專利名稱：：誘發豬生殖和呼吸綜合征(prrs)的病毒的新的減毒株,由其產生的疫苗和診斷試劑盒及...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種能誘發豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)的病毒的新的減毒株。用來源于猴腎的新細胞克隆對毒性株進行減弱和復制的方法可用于制備疫苗和診斷試劑盒，以早期診斷PRRS，并對該疾病進行有效的預防性治療。現有技術1987年，人們在北美首次發現一種豬的疾病，當時稱為“神秘的豬病”或MSD，以后又稱作“豬不育和呼吸綜合征”或SIRS。1990年，在中歐首次發現相似的綜合征，以后又傳播到包括西班牙在內的其它歐洲國家。開始時，歐洲稱此病為“流行性豬流產和呼吸綜合征”或PEARS，最后稱之為“豬生殖和呼吸綜合征”或PRRS。這個名稱逐漸被廣泛接受。已知PRRS的病原體是一種包圍RNA的小病毒，它是在荷蘭首次分離到的被稱作Lelystad病毒。有人提出，該病毒屬于動脈病毒(Arterviridae)。該病毒在專利申請PCTWO-92/21375及歐洲專利EP-B-0587780(StichtingCentraalDiegeneeskundigInstituut)中已有描述，而后者來源于前者。為這些申請的目的，上述病毒的分離物被保藏于巴黎的巴斯德研究所，保藏號為I-1102。如專利申請PCTWO-93/03760(Collins等)和歐洲專利申請EP-A-0529584(BoehringerIng.)中所述，北美型病毒的分離幾乎與歐洲型病毒的分離同時進行。為這些申請的目的，上述病毒的分離物被保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC)，保藏號為VR-2332。歐洲型和北美型病毒有明顯的不同，這不僅表現于血清學反應性而且涉及到主要RNA片段核苷酸序列的同源程度。在歐洲專利申請EP-A-0676467(Akzo)的前兩頁中對二者的不同進行了詳細描述，且引用了大量的文獻。在上述的專利申請中得出這樣的結論，歐洲型病毒和美洲型病毒在很久以前就已明確地分離。因此可預料，對其中一個類型可能有效的疫苗對另外一個類型效果很小或根本無效。從歐洲和美洲型病毒均分離到不同的毒株。每一毒株具有其獨特性，有幾種毒株已成為專利申請的目標。例如，專利申請PCTWO-93/07898(Akzo)描述了一種歐洲毒株，及由之產生的疫苗，保藏于CNCM(巴斯德研究所)，保藏號I-1140。來源于同一優先權申請的專利申請PCTWO-93/14196和歐洲專利申請EP-A-541418(Rhōne-Merieux)，描述了在法國分離到的一種新的毒株，保藏于CNCM(巴斯德研究所)，序號I-1153。歐洲專利申請EP-A-0595436(Solvay)描述了一種新的美洲毒株，其毒力強于開始時描述的毒株，其中還描述了其疫苗。該毒株保藏于ATCC，但在專利申請中沒有詳述其保藏號。最后，序號為ES-A-2074950(CyanamidIbērica)的西班牙專利申請描述一種叫做“西班牙毒株”的毒株，它不同于歐洲和美洲毒株，這種“西班牙毒株”保藏于歐洲動物細胞培養物保藏中心(EACCC)保藏號為V93070108。總之，PRRS的病原體很明顯地表現出一些多樣性，并且為了有效地與該疾病作斗爭，需要依感染豬的毒株類型而不同的疫苗。在母豬中，該疾病的特征在于缺乏食欲，厭食，生殖性疾病(流產，早產，死產或產虛弱的小豬，胚胎死亡，有或沒有干尸化)。