專利名稱：：用復合毒素防治昆蟲的制作方法
技術領域：
：本發明一般地說涉及昆蟲毒素在昆蟲防治中的使用，更具體地說，涉及的是關于表達昆蟲-選擇性毒素的殺蟲重組微生物，它們是增效的組合，用以提高殺死昆蟲的速率。本發明是在政府的支持下完成的，許可號為91-37302-6185，授權部門為美國農業部。美國政府在本發明中有一定的權利。發明背景鱗翅目夜蛾科包括一些很有破壞性的農業害蟲，如棉鈴蟲屬(Heliothis)、Helicoverpa、斜紋夜蛾屬(Spodoptera)和粉紋夜蛾屬(Trichoplusia)。例如在夜蛾科中還包括煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)、棉鈴蟲(Helicoverpazea)、棉葉夜蛾(Alabamaargillacea)、八字紋地老虎(Amathesniarum)、透明緩夜蛾(Crymodesdevastator)、青銅地老虎(Nephelodesemmedonia)、草地夜蛾(Laphygmafrugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和雜色地老虎(Peridromasaucia)。農業害蟲如夜蛾科昆蟲(及其它)對農藥的抗性，導致對環境和人類健康危害。對殺蟲劑的抗性問題導致使用更多無選擇的和有毒化合物以克服害蟲的抗性，這就引起了破壞和惡性循環。選擇性天然毒素已被建議使用在昆蟲防治中。這些毒素包括有毒動物體內特殊的腺組織中產生的物質。毒液可例如借助于穿刺器官，導入被捕獲物或目標物的體內，麻痹和/或殺死它，以及其它的已知的釋放毒物方法。以蝎子為例，在它的毒液中含有大量的有毒的和作用于興奮系統的蛋白質或神經毒素。其中被建議用于昆蟲防治的昆蟲特異毒素是從蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、蝎子如鉗蝎(Buthueupeus)和撒哈拉蜂蝎(Androctonusaustralis)，Leiurusquinqustriatushebraeus、Leiurusquinqustriatusquinqustriatus和螨(虱狀蒲螨)(Pyemotestritici)獲取的毒素。由屬于鉗蝎亞科(Buthinae)蝎子中得到的毒液，主要含有四個重要組的調節軸突鈉傳導的多肽神經毒素。第一組蝎子神經毒素是α-毒素，它選擇地作用于哺乳動物，由于延緩或阻斷鈉通道失活，使動作電位極端延長(Catterall，《科學》[Science]，223653-661(1984)；Rochat等，《細胞藥理學進展》[AdvancesinCytopharmacology]，pp.325-334(1979))。第二組毒素是β-毒素，損害鈉通道的活性(Couraud和Jover，《自然毒素手冊》[HandbookofNaturalToxins]Tu，A.編，第二卷，pp.659-678(1984)紐約MarcelDekker)。第三組神經毒素是抑制性昆蟲選擇性毒素，由于抑制鈉電流，從而它基本上阻斷動作電位，導致昆蟲逐漸軟弱麻痹(Lester等，《生物化學和生物物理學報》[Biochim.Biophys.Acta]701370-381(1982)；Zlotkin等，[Arch.Biochem.Biophys]，240877-887(1985))。第四組神經毒素是興奮性昆蟲選擇性毒素，由于增加鈉峰電流和延緩其失活所依賴的電壓，從而誘導反復點燃其運動神經，導致昆蟲即刻(擊倒)的抽搐麻痹(Walther等，《昆蟲生理學雜志》[J.InsectPhysiol.]，221187-1194(1976)；Pelhate等，《生理學雜志》[J.Physiol.]，30318-319(1981))。除了蝎子和螨的毒素以外，在蝸牛、蜘蛛和若干其它節肢動物的毒液中也已經鑒定出昆蟲選擇性毒素。(參見Zlotkin的綜述，《綜合昆蟲生理學、生物化學和藥理學》[ComprehensiveInsectPhysiolopy，BiochemistryandPharmacology]，第10卷，第15章，pp.499-541(1985))。繭蜂的毒液對鱗翅目幼蟲具有很高的毒性。通過在昆蟲神經肌肉結合點誘發興奮性谷氨酸能(glutaminergic)傳導的前聯合體間斷，麥蛾繭蜂(Braconhebetor)的毒液引起鱗翅目幼蟲軟弱麻痹(Piek等，Comp.Biochem.Physiol.，72c303-309(1982))。獨居蜂(solitarywasp)對很多不同目的昆蟲和蜘蛛都表現出毒性(Rathmeyer，Z.Vergl.，Physiol.，45453-462(1962))。這些毒液的一個例子是三角泥蜂(Philanthustriangulum)毒液，由于前聯合體阻斷神經肌肉的傳輸，這種毒液誘發昆蟲基本軟弱麻痹；它對興奮性和抑制性傳輸都產生影響(May等，《昆蟲生理學》[InsectPhysiol)，25285-691(1979))。黑寡婦蜘蛛(Latrodectusmactans)的毒液含有的一些對昆蟲有神經毒性，但對哺乳動物沒有神經毒性的組分，而其它組分具有相反的選擇性(Fritz等，Nature，238486-487(1980)；Ornberg等，Toxicon，14329-333(1976))。最近，一種稱為LqhαIT的毒素，它在一級結構和電生理學作用牢固地重新裝配α-毒素，已從L.quinquestriatushebraeus的毒液分離出來并表現出主要影響昆蟲(Eitan等，《生物化學》[Biochemistry]，29(1990)，PP.5941-5947)。有毒動物的毒液是由各種作用于被捕獲物的興奮系統中的不同靶位點的毒素組成。比較毒素和其各自的天然毒液對鱗翅目幼蟲的活性，以此數據為基礎，可以清楚地看到，天然毒液的效力不能用單一毒素的活性來解釋。