植特產生的重組前十二指腸酶和多肽衍生物、及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：：植特產生的重組前十二指腸酶和多肽衍生物、及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及通過植物產生重組前十二指腸脂酶(尤其是重組胃脂酶)的方法，涉及其具有脂酶活性的其他多肽衍生物，還涉及其應用，尤其是作為功能性食物或在藥物組合物中或在農業食品或工業應用的酶配制物中。狗胃脂酶(DGL)是一種分子量約為50千道爾頓(kDa)的379個氨基酸(AA)的糖蛋白，以氨基末端(NH2-末端)含信號肽的前體形式被合成，由狗胃的基底粘膜半數細胞分泌(CarrièreF.等，1991)。人胃脂酶(HGL)以前體形式天然合成，在Bodmer等(1987)的出版物中有述。成熟的HGL蛋白由379個氨基酸組成。信號肽(HGLSP)由19個氨基酸組成。這些酶屬于稱為“前十二指腸”的脂酶家族，其中一些成員已被純化，有些甚至已被克隆(DochertyA.J.P.等，1985；BodmerM.W.等，1987；MoreauH.等，1988；歐洲專利0191061和0261016)。長期以來，人們想當然地認為食物液的水解是在胰腺產生的酶作用下發生在小腸中(BernardC.，1849)。但是一些發現已提示甘油三酯的水解可能在前十二指腸酶的間接作用下發生在胃中(Volhard，F.，1901；Shonheyder，F.和Volquartz，K.，1945)。這些酶，尤其是狗胃脂酶具有區別于哺乳動物胰脂酶的酶學和物理化學性質。胃脂酶和胰脂酶的這些差別主要涉及以下幾點分子量、氨基酸組成、對胃蛋白酶的抗性、底物特異性、最適作用pH和在酸性介質中的穩定性。但在體外某些條件下，胃脂酶和胰脂酶間可能顯示對長鏈甘油三酯水解的協同作用(Gargouri，Y.等，1989)。已知幾種病理狀態(膽囊纖維樣變性、胰腺外分泌不足)中，病人完全或部分缺乏胰腺外分泌，從而缺乏水解食物所必需的酶(淀粉酶、脂酶、蛋白酶)。小腸中脂肪(尤其是長鏈甘油三酯)不吸收在這些病人中表現為皮脂溢非常明顯地升高，在年輕病人中表現為非常令人關注的體重增長減慢。為了糾正這一狀態，在進食時給予這些主體豬胰提取物。這種提取物的療效經同時服用DGL可明顯改善，這是因為后者對長鏈甘油三酯的特異性作用。Carriere等(1991)的文章描述了DGL的純化和NH2-末端序列的確定。該出版物中還描述了從狗胃中提取該酶的方法。該方法基本包括在存在水溶性鹽的酸性介質(pH2.5)中浸提狗的胃，水溶性鹽可促進脂酶在所述介質中鹽析。經分子篩過濾和離子交換層析步驟可將DGL純化至均質。經這些方法獲得的純化DGL是分子量為49000D的糖蛋白，其中糖部分占6000，蛋白占43000。難以弄到狗胃這一明顯原因阻礙了這一方法在實驗室和工業中的任何發展。這就需要發現一種能大量生產DGL而無需使用狗胃的方法。測定DGL的核苷酸和肽序列以便用基因工程方法工業生產DGL。這些工作是1993年12月16日提交的國際申請WO94/13816的主題。該國際申請中描述的重組DGL的生產方法以大腸桿菌作為生產DGL的轉化宿主細胞。在用大腸桿菌生產重組DGL的過程中遇到了一些難題，特別是需要在發酵罐中培養大量的大腸桿菌，費用高，這導致發明人尋求生產DGL的其他方法。哺乳動物細胞當然更適合哺乳動物基因的表達。但這種應用產生蛋白成熟化的問題。實現翻譯后成熟化的酶系統在組織間、器官間或種間各不相同。例如，已報道，如果從人血中獲得蛋白或如果從重組細胞產生蛋白，如中國倉鼠卵巢細胞，或在轉基因動物奶中獲得蛋白，血漿蛋白質的翻譯后成熟化并不相同。而且，哺乳動物細胞的表達水平低，需體外非常大體積地培養，費用很高。在轉基因動物(小鼠、綿羊和奶牛)的奶中生產重組蛋白能降低生產費用并克服表達水平的問題。但仍有倫理問題和病毒、亞病毒(朊病毒)污染的問題。由于這些原因，將哺乳動物基因轉基因至植物細胞中，提供了一條大量生產新的重組蛋白的途徑，生產費用降低，而且無病毒或亞病毒污染的危險。幾個實驗室于1983年發現，可能將外源基因轉移到植物細胞的基因組中(Bevan等，1983；Herrera-Estrella等，1983，a和b)并從這些遺傳改造的細胞再生轉基因植物。這樣，所有的植物細胞都具有遺傳改造的特征，并且經過有性受精傳遞給后代。這些工作的結果是，許多實驗組致力于在植物細胞或在轉基因植物中生產哺乳動物重組蛋白(Barta等，1986；Marx，1982)。這一領域中最早令人關注的結果之一是在轉基因煙草植物中生產抗體(Hiatt等，1989)。為了在種子(蛋白在植物中的儲存位點)中表達外源蛋白，Vandekerckhove工作組(1989)將Leu-腦啡肽的編碼序列融合到編碼Arabidopsisthaliana的2S白蛋白的基因上。應用這一結構，獲得了在種子中以總蛋白0.1％左右的表達水平特異表達Leu-腦啡肽的轉基因油菜植物。Sijmons及其同事于1990年將人血清白蛋白的基因轉移到煙草和馬鈴薯的細胞中。無論信號肽的來源如何(植物或人)，在馬鈴薯葉、莖和塊根中以總蛋白0.02％左右的水平獲得了人血清白蛋白。還在植物中生產了其他哺乳動物重組蛋白乙型肝炎表面抗原(Mason等，1992)、干擾素(DeZoeten等1989；Edelbaum等，1992；Truve等，1993)；鼠抗鏈球菌變體抗體，齲齒藥物(Hiatt和Ma，1992；Ma等，1994)，抗癌細胞抗體scFC片段(RusselD.，1994)，抗皰疹抗體(RusselD.，1994)，水蛭素(Moloney等，1994)，霍亂毒素(HeinR.，1994)，和人表皮生長因子(EGF)(Higo等，1993)。所有這些研究表明，在植物細胞中產生重組蛋白是可能的，在動物細胞中從DNA序列到合成蛋白的機制是相似的。但在植物和動物細胞間存在一些差異，尤其是從多甘露糖苷聚糖到復雜聚糖的成熟化，或信號肽的切割位點，因而不能保證通過轉化在植物細胞中獲得有足夠活性的哺乳動物蛋白。本發明者已證明利用以適當重組核苷酸序列轉化的植物細胞，能獲得具有在工業應用中能開發利用的足夠酶活性的重DGL或重組HGL或從中衍生的多肽。本發明的目的是提供一種用植物生產具有酶活性(特別是脂酶活性)的哺乳動物重組前十二指腸脂酶，尤其是重組DGL或HGL，或其衍生多肽的新方法，所述重組脂酶或其衍生多肽可用于工業中。本發明的另一目的是提供實施這一方法的工具，特別是新的重組核苷酸序列，遺傳轉化的植物細胞，遺傳轉化的植物或植物部分(尤其是葉、莖、果實、種子或谷拉、根)和這些植物或植物部分的遺傳轉化的碎片。本發明的目的還在于提供新的哺乳動物重組前十二指腸脂酶或任何衍生多肽，它們具有酶活性，得自遺傳轉化的植物細胞或植物。本發明的目的還在于提供可用于進行酶促反應(尤其是工業規模的)的新酶組合物。本發明的目的還在于提供新的藥物組合物，尤其用于治療機體脂酶水平缺陷的相關疾病，如膽囊纖維樣變性。本發明的另一目的是提供新的燃料，也稱為生物燃料，其具有比石油燃料污染小和生產費用低的優點。借助下列本發明-圖1顯示cDNA的核苷酸序列，其中位于1-1137位核苷酸編碼圖2所示、相應于SEQIDNO2的DGL。-圖2顯示DGL的氨基酸序列，相應于SEQIDNO2。-圖3顯示衍生自圖1所示cDNA的核苷酸序列，相應于SEQIDNO1，所述衍生序列的1-1137位的核苷酸編碼如圖2所示并相應于圖2的DGL。-圖4顯示cDNA的核苷酸序列，其中位于47-1240位的核苷酸編碼398個氨基酸的HGL前體，104-1240位的核苷酸編碼379個氨基酸的成熟HGL。-圖5顯示HGL的氨基酸系列，HGL前體由1-398位氨基酸界定，成熟HGL由20-398位氨基酸界定。-圖6、7、8顯示本發明重組序列轉化的Xanthi煙草葉和種子，油菜種子和馬鈴薯葉和果實所產生重組多肽的“western”型免疫檢測試驗的結果。-圖9和10分別顯示抗從煙草葉純化的DGL的抗脂酶抗體的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和該膠轉移到硝酸纖維素膜上的結果。-圖11顯示膜上檢測重組DGL糖殘基的一個例子。-圖12顯示純化自油菜種子的DGL的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。-圖13、14和15顯示用本發明轉化的種子對油酸甲酯進行的各種試驗。本發明涉及一種重組核苷酸序列轉化植物細胞以從這些細胞或從這些細胞所獲植物中獲得活性酶形式的哺乳動物重組前十二指腸脂酶或一種(或多種)從后者衍生而來的如下定義的多肽的用途，所述重組核苷酸序列一方面含有編碼任何哺乳動物前十二指腸脂酶的cDNA，即其編碼核苷酸序列有至少約75％，特別是約77％-85％同源性，其氨基酸序列具有至少70％，特別是約80％-90％的同源性，且具有耐酸特性，在pH約1-5以下，特別是pH約1.5-2以下具有活性的脂酶，特別是編碼任何哺乳動物胃脂酶的cDNA，或編碼從上述前十二指腸脂酶經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的任何多肽的cDNA，該衍生多肽具有如上所述的前十二指腸脂酶的特征；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA編碼的前十二指腸脂酶、或產生如上所定義的衍生多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。本發明特別涉及一種重組核苷酸序列轉化植物細胞以從這些細胞或從這些細胞所獲得植物中獲得活性酶形式的重組DGL或一種(或多種)從后者衍生而來的如下定義的多肽的用途，所述重組核苷酸序列一方面含有如圖2所示狗胃脂酶(DGL)的如圖1所示cDNA，或從該cDNA衍生的核苷酸序列，特別是經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)核苷酸而衍生，所述衍生序列能夠編碼一種氨基酸序列與圖2所示DGL相同的多肽，或編碼從DGL經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA或上述衍生序列所編碼多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制(特別是植物細胞的RNA聚合酶)所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。本發明還涉及含有如圖1所示cDNA或如上所述從所述cDNA衍生的核苷酸序列的任何重組核苷酸序列。這方面，本發明特別涉及含圖1所示cDNA的如上所述任何重組核苷酸序列，所述cDNA編碼如圖2所示的狗胃脂酶(DGL)。本發明還特別涉及含圖1所示cDNA所衍生核苷酸序列的上述任何重組核苷酸序列，所述衍生核苷酸序列如上所定義并編碼圖2中所示的狗胃脂酶(DGL)。這種衍生序列最好如圖3所示，相應于圖1所示序列，但其中12位核苷酸的A被G所代替，13位核苷酸T被C所代替，15位核苷酸A被T所代替。