有時感染的母豬會死亡。一種較少出現的癥狀是耳部、腹部或外陰部出現短暫的藍色；因此該疾病起初在荷蘭被稱作“Abortusblauw”，在英國被稱為“藍耳”。在小豬中，這些癥狀是年齡依賴性的；在新生的小豬中，可觀察到呼吸困難和肌肉震顫，而在較大些的小豬中，后部的麻痹和共濟失調則更常見。在流行的高峰期，出生第1天的死亡率是有限的，但在10天大的小豬中可達到80％。感染的育肥豬出現短暫的少食和較多的呼吸系統的問題。疾病的潛伏期變化很大，從5天至37天(I.B.RobertsonEurp.Comm.SeminaronPRRS，114-5，布魯塞爾，1991)。有時，該疾病的傳播非常慢，但是，當一個農場感染的時候，該疾病可持續數月(B.Thacker，Int.Symp.onSIRS，St.Paul/Minnesota，1992)。抗這些病毒的抗體，在感染后6天，已用免疫過氧化物酶技術(免疫過氧化物酶單層法，以后稱為IPMA)檢測出來，如Wensvoort等所描述的(TheVet.Quart13121-130，1991。5天后抗體的滴度可達到1/20,000，通常能持續12個月以上。但是如V.Ohlinger等，Meredith，M.De.PigDis.Info.CenterCambridge，1992年12月所報道的，一些豬在4-5個月以后血清呈陰性。這些作者可以從感染后的不同器官中分離病毒，感染6周后，肺、血清、血漿及血細胞勻漿中病毒的滴度可達到106TCID50(組織培養物感染劑量的50％)。這表明病毒和抗體一起可持續幾周。此外，人們還認識到在疾病爆發中存活下來的動物對于敏感的豬是傳染源。感染后1天可檢測到病毒血癥，這可持續56天，通常較之為短。在病毒的血源性傳播中，病毒可到達懷孕母豬的胎盤。已經證明，病毒可通過胎盤引起胚胎死亡。最高的胚胎敏感性發生于懷孕的倒數第三周(lastthirdofgestation)中。此外，病毒可在胚胎中復制而不引起胚胎死亡。但是，從干尸化胚胎或自溶胚胎中還沒有分離到該病毒。在小豬中，當從初乳中獲得的母體抗體減少時會發生這種疾病。在懷孕的倒數第三周(Iastthirdofpregnancy)中感染病毒的母豬所生下的活豬仔，其中一些可在初次哺乳前觀察到抗病毒的抗體。通常，這些動物在出生時也可表現出病毒血癥(C.Terpstra等，Vet.Q.13131-136，1991)。盡管大量巨噬細胞被破壞，但是還沒有明確證實誘發PRRS的病毒的免疫抑制活性。但是經常出現與之相關的繼發性感染，在養豬場中引起嚴重的經濟損失。現在，可在有大量豬群的大多數國家中發現PRRS病毒。由于直接地或間接地因PRRS病毒感染而產生的繼發性病因所造成的經濟損失，如今，PRRS是影響養豬業的最重要疾病之一。用豬的肺泡巨噬細胞(PAM)培養物制備的無活性疫苗在實驗室中得到可接受的結果，但在農場環境中的效力部分依賴于環境狀況及對接種動物進行的管理。阻礙獲得抗PRRS病毒免疫產物的問題之一是用于病毒復制的穩定底物的利用率很有限。直到最近，PRRS病毒僅能在豬的肺泡巨噬細胞(PAM)培養物中擴增(WensvoortG.等，TheVet.Quart.13121-130，1991)。用一定年齡的無疾病的豬來獲得這些巨噬細胞有一些缺點。此外，在回收的PAM中不能保證對病毒感染的敏感性，因為從不同動物得到的細胞底物經常不同。這就成為導致制備恒定和同質批量抗原的主要障礙，并且每一批量抗原均需對其進行評價以確定其敏感性。