天然毒液的高效力可能涉及到毒液中的不同毒素在下述三個方面共同協作的結果同一離子通道不同靶位點(表3，Trainer等，JBC，26817114-17119(1993))，同一可興奮細胞的不同離子通道(Olivera等，《科學》[Science]，249，257-263(1990))，和/或毗鄰的可興奮細胞(神經和/或肌肉)的不同結合點(Olivera等，《科學》[Science]，249，257-263(1990))。有抑制性和興奮性作用的昆蟲選擇性毒素不會與α-昆蟲毒素競爭其結合點(Gordon和Zlotkin，FEBS.Lett.，315，(1993)pp.125-128)。與蝗蟲和蟑螂的神經膜相反，在鱗翅目幼蟲的神經膜的結合點上，興奮性毒素不替代抑制性毒素(Gordon等，《生物化學》[Biochemistry]，31(1992)，pp.7622-7628；Moskowitz等，《昆蟲生物化學和分子生物學》[InsectBiochem.Molec.Biol.]，24(1994)，pp.13-19)。近來，屬于桿狀病毒科的苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒(AcNPV)，已通過表達昆蟲選擇性毒素作了遺傳上的修飾，以提高殺蟲的速度。把昆蟲選擇性毒素引入昆蟲病原病毒曾導致殺死昆蟲宿主的時間減少，正如在1994年4月15日申請的美國專利申請號08/229417中所描述的那樣，上述美國專利申請是1990年12月19日申請的美國專利申請號07/629603的接續申請，它們與此(部分)共同轉讓。Tomalski等的美國專利號5266317，1993年11月30日公布，討論表達昆蟲捕食蜱螨的昆蟲特異性麻痹神經毒素的重組桿狀病毒的應用。Barton等的美國專利號5177308，1993年1月5日公布，在創造表達由蝎子得來的昆蟲特異性毒素和/或土壤微生物毒素的轉基因植物方面采用了一種不同的途徑。在一未決申請(它與此共同轉讓)，Hammock和McCutchen在1994年7月5日申請的美國專利申請號08/279956中，討論了用重組病毒與有機殺蟲劑的增效組合來進行昆蟲防治。由于大范圍出現害蟲對有機殺蟲劑如擬除蟲菊酯害蟲抗性已經開始造成巨大的作物損失，因此這些新出現的使用重組的策略來進行害蟲種群的防治是非常有希望的。單就棉花來說，pyr-R棉鈴蟲種類的出現已經導致每年數百萬美元的損失。實際上，在一些案例中，擬除蟲菊酯殺蟲劑對棉鈴蟲屬幼蟲侵害的防治已經完全失敗，結果棉花全部被毀。發明概述本發明的一個方面是，通過遺傳工程提供的殺蟲微生物的應用，提供一種防治各種害蟲的方法。根據本發明防治的害蟲是，例如昆蟲、蜱螨和線蟲類。因此，本發明可適用于鱗翅目和其它目，以及夜蛾科和其它科。這些害蟲用一種或更多種重組微生物表達的毒素的增效組混合來處理(或處理其位點)。例如，這種方法可以使用表達第一種神經毒素的第一種重組病原體與表達第二種神經毒素的第二種重組病原體組合，或者使用表達多種(如第一種和第二種)神經毒素的單一重組病毒。本發明的方法加快了用病毒殺死害蟲的速率。附表簡述在附圖中，表1闡明了合成基因LqhIV的核苷酸序列，SEQIDNO1，它是一種實施本發明的優選毒素。優選實施方案詳述本發明是遺傳工程化的殺蟲微生物組合在處理害蟲如昆蟲中的應用。雖然重組桿狀病毒將始終作為優選微生物的例證，但本發明也可用多種微生物作為重組釋放體系來實施本發明。因此，可用于本發明的微生物包括DNA和RNA病毒如桿狀病毒，真菌和細菌。大約40種核多角體病毒已從昆蟲種類里分離出來。(參見例子，《無脊椎動物病毒圖集》[AtlasofInvertebrateViruses]，Adams和Bonami，編輯，CRCPress，Inc.，1991)。各種桿狀病毒包括那些感染如下昆蟲的桿狀病毒棉鈴蟲(Helicoverpazea)、煙芽夜蛾、花旗松毒蛾(Orgiapseudotsugata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、苜蓿銀紋夜蛾、松柏鋸角葉蜂(Neodiiprionsertifer)、蘋果蠹卷蛾(Laspeyresiapomonella)，它們已經注冊為殺蟲劑，所有這些來自昆蟲種類的桿狀病毒都適合用來實施本發明。多數真菌都能使昆蟲感染。把昆蟲選擇性毒素引入這些真菌的基因組會提高它們作為殺蟲劑的效力。例如，蠶白僵菌(Beauvariabassania)和Beauvariabrongniartii有很大的宿主范圍，它們已被建議作為候選的微生物殺蟲劑(參見Miller的綜述，《科學》[Science]，219715-721，1983)。已經作為昆蟲防治劑的細菌(除蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)之外)，包括日本甲蟲芽孢桿菌(Bacilluspopilliae)、緩病芽孢桿菌(B.lentimorbus)和球狀芽孢桿菌(B.sphaericus)。通過把昆蟲選擇性毒素引入這些細菌的基因組來改善它們的效力從而提高它們作為殺蟲劑的潛力。本發明的實施涉及兩種在防治昆蟲方面有增效作用的毒素的組合應用。這兩種毒素可通過其中已引入兩種毒素基因的單一重組微生物的方式來表達，或者可以通過制備兩種重組微生物來實施，所述的二種重組衍生物各可以通過把一個編碼各自的昆蟲毒素的基因克隆入基因組來完成構建。選擇的毒素對的組合可以通過幾種方法來確定。如將在下文進行描述的(如通過實施例6的篩選技術描述的)，優選選擇作用于同一細胞通道(典型的是鈉通道)但作用于非疊加位點的毒素，正如將在下文所進一步描述的那樣。在前面提到，用來實施本發明的優選微生物是桿狀病毒。用“桿狀病毒”是指桿狀病毒科(Baculoviridae)的任何桿狀病毒，如核多角體病毒(NPV)。桿狀病毒是一大組進化上相關的病毒，只感染節肢動物；實際上，有些桿狀病毒只感染那些有重要經濟意義的農業和林業作物的害蟲，而其它的桿狀病毒已知專門感染其它害蟲。因為桿狀病毒只感染節肢動物，因而對人類、植物和環境很少或沒有危害。