本發明的重組核苷酸序列最好含有一個(或多個)負責將本發明的多肽(即重組DGL或上述衍生多肽)引向植物細胞特定腔室中的肽的編碼序列，特別是引向內織同或液泡，或細胞外的果膠纖維素壁或細胞外空間(也稱為質外體)。在可用于本發明的植物細胞轉化的轉錄終止子中可提及Franck等(1980)的文章中描述的花椰菜葉病毒(CaMV)的多聚A35S終止子，或多聚ANOS終止子，后者相當于土壤根瘤桿菌產生胭脂堿菌株Ti質粒胭脂堿合成酶基因的3′-非編碼區(Depicker等，1982)。關于這方面，本發明涉及在所述cDNA或其衍生序列的下游含多聚A35S終止子或土壤根瘤桿菌的多聚ANOS終止子的上述任何重組核苷酸序列。在可用于本發明的植物細胞轉化的轉錄啟動子中，可提及-CaMV的35S啟動子或最好35S雙結構啟動子(pd35S)，這些啟動子允許從本發明轉化細胞獲得的整個植物中表達本發明的重組多肽，并在Kay等(1987)的文章中有描述，-小蘿卜(radish)cruciferin基因的pCRU啟動子，它允許只在本發明轉化細胞所得植物的種子(或谷粒)中表達本發明的重組多肽，并在Dwepigny-This等(1992)的文章中有描述，-分別相當于Arabidopsisthaliana儲備蛋白基因GEA1和GEA6的5’非編碼區的pGEA1和pGEA6啟動子(Gaubier等，1993)，其允許谷粒中的特異性表達，-作為嵌合啟動子的超級啟動子pSP(pCT/US94/12946)，它由根瘤土壤桿菌章魚堿合成酶基因的三個轉錄活化子、甘露堿合成酶基因啟動子的轉錄活性元件和根瘤土壤桿菌甘露堿合成酶啟動子融合而構成。-McElroy等(1991)所述含于質粒pActl-F4中的后接稻actine內含子的稻actine啟動子(pAR-IAR)，-Reina等(1990)所述含于質粒pγ36中的玉米γzeine基因啟動子(pγzeine)，其允許在玉米種子胚乳中表達。關于這一點，本發明涉及在所述cDNA或其衍生序列上游含有CaMV雙結構啟動子(pd35S)，或radishcruciferin基因pCRU啟動子，或Arabidopsisthaliana的pGEA1或pGEA6啟動子，或根瘤土壤桿菌超級啟動子pSP，或稻的pAR-IAR啟動子，或玉米的Pγzeine啟動子的上述任何重組核苷酸序列。用于本發明的引導肽的編碼序列可源自植物、人或動物。植物來源的引導肽編碼序列中，可提及-甜馬鈴薯中編碼sporaminA23個氨基酸前肽(信號肽)的69個核苷酸的核苷酸序列(在以下的實施例中描述)，該信號肽允許本發明的重組多肽進入本發明轉化植物細胞的分泌系統(簡單地講是進入內織網)，-甜馬鈴薯中編碼sporaminAN-末端14個氨基酸的液泡引導原肽的42個核苷酸的核苷酸序列(在以下的實施例中描述)，其允許本發明的重組多肽在本發明的轉化植物細胞的液泡中積累，-編碼由上述信號肽N-末端部分到C-末端部分23個氨基酸和其后的上述原肽14個氨基酸所組成的sporaminA37個氨基酸前原肽的111個核苷酸的核苷酸序列(在以下的實施例中描述)，該前原肽允許本發明的重組多肽進入本發明轉化植物細胞的分泌系統及在液泡中積累，上述三個序列在Murakami等(1986)和Matsuoka和Nakaura(1991)的文章中有描述，-大麥植物血凝素的羧基末端原肽，特別在Schroeder等(1993)和Bedharek和Ralkhel(1991)的文章中有描述。人或動物來源的引導肽編碼序列中可提及編碼人胃脂酶(HGL)信號肽的序列(如歐洲專利0191061中所述)，或編碼兔胃脂酶信號肽的序列(如歐洲專利申請0542629中所述)，其序列在下述實施例中給出，或人胰脂酶(HPL)的或狗胃脂酶(DGL)的信號肽編碼序列。對引導肽的編碼序列還可提及編碼四肽KDEL并可引導至內織網的序列。關于這一點，本發明涉及在所述cDNA或其衍生序列上游和所用啟動子下游的含有全部或部分信號肽編碼序列的上述任何重組核苷酸序列，如甜馬鈴薯的sporaminA信號肽或HGL的或RGL的或DGL的信號肽，使所述重組核苷酸序列編碼的蛋白中，信號肽的C-末端最后一個氨基酸與所述cDNA或其衍生序列編碼的多肽N-末端第一個氨基酸連接。本發明還涉及在信號肽編碼序列和所述cDNA或其衍生序列之間含有編碼全部或部分液泡引導肽的序列的上述任何重組核苷酸序列，所述引導序列尤其為甜馬鈴薯的sporaminA液泡引導序列，編碼液泡引導肽，這樣使得所述重組核苷酸序列編碼的蛋白中，液泡引導肽的N-末端第一個氨基酸與信號肽的C-末端最后一個氨基酸連接，所述引導肽的C-末端氨基酸與所述cDNA或其衍生序列所編碼多肽的N-末端第一個氨基酸連接。本發明還涉及在所述cDNA或其衍生序列下游含有編碼全部或部分液泡引導肽的序列的上述任何重組核苷酸序列，所述引導肽尤其為大麥植物血凝素的液泡引導肽，編碼液泡引導肽，這樣使得所述重組核苷酸序列編碼的蛋白中，液泡引導肽的N-末端第一個氨基酸與所述cDNA或其衍生序列編碼的多肽C-末端最后一個氨基酸連接。本發明更特別涉及下列重組核苷酸序列-在5’→3’方向上含有CaMVpd35S啟動子，sporaminA信號肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pd35S-PS-DGL)，-在5’→3’方向上含有CaMVpd35S啟動子，sporaminA前原肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pd35S-PPS-DGL)，-在5’→3’方向上含有CaMVpd35S啟動子，RGL信號肽的一部分(即如下述實施例中所示的其頭19個氨基酸組成的序列，編碼最后3個C末端氨基酸的9個氨基酸缺失)，緊隨后者的圖1所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pd35S-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU啟動子，sporaminA信號肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pCRU-PS-DGL)，-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU啟動子，sporaminA前原肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pCRU-PPS-DGL)，-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pCRU-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有Arabidopsisthaliana的pGEA1啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pGEA1-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有Arabidopsisthaliana的pGEA6啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pGEA6-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有稻pAR-IAR啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S或根瘤土壤桿菌的多聚ANOS終止子的重組核苷酸序列(稱為pAR-IAR-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pγzeine-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，四肽KDEL的編碼序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL)。本發明的重組核苷酸序列最好還含有可用作所述重組序列標記的核苷酸序列，尤其為了區別(從而選擇)被所述重組序列轉化的植物細胞和未轉化的細胞。可用作所述重組序列標記的核苷酸序列優先選自抗生素抗性基因，特別是卡那霉素抗性基因。本發明還涉及在其復制非關鍵性位點上插入了本發明重組核苷酸序列的任何載體，特別是質粒載體。本發明還涉及用如上所定義的載體轉化的任何宿主細胞，特別是任何細菌，如根瘤土壤桿菌。本發明還涉及活性酶形式重組DGL和/或尤其通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸而從中衍生的具有脂酶活性的一種(或多種)多肽的任何制備方法，其特征在于它包括-轉化植物細胞使一種(或多種)本發明的重組核苷酸序列被整合在這些細胞的基因組中，-適當時從上述轉化細胞產生轉化植物，-特別通過提取，然后適當時純化，回收所述細胞中或上述轉化植物中產生的重組DGL和/或上述衍生多肽。根據本發明上述方法的一種實施方案，通過將本發明的重組核苷酸序列轉移至原生質中進行植物細胞的轉化，特別是按Kreis等(1982)的文章中描述的方法在存在二價陽離子(Ca2+)的聚乙二醇(PEG)溶液中培養原生質后。植物細胞的轉化還可以通過電穿孔法進行，尤其是按Fromm等(1986)的文章中描述的方法。植物細胞轉化還可以用基因槍進行，基因槍可將包被有本發明重組核苷酸序列的金屬顆粒以非常高的速度投射，從而將基因輸入細胞核中，特別按Sanford(1988)的文章中描述的技術。植物細胞轉化的另一方法是如DeLaPenna等(1987)的文章中所述的細胞漿或細胞核微注射。根據本發明上述方法的一個特別優選的實施方案，將植物細胞與用本發明載體轉化的細胞宿主放在一起，所述細胞宿主能感染所述植物細胞，使原本含于上述載體基因組中的本發明重組核苷酸序列整合在植物細胞基因組中，從而使植物細胞轉化。上述細胞宿主最好是根瘤土壤桿菌，特別按Bevan(1984)和An等(1986)的文章中描述的方法，或為毛根土壤桿菌，特別按Jouanin等(1987)的文章中所述方法。可在本發明中被轉化的植物細胞中，可提及油菜、煙草、玉米、豌豆、胡蘿卜、小麥、大麥、馬鈴薯、大豆、向日葵、萵苣、稻和苜蓿的細胞。根據上述本發明方法的一種實施方案，在體外(特別是在生物反應器)中培養本發明轉化的植物細胞，按Brodelius(1988)的文章中所述方法在液體培養基中培養，或按Brodelius等(1979)的文章中所述方法以固定化形式培養，或按Deno等(1987)的文章中所述方法體外培養轉化的根。然后收集上述體外培養基，以從中提取及適當時純化(特別通過層析)所述轉化細胞體外培養所產生的如上所定義的重組DGL和/或衍生多肽。按照本發明重組DGL和/或衍生多肽的上述制備方法的一個優選實施方案，植物細胞轉化后有一個在適當培養基中培養所述轉化細胞產生轉化植物的步驟。通過對整個植物或這些植物的部分(尤其是葉、莖或果實)，或對這些植物產的種子進行提取，獲得所得整個植物的細胞所產生的重組DGL和/或衍生多肽，所述提取之后適當時進行重組DGL和/或衍生多肽的純化。