由于所有這些原因，穩定和持續的細胞宿主利用率的降低嚴重地阻礙了獲得突變物的研究進程，而該突變物是基于PRRS病毒在細胞底物中的復制和減毒變種的選擇之上的。待解決的主要問題之一是中和毒性病毒使之不能在PAM中復制，因為病毒復制會導致PAM的破壞。因此，病毒對來源于轉化細胞系的底物的適應性將會為獲得減毒突變株和制備滅活疫苗提供適宜的手段，由此可排除PAM的依賴性和可變性。專利申請PCTWO94/18311(Miles)建議將某一PRRS病毒株在獨特的稱作克隆9009B的克隆中增殖，9009B來源于非洲綠猴腎細胞系，專利申請人稱為MA-104(M)系，后者來源于名為MA-104的商品細胞系。在該專利申請中沒有說明這一獨特克隆的保藏，因此該專利難以實施和重現。發明目的本發明的目的是PRRS病毒的新的減毒株，該減毒株使得可以以穩定和可再現的方式得到無毒的豬疫苗，該疫苗對預防PRRS有高的有效性。本發明的另一目的是來源于穩定的猴腎細胞系MA-104的細胞克隆及其制備方法，該細胞克隆能夠維持PRRS病毒高滴度生長，使得能獲得特定減毒株的穩定的病毒收獲物。本發明的另一目的是對PRRS疾病有效的疫苗及其制備方法，該疫苗可從新的減毒株及其突變株得到。本發明的另一目的是PRRS疾病的診斷試劑盒及其制備方法，該試劑盒可從新的減毒株或其突變株得到。發明詳述本發明的PRRS病毒的減毒株是從一個西班牙農場的感染的豬中分離到的毒性株經減毒后得到的。為了滿足說明的充分性，該減毒株保藏于巴斯德研究所的國家微生物培養物保藏中心(CNCM)，保藏號為1-1642。保藏日期為23/11/95。毒性株的減毒和復制在細胞克隆中經過系列傳代進行，這一細胞克隆也是本發明的目的，作者稱之為Clon-8。該克隆從一名為MA-104的商品猴腎細胞系而來。也是為了滿足說明的充分性，Clon-8于上述日期保藏于巴斯德研究所的CNCM，保藏號為I-1643。以前，克隆商品細胞系MA-104用于篩選和分離Clon-8。克隆是這樣進行的把細胞懸浮在合適的生長培養基中(例如含胎牛血清(FBS)的Earle′s基本培養基)，以不同的濃度鋪放懸液，篩選并用胰酶消化克隆，然后在培養瓶中擴展。用所描述的方法對所得到的克隆進行連續克隆，直到獲得分化良好的克隆。去除形狀不規則或難以擴增的克隆，測定所選克隆對PRRS病毒起始毒性株感染的敏感性。由于Clon-8且對病毒復制的高敏感性(高TCID50)和所得病毒收獲物的一級性和再現性，故選擇了Clon-8。毒性株通過在Clon-8培養物中進行連續復制而減毒，優選在34℃進行。測定感染的病毒顆粒含量以估計其復制能力，檢測細胞病變的效果(CPE)以估計適應度。根據所得結果，病毒在Clon-8中可進行復制，至少在20代中沒有生命力的喪失，減毒的結果是提供了一種實用的保存其抗原性的無毒病毒。因此，本發明的PRRS病毒減毒株是以一種穩定和工業上可重復的分式獲得的，從而便于用它來獲得PRRS疫苗和PRRS診斷試劑盒。感染了毒性株或感染了減毒株的豬群間進行的對比試驗清楚地表明，減毒株對感染了它的動物無害。另外，本發明的減毒株在血清陰性的豬中表現出了高復制效率，并且以200TCID50的小劑量肌肉內接種給動物時可誘導產生血清轉化現象。這種方法誘導產生的抗體可至少持續80天。因而本發明的減毒株是制備預防豬PRRS疫苗的良好基質。可用本領域中任何一種人們所熟知的方法來制備這種疫苗，可制成各種傳統的形式，如分散液、乳油液、脂質體組合物、凍干形式等。疫苗組合物可用不同的佐劑完成，如免疫刺激物，乳化劑，穩定劑等。疫苗的施用可以是肌內的或皮下的，鼻內的，氣管內的，皮的，經皮的或皮內的。