在適合的DNA病毒中，除了桿狀病毒科(Baculoviridae)之外是昆蟲痘病毒外(EPV)，如西方五月鰓角金龜子(Melolonthamelonotha)痘病毒、桑燈蛾(Amsactamoorei)痘病毒、亞洲飛蝗(Locustamigratotia)痘病毒、血黑蝗(Melanoplussanguinipes)痘病毒、沙漠蝗(Schistocercagregaria)EPV、埃及伊蚊(Aedesaogypti)痘病毒和淡色搖蚊(Chironomusluridus)痘病毒。其它適合的DNA病毒是顆粒體病毒(GV)等。適合的RNA病毒包括披膜病毒科、黃病毒屬、小RNA病毒、質多角體病毒及類似的病毒。雙鏈DNA病毒Eubaculovirinae的亞科有兩個屬，NPVs和GVs，它們在生物防治中特別有用是因為它們在其生命周期中產生包含體。GVs的例子包括蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)顆粒體病毒，大菜粉蝶(Pierisbrassicae)顆粒體病毒，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)顆粒體病毒，ArtogeiarapaeGV和印度谷螟(Plodiainterpunctella)顆粒體病毒。用來實施本發明的適合的桿狀病毒可以是包含的或不包含的。核多角體病毒(“NPV”)是桿狀病毒亞組的一種，是“包含”的。那就是說，NPV組的一個特有特征是很多病毒粒子嵌在晶狀蛋白的基質間，這就是所指的“包含體”。NPV的例子包括舞毒蛾(Lymantriadispar)NPV、苜蓿銀紋夜蛾NPV、芹菜夜蛾(Anagraghafalcifera)NPV，斜紋夜蛾(Spodopteralitturalis)NPV、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)NPV、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)NPV、甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)NPV、樅色卷蛾(Choristoneurafumiferana)NPV、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)NPV、HelicoverpazeaNPV、刺金翅夜蛾(Rachiplusiaou)NPV。在田間經常優先使用包含病毒是由于它們較好的穩定性，因為病毒的多角體蛋白外衣給包含入的感染核衣殼提供很好的保護。在例證中，在實施本發明中有用的桿狀病毒是得自下列害蟲的桿狀病毒芹菜夜蛾(Anagraphafalcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、油桐尺蠖(Buzurasuppressuria)、蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)、Helicoverpazea、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)、甘藍夜蛾(Manestiabrassicae)、小菜蛾(Piutellaxylostella)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)和斜紋夜蛾(Spodopteralitura)。用來實施本發明的一個特別有用的“NPV”是AcNPV，是來自苜蓿銀紋夜蛾(autographacalifornica)的核多角體病毒。對苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)有特別的興趣，是因為在斜紋夜蛾屬(Spodoptera)、Trichoplusia和棉鈴蟲屬(Heliothis)中多種主要害蟲種類對此病毒敏感。表達的殺蟲毒素特別是來自或類似于節肢動物或其它無脊椎動物毒素的神經毒素，如蝎毒、黃蜂毒、蝸牛毒、螨毒或蜘蛛毒。一種有用的蝎毒如來自撒哈拉蜂蝎(Androctonusaustralis)的AaIT。Zlotkin等，《生物化學》[Biochimie]，53，1073-1078(1971)。一種有用的蝸牛毒來自蝸牛Conusquerciones的毒液，用嘴釋放出來，蝸牛毒中的某些個別的毒素對節肢動物包括昆蟲有選擇性。參見例如，Olivera等，“DiversityofConusNeuropeptides”，《科學》[Science]，249257-263(1990)。甚至是通常出現在昆蟲生命發育期間的多肽可以也作為一種殺蟲毒素，且可依據本發明使用。例如，保幼激素酯酶(JHE)的早熟特征會減少宿主昆蟲保幼激素的滴度，這樣會不可逆轉地結束取食階段，試圖蛹化，而使害蟲死亡。JHE的氨基酸序列已知，且基因已被克隆。本發明優選的實施方案包括表達保幼激素酯酶(JHE)突變的重組微生物，制備這種JHE突變或缺失的示范方法，幾種有用的JHE突變和在昆蟲防治中使用的重組表達載體(含有JHE或突變的JHE編碼序列)。正如在1994年2月17日公布的發明人為Hammock等的WO94/03588中所描述的，該文并入本文作為參考。在Hammock等的WO94/03588中描述的兩個突變體是雙賴氨酸突變體(K29R，K522R)，其中在JHE位置29和位置522通過定點誘變用精氨酸代替普通賴氨酸。所描述的另一個突變體為其中絲氨酸201變成甘氨酸，該突變體被稱為“S201G”。JHE的催化缺陷S201G突變體的殺蟲活性與試驗昆蟲對蝎毒的50％死亡率在時間上相近(當用AcNPV基因工程處理時)。因此，自然產生的JHE昆蟲蛋白，一般沒有毒性，可以通過如定點誘變(或其它)而修飾為有毒的媒介物。除了氨基酸殘余物的改變，其它JHE突變體可以通過例如缺失N-末端的19個氨基酸(它們是新合成蛋白質進入分泌通道的信號序列)而制備，變成糖基化，然后離開細胞。同JHE一樣，來自撒哈拉蜂蝎的興奮性毒素(AaIT)的氨基酸序列已經確定，該序列已經發表(Darbon1982)，AaIT基因已被克隆且插入表達載體用來防治昆蟲。(參見WO92/11363，1992年7月9日公布，發明人Belagaje等)。AaIT毒素對昆蟲表現出毒性，而對等足類和哺乳動物沒有毒性。