用于在本發明上述方法中收獲重組DGL和/或衍生多肽的轉化植物是T0代植物，即本發明的轉化細胞在適當培養基中培養所得到的植物，或最好為前代植物通過自授粉而得的后代植物(T1、T2等)，其中本發明的重組核苷酸序列按孟德爾法則復制。實施本發明方法可獲得的衍生自重組DGL的多肽中，可提及-由圖2中位于55和379位氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ54)，由SEQIDNO4代表，所述多肽由SEQIFNO3代表的核苷酸序列編碼，-由圖2中位于5和379位氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ4)，由SEQIDNO6代表，所述多肽由SEQIDNO5代表的核苷酸序列編碼。本發明還特別涉及制備圖2所示重組DGL，適當時制備一種(或多種)衍生多肽，特別是上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的如上所述方法，所述方法的特征在于在植物細胞基因組中整合一方面含有圖1所述cNDA，另一方面含有RGL22氨基酸信號肽的編碼序列(最好是RGL信號肽頭19個氨基酸的編碼序列)的上述重組序列來進行所述植物細胞的轉化。本發明特別涉及制備圖2所示重組DGL，適當時多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的如上所述方法，其特征在于它包括-轉化植物葉的外植體細胞，將后者與含有上述重組核苷酸序列pd35S-RGLSP-DGL的上述質粒轉化的根瘤土壤桿菌菌株在適當培養基中接觸，-在含有卡那霉素的培養基上選擇轉化的外植體，-上述轉化的外植體在適當培養基中培養，產生轉化植物，-提取重組DGL和適當時的多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過在適當緩沖液中研磨上述轉化植物的葉和/或種子和/或果實，離心并收集構成酶活性植物提取物的上清液，-適當時從上步所得提取物純化重組DGL，特別是通過對上清液進行層析，導致制備基本純的重組DGL。本發明還涉及上述方法用于制備基本純的多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，其中從上述方法中所得提取物中純化所述多肽，特別是對提取上清液進行層析。本發明還特別涉及上述多肽(Δ4)的制備，適當時制備基本純的多肽(Δ4)，其中實施上述方法，該方法中用pd35S-RGLSP-DGL序列轉化的細胞為茄科(特別是煙草或番茄)的外植體細胞。根據上述方法的一個實施方案，從上述轉化的煙草植物葉提取可特異性獲得多肽(Δ4)，特別是在適當緩沖液中研磨這些葉子，離心并收集上清液。然后可從含有所述多肽(Δ4)的葉提取物中純化多肽(Δ4)，特別是對所述上清液進行層析。本發明特別涉及制備重組DGL和/或如上定義的從中衍生的一種(或多種)多肽的上述方法，其特征在于在植物細胞細胞基因組中整合入一方面含有圖3所示核苷酸序列另一方面含有上述sporaminA信號肽編碼序列的序列，進行植物細胞的轉化步驟。實施上述方法可獲得的衍生自重組DGL的多肽中，可提及上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。本發明特別涉及上述重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的制備方法，其特征在于它包括-轉化植物的外植體細胞(特別是葉的外植體)，將后者與含有重組核苷酸序列pd35S-PS-DGL和/或pd35S-PPS-DGL的上述質粒轉化的根瘤土壤桿菌菌株接觸，-在含有卡那霉素的培養基上選擇轉化的外植體，-上述轉化的外植體在適當培養基中培養，產生轉化植物，-提取重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過在適當緩沖液中研磨上述轉化植物的葉和/或種子和/或果實，離心并收集構成酶活性植物提取物的上清液，-適當時從上步所得提取物純化重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過對上清液進行層析，導致制備基本純的重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。本發明還特別涉及上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的制備，其中實施上述方法，該方法中轉化的細胞為茄科(特別是煙草或番茄)的外植體細胞。根據本發明上述方法的一個特別的實施方案，從上述轉化的煙草植物種子提取物中可特異性獲得多肽(Δ54)，特別是在適當緩沖液中研磨這些種子，離心并回收上清液。然后可從含有所述多肽(Δ54)的上述種子提取物中純化多肽(Δ54)，特別是對所述上清液進行層析。本發明特別涉及制備重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的方法，其特征在于它包括-轉化植物的外植體細胞，將后者與含有重組核苷酸序列pCPU-PPS-DGL和/或序列pCRU-PS-DGL和/或序列pGEA1-RGLSP-DGL和/或序列pGEA6-RGLSP-DGL和/或序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL的上述質粒轉化的根瘤土壤桿菌菌株接觸，-在含有卡那霉素的培養基上選擇轉化的外植體，-上述轉化的外植體在適當培養基中培養，產生轉化植物，-提取重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過在適當緩沖液中研磨上述轉化植物的葉和/或種子和/或果實，離心并收集構成酶活性植物提取物的上清液，-適當時從上步所得提取物純化重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過對上清液進行層析，導致制備基本純的重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。本發明特別涉及通過實施上述方法制備上述多肽(Δ54)的方法，其中轉化的細胞是油菜和煙草的外植體細胞，通過研磨轉化的種子而提取多肽(Δ54)。上述方法中轉化植物細胞最好選自煙草、油菜、玉米、豌豆、胡蘿卜、小麥、大麥、馬鈴薯、大豆、向日葵、萵苣、稻和苜蓿的細胞。本發明的一更特別的目的是重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的制備方法，其特征為在于它包括用帶有含重組核苷酸序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL的質粒的基因槍轟擊，轉化玉米愈傷組織，-在含有選擇試劑如卡那霉素的培養基上挑選轉化的愈傷組織，-在適當培養基中培養，從上述轉化的愈傷組織產生轉化的玉米植物，-提取重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過在適當緩沖液中研磨上述轉化植物的葉和/或種子和/或果實，離心并收集構成酶活性植物提取物的上清液，適當時從上步所得提取物純化重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是通過對上清液進行層析，導致制備基本純的重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。本發明還涉及在其基因組中穩定地整合有一種(或多種)本發明上述重組核苷酸序列的任何遺傳轉化的植物細胞。本發明還涉及含有一種(或多種)本發明重組多肽如重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的上述任何轉基因植物細胞，所述植物細胞也稱為酶活性(特別是如下定義的脂酶活性)植物細胞。本發明還涉及在其基因組中穩定地整合有一種(或多種)本發明上述重組核苷酸序列的遺傳轉化種子。本發明還涉及含有一種(或多種)本發明重組多肽如重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的上述任何轉基因種子，所述種子也稱為酶活性(特別是如下定義的脂酶活性)種子。本發明的轉化種子是從本發明的遺傳植物收獲的那些，這些轉化植物為本發明轉化細胞培養產生的上述T0代植物，或通過前代自授粉或植物雜交獲得的后代植物(T1、T2等)(如上所示)。本發明還涉及遺傳轉化的植物或植物部分(特別是外植體、莖、葉、根、花粉等)，特征在于在其基因組中穩定地整合有一種(或多種)本發明的上述重組核苷酸序列。本發明還涉及含有一種(或多種)本發明重組多肽如重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的上述任何轉基因植物或植物部分，所述植物或植物部分也稱為酶活性(特別是如下定義的脂酶活性)植物或植物部分。本發明特別涉及培養本發明的上述細胞或種子所獲得的上述轉化植物。本發明的轉化植物或植物部分最好選自油菜、煙草、玉米、豌豆、胡蘿卜、小麥、大麥、馬鈴薯、大豆、向日葵、萵苣、稻和苜蓿，或這些植物的某些部分。本發明涉及任何酶活性的特別是如下定義的脂酶活性的植物提取物，其通過實施上述本發明方法之一而制得，含有一種(或多種)本發明的重組多肽如重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)作為活性酶。本發明植物或植物部分和酶活性提取物的脂酶(或脂解)活性，特別可按Gargouri的方法(Gargouri等，1986)用短鏈甘油三酯(如三丁精)作為底物而測定。酶活性用單位U表示，一個單位U相當于在37℃最佳pH條件下每分鐘釋放1μmmol游離脂肪酸所需酶量。本發明酶活性植物提取物中酶活性重組多肽的重量百分比優選為這些提取物中總蛋白重量的約0.1-20％，特別是約1-15％，這相當于有0.5U/克葉鮮重(FW)到1000U/g葉鮮重，特別是約10-300U/g葉鮮重，或約1-5000U/g種子鮮重，特別是約10-1000U/g種子鮮重的酶活性水平。