使用了奇數引物，將產生過量的單鏈分子。這些分子將是有用的，例如，作為雜交探針，并因此提供了優于其它擴增技術的額外優勢。由于產物線性積累并因此可準確定量，故還帶來了進一步的優勢；與用新合成DNA作為用相同引物的隨后輪循環的模板的指數方法相比，“假陽性”的出現幾率將減少。
實施例在下面幾個實施例中使用的溶液描述如下TE(Tris-EDTA)10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8.0TBE(Tris-硼酸鹽-EDTA)89mM Tris-HCl，89mM硼酸，2mM EDTA，pH8.3Klenow聚合酶緩沖液50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，pH7.6激酶緩沖液50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亞精胺-HCl，0.1mM EDTA，pH7.6DNA聚合酶I緩沖液50mM Tris-HCl，10mM MgSO4，0.1mM DTT，50μg/ml小牛血清白蛋白，pH7.2測序酶緩沖液40mM Tris-HCl，20mM MgCl2，50mMNaCl，pH7.5Bst聚合酶緩沖液20mM Tris-HCl，20mM MgCl2，pH8.5棲熱水生菌聚合酶緩沖液50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠，pH8.310x Ficoll上樣緩沖液100mM Ths-HCl pH7.5，10mMEDTA，0.5％溴酚藍，0.5％二甲苯胺(xylene cyanol)，30％Ficoll5×SSPE50mM磷酸鈉pH7.0，0.9mM NaCl及5mM EDTA6×SSC0.9M NaCl，0.09M檸檬酸鈉本發明方法通過下面的實施例加以說明，其并非限制權利要求保護的范圍。
實施例1-當存在于模板中時1，3-丙二醇阻止引物延伸為了證實1，3-丙二醇成分用作不可復制因子并終止DNA合成的能力，合成具有或不具有含1，3-丙二醇成分(標記為不可復制因子“X”)的單核苷酸堿基的模板及互補于該模板3’末端的引物。合成的序列如下名稱 序列(5’→3’)DNA II 207 GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTCDNA II 207X GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTCP12 GAACCGGAGACT
引物與模板退火以形成下面的引物模板復合物5’GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTCTCAGAGGCCAAG 5’5’GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTCTCAGAGGCCAAG 5’該引物模板復合物然后在α-[32P]-dCTP存在下以各種DNA聚合酶(DNA聚合酶I Klenow片段，Ampli Taq聚合酶(珀金埃爾默-Cetus公司)，BST聚合酶(伯樂實驗室，Hercules，CA)及測序聚合酶(美國生物化學，Cleveland，OH))延伸并且產物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。
引物與模板以引物/模板比為10進行混合，并采用對聚合酶適宜的緩沖液。20μl反應液中含有1pmol207或207-X，10pmol P12，25μM dNTPs，0.5μCiα-[32P]-dCTP及Ampli Taq緩沖液，BST緩沖液，Klenow緩沖液或測序酶緩沖液。在加入一單位DNA聚合酶及37℃反應10分鐘之前樣品于90℃加熱2分鐘并冷卻至0℃5分鐘。如下所示，結果表明丙二醇殘基阻止所有四種DNA聚合酶的引物延伸5′GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTC<-----------------TCAGAGGCCAAG 5’5′GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTC<-----------------TCAGAGGCCAAG 5′實施例2-具有含丙二醇堿基的引物不支持PCR制備四種寡核苷酸，其中的2種含有不可復制的1，3-丙二醇成分。該序列在具有Z位的MMT-丙二醇磷酰胺的Eppendorf EcosynD300自動DNA合成儀上合成。當將序列放入合成儀時，Z被導入。該序列列于下表