疫苗的有效劑量可有很大變化，優選范圍為本發明減毒株的102-106TCID50。所得疫苗也可制備或多價疫苗，與另外的活的或滅活的豬病毒一起，或與活的或滅活的細菌一起，這也是本發明的一個目的。如本領域的技術人員所熟知的，疫苗也可以制備成包含有來源于本發明病毒株的病毒抗原的疫苗，例如用熱或化學方法等任何一種傳統的方法使含有該毒株的疫苗以完全滅活的形式存在，如含有該毒株被膜或RNA片段的疫苗等等。本發明的減毒株也可通過利用傳統的技術用于制備診斷試劑盒，該試劑盒包含有能用于檢測血清陽性動物中抗體的抗原成分。例如，用于檢測PRRS抗體的IPMA過程包括下列步驟a)使本發明的減毒病毒適應一種在培養微板中的穩定細胞培養物，優選克隆Clon-8，這種方式每孔中有20-40感染顆粒進行感染。b)用已知的固定劑把感染的細胞固定在固相載體上。c)檢測豬的血清抗體，把血清抗體在微板中培養，隨后用IPMA技術對微板中的抗體進行染色。附圖簡述作為其中的一部分，本說明書附有兩頁共4張圖。圖中，以下的描述是闡釋性的，不是限制性的。圖1是一張二維圖，表明了鼻內接種本發明的減毒株后，妊娠母豬的直腸溫度的變化。圖2是一張二維圖，表明了接種了本發明的減毒株的母豬所生小豬的體重變化。圖3是一張二維圖，表明了用IPMA檢測的接種本發明減毒株的母豬子代的乳液內抗體的動態圖，母豬1和10的子代在出生時滴度較低，這是由于在抽血時一些豬仔還沒有吃奶。圖4是一張三維圖，表明了肌內接種本發明減毒株的200，2,000和20,000TCID50的豬仔中體液應答的狀況。實施例以下給出幾個方法的實施例來更明確地對本發明進行闡述。這些實施例不應被認為是對發明范圍的限制。實施例1從穩定的猴腎細胞系MA-104獲得細胞克隆用歐洲動物細胞培養物保藏中心提供的保藏號為85102918的穩定猴腎細胞系MA-104，對篩選的PRRS毒株傳代6次，傳代在塑料培養瓶中單層生長的靜止的培養細胞中，在補充有10％胎牛血清(FBS)的Earle′sMEM培養基中，37℃沒有CO2補充的情況下進行。每次傳代中接種6-7天后收集病毒收獲物。為了檢測病毒收獲物的量，用不同感染量(此后稱MOI)的毒株接種給該細胞系。所獲得病毒收獲物的量很低(103-104TCID50/ml)，即使在四次適應傳代后也不足以用于疫苗產物。這些實驗中可觀察到僅僅有部分感染的細胞對毒性病毒敏感，而剩余的細胞對感染具有不感受性，出于這一原因，克隆這一細胞系，以選擇那些全部對毒株敏感的細胞群。克隆的篩選如下進行細胞系的懸液在含20％FBS的Earle′sMEM中稀釋，把不同的稀釋液加到96孔微板(NUNC)中。37℃，5％CO2培養8天。在第3天時，用顯微鏡觀察篩選只有一個細胞的培養板，在第8天用胰蛋白酶消化。這樣獲得44個克隆。此后，所得克隆在培養瓶中擴增，直到達到5×107/ml。然后用同樣的步驟對這些細胞進行第2次和第3次克隆。第3次克隆后，將得到的44個克隆擴增到獲得25ml每一克隆含6×106/ml的細胞懸液。整個過程所應用的培養基含20％FBS。根據其生長和活力特征對這些克隆進行進一步篩選。實施例2細胞克隆Clon-8的篩選根據其生長效力對前一實施例中所得的克隆進行評估，去除那些有繁殖問題，形態不規則或難以在37℃維持的。經過這一預選后，去除25個克隆，選出余下的9個克隆。所篩選的克隆用在PAM培養物中第8代傳代的PRRS病毒的毒性株懸液進行感染(如Bloemberg，M.等在VetMicrob.42，361-371，1994中所描述的)。