本發明特別涉及下列酶活性植物提取物*用序列pd35S-RGLSP-DGL或序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL按上述方法之一轉化植物的外植體細胞所獲植物的葉和/或種子和/或果實的提取物，其中含有重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是-用序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL按上述方法轉化煙草葉外植體細胞所得煙草葉的提取物，其中含有多肽(Δ54)和多肽(Δ4)，這兩種多肽的混合物相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-20％，所述提取物的酶活性約為100-300U/g鮮重，-用序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL按上述方法轉化番茄葉或果實的外植體細胞所得番茄葉或果實的提取物，其中含有多肽(Δ54)和多肽(Δ4)，這兩種多肽的混合物相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-20％，所述提取物的酶活性約為100-300U/g鮮重，-用序列pd35S-RGLSP-DGL按上述方法轉化煙草葉外植體細胞所得煙草葉的提取物，其中含有多肽(Δ4)，該多肽相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-20％，所述提取物的酶活性約為100-300U/g鮮重，-用序列pd35S-PPS-DGL按上述方法轉化煙草葉外植體細胞所得煙草葉的提取物，其中含有多肽(Δ54)，該多肽相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-1％，所述提取物的酶活性約為10-300U/g鮮重，*用序列pCPU-PS-DGL或序列pCRU-PPS-DGL，或序列pGEA1-RGLSP-DGL，或序列pGEA6-RGLSP-DGL按上述方法之一轉化植物的外植體細胞所獲植物種子的提取物，其中含有重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是-用序列pCPU-PS-DGL或序列pCRU-PPS-DGL，或序列pGEA1-RGLSP-DGL，或序列pGEA6-RGLSP-DGL按上述方法轉化油菜葉外植體細胞所得油菜種子的提取物，其中含有多肽(Δ54)，該多肽相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-1％，所述提取物的酶活性約為10-1000U/g鮮重，*用序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL按上述方法之一轉化植物的外植體細胞所獲植物種子的提取物，其中含有重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特別是-用序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEI按上述方法轉化油菜葉外植體細胞所得油菜種子的提取物，其中含有多肽(Δ54)，多肽(Δ54)相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-1％，所述提取物的酶活性約為10-1000U/g鮮重。本發明還涉及氨基酸序列如圖2所示的任何酶活性重組DGL，或從中衍生的多肽，特別是通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸，這些衍生多肽具有脂酶活性，它們是通過實施上述本發明方法以基本純的形式獲得的，這些方法包括本發明重組多肽的純化步驟，特別是對如上所述的酶提取物進行層析。作為從上述重組DGL衍生的多肽，本發明特別涉及上述多肽(Δ54)和(Δ4)，其分子量分別為約37kDa和約49kDa。酶活性重組DGL或具有酶活性的衍生多肽應理解為按上述Gargouri方法測定具有脂酶活性的重組多肽。例如，本發明重組多肽具有約1000U/mg重組多肽，最好約100600U/mg的脂酶活性。本發明特別涉及從煙草葉或種子的酶活性提取物純化獲得的重組DGL，這些葉或種子來自轉化的煙草植物，后者本身來自用序列pd35S-RGLSP-DGL按上述方法轉化的煙草細胞，所述重組DGL具有上述脂酶活性。本發明還涉及從植物葉和/或種子和/或果實的酶活性提取物純化獲得的多肽(Δ54)和多肽(Δ4)，這些植物尤其為茄科，如轉化的煙草和番茄，植物本身得自用序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL，或序列pd35S-RGLSP-DGL按上述方法轉化的植物細胞，所述重組多肽(Δ54)和(Δ4)具有上述脂酶活性。本發明還涉及從煙草種子或油菜種子的酶活性提取物純化得到的多肽(Δ54)，這些種子分別來自轉化的煙草或油菜植物，后者本身分別來自用序列pCPU-PS-DGL或序列pCRU-PPS-DGL按上述方法轉化的煙草或油菜細胞，該重組多肽(Δ54)具有上述脂酶活性。本發明還涉及從油菜種子酶活性提取物純化獲得的多肽(Δ54)和(Δ4)，這些種子來自轉化的油菜植物，后者本身來自用序列pGEA1-RGLSP-DGL和/或序列pGEA6-RGLSP-DGL按上述方法轉化的油菜細胞，該重組多肽(Δ54)和(Δ4)具有上述脂酶活性。本發明還涉及從玉米種子酶活性提取物純化獲得的多肽(Δ54)和(Δ4)，這些種子來自轉化的玉米植物，后者本身來自用序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL按上述方法轉化的玉米細胞，該重組多肽(Δ54)和(Δ4)具有上述脂酶活性。本發明多肽(Δ54)和(Δ4)的表觀分子量分別為37kDa和49kDa，系經聚丙烯酰胺凝膠分析和電轉移至硝酸纖維素膜上后的免疫檢測而測得(這些方法詳見以下實施例)。本發明還涉及抗本發明重組多肽的抗體，更具體為抗本發明的重組DGL和/或抗上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的那些抗體，它們也可識別HGL。這種抗體可通過用這些多肽免疫動物，然后回收形成的抗體而獲得。當然這些抗體的產生不限于多克隆抗體。這還涉及由雜交瘤產生的任何單克隆抗體，所述雜交瘤可通過常規方法從用本發明一種純化多肽免疫的動物脾細胞(尤其是小鼠或大鼠的)和適當的骨髓瘤細胞形成，按照其產生識別開始用于免疫動物的上述多肽及HGL的單克隆抗體的能力篩選雜交瘤。本發明還涉及本發明的轉化植物、植物部分、植物細胞或種子在制備一種(或多種)本發明重組多肽如重組DGL或其上述衍生多肽中的應用，特別是經實施本發明上述方法之一，所述重組多肽是基本純的形式或包括在上述定義的酶活性植物提取物中。本發明還涉及本發明酶活性植物或植物部分或上述定義的酶活性提取物或本發明的重組多肽在人或動物食品中的應用，該重組多肽為如上述定義的重組DGL或其衍生多肽。本發明特別涉及本發明的酶活性植物或植物部分，特別是葉、果實、種子作為食物的應用。在這方面，本發明特別涉及含有如上所述的酶活性植物或植物部分的任何食品，后者特別是由植物產生的葉、果實、種子，其具有人和動物可食性特征。本發明還涉及含有如上所述的一種(或多種)酶活性植物和/或該(這些)植物部分，特別是該(這些)植物的葉和/或種子和/或果實和/或一種(或多種)上述酶活性的植物提取物和/或本發明的一種(或多種)重組多肽的任何營養組合物，其中適當時可與一種(或多種)可食性組份組合。含于上述營養組合物中的植物或植物部分最好是研碎材料的形式。本發明的食品(又稱功能性食品)或本發明的營養組合物更尤其有利于促進健康個體或患有一種或多種可能或可能不影響胃脂酶和/或胰脂酶產生水平的病變的個體，吸收所攝取的動物和植物脂肪。在這方面，本發明的食品或營養組合物最好用作營養添加劑。本發明還涉及本發明酶活性的植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，或如上定義的酶活性植物提取物，或本發明的重組多肽，例如如上定義的重組DGL或其衍生多肽，用于制備有利于促進健康個體或患有一種或多種可能或可能不影響胃脂酶和/或胰脂酶產生水平的病變的個體，吸收所攝取的動物和植物脂肪的藥物(或藥物組合物)。尤其是，這些藥物組合物最好應用于正在進行改變脂肪吸收機制的醫學治療的個體或老年人。本發明的藥物組合物還更尤其有利于與器官內脂酶(特別是胃和/或胰脂酶)缺乏相關的病變和如膽囊纖維樣變性和胰腺外分泌不足的病變的治療。本發明更特別涉及含有一種(或多種)上述酶活性植物提取物和/或一種(或多種)本發明的重組多肽的任何藥物組合物，其適當時可與藥物可用的載體組合。本發明更特別涉及含有基本純的形式或上述酶活性提取物形式的重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的任何上述藥物組合物。本發明的藥物組合物優選口服，特別是以膠囊、片劑或粉末形式。如果所述藥物組合物含有上述酶活性提取物，則人每天的劑量優選從約200mg到約1000mg，并且最好分配在正餐時間左右服用；如果所述藥物組合物含有基本純形式的本發明的重組多肽，則日劑量為約100mg到約500mg。本發明還涉及本發明酶活性的植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，或如上定義的酶活性植物提取物，或本發明的重組多肽，例如如上定義的重組DGL或其衍生多肽，用于進行工業、農業食品和農用工業領域中，特別是在脂肪工業、脂肪化學及奶品工業中的酶促反應。在這方面，本發明特別涉及工業、農業食品和農用工業領域中，特別是在脂肪工業、脂肪化學及牛奶工業中，通過一個或多個酶促反應而進行的酶促生物轉化或生物催化的方法，利用本發明酶活性的植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，或如上定義的酶活性植物提取物，或本發明的重組多肽，例如如上定義的重組DGL或其衍生多肽進行這些酶促反應。本發明更特別涉及可在工業、農用和農用工業使用的酶制劑，其可用于進行上述應用并含有一種(或多種)上述酶活性植物提取物，特別是重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，其適當時可與能用于上述工業應用過程中的一種(或多種)附加物或其他酶相組合。本發明更特別涉及本發明酶活性的植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞進行工業規模的酶促生物轉化反應或生物催化反應的應用，例如酶促水解或轉酯化作用。本發明酶活性的植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞最好同時用作酶源和反應底物。本發明還涉及應用本發明酶活性的植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，更特別是含重組DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的植物的任何生物催化方法，所述植物或植物部分同時用作酶源和反應底物。本發明更特別涉及本發明酶活性的植物或這些植物部分用于生物燃料的制備。在這方面，目前本發明涉及任何通過加入醇(尤其是甲醇或乙醇)到全部或部分本發明的轉化植物，尤其是轉化的油菜、向日葵或黃豆的磨碎物中，并回收生物燃料(特別是通過過濾)以制備生物燃料的方法。本發明還涉及例如通過進行上述方法而得到的植物脂肪酸的酯，特別是油酸的甲酯。本發明還涉及通過進行如上所述方法而得到的任何生物燃料，和更特別是含有植物脂肪酸酯的任何上述生物燃料。本發明更特別涉及任何通過對油菜籽進行如上所述方法而得到的含有一種油酸甲酯的生物燃料。