實施本發明的另一種適合的毒素作用于昆蟲鈉通道，它與α-毒素作用于哺乳動物的鈉通道的方式非常相似。這種神經毒素是從一種黃蝎(Leuirusquinquestriatushebraeus)得到，該神經毒素在此稱為LqhαIT。這種毒素的鑒別和純化在(“一種使鈉電流失活的麻痹昆蟲的蝎子神經毒素純化、一級結構和作用方式”，Eitan等，《生物化學》[Biochemistry]，295941-5947(1990))一文中作了描述。實施本發明的兩種優選的分離和純化的形式的毒素是新穎的，并在下文作較為詳細的描述。簡而言之，這兩種毒素被稱為“LqhIV”和“LqhVI”。這兩種毒素產生于(Leuirusquinquestriatushebraeus)的毒液中，在天然形式的混合物中這種毒液包含大量的個別毒素。LqhIV毒素是一種很有效力的鱗翅目毒素，當注入鱗翅目幼蟲體內時，它與其它蝎毒共同表現出正協同性，對哺乳動物沒有或有很弱的毒性。在圖1中闡明LqhIV毒素的合成基因，SEQIDNO1。因此，這兩種優選毒素的基因可以合成(由于肽的序列大小足夠的小，使得合成DNA成為可能)。此外，這些基因可以被克隆，之后編碼序列可以被克隆入一個轉移載體，如在下文中將進一步舉例說明的。我們已經在麗蠅幼蟲和棉鈴蟲幼蟲兩者體內，用毒素AaIT和LqhoIT增效組合證明了本發明的各個方面。這些昆蟲選擇性神經毒素組合使用時的殺蟲活性增加5-10倍。說明本發明的其它組合和實驗細節將在下文詳細討論。各種其它蝎毒(例如鉗蝎類(Buthoidscorption)也可以為增效組合使用，如LqqIT2，是一種來自Leiurusquinquestriatusquinquestriatus的抑制性昆蟲毒素。獲得這種神經毒素的純化方法由Zlotkin等發表于(《生物化學和生物物理檔案》[ArchiyesofBiochem.Biophys]，240877-887(1985))中。BjIT2是另一種來自鉗蝎(Buthotusjudaicus)的抑制性昆蟲毒素。純化方法已經由Lester等發表，《生物物理學報》[Biochim.Biophys.Acta)，701370-381(1982)。BjIT2存在于位置15上的氨基酸序列不同的兩個同種型中。形態1在此位置為異亮氨酸，形態2在此位置為纈氨酸。LqhIT2是另一種來自Leuirusquinquestriatushebraeus的抑制性昆蟲毒素，用反相HPLC進行純化。此外，從chactoid蝎子(Scorpiomauruspalmatus)的毒液純化的其它毒素也可以使用。例如，SmpIT2，來自chactoid蝎子(Scorpiomauruspalmatus)，是一種抑制性昆蟲毒素。它的純化方法由Lazarovici等發表于《生物和化學雜志》[J.Biol.Chem.]，2578397-8404(1982)。還可以從chactoid蝎子(Scorpiomauruspalmatus)的毒液純化得到的其它毒素是SmpCT2和SmpCT3，和crustacean毒素，其純化方法已經在耶路撒冷希伯來大學的Lazarovici博士在其博士論文(1980)“StudiesontheCompositionandActionoftheVenomoftheScorpionScorpiomauruspalmatus(Scorpionidae)”中描述。表1中列出實施本發明的優選毒素以及其純化方法和鑒別的引證。表1引證的參考文獻毒素AaITZoltkin等，《生物化學》[Biochim.]，53，1075-1078(1971).AaIT1Loret等，《生物化學》[Biochem.]，29，1492-1501(1990).AaIT2Loret等，《生物化學》[Biochem.]，29，1492-1501(1990).LqqIT1Zlotkin等，《生物化學和生物物理檔案》[Arch.fBiochem.&Biophys.]，240，877-887(1985).BjIT1Lester等，《生物化學生物物理學報》[Biochem.Biophys.Acta.]，701，370-387(1982).LqhIT2Zlotkin等，《生物化學》[Biochem.]，30，4814-4821(1991).LqqIT2Zlotkin等，《生物化學和生物物理檔案》[Arch.fBiochem.&Biophys.]，240，877-887(1985).BjIT2Lester等，《生物化學生物物理學報》[Biochem.Biophys.Acta.]，701，370-387(1982).LqhαITEitan等，《生物化學》[Biochem.]，29，5941-5947(1990).TSVIIBechis等，《生物化學生物物理研究》[Biochem.Biophys.Res.Comm.]，122，1146-1153(1984).螨毒素Tomalski等，《毒素》[Toxicon]，27，1151-1167(1989).α-芋螺毒素Gray等，(JBC)，256，4734-4740(1981)；Gray等，《生物化學》[Biochem.]，23，2796-2802(1984).μ-芋螺毒素Gruz等，(JBC)，260，9280-9288(1989)；Grus等，《生物化學》[Biochem.]，28，3437-3442(1989).chlorotoxinDebin等，《美國生理學雜志》[Am.J.Physiol.]，264，361-369(1993).ω-芋螺毒素Olivera等，《生物化學》[Biochem.]