名稱序列(5’→3’)BGP-2 22GGGTGGGAAAATAGACCAATAGBGP-2 22X GGGTGGGAAAATAGACCXATAGBGP-1 30GGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCABGP-1 30X GGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAXGTCA人類β-珠蛋白基因(GenBank位置HUMHBB)中該寡核苷酸互補位點顯示于圖12。
體外擴增反應以四種引物的各種組合完成。在標準PCR反應緩沖液中每種反應含有100ng人類基團組DNA，各6pmol的兩種引物。反應置于熱循環儀中(Ericomp)并加熱至94℃3分鐘，冷卻至55℃30秒，加熱至72℃30秒然后按如下進行31輪加熱冷卻循環94℃，1分鐘，55℃，30秒，72℃30秒。經熱循環以后，樣品于72℃中再孵育3.5分鐘。僅含有不具丙二醇引物(BGP-130和BGP-222)的反應得到了319bp的擴增產物。因此證實含有丙二醇的引物不支持PCR。
實施例3-含有1，3-丙二醇的引物產生特異性DNA片段質粒pHβA與含有丙二醇的引物(BGP-130X及BGP-222X)或不含丙二醇成分的對照引物(BGP-130及BGP-222)混合。引物/模板混合物置于94℃20秒的熱循環條件以解離雙鏈模板，接著以48℃20秒。最后一輪循環后，反應混合物于48℃進一步孵育5分鐘40秒以完成引物延伸反應和退火單鏈DNA。利用含有丙二醇引物的反應混合物(根據本發明)經45輪的引物延伸循環。利用不含丙二醇成分的引物的PCR反應經10輪引物延伸的循環。反應產物于1.5％的瓊脂糖(TBE緩沖液)上電泳。含有丙二醇的引物產生小于PCR產生片段的DNA片段。較小的片段大小是由于引物延伸沒有延伸至模板鏈末端，導致在產物上留下5’突出端。
圖11顯示了PCR反應產物與根據本發明的LLA反應產物的比較。以指數方式積累的PCR反應主要產物為完全的雙鏈，具有相應于所用引物末端的限定的末端。然而，由于跨過不可復制因子的引物延伸沒有發生，本發明方法的產物短于相應的PCR產物。
實施例4-含有丙二醇的引物支持DNA擴增根據本發明的擴增反應用BGP-130X及BGP-222X進行各種數目的循環。擴增產物進行斑點印跡雜交，并且雜交信號與獲自含有該序列的已知量質粒DNA信號相比較。
制備15μl的反應液，其在標準PCR緩沖液中含有1.1ng質粒pHβA(含有克隆于pBR322中的完整人類β-珠蛋白基因)，5pmolBGP-1 30X，5pmol BGP-2 22X，83μM dNTPs，2.5單位的AmpliTaqRDNA聚合酶。熱循環反應在Corbett Research FTS-1熱循環儀中進行45、32及22輪循環，程序如下94℃20秒，48℃20秒。循環結束時反應加熱至94℃20秒且然后于48℃孵育4分鐘。
反應產物(3μl)與10μl 4N的NaOH、250mM EDTA混合并印跡到Zeta-探針膜(伯樂實驗室，Hercules，CA)上。同樣變性的56、118及231ng的質粒pHβA也包括在膜上。該膜在5×SSPE，1％SDS，5mg/mlBlotto，10μg/ml Homomlx I RNA中與5’-32P-CTGCAG TAACGGCAGACTTCTCCT于55℃雜交3小時。雜交以后印跡在室溫下以6×SSC洗滌，然后用伯樂分子圖像儀掃描。反應產物約250倍的擴增證明本發明方法導致感興趣核酸序列的擴增。
實施例5-從基團組DNA中擴增人類β-珠蛋白基因根據本發明的線性擴增反應根在15μl體積中完成，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(800ng基因組DNA或104個質粒pHβ4分子)，200μM的每種dNTP(dATP，dTTP，dCTP，及dGTP)，2pmol的寡核苷酸引物BGP5-22X及BGP4-22X，以及2單位的Ampli-Taq聚合酶(珀金埃爾默Cetus)。質粒pHβA含有克隆于pBR322中PstI位點的4.4kb的人類β-珠蛋白基因的PstI的片段。作為陰性對照，除了模板DNA之外包括用于前述反應中所有成分進行反應(“無模板”對照)。模板DNA變性3分鐘后，擴增按如下進行99輪循環55℃退火30秒，72℃聚合15秒，并于94℃變性30秒。在最后一輪循環結束時，樣品于55℃退火30秒并最后于72℃聚合4分鐘。