本發明還涉及以抗本發明的重組多肽的上述抗體對可能含有DGL或HGL的生物樣本中DGL或HGL進行檢測或分析的用途。本發明更特別涉及以這些抗體對與生物體中脂酶過多或相反不足或甚至缺乏相關的病變進行體外診斷的用途。對取自患者的生物學標本所進行的體外診斷方法包括一個將該標本與一種或多種抗體混合的階段，隨后為檢測任何在前一階段中形成的抗體-HGL復合物的階段。在這方面，本發明還涉及用以進行體外檢測或診斷的上述方法的試劑盒，其包括；-上述抗體，最好用放射性或酶法標記，和由適于這些抗體和HGL進行免疫反應的介質組成的試劑。-可檢測這些抗體和HGL所形成的免疫復合物的試劑。本發明更特別涉及一種重組核苷酸序列轉化植物細胞以從這些細胞或從這些細胞所獲得植物中獲得活性酶形式的重組HGL或一種(或多種)從后者衍生而來的如下定義的多肽的用途，所述重組核苷酸序列一方面含有編碼如圖5所示人胃脂酶(HGL)的如圖4所示cDNA，或從該cDNA衍生的核苷酸序列，特別是經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)核苷酸而衍生，所述衍生序列能夠編碼一種氨基酸序列與圖5所示HGL相同的多肽，或編碼從HGL經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA或上述衍生序列所編碼多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制(特別是植物細胞的RNA聚合酶)所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。在這方面，本發明還涉及任何以圖4所示的編碼HGL的核苷酸序列取代在轉化植物以制備重組DGL中所述的、如圖1或圖3所示的編碼DGL的核苷酸序列的重組核苷酸序列。本發明更特別涉及下列重組核苷酸序列-在5’→3’方向上含有根瘤土壤桿菌的pSP啟動子，HGL信號肽的編碼序列，緊隨后者的圖4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pSP-HGLSP-HGL)，-在5’→3’方向上含有根瘤土壤桿菌的pSP啟動子，HPL信號肽的編碼序列，緊隨后者的圖4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pSP-HPLSP-HGL)，-在5’→3’方向上含有根瘤土壤桿菌的pSP啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pSP-RGLSP-DGL)。本發明還涉及如上所述含有編碼HGL和/或其衍生多肽的上述重組核苷酸序列的載體和這些載體轉化的宿主細胞。本發明還涉及活性酶形式重組HGL和/或尤其通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸而從中衍生的具有脂酶活性的一種(或多種)多肽的任何制備方法，其特征在于它包括-轉化植物細胞使一種(或多種)本發明的重組核苷酸序列被整合在這些細胞的基因組中，-適當時從上述轉化細胞產生轉化植物，-特別通過提取，然后適當時純化，回收所述細胞中或上述轉化植物中產生的重組HGL和/或上述衍生多肽。本發明更特別涉及通過實施如上所述的生產重組DGL和/或衍生多肽的方法，應用一種含有圖4所示序列的上述重組序列以制備重組HGL的任何制備方法。實施本發明方法可獲得的衍生自重組HGL的多肽中，可提及-由圖5中位于74和398位氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ54HGL)，-由圖5中位于24和398位氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ4HGL)。本發明更特別涉及制備重組HGL和/或多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)的如上所述方法，其特征在于它包括轉化植物葉的外植體細胞，將后者與含有上述重組核苷酸序列pSP-HGLSP-HGL和/或pSP-HPLSP-HGL和/或pSP-RGLSP-HGL的上述質粒轉化的根瘤土壤桿菌菌株在適當培養基中接觸，-在含有卡那霉素的培養基上選擇轉化的外植體，-上述轉化的外植體在適當培養基中培養，產生轉化植物，-提取重組HGL和適當時的多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)，特別是通過在適當緩沖液中研磨上述轉化植物的葉和/或種子和/或果實，離心并收集構成酶活性植物提取物的上清液，-適當時從上步所得提取物純化重組HGL，特別是通過對上清液進行層析，導致制備基本純的重組HGL。本發明還涉及在其基因組中穩定地整合有一種(或多種)本發明上述重組核苷酸序列的任何植物或該植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子。本發明涉及任何酶活性的特別是如下定義的脂酶活性的植物提取物，其通過實施上述本發明方法之一而制得，含有一種(或多種)本發明的重組多肽如如重組HGL和/或多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)作為活性酶。本發明更特別涉及用序列pSP-HGLSP-HGL和/或pSP-HPLSP-HGL和/或pSP-RGLSP-HGL按上述方法之一轉化植物的外植體細胞所獲植物的葉和/或種子的提取物，其中含有重組HGL和/或多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)，特別是-用序列pSP-HGLSP-HGL和/或pSP-HPLSP-HGL和/或pSP-RGLSP-HGL按上述方法轉化煙草葉外植體細胞所得煙草葉或種子的提取物，其中含有多肽(Δ54HGL)和多肽(Δ4HGL)，這兩種多肽的混合物相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-20％，所述提取物的酶活性約為100-300U/g鮮重，-用序列pSP-RGLSP-HGL轉化煙草葉的外植體細胞所得煙草葉的提取物，其中含有多肽(Δ4HGL)，該多肽相對所述提取物中蛋白總重的重量百分比約為0.1-20％，所述提取物的酶活性約為100-300U/g鮮重。本發明還涉及氨基酸序列如圖5所示的任何酶活性重組HGL，或從中衍生的多肽，特別是通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸，更加特別為多肽(Δ54HGL)和(Δ4HGL)，這些衍生多肽具有脂酶活性，例如它們是通過實施上述本發明方法以基本純的形式獲得的，這些方法包括本發明重組多肽的純化步驟，特別是對如上所述的酶提取物進行層析。如先前對重組DGL所作的描述，本發明還涉及-抗本發明的重組HGL或其衍生多肽的多克隆或單克隆抗體，及其如上所述的用途，-基于本發明的如上定義的酶活性植物，或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子，或植物細胞或提取物，或重組HGL或其衍生多肽的食品、營養組合物或藥物組合物、或工業用途的酶制劑，-任何由本發明的重組HGL或其衍生多肽，或如上定義的酶活性植物，或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子，或植物細胞或提取物所進行的酶促生物轉化方法或生物催化，或生物燃料制品。在下面的所述重組核苷酸序列的制備和產生本發明重組多肽的轉化植物的制備及制備生物燃料的方法的詳細描述中，將進一步說明本發明。1.編碼重組狗胃脂酶蛋白并可在茄科的葉和種子中表達的嵌合基因的構建I-A)編碼重組GDL并可在煙草中表達的嵌合基因的構建編碼重組狗胃脂酶(GDL)的基因在煙草的葉和種子中表達需要下列調控序列1.雙結構CaMV(花椰菜花葉病毒)啟動子35S(pd35s)。該序列相當于位于天然啟動子35S的TATA元件上游并能激活轉錄的序列的重復(Kay等，1987)。2.雙鏈環狀DNA的轉錄終止序列，終止子多聚A35S，其對應于花椰菜花葉病毒序列的3’端非編碼區，該終止子可形成35S的轉錄本(Frnaka等，1980)。應用重組DNA技術(Sambrook等，1989)可從pBIOC4構建各種質粒。該二分質粒衍生自pGA492(An，1986)，在其轉移DNA的左右邊界之間含有如下源于質粒pTiT37的序列編碼胭脂堿合成酶的nos基因的結構性啟動子(Depicker等.1982)，頭8個密碼子缺失的編碼新霉素磷酸轉移酶II的npt11基因的編碼序列(Berg和Berg，1983)，(其中起始密碼子為甲硫氨酸ATG)，該序列連接到nos基因(Depicker等，1982)編碼序列的頭14個密碼子上，nos終止子(Depicker等，1982)，隨后為在編碼氯霉素乙酰轉移酶的cat基因(Close和Rodriguez，1982)和根瘤土壤桿菌的質粒pTiA6基因6的終止序列(Liu等，1993)之前的含多克隆位點(也稱多接頭)(HindIII-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII)的區域。為了基本去除所有編碼cat基因的序列，質粒pGA492經Sac1(多接頭的限制性位點)和Sca1(存在于cat基因序列中的限制性位點)的兩次酶切消化，然后根據使用說明進行T4DNA多聚酶處理。修飾質粒(20ng)在含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)的10μL反應體系中，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Habahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。接著應用磷酸化的HindIII-EcoRI銜接子(Stratagene克隆系統)，將該克隆質粒DNA中保留的HindIII限制性酶切位點修飾成EcoRI限制性酶切位點。為了完成這一修飾，500ng的該克隆的質粒DNA用HindIII酶切消化，根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化，然后加入1500ng的HindIII-EcoRI銜接子、1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃共沉淀30分鐘。12000g離心30分鐘后，用70％乙醇洗滌沉淀的DNA，干燥，溶解于8μl水中，65℃保持10分鐘，然后加入1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14C°連接16小時。65℃10分鐘滅活T4DNA連接酶之后，連接反應混合物經EcoRI酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后如上所述進行連接。