，23，5087-5090(1984)；Rivier等，(JBC)，262，1194-1198(1987).PLTX1Branton等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，12，176，(1986).PLTX2Branton等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，12，176(1986).PLTX3Branton等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，12，176，(1986).Ag1Kerr等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，182(1987)；Sugimori等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，228，(1987).Ag2Kerr等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，182(1987)；Jackson等，《神經科學協會文摘》[Soc.Neurosci.Abs.]，13，1078(1987)。ω-AgatoxinAdams等，JBC，265，861-867，(1990).μ-AgatoxinAdams等，JBC，265，861-867，(1990).Ho1Bowers等，PNAS，84，3506-3510(1987).α-LaterotoxinGrasso等，《神經化學中的神經毒素》[NeurotoxinsinNeurochemistry)，Dolly編輯，67-79(1988)Steatoda毒素Cavalieri等，《毒素》[Toxicon]，25，965-974(1987).BomIIIVargas等，《歐洲生物化學雜志》[Eur.J.Biochem.]，162，589-599(1987).表1的說明性毒素可由之純化的許多生物體的cDNA庫可按下列文獻中的描述得到Zilberberg等(1992)，《昆蟲生物化學分子生物學》[InsectBiochem.Molec.Biol.]，22(2)，199-203(Leiurusquinquestriatushebraeus)；Gurevitz等，(1990)FebsLett.，269(1)，229-332(Buthusjudaicus)；Bougis等(1989)，JBC，264(32)，19259-19256(Androctonusaustralis)；Martin-Euclaire等(1992)FebsLett.，302(3)，220-222(Tityusserrulatus)；Woodward等(1990)EMBOJ.，9(4)，1015-1020(Conustextile)；和Colledge等(1992)，《毒素》[Toxicon]，30(9)，1111-11116(Conusgeographus)。對于其它的毒素，用類似于實施例7所示范的方式，可以構建編碼這些毒素的合成基因。在前面曾提到，適合實施本發明的兩種分離和純化形態的毒素是新穎的。其中之一稱為“LqhIV”，具有氨基酸序列SEQIDNO2GVRDAYIADDKNCVYTCGANSYCNTECTKNGAESGYCQWFGKYGNACWCIKLPDKVPIRIPGKCR。SEQIDNO2的65個氨基酸的肽將在實施例5中進一步描述。另一個新穎的毒素，稱為“LqhVI”，具有氨基酸序列SEQIDNO3GVRDGYIAQPENCVYHCFPGSPGCDTLCKGDGASSGHCGFKEGHGLACWCNDLPDKVGIIVEGEKCH。這個67個氨基酸的肽也將在實施例5中進一步描述。毒素，如表1所列出的或是SEQIDNOS2和3優選的毒素，通過首先將具有不同藥理的毒素實驗性組合可以非常容易地被選擇來形成增效的組合。例如，AaIT是一種興奮性昆蟲毒素，而LghIT2是一種抑制性毒素。通過常規結合方案(參見Gordon等，《生物化學生物物理學學報》[Biochim.Biophys.Acta.]，778349-358(1984)，對于AaIT、BjIT1和BjIT2而言，用亞洲飛蝗(Locustamigratoria)膜小泡)，可以篩選出對感興趣的昆蟲在同一通道但非重疊位點上的活性。這是因為，正如本領域所知，各種昆蟲的神經膜有可變性。例如，最近有幾篇論文報導，與蝗蟲或蟑螂的神經膜不同，鱗翅目幼蟲神經膜可以在同一時間與抑制性和興奮性昆蟲毒素結合。在前面提到的AaIT和LghαIT增效組合的例子中，該組合對于麗蠅幼蟲增效效力是對棉鈴蟲(Heliothis)幼蟲的兩倍。相反，AaIT和LghIT2的組合，應用于棉鈴蟲(Heliothis)幼蟲時，是一個增效組合(5倍的效力)，但當單獨使用任何一種毒素對麗蠅幼蟲效力都沒有增加，這些毒素的組合可以用于在昆蟲種群中以提高選擇性。為了生產重組微生物，如桿狀病毒，為防治昆蟲的目的，優選包含一個的分泌信號序列。分泌信號序列可以從細菌、酵母菌、真菌或高級真核生物(包括所有動物和植物)的蛋白質提取(如參見Watson，Nucl.Ac.Res.125145-5164(1984))。更優選的是來自昆蟲源蛋白的分泌信號序列，如那些來自Hyalophoracecropia的殺菌肽B(vanHofster等，PNAS，822240-2243(1985))，來自煙草天蛾(Manducasexta)的蛻殼激素(Horodyski等，PNAS，868123-8127(1989))。同樣優選的是與蝎毒自然關聯的分泌信號序列，這可以通過mRNA，cDNA或基因DNA的分析來確定。更優選的是AaIT的天然分泌信號序列(Bougis等，《生物學化學雜志》[J.Biol.Chem.]，26419259-19265(1989))。重組微生物毒素可以被表示為毒素的功能衍生物。毒素的“功能衍生物”是一種具有生物活性的化合物(或是功能上的或是結構上的)，大體上與毒素的生物活性相似。術語“功能性衍生物”意指包括分子的“片段”、“變體”、“相似物”或“化學衍生物”。如毒素的分子的“片段”就是指分子的任何多肽子集合。如毒素的分子的“變體”就是指在結構和功能上不是與整個分子就是與它的片段大體上相似的一種分子。如果兩個分子在結構上大體相似或如果兩個分子擁有相似的生物活性，那么就說這個分子與另一個分子大體上相似。因此，只要兩個分子具有相似的活性，在此就把它們當作那個術語變體使用，即使一種分子的結構不能在另一個分子中找到，或即使氨基酸殘余的序列不相同。