預先進行細胞克隆的適應過程病毒在37℃3次傳代中進行復制，保持80-90％的融合單層與病毒懸液接觸6天，然后在-80℃冷凍，24小時后融化。用補充有10％FBS和慶大霉素(0.4mg/ml)的Earle′sMEM作感染培養基。抗真菌或抗酵母的化合物均不應用。這樣所獲得的每種病毒收獲物在相應的細胞克隆中進行滴定。對結果進行分析后，可得出這樣的結論這9個克隆對病毒感染敏感，滴度大于等于104.2TCID50/ml。結果見表I。表I所得細胞克隆對特定毒性株的敏感性</tables>如表1中所看到的，未克隆的細胞系對病毒的敏感性很低，因此用它作抗原來獲得有效的疫苗似乎是不可行的。表1也顯示出一些克隆株，尤其是Clon-8，其對病毒的敏感性比未克隆的細胞系高得多，克隆Clon-8尤為顯著，當滴度達到106TCID50/ml的時候，可從Clon-8的病毒收獲物中獲得。根據上述的結果，選擇了Clon-8。用幾種方法研究了該克隆的可靠性。在幾種不同的方法中，病毒收獲物的滴度有很好的重復性，其值在105-107TCID50/ml之間。實施例3減毒病毒株的獲得本發明減毒病毒株是通過在34℃復制Clon-8細胞培養物中特定的毒性株而得到的。病毒感染的Clon-8細胞單層在34℃保持直至CPE形成。CPE的檢測通常比在37℃保持的培養物中的晚24-48小時，但是，沒有發現在兩個溫度下形成的CPE有明顯的差異。利用Clon-8細胞單層對收獲的病毒收獲物進行滴定。此外，用IPMA檢測了病毒的一致性。將病毒接種給75cm2接近融合的Clon-8細胞單層，然后在34℃吸附2小時。接著，把感染培養基加到單層細胞。感染培養基是調整了的Earle′s基本培養基，補充有10℃FBS，預先加熱到34℃。把75cm2的培養瓶放置到34℃的培養箱中，每天檢查直到發現清楚地CPE。經常是在感染后第5天和第7天，當80-95％的細胞單層出現CPE時，收集病毒的收獲物。然后將病毒收獲物以2000rpm進行離心，并對懸液進行滴定以確定病毒的滴度(TCID50/ml)。用上述的方法傳代20次。在第1、5、10、15、20次傳代的時候對病毒的含量進行評價。結果表明，病毒可于34℃在Clon-8細胞單層中復制。而無任何活力的丟失，至少傳代20次是這樣的(表II)。表II34℃病毒在Clon-8中從P.1至P.20代的增殖的評價</tables>進一步的結果證實，Clon-8細胞單層可在MOI為0.001時感染。下面實施例中進行的實驗表明，從P.20得到的強毒株對豬無害。實施例4減毒病毒株的生物學特性和用它接種的效果開始時應用的用于獲得本發明減毒株的病毒株是一毒性株。對妊娠母豬的主要作用為早產，產衰弱，死亡和/或干尸化的新生豬仔，被感染的母豬也可在感染后的4-5天出現3-5天的輕微呼吸困難和抑制。用起始毒性株的106.6TCID50鼻內感染四只妊娠的母豬(參考號01，02，03，06)。用兩只未感染的母豬(參考號73和74)作對照。結果如表III所示。表III妊娠母豬接種毒性株后對子代的影響</tables>僅有一只感染的母豬在預定的日期生產。感染的母豬分別產了2、0、5、6只死產的豬仔，2、4、2、1只衰弱的豬仔。衰弱的豬仔出生后幾天死亡。斷奶時，每只對照母豬平均有11只豬仔存活，而每只感染的母豬產的豬仔平均僅存活6.5只。斷奶時，豬仔的平均重量為4621g(感染母豬的豬仔)和5363g(對照母豬的豬仔)。從衰弱豬仔的肺勻漿中分離出有毒的PRRS病毒。進行感染攻擊后，感染的母豬及其子代均出現血清轉化現象。利用兩種性別的豬通過特異性試驗實現本發明減毒病毒株的生物學表征。