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法提取所得克隆的質粒DNA，并分別進行HindIII和EcoRI限制性內切酶酶切分析。目的二分質粒僅含有編碼cat基因序列的后9個密碼子和一個EcoRI位點，被稱為pBIOC4。利用質粒pJIT163Δ可分離到由啟動子pd35S和終止子多聚A35S組成的表達盒。質粒pJIT163Δ衍生自pJIT163，而pJIT163本身衍生自pJlT60(Guerimeau和Mullineaux，1993)。質粒pJIT163在多接頭的HindIII和SaII位點之間有一個ATG密碼子。為了抑制該ATG并得到質粒pJIT163Δ，質粒pJIT163經HindIII和SalI的兩次酶切消化，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后根據使用說明進行Klenow酶(NewEnglandBiolabs)處理，經1體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和1體積氯仿∶異戊醇(24∶1)的抽提去蛋白，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，最后加入1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。為了分離到由啟動子pd35S和終止子多聚A35S組成的表達盒(SacI-XhoI片段)，克隆pJIT163Δ的質粒DNA經SacI和XhoI的酶切消化，帶有表達盒的SacI-XhoI片段經0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后根據使用說明進行綠豆芽核酸酶(NewEnglandBiolabs)處理。pBIOC4質粒用EcoR1酶切消化，經綠豆芽核酸酶(NewEnglandBiolabs)處理并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化，將上述純化的插入片段克隆于其中。在含2μll10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇和5UT4DNA連接酶(Amersham)的10μl體積中，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC21。狗的胃脂酶(DGL)天然地合成為前體形式。成熟的DGL由379個氨基酸組成。DGL的互補DNA克隆于表達載體pRU303的BglII和SalI位點上，成為如國際申請W094/13816號中所述的載體pDGL5.303。pDGL5.303用于含PS-DGL的質粒pBIOC25和含PPS-DGL的質粒pBIOC26的構建，其中編碼成熟DGL的序列之前分別有植物來源的信號肽(PS)和前肽(PPS，即后跟N-末端液泡定位序列的信號肽)。PS和PPS序列分別由23和37個氨基酸組成，它們都來自甜馬鈴薯塊根的儲存蛋白sporaminA(Murakami等，1986；Matsukoa和Nakamura，1991)。為了簡單地融合成熟的DGL序列和導向信號序列，如PS或PPS，在成熟的DGL序列的第4和5號密碼子上引入一附加的HindIII位點來修飾質粒pDGL5.303，這一修飾應用兩個寡聚脫氧核苷酸通過PCR進行定點誘變，這兩個寡聚脫氧核苷酸為5’caggagatcTTGTTTGGAAAGCTTCATCCC3′(含有質粒的單一BglII位點并產生附加的HindIII位點)和5′CATATTCCTCAGCTGGGTATC3′(含有質粒的單一PvuII位點)。在100μl的反應體系中應用PCR擴增BglII-PvuII片段，這一體系中含有10μl10×TaqDNA聚合酶緩沖液(500mgKCL，100mMTris-HCl，pH9.0，1％Triton×100)、6μl25mMMgCl2，3μl10mMdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，上述兩個寡聚脫氧核苷酸各100pM，5ngDNA(含有DGL互補DNA的表達載體pRU303)，2.5UTaqDNA聚合酶(Promega)和2滴凡士林油。DNA在94℃變性5分鐘，然后進行30個循環，每一循環94℃變性5分鐘，50℃雜交1分鐘，72℃延伸1分鐘，然后72℃延伸5分鐘。該PCR反應在PERKINELMERCETUS的″DNA熱循環″儀上進行。氯仿抽提去除油。隨后沉淀含在反應體系中的DNA片段加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，用2種限制酶BglII和PvuII酶切消化。PCR產生的并消化過的DNA經2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到載體pDGL5.303的質粒DNA上。載體pDGL5.303經BglII和PvuII的兩次酶切消化，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化載體和PCR產生的并消化過的DNA片段進行連接，10μl反應體系如上述含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hahahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法對部分克隆的質粒DNA進行測序加以驗證。這一HindIII位點的引入沒有影響DGL的遺傳編碼。實際上，天然DGL序列AAATTA(Lys-Leu)變成了AAGCTT(Lys-Leu)。所得質粒稱為pBIOC22，其含有成熟DGL蛋白的序列LEUPHEGLYLYSLEU------THRASPASNLYSAMBagatcTTGTTTGGAAAGCTT------ACAGATAATAAGTAGTTCTAGA----------------BglIIHindIIIXbaI單一限制位點單一限制位點LEU成熟DGL的第一個密碼子，AMB終止密碼子a..含有PS-DGL的二分質粒pBIOC25的構建質粒pBIOC22用BglII完全酶切和HindIII部分酶切，以去除編碼成熟DGL蛋白中的多肽Leu-Phe-Gly-Lys(前4個氨基酸)的序列。這一序列由編碼含23個氨基酸的信號肽PS的序列(ATGAAAGCCTTCACACTCGCTCTCTTCTTAGCTCTTTCCCTCTATCTCCTGCCCAATCCAGCCCATTCC)所取代，并與編碼成熟DGL蛋白的序列的頭4個密碼子相融合(″PS-成熟DGL的頭4密碼子″)。根據第I節中所述的PCR擴增的操作方法，應用下列2個寡聚脫氧核苷酸5′caggagatctgATGAAAGCCTTCACACTCGC3′和5′GATGAAGCTTTCCAAACAAGGAATGGGCTGGATTGGGCAGG3′，利用質粒pMAT103(Matsuoka和Nakamura，1991)，PCR擴增序列″PS-成熟DGL的頭4密碼子″。經BglII和HindIII的雙酶切后，PCR擴增得到的DNA片段進行2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pBIOC22質粒DNA上。載體pBIOC22經BglII和HindIII雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化載體和PCR產生的并消化過的DNA片段進行連接，10μl反應體系如上述含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法對部分克隆的質粒DNA進行測序加以驗證。成熟的DGL和PS的序列被克隆，并保持了其開放讀碼框架。PS和成熟DGL之間的剪接序列為Ser-Leu。該質粒稱為pBIOC23。經BglII和XbaI雙酶切從pBIOC23上將帶有PS-DGL序列的BglII-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀和干燥。然后根據使用說明進行Klenow酶(NewEnglandBiolabs)處理該DNA片段并連接到質粒pBIOC21的DNA上，pBIOC21質粒DNA在HindIII位點酶切消化，經Klenow酶處理并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng帶有PS-DGL的片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC25。應用Pharmacia的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法對編碼重組蛋白PS-DGL的片段的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等的方法，二分載體pBIOC25的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。b.含PPS-DGL的二分質粒的構建質粒pBIOC22用BglII完全酶切和HindIII部分酶切，以去除編碼成熟DGL蛋白中的多肽Leu-Phe-Gly-Lys(前4個氨基酸)的序列。這一序列由編碼含37個氨基酸的信號肽PPS的序列(ATGAAAGCCTTCACACTCGCTCTCTTCTTAGCTCTTTCCCTCTATCTCCTGCCCAATCCAGCCCATTCCAGGTTCAATCCCATCCGCCTCCCCACCACACACGAACCCGCC)所取代，并與編碼成熟DGL蛋白的序列的頭4個密碼子相融合(″PPS-成熟DGL的頭4密碼子″)。根據第1節中所述的PCR擴增的操作方法，應用下列2個寡聚脫氧核苷酸5′caggagatctgATGAAAGCCTTCACACTCGC3′和5′GATGAAGCTTTCCAAACAAGGCGGGTTCGTGTGTGGTTG3′，利用質粒pMAT103(Matsuoka和Nakamura，1991)，PCR擴增序列″PPS-成熟DGL的頭4密碼子″。經BglII和HindIII的雙酶切后，PCR擴增得到的DNA片段進行2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pBIOC22質粒DNA上。載體pBIOC22經BglII和HindIII雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化載體和50ngPCR產生的并消化過的DNA片段進行連接，10μl反應體系如上述含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆的質粒DNA進行測序加以驗證。成熟的DGL和PPS的序列被克隆，并保持了其開放讀碼框架。PPS和成熟DGL之間的剪接序列為Ala-Leu。