如毒素的分子的“相似物”就是指分子在功能上不是與整個分子就是與它的片段大體上相似。在此處使用時，當分子包含不是正常分子的一部分的額外化學部分時，該分子被說成是另一個分子的“化學衍生物”。這個部分可以改善分子的溶解性、吸附性、生物半衰期等。能夠調節這些效果的部分公開于Remington′sPharmaceuticalSciences(1980)中。耦聯這個部分到一個分子的步驟在技術上是眾所周知的。通常，毒素(或這些毒素)的表達包括足以指導RNA合成開始的啟動子區。一個桿狀病毒啟動子基因是編碼多角體蛋白的基因，因為多角體蛋白質是已知的高度表達的真核生物基因，不過也可以使用其它啟動子和雜合啟動子的序列，例如p10。表達一個毒素的重組桿狀病毒可以通過本領域已知的方案來制備(例如Tomalski等，美國專利號5,266,317，由來自昆蟲寄生螨的神經毒素的作例證；McCutchen等，《生物學技術》[Bio/Technology)，9，848-854(1991)和Maeda等，“重組桿狀病毒表達的昆蟲特異性神經毒素的殺蟲效果”，《病毒學》[Virology]，184，777-780(1991)，說明了表達AaIT的重組桿狀病毒的構建)。能夠表達兩個不同的毒素的單一桿狀病毒的制備，可以通過類似于下列的方案來完成Belayev和Roy，《核酸研究》[NucleicAcidResearch]，215，1219-1223(1993)；Wang等，《基因》[Gene]，100，131-137(1991)，作適當的改進。實施例1闡明了這一類似的方案。實施例1使用標準分子克隆技術可以把兩個昆蟲毒素基因克隆入轉移載體如PacUW51P2中。這種轉移載體是苜蓿銀紋夜蛾(AcNPV)多角體蝗蟲基的載體，該載體包含一前一后插入的AcNPVp10啟動子和SV40轉錄終止信號的拷貝。該拷貝在多角體基因啟動子的上游，但是以相反的方向。這會有利于在多角體啟動子控制下在BamHI位點維持一個外來基因編碼區域，以及在p10啟動子控制下在BglII克隆位點維持第二個外來基因編碼區域。因此，產生的重組病毒表達兩個外來蛋白質。由此制備的重組AcNPV可以通過繁殖草地貪葉蛾(Spodopterafrugiperda)細胞(Sf21)而分離，而Sf21是通過鈣沉淀而與重組質粒共轉染的。多角體感染的細胞可以在感染后被鑒別和收集，重組病毒噬斑可以通過篩選純化。通過標準方案純化重組病毒，得到的結果進行純的重組培養并貯存，如在4℃和-80℃。標準方案例如描述于O′Reilly，Miller和Luckow的《桿狀病毒表達載體，實驗室手冊》[BaculovirusExpressionVectors，ALaboratoryManual)。實施例2四種不同昆蟲毒素對兩種不同昆蟲和小鼠的活性已經測定(因為從們喜歡使用對哺乳動物作用很小或沒有影響的昆蟲毒素)。通過已確立的方法，這些毒素已從各自原生毒液中純化出來。通過Reed和Muench的方法(1938)已經測定它們對老鼠、麗蠅幼蟲和鱗翅目昆蟲的毒性。表2表明毒素對昆蟲和小鼠的活性，以50％終點計(各自的麻痹或致死劑量PU50，LD50)。毒素對于麗蠅幼蟲的PU50值與以前已經發表過的結果一致(Zlotkin等，《生物化學》[Biochim.]，53，1075-1078(1971)；和Eitan等，《生物化學》[Biochem.]，29，5941-5947(1990))。這些毒素對于鱗翅目煙芽夜蛾幼蟲的毒性和它們對海灰翅夜蛾幼蟲的毒性相差不大。LqhαIT對小鼠(SwissWebster)表現較高的毒性，但其它毒素對哺乳動物無毒性(3μg/gb.w注入皮下沒有效果，與哺乳動物毒素AaHII的LD50-0.018μg/20gb.w相反(DeLima等，1986)。毒素LqhIV和LqhVI是值得考慮的，因為LqhIV是從蝎毒中分離出來的至今最有效力的鱗翅目毒素而毒素LqhVI有微弱的哺乳動物毒素。表2</tables>a.25-40只麗蠅幼蟲分別被注入每一種毒素(三次重復)并測定PU50。當注射后立即導致收縮性麻痹時測定興奮性毒素AaIT、LqhVI和LqhIT3的PU50。在注射后軟弱麻痹5分鐘時測定抑制性毒素LqhIT2的PU50。在注射后延遲和維持收縮性麻痹5分鐘時測定α昆蟲毒素LqhαIT和LqhIV的PU50。b.25-40只鱗翅目幼蟲分別被注入每一種毒素(三次重復)，并測定經注射后24小時沒有能力移動或當掀翻它沒有能力翻轉回來時的PU50。c.8只老鼠(兩次重復)皮下注射，在注射后24小時測定對小鼠的LD50。實施例3同時注入毒素的組合，并測定毒性，結果概括于表3中。毒性組合包括相應于每種毒素的一個PU50單位的量及其稀釋度。不在同一結合點相互競爭且在其藥理學上有差異的一對毒素是增效的。如表3中所示，協同的程度不僅取決于毒素的組合，而且取決于試驗動物。表3</tables>a.25-40只麗蠅幼蟲每一只被注入組合毒素(三次重復)，在注射后一分內幼蟲迅速萎縮時測定PU50。b.25-40只鱗翅目幼蟲每一只被注入組合毒素(三次重復)，并測定經注射后24小時沒有能力移動或當掀翻它沒有能力翻轉回來時的PU50。c.8只小鼠(兩次重復)皮下注射，在注射后24小時測定對小鼠的LD50。*由一定數量的毒素蛋白(以各種稀釋度使用1∶1比率的毒素)所產生的效果與每一種毒素單獨的PU50相比較來評價效力。如表3中闡明的，大于單一效力的組合是大于增強的劑量反應。因此，這些組合增加了殺蟲率，也闡明了本發明優選的實施方案。實施例4實施本發明時，要防治的害蟲是用表達這些重組桿狀病毒來處理(和/或處理其地點)。在這個例子中，表達兩種不同組合的毒素的兩種病毒的組合施用，與應用每一個病毒單獨施用相比較，顯示出減少殺死昆蟲宿主所需的時間。因此，如表4所示，組合施用重組AcAaIT和重組AcLqhαIT會大大減少殺死時間。表4致死時間(LT)是在三齡煙芽夜蛾幼蟲對AcAaIT(10000PIB′S)、AcLqhαIT(10000PIB′S)和AcAaIT(5000PIB′S)與AcLqhαIT(5000PIB′s)的組合施用的響應的基礎上獲得的。將小的食物塞分別放置于微量滴定盤的各個小孔中，同時接入任何一種相應的病毒。