第一步驟(100輪循環)結束時，從每種樣品(基因組DNA，質粒DNA，和陰性對照)中取出7.5μl，并與7.5μl含棲熱水生菌聚合酶緩沖液，5pmol引物BGP1-35X及BGP2-35X，及2單位Apmpli Taq聚合酶的溶液混合。除了退火溫度為63℃以外，循環程序類似于第一步驟所用的程序。
為了控制由擴增產生的片段的大小，進行了兩種反應。一種反應含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，5pmol引物BGP5-22X及BGP4-22X，1×108個質粒pHβA分子，及3單位的Ampli-Taq聚合酶。除了使用引物BGP1-35X和BGP2-35X之外第二種對照包括與前面反應相同的成分。模板DNA于94℃變性4分鐘并然后用下面條件的程序循環48次于55℃退火及聚合30秒；于94℃變性30秒。在最后一輪循環結束時樣品于55℃退火30秒并于72℃聚合4分鐘。
引物序列(5’-->3’)BGP1-35XCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGXCATCBGP2-35XGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGXGTCABGP4-22XCCAAAGGACTCAAAGAAXCTCTBGP5-22XCCTCACCCTGTGGAGCCXCACCLLA產物的分析全部反應(15μl)與1.6μl10×Ficoll上樣緩沖液混合并于1.5％瓊脂糖凝膠(伯樂超純瓊脂糖)中電泳。電泳于TBE緩沖液中110伏進行90分鐘。凝膠隨后以溴化乙錠(1μg/ml)染色30分鐘，脫色15分鐘，并通過紫外(UV)照射拍照。電泳的DNA然后通過堿性轉移(Reed，K.C.和D.A.Mann，從瓊脂糖凝膠中快速轉移DNA至尼龍膜上，核酸研究，137207-722(1985))轉移至尼龍膜(Zeta Probe，伯樂)上并通過UV輻射(Church，G.M.和W.Gilbert，基因組測序，美國科學院院報，811991-1995(1984))固定至膜上。膜于5×SSPE，1％SDS，10μg/ml homomix RNA及0.5％脫脂奶粉(康乃馨，洛杉磯，CA)中預雜交1小時并隨后以2.5×106cpm/ml 5’末端32P標記的探針5’CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT在55℃雜交2小時。膜以6×SSC室溫洗2次各30分鐘并在室溫放射自顯影30分鐘。
基因組DNA產生與珠蛋白基因質粒DNA對照相同的片段。片段的大小為由BGP1-35X及BGP2-35X引物產生的大小。
實施例6與PCR體外擴增相比LLA擴增產物對污染具有抗性本發明的“LLA”擴增反應在15μl體積中完成，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(3.5×109個質粒pHβA分子)，200μM每種dNTP(dATP、TTP、dCTP和dGTP)，5皮摩爾(picomoles)寡核苷酸引物BGP1-22X及BGP2-22X，以及1.25單位的Ampli-Taq DNA聚合酶(珀金埃爾默Cetus)。模板DNA變性1分鐘以后，通過于48℃退火30秒及94℃變性30秒進行49輪擴增。最后一個循環結束時，樣品于48℃孵育4分鐘。
為了比較目的，在15μl體積中進行PCR反應，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(3.5×109個質粒pHβA分子)，200μM的每種dNTP(dATP、TTP、dCTP、及dGTP)，5皮摩爾的寡核苷酸引物BGP1-22和BGP2-22，及1.25單位的Ampli-Taq DNA聚合酶。模板DNA變性1分鐘后，通過于48℃退火30秒并于94℃變性30秒進行9個循環的擴增。最后一個循環結束時，樣品于48℃孵育4分鐘。