無害試驗在3個PRRS血清陰性的妊娠母豬中進行，這些豬來源于一個從來沒有流行過PRRS的小農場。在母豬懷孕的倒數第三周接種病毒，這時對病毒最敏感。在懷孕的第78天和第93天之間鼻內施用減毒病毒，每只母豬的劑量為106TCID50。接種病毒后，3只母豬的生理常數保持未變，直腸的溫度在正常參數內(見圖1)。三只母豬也都在預定的日期生產。所得結果概括在表IV中。表IV妊娠母豬接種減毒病毒后對后代的影響</tables>這三只母豬分別產13、4和16只豬仔。新生豬仔的生命力被認為正常。然而，在兩只母豬的后代中發現幾只干尸化的豬仔。豬仔的重量變化在所有的個體中都是正常的(見圖2)，直到觀察期末(45天)都在正常參數范圍內。在任一豬仔中均未發現與PRRS病毒感染的有關的虛弱及紊亂。此外，在新生豬仔的血液或血清樣品中均未檢測到PRRS病毒。病毒接種21-36天后，在妊娠母豬的血液和血清樣品中均未檢測到PRRS病毒。所有的事實證明妊娠母豬中的減毒PRRS株無毒害作用。很明確這是對野生型病毒感染的最敏感類型。當用傳統的技術在PAM培養物中篩檢PRRS病毒存在的時候發現接種后的妊娠母豬所產新生豬仔的血清樣品為陰性。用減毒病毒接種的三只母豬產后45天體液中抗體的IPMA滴度為1/480，這一滴度很穩定，45天之后稍微有些變化。母豬在接種21天之后血清呈陽性，如圖3中所能見到的，感染母豬所產豬仔在初次吸乳之后出現血清陽性，這種情況至少能持續到75天齡。在一組12只懷孕至倒數第三周的母豬中進行了另外的無毒試驗，八只母豬肌內接種39疫苗劑量(105TCID50)剩余的四只作對照以評價減毒株對生殖參數的影響。接種的母豬的生理參數無變化，并且這些豬在預定日期生產。結果如表V所示。如在表中所能見到的。接種了的母豬和作為對照的四只母豬均產下正常數目的豬仔。豬仔也有正常的生命力。表V接種減毒病毒對懷孕至倒數第三周的母豬的生殖參數的影響</tables>本發明的減毒株能在PRRS血清陰性的豬中進行有效的復制。這可由這樣的事實證明，肌內施用小至200TCID50的減毒株即可復制并能在豬內誘導血清轉化。如在圖4中所能見到的，在接種的動物中誘導的抗體至少能持續存在52天。本發明的減毒病毒并不傳播給與肌內接種的八只豬仔放在一起的那四只未接種的標記了的豬仔。病毒不傳播給未接種的動物這一事實說明減毒株適宜用作疫苗。而且，在接種的豬中沒有發現白細胞減少或任何其它臨床癥狀，這表明當肌內施用時減毒病毒也無毒害作用。接種后11天就有平均86％的接種豬仔出現血清陽性。本發明的減毒病毒能在接種的豬中誘導保護性免疫應答，這能防止PRRS毒性株感染的臨床效應。因此當4周齡的接種豬仔感染毒性病毒時，其中75％沒有發現臨床癥狀。但從另一方面來說，如表VI中所能見到的，有80％的未接種的對照豬仔在進行實驗性感染后出現直腸溫度的顯著升高，而且，實驗性感染后19天進行尸檢，接種豬仔的肺損傷明顯低于未接種的對照組。以同樣的方式實驗性感染后僅在25％的接種動物中發現毒性病毒，而未接種的對照動物中有80％能在感染后至少12天檢測到毒性病毒。表VI感染后接種的對照的豬仔中的高熱現象</tables>保藏的微生物的資料根據布達佩斯協定，本發明的病毒毒株和細胞克隆Clon-8均保藏于(法國)巴黎巴斯德研究所的國家微生物培養物保藏中心(CNCM)的國際機構。申請人識別號CNCM號保藏日期VP-046-BISI-164223/11/95Clon-8I-164323/11/95這些保藏品是在布達佩斯協議規定的狀態下為公眾可得到的。這并不能解釋為允許實施本發明，因為這樣將侵犯本發明申請人的權利。權利要求1.