該質粒稱為pBIOC24。經BglII和XbaI雙酶切從pBIOC24上將帶有PPS-DGL序列的BglII-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀和干燥。然后根據使用說明進行Klenow酶(NewEnglandBiolabs)處理該DNA片段并連接到質粒pBIOC21的DNA上，pBIOC21質粒DNA在HindIII位點酶切消化，經Klenow酶處理并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng帶有PS-DGL的片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。該質粒稱為pBIOC26。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法對編碼重組蛋白PPS-DGL的片段的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等的方法，二分載體pBIOC25的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。c.含RGLSP-DGL的二分質粒的構建兔胃脂酶合成為前體形式，該前體含有位于NH2末端及成熟脂酶多肽序列之前的22個氨基酸的信號肽。含有編碼兔胃脂酶的完整cDNA的克隆pJO101如歐洲專利申請92403055.4號中所述。該專利申請由″InstitutdeRechereheJouveinal″于12.11.92提出，名為″編碼兔胃脂酶和多肽衍生物的核酸，其生產這些多肽的應用和藥物組合物″。比較狗胃脂酶和兔胃脂酶前體的多肽序列，發現兩種蛋白都存在LFGK序列。根據純化的天然蛋白(Moreau等，1988)發現在兔脂酶的多肽序列中，前三個殘基L、F和G不存在，它們構成了22個氨基酸的RGL信號肽的一部分。結果，無這三個共有氨基酸的兔胃脂酶信號肽融合到成熟的狗胃脂酶的蛋白序列。其多肽序列由以下19個氨基酸組成MWVLFMVAALLSALGTTHG。質粒pBIOC22用BglII完全酶切和HindIII部分酶切，以去除編碼成熟DGL蛋白中的多肽Leu-Phe-Gly-Lys(前4個氨基酸)的序列。這一序列由編碼19個氨基酸的兔胃脂酶信號肽RGLSP的序列(ATGTGGGTGCTTTTCATGGTGGCAGCTTTGCTATCTGCACTTGGAACTACACATGGT)所取代，并與編碼成熟DGL蛋白的序列的頭4個密碼子相融合(″RGLSP-成熟DGL的頭4密碼子″)。根據第I節中所述的PCR擴增的操作方法，應用下列2個寡聚脫氧核苷酸5′aggagatctcaacaATGTGGGTGCTTTTCATGGTG3′和5′GATGAAGCTTTCCAAACAAACCATGTGTAGTTCCAAGTG3′，利用pJO101，PCR擴增序列″RGLSP-成熟DGL的頭4密碼子″。經BglII和HindIII的雙酶切后，PCR擴增得到的DNA片段進行2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pBIOC22質粒DNA上。載體pBIOC22經BglII和HindIII雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化載體和50ngPCR產生的并消化過的DNA片段進行連接，10μl反應體系如上述含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆的質粒DNA進行測序加以驗證。RGLSP和成熟的DGL的序列被克隆，并保持了其開放讀碼框架(就是說它們構成了單一的開放讀碼框架)。RGLSP和成熟DGL之間的剪接序列為Gly-Leu。該目的質粒稱為pBIOC40。經BglII和XbaI雙酶切從pBIOC40上將帶有RGLSP-DGL序列的BglII-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀和干燥。然后根據使用說明進行Klenow酶處理該DNA片段并連接到質粒pBIOC21的DNA上，pBIOC21質粒DNA在HindIII位點酶切消化，經Klenow酶處理并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng帶有RGLSP-DGL的片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。目的質粒稱為pBIOC41。應用Pharmacia的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對編碼重組蛋白RGLSP-DGL的片段的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等(1978)的方法，二分載體pBIOC41的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌LBA4404中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。I-B)編碼重組DGL并可在番茄中表達的嵌合基因的構建所用構建質粒與用于煙草的遺傳轉化相同，名為pBIOC25、pBIOC26和pBIOC41。II.編碼重組狗胃脂酶蛋白并可在油菜仔中表達的嵌合基因的構建a)含啟動子pCRU的二分質粒pBIOC28的構建在油菜仔中表達狗胃脂酶(DGL)要求將編碼DGL的cDNA插入到下列調控序列之間1.啟動子pCRU相當于種子的儲存蛋白基因如小蘿卜的cruciferinA的5端非編碼區，可在種子中特異性表達。2.雙鏈環狀DNA的轉錄終止序列，終止子多聚A35S，其對應于花椰菜花葉病毒序列的3’端非編碼區，該終止子可形成35S的轉錄本(Franck等，1980)。為了得到類似于pBIOC21但其啟動子pd35S由pCRU取代的二分質粒，應用pBI221衍生的質粒pBI221-CRURSP(Depigny-This等上市，1992)，分離含啟動子pCRU的″Klenow酶處理的EcoRI-BamHI″片段。通過用啟動子pCRU來取代35S，從pBI221(Clontech銷售)衍生出質粒pBI221-CRURSP。帶有啟動子pCRU的″Klenow處理過的EcoRI-BamHI″片段經0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并連接到pJIT163質粒DNA中。pJIT163質粒DNA首先經KpnI酶切，并根據使用說明進行T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)處理，然后用BamHI酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng″Klenow處理過的EcoR1-BamH1″片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC27。質粒pBIOC27經Xho1完全酶切和隨后的EcoR1部分酶切，可分離到由啟動子pCRU和終止子多聚A35S組成的表達盒。該片段經0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥，根據使用說明用Klenow酶(NewEnglandBiolabs)處理并連接到質粒pBIOC24DNA的EcoR1位點上，該酶切位點已根據使用說明用Klenow酶處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ngXhoI-EcoRI片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μll10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC28。b.含PPS-DGL的二分質粒pBIOC29的構建I-A-b中已描述了帶有PPS-DGL序列的BglII-XbaI片段的分離。該片段被連接到連接到質粒pBIOC28DNA的EcoRI位點上，該酶切位點已根據使用說明用Klenow酶處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ngBglII-XbaI片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hahahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC29。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對編碼重組蛋白PPS-DGL的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等(1978)的方法，二分載體pBIOC29的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌LBA4404中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。c)含pGEA1D啟動子的二分質粒pBIOC90和pBIOC91的構建編碼重組狗胃脂酶(DGL)的動物基因在油菜仔中表達需要下列調控序列1.啟動子pGEA1相當于種子的儲存蛋白基因Arabidopsisthaliana的GEA1的5′端非編碼區，可在種子中特異性表達。2.雙鏈環狀DNA的轉錄終止序列，終止子多聚A35S，其對應于花椰菜花葉病毒序列的3’端非編碼區，該終止子可形成35S的轉錄本(Franck等，1980)。為了得到類似于pBIOC21但其啟動子pd35S由pGEA1D取代的二分質粒pBIOC90，從質粒pGUS2-pGEA1中分離帶有啟動子pGEA1并經Klenow酶處理的HindIII-BamHI片段。通過啟動子pGEA1代替啟動子pd35S，從pBI221衍生得到克隆pGUS-2-pGEA1。該質粒含有2個ATGGEA1(Em2)基因的ATG和gus基因的ATG。應用兩個寡聚脫氧核苷酸5′CAAACGTGTACAATAGCCC3′和5′CCCGGGGATCCTTTTTTG3′，PCR擴增SalI位點和克隆pGUS-2-pGEA1中GEA1基因的ATG上游序列之間的DNA片段。調整雜交溫度。PCR擴增片段經SalI和BamHI酶切消化，2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pGUS-2-pGEA1質粒DNA上。載體pGUS-2-pGEA1經SalI和BamHI雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥。100ng載體和50ngPCR產生的并酶切過的DNA片段進行連接，10μl反應體系如上述含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆測序加以驗證。