LLA和PCR產物的分析LLA及PCR產物的兩倍系列稀釋液(1/64μl、1/32μl、1/16μl、1/8μl、1/4μl、1/2μl、1μl、2μl、4μl及8μl)與1×Ficoll上樣緩沖液混合并于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳。電泳在1×TBE緩沖液中以110伏特進行90分鐘。電泳的DNA通過堿性轉移(Reed和Mann，1985)轉移至尼龍膜，通過紫外輻射交聯(Church和Gilbert，1984)，且然后以2×SSC中和。然后，膜在5×SSPE、1％十二烷基磺酸鈉(SDS)，10μg/ml homomix RNA，0.5％脫脂奶粉及2.5×106cpm32p標記的探針5’CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT中雜交。雜交在55℃進行2小時。雜交以后，膜在室溫以6×SSC洗兩次各15分鐘且然后以伯樂GS-250分子圖像儀掃描和定量。
擴增子污染實驗相同量的LLA產物(1/26μl)及PCR(1/16μl)產物(由圖像儀定量(上述))用蒸餾水進行104、105及106倍的稀釋；這些稀釋液隨后用作PCR反應的DNA模板。擴增反應在15μl體積中完成，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(LLA或PCR稀釋液)，200μM的每種dNTP(dATP、TTP、dCTP及dGTP)，5皮摩爾的寡核苷酸引物BGP1-22和BGP2-22，及1單位的Ampli-Taq聚合酶。反應以雙份進行且在第-步94℃熱變性3分鐘以后，樣品進行25和30輪擴增循環(55℃30秒，72℃30秒，及94℃30秒)并最后于50℃孵育30秒及72℃孵育4分鐘。此外，包括除了模板DNA外含有所有試劑的陰性對照。
為了控制和定量LLA和PCR DNA模板的相對量，用在BGP1-22和BGP2-22內部引導的不同引物套(MD040和PC04)進行第二套PCR反應。反應成分(除了引物)和反應條件如前面段落所述。
15μl反應液與16μl 10×Ficoll上樣緩沖液混合并于1.5％瓊脂糖凝膠(伯樂超純瓊脂糖)中電泳。電泳于1×TBE緩沖液中110伏特進行90分鐘。凝膠然后以溴化乙錠(1μg/ml)染色30分鐘，脫色15分鐘，并通過紫外(UV)照射拍照。電泳的DNA然后通過堿性轉移(Reed和Mann(1985))轉移至尼龍膜并通過UV照射固定至膜上(Church(1984))。膜于5×SSPE，1％SDS，10μg/ml homomix RNA及0.5％脫脂奶粉中預雜交1小時，然后與2.5×106cpm/ml 5’-P32標記的探針5’CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT于55℃雜交2小時。以6×SSC于室溫洗膜2次并且反應以伯樂GS-250分子圖像儀定量。
結果測定以外側引物套(測量擴增子在第二個反應中擴增的能力)與內側引物套(測量存在于反應中擴增子的數量)擴增的反應的雜交比。正如從下表中所能見到的，LLA反應產生的擴增子能抵抗從外側引物的擴增并且因此將抵抗遺留污染的影響。
表II污染對隨后擴增的影響稀釋外側內側(PCR)外側內側(LLA)10-41.58 0.1710-51.62 0.02實施例7通過LLA用含核糖核苷的引物制備特異性DNA片段用標準的自動固相合成方法制備具有下面序列的寡核苷酸及含核糖核苷的寡核苷酸。在寡核苷酸GH1和GH2中的尿嘧啶核苷為核糖核苷。
名稱序列(5’-->3’)GH1 SEQTTCCCAACCAUTCCCTTAGH2 SEQGGATTTCTGUTGTGTTTCGH3 SEQTTCCCAACCATTCCCTTACHG SEQGGATTTCTGTTGTGTTTCMd114 TAGCGTTGTCAAAAAGCC進行用含有核糖核苷的引物GH1和GH2或脫氧引物GH3和GH4從基團組DNA樣品中擴增人類生長激素基因片段的體外擴增反應。每種反應在含有1.5單位Taq聚合酶(珀金-埃爾默)的標準PCR反應緩沖液中含有500ng人類基因組DNA及兩種引物中每種引物40皮摩爾。通過將反應混合物置于熱循環儀中，并加熱至95℃4分鐘，冷卻至52℃2分鐘，然后加熱至72℃1分鐘進行擴增反應。擴增反應按如下持續28個循環94℃4分鐘、52℃2分鐘及72℃1分鐘；且然后進行如下的一輪循環94℃1分鐘，52℃2分鐘及72℃6分鐘。反應以后，擴增產物于1.5％瓊脂糖凝膠中分離，然后用制備基因(“Prep-A-Gene”)DNA純化試劑盒(可從伯樂得到)純化。