誘發被稱作豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)的豬病的病毒的減毒株，它基本上與95年11月23日保藏于巴斯德研究所CNCM的保藏號為I-1642的保藏物一致。2.一種保護豬免于被稱作豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)的疾病的疫苗，其特征在于該疫苗包含權利要求1的病毒株和/或至少一種可由它得到的病毒性抗原。3.權利要求2的疫苗，其中病毒性抗原是滅活的病毒。4.權利要求2的疫苗，其特征在于該疫苗包含102-106TCID50的減毒病毒株。5.權利要求2或3的疫苗，其中疫苗劑量包含一定的病毒性抗原量，該病毒性抗原量與102-106TCID50的減毒病毒株所產生的量相等。6.權利要求2-5中任一權項的疫苗，其特征在于該疫苗包含附加的免疫刺激性佐劑和/或乳化劑和/或穩定劑。7.權利要求2-6中任一權項的疫苗，其特征在于該疫苗以單獨或組合的形式包含附加的活的或滅活的豬病毒。8.權利要求2-6中任一權項的疫苗，其特征在于該疫苗包含附加的活的或滅活的細菌。9.來源于穩定的猴腎細胞系MA-104的細胞克隆，它基本上與95年11月23日保藏于巴斯德研究所CNCM的保藏號為I-1643的保藏物一致。10.一種獲得PRRS病毒的減毒株的方法，其特征在于該方法主要包括通過在權利要求9的細胞克隆中連續傳代而對毒性株進行修飾。11.權利要求10的方法，其特征在于在連續傳代中溫度保持在34℃。12.一種制備抗PRRS的活性疫苗的方法，其特征在于該方法主要包括將權利要求1的病毒株在權利要求9的細胞克隆中繁殖。13.權利要求12的方法，其特征在于該方法將病毒株在34℃進行繁殖。14.權利要求12或13的方法，其特征在于所獲得的減毒株的制劑為水性分散液、油性乳液、脂質體組合物或凍干形式，帶有或不帶有權利要求6中的佐劑。15.權利要求12-14中任一權項的方法，其特征在于所得減毒株被熱滅活或化學滅活，直到它被完全滅活。16.一種PRRS診斷方法，其特征在于該方法包括權利要求1的減毒株和/或至少一種來源于它的病毒性抗原。17.一種檢測PRRS抗體的方法，該方法包括下列步驟a)使權利要求1的減毒病毒株適宜在培養微板中的穩定細胞培養物中生長，其方式為每孔用大約20-40個感染性顆粒感染；b)用已知的固定劑把感染的細胞固定在固相上；c)通過在微板中培養豬血清，用IPMA技術對其染色，來檢測來自豬血清的抗體；18.權利要求17的方法，其中穩定的細胞培養物是權利要求9的細胞克隆。19.權利要求1中的減毒病毒株在制備抗被稱作PRRS的豬病的疫苗中的應用。20.權利要求1中的減毒病毒株在制備檢測被稱作PRRS的豬病的診斷試劑盒中的應用。全文摘要本文描述了誘發豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)的病毒的新的減毒株(CNCM巴斯德研究所Ⅰ－1642),同時也描述了用從猴腎細胞系MA－104(CNCM巴斯德研究所Ⅰ－1643)獲得的一種新克隆對它進行減毒和復制的方法。由于該新的減毒株對豬無毒害作用且具有高度的免疫原性,因此可用它獲得疫苗和診斷試劑盒,使PRRS的早期診斷和有效的預防性治療成為可能。文檔編號C12N7/08GK1185806SQ9619413公開日1998年6月24日申請日期1996年12月4日優先權日1996年1月25日發明者R·A·伯奇,E·E·馬索,P·R·普雅阿斯,N·S·羅卡申請人:海普拉實驗室有限公司