把三齡煙芽夜蛾幼蟲加到盤上并保持27℃。每隔5-10分種記錄死亡率。用概率分析程序分析致死時間。因此，表4的數據是用致死時間(LT)表示的對殺死速率的研究，且類似的方法可以用來確定致死劑量，而致死劑量大概會有主要的經濟重要性。例如，有了50％幼蟲死亡的致死時間，可見，實施本發明方法中的毒素組合與施用單個重組體相比，大約減少12％-18％殺死宿主幼蟲所需要的時間。當人們認為與野生型AcNPV相比較，使用重組AcAaIT的處理代表大約減少40％殺死宿主幼蟲所需要的時間時，可見，本發明的實施造成基本上減少昆蟲取食損害且明顯減少被損傷的植物。另外，用重組微生物感染的幼蟲，典型的是在死亡前數小時，開始顯示麻痹特征且停止取食。這就進一步增加了本發明方法的實際殺蟲效果。實施例5LqhIV和LqhVI的純化蝎子(L.quinqestriatushebraeus)的毒液是從Sigma(USA)獲得的。凍干的L.quinqestriatushebraeus毒液(50mg)于2ml10mMpH＝6.4的乙酸銨中懸浮并勻漿。在27000g下離心20分鐘去除不溶物質。收集上清液并且將粒狀沉淀重新懸浮于另外的2ml10mMpH＝6.4的乙酸銨中，勻漿并再次離心。此提取法做4次，以期最大量地從毒液中提取蛋白質。把所有離心過程的上清液收集起來，裝在陽離子交換柱上(10ml的CM-52)并用線性梯度為0.01-0.5MpH＝6.4的乙酸銨在流速為10ml/hr下洗脫。在280nm監測吸光度且相應地收集峰值。來自陽離子交換色譜的級分CM-III和CM-VI進一步在RP-HPLC的VydacC4柱上純化。從CM-VI上純化LqhIV可依照以下步驟緩沖液A是5％的ACN和0.1％的TFA，緩沖液B是95％的ACN和0.1％的TFA。柱子用緩沖液A平衡，并用線性梯度為0-60％的緩沖液B洗脫70分種，流速為0.6毫升/分種。在214nm監測吸光度且相應地收集峰值，從CM-III純化LqhVI可依照以下步驟緩沖液A是5％的ACN和0.1％的HFBA，緩沖液B是95％的ACN和0.1％的HFBA。柱子用緩沖液A平衡并用線性梯度為0-90％的緩沖液B洗脫105分種，流速為0.6毫升/分種。在214nm監測吸光度且相應地收集峰值。收集洗脫的級分，并測試其活性(表2)和純度。毒素的純度LqhIV和LqhVI的均一性和純度用FreeSolutionCapillaryElectrophoresis測試(AppliedBiosystemsModel270A)。用20mMpH＝2.9的檸檬酸鈉使毛細管平衡且使用真空裝載樣品(0.02mg/ml蛋白質)2秒鐘。流動緩沖液是20mMpH＝2.9的檸檬酸鈉，電壓力為20KV。序列測定使用已經確立的方法(Fernandez等，《蛋白質化學的技術》[TechniquesinProteinChemistry]，第5卷，第215頁)，把每種毒素20μg還原和羧甲基化。使用HP序列分析儀，通過自動化Edman降解，測定N-末端的序列。使用內蛋白酶Asp-N消化還原的和羧甲基化的LqhIV，產生肽。在使用聚合柱的微孔HPLC(UltrafastMicroprotein分析儀-MichromBioResourcesInc.)上分離消化的肽。緩沖液A是5％的ACN和0.1％的TFA，緩沖液B是95％的ACN和0.1％的TFA。柱子用緩沖液A平衡，并用線性梯度為0-50％的緩沖液B洗脫50分種，流速為0.05毫升/分種。在214nm監測吸光度且相應地收集峰值。為了確定這種毒素的完整氨基酸序列，對肽P2進行測序。實施例6結合方案昆蟲神經元膜的制備昆蟲神經元組織的所有解剖和制備都是在如下組份的冷緩沖液中進行的0.25M甘露醇、10mMpH＝7.4的EDTA、5mMHEPES(用Tris調至pH為7.4)、50μg/ml苯甲基磺酰氟、1μM胃蛋白酶抑制劑A、1mM碘乙酰胺和1mM1，10-菲咯啉(1，10-phenantroline)。昆蟲神經組織在冰冷緩沖液中解剖和勻漿，碎片通過1000g離心分離10分鐘去除。上清液在27000g下離心45分鐘并收集膜(P2)。P2懸浮于緩沖液中且調節至10％Ficoll(在緩沖液中)，并在10000g離心75分鐘。收集所產生的代表富含突觸體碎片的漂浮表皮，接著用低滲透壓介質(5nMTris-HClpH＝7.4、1mMEDTA、50μg/ml苯甲基磺酰氟、1μM胃蛋白酶抑制劑A、1mM碘乙酰胺和1mM1，10-菲咯啉)處理，形成膜小泡。這種膜小泡在使用前經27000g離心分離45分鐘后，收集在少量解剖緩沖液內，并在-80℃貯藏。毒素的放射性碘標記毒素由用0.5毫居里無載體Na125I(-0.3nmol)(Amersham)和5毫克(～0.7nmol)毒素的iodogen(PierceChemicalCo.，Rockville，MD)碘化。此單碘化毒素在使用BeckmanUltraporeC3RPSC柱(4.6×75毫米)的HPLC上純化，得到的級分用流速為0.5毫升/分鐘，梯度為10-80％的溶劑B(溶劑A＝0.1％TFA，溶劑B＝50％ACN，50％2-丙醇和0.1％TFA)洗脫。單碘化毒素的洗脫在天然毒素的峰(大約28％的溶劑B)之后為放射性蛋白質的第一個峰(大約30％的溶劑B)。依據125I的特異放射性估計放射性同位素標記的毒素的濃度和相應于2424dpm/fmol單碘化毒素。結合試驗競爭結合試驗是在標記毒素的恒定濃度存在下，在平衡的條件下使用增加未標記毒素濃度來進行。所有結合試驗的分析是使用迭代計算機程序LIGAND(P.J.Munson和D.Rodbard，由G.A.McPherson改進，1985)進行的。昆蟲膜小泡懸浮于含有0.13M膽堿鹽酸鹽、1mMEDTApH＝7.4、20mMHEPES/TrispH＝7.4和5mg/mlBSA的結合介質中。接著與毒素溫育一小時，此反應混合物用2ml冰冷洗滌緩沖液(150mM膽堿鹽酸鹽、5mMHEPES/TrispH＝7.4、1mMEDTApH＝7.4和5mg/mlBSA)稀釋并在真空下用GF/F過濾器(Whatman，U.K.)過濾，接著每一次用2ml的洗滌緩沖液再沖洗過濾器兩次。