于5.6μl反應體積中的擴增產物以1.4μl 0.5M NaOH處理以在相鄰于摻入到第一PCR產物中的尿嘧啶核苷的磷酸二酯鍵處切割擴增產物，然后加熱至95℃15分鐘。這些溶液通過加入0.9μl 1M HCl而中和，然后將產物進一步線性擴增以證實第一個引物延伸產物不再含有用于PCR反應的含核糖核苷酸引物的完全拷貝。PCR產物用在5’末端以P32標記的寡核苷酸Md114進行引物延伸。依據反應中所用的引物，用以NaOH處理的PCR擴增片段制備的引物延伸產物短于沒有被NaOH切割的PCR擴增片段的引物延伸產物。這些結果證明了摻入的核糖核苷可被切割以阻止在隨后輪的PCR擴增中引物的延伸。
權利要求
1.一種用于擴增包含在互補核酸鏈內的感興趣的核酸序列的方法，包括(a)在適當條件下將所述的鏈與含有不可復制因子的引物接觸，使第一代引物延伸產物用所述的鏈作為模板而合成，并且其中用于鏈的引物的選擇是使以其合成的第一代引物延伸產物在與鏈分離后，可用作互補鏈引物的模板用于合成第二代引物延伸產物；(b)將第一代引物延伸產物從其各自模板上分離以制備單鏈分子；和(c)在適當條件下用步驟(a)的引物處理第一代引物延伸產物從而用第一代引物延伸產物作為模板而合成第二代引物延伸產物；其中的第二代引物延伸產物至少含有感興趣核酸序列的部分序列，并且不能夠用作延伸后合成其模板的引物合成延伸產物的模板。
2.根據權利要求1的方法，其進一步包括將產生的第二代引物延伸產物與其各自的模板分離以制備單鏈分子。
3.根據權利要求1的方法，其中的步驟(c)至少重復一次。
4.根據權利要求1的方法，其中的不可復制因子不位于任何所述引物的末端殘基。
5.根據權利要求1的方法，其中的不可復制因子為脫氧核糖核苷酸的衍生物。
6.根據權利要求1的方法，其中的不可復制因子為核糖核苷酸的衍生物。
7.根據權利要求5的方法，其中的不可復制因子為1，3-丙二醇殘基。
8.根據權利要求5的方法，其中的不可復制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇殘基。
9.根據權利要求1的方法，其進一步包括在適當條件下以含有不可復制因子的引物處理第二代引物延伸產物的步驟從而利用第二代引物延伸產物作為模板而合成引物延伸產物。
10.一種用于擴增包含在互補核酸鏈中的感興趣的核酸序列的方法，包括(a)在適當條件下將所述的鏈與含有不可復制因子的第一種引物和第二種引物接觸，使第一代引物延伸產物用所述的鏈作為模板而合成，并且其中第一種引物和第二種引物的選擇是使第一代引物延伸產物在與其模板分離后，可用作第一種引物和第二種引物的模板用于合成第二代引物延伸產物；(b)將第一代引物延伸產物從其各自模板上分離以制備單鏈分子；和(c)在適當條件下用第一種引物和第二種引物處理第一代引物延伸產物從而用第一代引物延伸產物作為模板而合成第二代引物延伸產物；其中的第二代引物延伸產物至少含有感興趣核酸序列的部分序列，第一種引物的第二代引物延伸產物能夠用作模板產生第二種引物的引物延伸產物。
11.根據權利要求10的方法，其進一步包括分離步驟(c)中產生的引物延伸產物以制備單鏈分子。
12.根據權利要求10的方法，其中的步驟(c)至少重復一次。
13.根據權利要求10的方法，其中的不可復制因子不位于任何所述引物的末端殘基上。
14.根據權利要求10的方法，其中的不可復制因子為脫氧核糖核苷酸的衍生物。
15.根據權利要求10的方法，其中的不可復制因子為核糖核苷酸的衍生物。
16.根據權利要求14的方法，其中的不可復制因子為1，3-丙二醇殘基。
17.根據權利要求14的方法，其中的不可復制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇殘基。
18.根據權利要求10的方法，其進一步包括在適當的條件下用第三種引物處理所述第二種引物的第二代引物延伸產物，其中所述的第三種引物含有不可復制因子，從而利用所述第二種引物的第二代引物延伸產物作為模板而形成第三種引物延伸產物。
19.根據權利要求10的方法，其中每條所述的鏈含有第一種引物的引物結合位點和第二種引物的引物結合位點，第一種引物的引物結合位點位于第二種引物的引物結合位點的3’。