在1μM未標記的毒素存在下，測定非特異性毒素結合。實施例7合成基因的構建(圖1，SEQIDNO1)采用一個桿狀病毒的優選密碼子使用把一個毒素的蛋白質序列變換成一個核苷酸序列。毒素基因與前導序列的核苷酸序列(家蠶素，天然前導序列或其它)和適當的限制酶位點被用來設計和合成寡核苷酸的5個互補對。通過使用外部寡核苷酸作為引物的PCR，使寡核苷酸被磷酸化、退火、連接和擴增。PCR產品被平端連接入PCRscript質粒，并通過測序證實正確的序列。BamHI限制片斷在一個桿狀病毒啟動子作用下，從此克隆入一個桿狀病毒轉移載體的質粒中獲救(P10，多角體蛋白，Basic，IE1等)。一個包括基因的正確序列和前導序列的質粒通過測序確定。使用產生的轉移載體和標準的程序構建出一個表達毒素的重組病毒。表達AaIT和LqhIV的病毒的構建家蠶素的前導序列和編碼毒素LqhIV的基因如上所述被設計和合成。確定正確序列，并將基因克隆入已包含AaIT基因的雙表達的轉移載體。pAcUW51P2轉移載體是一有兩個克隆位點的多角體蛋白陽性載體，Bg1II位點和有家蠶素的前導序列的LqhIV基因克隆入BamHI位點。使用Lipofectin程序，將Sf21細胞用所得的轉移載體和傳染病毒顆粒共轉染。重組病毒在標準噬菌斑試驗中被選作一個多角體蛋白陽性表現型。依據標準程序將Sf21細胞用重組病毒AcAaLq接種。從病毒感染細胞中得到的蛋白質提取液在15％SDS-PAGE凝膠上分離并隨后電洗脫到硝化纖維素膜上。膜用AaIT和LqhIV抗體探查，結合的抗體使用兔子IgGHRP共軛體檢測。綜上所述，依據本發明生產出來的遺傳工程處理過的殺蟲微生物，可應用于防治各種害蟲。在此運作中，可以應用單一的表達許多種神經毒素的重組病毒。通過選擇作用在相同細胞通道(典型的鈉通道)但在非重疊位點上的毒素來決定毒素的組合。此外，可采用兩種(或更多)各表達不同毒素的重組殺蟲微生物。再者，幾種表達的毒素如已描述的已被選擇出。這些表達的毒素的組合加速殺死害蟲的速率，其效果遠非簡單的“加合”所能比。例如，毒素AaIT和LqhαIT的組合使用使麗蠅幼蟲和棉鈴蟲屬幼蟲的致死率增加5-10倍。另外毒素的組合可用于增加對昆蟲組群的選擇性。重組微生物的常規施用方法(噴霧、彌霧、噴粉、撒施和澆潑)可采用以下劑型如粉劑、粉塵、顆粒，以及如在聚合物中的膠囊。為了使用表達殺蟲毒素的增效組合的重組微生物，組合物典型地包括惰性載體如粘土、乳糖、脫脂大豆粉和類似的應用輔助劑。本發明上面描述的關于優選的特別實施方案應理解為，描述和實施例意欲說明和而不限制發明范圍，其發明范圍是由所附權利要求書來限定。權利要求1.一種防治昆蟲、蜱螨和線蟲類害蟲的方法，包含用至少兩種不同的昆蟲毒素處理所述害蟲或其地點，毒素的來源是至少一種重組微生物或是多種重組微生物，毒素在昆蟲細胞膜通道有非疊加結合位點。2.根據權利要求1的方法，其中毒素的來源是重組昆蟲病毒。3.根據權利要求1的方法，其中重組昆蟲病毒的來源是桿狀病毒。4.根據權利要求3的方法，其中桿狀病毒是核多角體病毒。5.根據權利要求3的方法，其中桿狀病毒來源于苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)，芹菜夜蛾(Anagraphafalcifera)，黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)，油桐尺蠖(Buzurasuppressuria)，蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)，Helicoverpazea，棉鈴曳(Heliothisarrigera)，Mariestiabrassicae，小菜蛾(Plutellaxylostella)，甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)，海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)或斜紋夜蛾(Spodopteralitura)。6.根據權利要求1的方法，其中毒素是AaIT、LqhIT2、LqhαIT和LqhIT3神經毒素的組合。7.根據權利要求1的方法，其中的毒素包含一個JHE突變體。8.根據權利要求6或7的方法，其中害蟲是煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)或麗蠅(blowfly)。9.一種在昆蟲防治中使用的基本上純的昆蟲毒素，具有氨基酸序列SEQ.IDNO1或SEQ.IDNO2。10.一種重組微生物，它在用其感染的昆蟲細胞中，表達至少兩種對昆蟲細胞有毒的外源蛋白質，或其功能性衍生物，所述微生物基因組帶有分泌信號序列。11.根據權利要求10的重組微生物，其中的微生物是核多角體病毒。12.根據權利要求10或11的重組微生物，其中的至少一種外源蛋白是蝎毒素。13.根據權利要求10的重組微生物，其中外源蛋白是從蝎、黃蜂、蝸牛、螨或蜘蛛毒液的遺傳序列編碼中得到的。14.根據權利要求10、12或13的微生物，其中桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒。15.一種昆蟲防治組合物，包含第一和第二重組桿狀病毒，第一和第二重組桿狀病毒分別表達第一和第二毒素，第一和第二毒素在昆蟲細胞膜通道上有非疊加結合位點。16.一種昆蟲防治組合物，包含一種重組桿狀病毒，它在用其感染的昆蟲細胞中，表達多種殺蟲毒素。全文摘要本發明提供一種加速殺死害蟲如鱗翅目的速率的方法。該方法包含用由至少一種重組微生物表達的至少兩種不同昆蟲毒素處理害蟲或其地點。已發現,這樣的毒素對,它們彼此之間在相同的結合位點上無競爭而且在它們藥理學上有差異,且提供增效防治。優選的殺蟲微生物是桿狀病毒。文檔編號C12N15/09GK1185718SQ96194239公開日1998年6月24日申請日期1996年4月30日優先權日1995年5月8日發明者B·D·漢默克,R·海爾曼,H·莫斯克維茨申請人:加利福尼亞大學董事會