20.一種擴增包含在互補核酸鏈內的感興趣核酸序列的方法，包括(a)將所述的鏈在第一套引物延伸反應條件下與第一種引物及第二種引物接觸，所述的第一種引物及第二種引物均含有不可復制因子，從而使第一代引物延伸產物用所述的鏈作為模板從第一種引物而不是第二種引物合成，并且其中第一種引物的選擇是使來自此步驟的第一代引物延伸產物在與其模板分離后，可用作模板合成所述互補鏈的第一種引物的第二代延伸產物；(b)將第一代引物延伸產物與其各自的模板分離以制備單鏈分子；(c)以步驟(a)的引物在適當條件下處理第一代引物延伸產物從而用第一代引物延伸產物作為模板產生第二代引物延伸產物；(d)將第二代引物延伸產物與其各自的模板分離以制備單鏈分子；(e)重復步驟(c)和(d)至少一次；和(f)將步驟(e)的反應混合物置于第二套引物延伸反應條件中從而用第二代引物延伸產物作為模板從所述的第二種引物合成引物延伸產物。
21.根據權利要求20的方法，其中所述的第一套引物延伸反應條件較第二套引物延伸反應條件更為嚴格。
22.根據權利要求20的方法，其中所述的第一套條件包括較所述的第二套條件更高的溫度。
23.根據權利要求20的方法，其中的不可復制因子不位于任何所述引物的末端殘基上。
24.根據權利要求20的方法，其中的不可復制因子為脫氧核糖核苷酸的衍生物。
25.根據權利要求20的方法，其中所述的不可復制因子為核糖酸苷酸的衍生物。
26.根據權利要求24的方法，其中的不可復制因子為1，3-丙二醇殘基。
27.根據權利要求24的方法，其中的不可復制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇殘基。
28.根據權利要求20的方法，其中所述的每條鏈含有第一種引物的引物結合位點和第二種引物的引物結合位點，第一種引物的引物結合位點位于第二種引物的引物結合位點的3’。
29.根據權利要求1的方法，其中的核酸序列含有與遺傳疾病有關的多態位點，并且所述的每種引物的選擇是使之僅在所述疾病狀態存在或不存在時引導核酸合成。
30.根據權利要求29的方法，其中所述的遺傳疾病為鐮刀型細胞貧血。
31.根據權利要求1的方法，進一步包括檢測擴增的感興趣核酸序列的存在與否。
32.根據權利要求10的方法，進一步包括檢測擴增的感興趣核酸序列的存在與否。
33.根據權利要求20的方法，進一步包括檢測擴增的感興趣核酸序列的存在與否。
34.用于擴增特定核酸序列的試劑盒，包括DNA聚合酶，待擴增的每種序列的引物對，以及能由所述的引物和DNA聚合酶復制的對照核酸序列，其中所述的每種引物均包括不可復制因子。
35.根據權利要求34的試劑盒，其中的不可復制因子為1，3-丙二醇殘基。
36.根據權利要求34的試劑盒，其中的不可復制因子為1，4-脫水-2-腫氧-D-核糖醇殘基。
37.用于擴增特定核酸序列的試劑盒，包括DNA聚合酶，每種待擴增序列的引物對，以及能夠檢測特定核酸序列擴增產物存在與否的核酸探針，其中所述的每種引物均包括不可復制因子。
38.根據權利要求37的試驗盒，進一步包括能由所述引物和DNA聚合酶復制及能由所述的核酸探針檢測的對照核酸序列。
39.根據權利要求37的試劑盒，其中的不可復制因子為1，3-丙二醇殘基。
40.根據權利要求37的試劑盒，其中的不可復制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇殘基。
41.根據權利要求34的試劑盒，其中所述引物的選擇是使之擴增代表遺傳疾病或異常的核酸序列。
42.根據權利要求37的試劑盒，其中所述引物的選擇是使之擴增代表遺傳疾病或異常的核酸序列。
全文摘要
感興趣核酸序列的大量合成(“擴增”)通過一系列銜接的多輪引物延伸反應(LLA)來完成。本方法每個引物延伸反應中使用的引物含有不可復制因子,其終止核酸合成并因此阻止合成的分子用作隨后循環的模板。合成的分子在引物延伸過程中以數學線性方式積累,因而使該方法對污染核酸相對不敏感。采用了多引物套從而保證了感興趣的核酸序列的大量拷貝的積累。本發明也提供了擴增的感興趣核酸序列的檢測方法,以及完成該反應的試劑盒。
文檔編號C12N15/09GK1186520SQ96194406
公開日1998年7月1日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月7日
發明者羅伯特·布魯斯·華萊士 申請人:伯樂實驗有限公司