所得克隆稱為pGUS-2-pGEA1D。帶有來自pGUS-2-pGEA1D的啟動子pGEA1D的HindIII-BamHI片段，根據使用說明(Biolabs)用Klenow酶處理，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并連接到pBIOC21質粒DNA的KpnI和HindIII位點上，這些酶切位點已根據使用說明用T4DNA聚合酶(Biolabs)處理。20ng上述去磷酸化的載體和200ngXhoI-EcoRIDNA片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC90。為了得到二分質粒pBIOC91，來自pBSII-pGEA1D的表達盒″pGEA1D-tNOS″被導入到二分質粒pSCV1.2中，pSCV1.2可通過常規的克隆方法將帶有Fromm等(1986)所述的表達盒″p35S-nptII-tNOS″的HindIII片段克隆到EdwardsG.A.1990年構建的pSCV1的HindIII位點上。經兩個階段得到質粒pBSII-pGEA1D一方面，帶有根瘤土壤桿菌的tNOS(胭脂堿合成酶基因的終止子)的Sac1-EcoR1片段，根據使用說明用T4DNA聚合酶(Biolabs)處理并純化后，克隆至Stratagene銷售的pBSIISK+的EcoRV位點上，這一酶切位點已根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng去磷酸化的載體和200ng上述含tNOS的DNA片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆測序加以驗證。所得質粒稱為pBSII-tNOS。另一方面，帶有pGEA1D的片段經HindIII酶切后Klenow處理和BamHI酶切，純化，克隆到質粒pBSII-tNOS的″BamHI和Klenow處理的XbaI″位點上。100ng上述載體和50ng上述DNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。目的克隆稱為pBSII-pGEA1D。然后，含在Klenow處理的Xba1-HindIII片段中的″pGEA1D-tNOS″表達盒克隆至pSCV1.2的SmaI位點上，這一酶切位點已根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng去磷酸化的載體和200ng帶有″pGEA1D-tNOS″表達盒的片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC91。d)含pGEA6D啟動子的二分質粒pBIOC92的構建編碼重組狗胃脂酶(DGL)的動物基因在油菜仔中表達需要下列調控序列1.啟動子pGEA6相當于種子的儲存蛋白基因Arabidopsisthaliana的GEA6的5′端非編碼區，可在種子中特異性表達。2.雙鏈環狀DNA的轉錄終止序列，終止子多聚A35S，其對應于花椰菜花葉病毒序列的3’端非編碼區，該終止子可形成35S的轉錄本(Franck等，1980)。為了得到類似于pBIOC21但其啟動子pd35S由pGEA6D取代的二分質粒pBIOC92，從質粒pGUS2-pGEA6中分離帶有啟動子pGEA6D并經Klenow酶處理的EcoRI-BamHI片段。從pUC18衍生得到的克隆pGUS-2-pGEA6含有2個ATGGEA6(Em6)基因的ATG和gus基因的ATG。GEA6基因的ATG被破壞。應用兩個寡聚脫氧核苷酸5′AAGTACGGCCACTACCACG3′和5′CCCGGGGATCCTGGCTC3′，PCR擴增AccI位點和克隆pGUS-2-GEA6中GEA6基因的ATG上游序列之間的DNA片段。調整雜交溫度。PCR擴增片段經AccI和BamHI酶切消化，2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pGUS-2-GEA6質粒DNA上。載體pGUS-2-GEA6經Acc1和BamHI雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥。100ng上述載體和50ng上述PCR產生的并酶切過的DNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆測序加以驗證。所得克隆稱為pGUS-2-pGEA6D。帶有來自pGUS-1-pGEA6D的啟動子pGEA6D的EcoRI-BamHI片段，根據使用說明(Biolabs)用Klenow酶處理，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并連接到修飾過的pBIOC21質粒DNA的Klenow處理的Xho1位點上。質粒pBIOC21經HindIII酶切后Klenow處理和KpnI酶切，去掉含pd35S的片段并用含有pSBIISK+的KpnI-XhoI-SalI-ClaI-HindIII-BamHI-SmaI-EcoRI-EcoRV位點的多接頭的KpnI-EcoRV片段來代替，從而得到修飾的pBIOC21質粒。20ng去磷酸化的修飾過的pBIOC21和200ng上述EcoRI-BamHI片段進行連接。20μl反應體系含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所述質粒稱為pBIOC92。e)含RGLSP-DGL的二分質粒pBIOC93、pBIOC94、pBIOC95、pBIOC96和pBIOC97的構建質粒pBIOC40如上所述。該質粒含有帶有RGLSP-DGL序列的BglII-XbaI片段。經BglII和XbaI雙酶切分離到該片段，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，進行乙醇沉淀，干燥，Klenow酶處理并連接到經EcoRI酶切、Klenow處理和去磷酸化的pBIOC28(上述)中；或經EcoRI酶切、Klenow處理和去磷酸化的pBIOC90中；或經SmaI消化和去磷酸化的pBIOC91中；或經HindIII酶切、Klenow處理和去磷酸化的pBIOC92中，以分別得到pBIOC93、pBIOC94、pBIOC95和pBIOC96。帶有表達盒″pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S″的KpnI-EcoRI片段，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，進行乙醇沉淀，干燥并連接到經Sma1酶切和去磷酸化的pSCV1.2，得到質粒pBIOC97。表達盒″pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S″來自pBIOC92。III.編碼重組人胃脂酶蛋白并能組成性表達(如在煙草的葉和種子)的嵌合基因的構建a)含嵌合啟動子超級啟動子pSP的二分質粒pBIOC82的構建編碼重組人胃脂酶(HDL)的基因在煙草的葉中表達需要下列調控序列1.嵌合啟動子超級啟動子(pSP；PCT/US94/12946)。它是通過融合根瘤土壤桿菌的章魚堿合成酶基因的啟動子的三個轉錄激活元件和甘露氨酸合成酶啟動子及其一個轉錄激活元件而成；2.雙鏈環狀DNA的轉錄終止序列，終止子多聚A35S，其對應于花椰菜花葉病毒序列的3’端非編碼區，該終止子可形成35S的轉錄本(Franck等，1980)。為了得到類似于pBIOC21但其啟動子pd35S由pSP取代的二分質粒，從質粒pBISNI(PCT/US92/12946)中分離得到帶有啟動子pSP的pvuII-SalI片段，經Klenow酶處理，1％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并連接到pBIOC81質粒DNA。pBIOC81質粒已由KpnI和EcoRI雙酶切，并根據使用說明用T4DNA聚合酶處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。質粒pBIOC81相當于XbaI位點缺失的pBIOC21。為了得到pBIOC81，pBIOC81質粒經XbaI酶切，Klenow酶處理并由T4DNA連接酶連接。20ng上述去磷酸化的修飾過的載體和200ng上述帶有pSP的DNA片段進行連接。20μl反應體系含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。目的質粒稱為pBIOC82。如Bodmer等(1987)的文章中所述，人胃脂酶(HGL)天然合成為前體形式。成熟的HGL蛋白由379個氨基酸組成。其信號肽(HGLSP)由19個氨基酸組成。HGLSP和HGL之間的限制性位點為Gly-Leu。編碼HGL前體的序列被用于含HGLSP-HGL的pBIOC85、含HPLSP-HGL的pBIOC87和含RGLSP-HGL的pBIOC89二分質粒的構建，這些質粒中編碼HGL的序列分別跟隨于HGL天然信號肽、人的胰脂酶信號肽(HPLSP；Giller等，1992)和兔的胃脂酶信號肽(RGLSP；前文已作描述；歐洲專利92.403055.4號)的編碼序列之后。經PstI和DraI雙酶切分離得到編碼HGL前體的序列，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥。然后將該片段克隆至Stratagene銷售的pBSIISK+的PstI和SpeI位點(已根據使用說明用T4DNA聚合酶(Biolabs)處理)上。100ng載體和50ng上述帶有HGL前體編碼序列的DNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。目的克隆稱為pBIOC83。應用兩個寡聚脫氧核苷酸通過PCR進行定點誘變，在第9和10號密碼子上引入一先前不存在的BamHI位點，對編碼成熟HGL的序列加以修飾，這兩個寡聚脫氧核苷酸為5’aaactgcaggctcgagTTGTTTGGAAAATTACATCCTGGATCCCCTGAAGTGACTATG3′(含有單一PstI、XhoI和BamHI位點)和5′AATGGTGGTGCCCTGGGAATGGCCAACATAGTGTAGCTGC3′(含有質粒pBIOC83的單一MscI位點)。在100μl的反應體系中應用PCR擴增PstI-MscI片段，這一體系中含有10μl10×TaqDNA聚合酶緩沖液(500mMKCL，100mMTris-HCl，pH9.0，1％TritonX100)、6μl25mMMgCl2，3μl10mMdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，上述兩個寡聚脫氧核苷酸各100pM，5ng基質DNA(載體pBIOC83)，2.5UTaqDNA聚合酶(Promega)和2滴凡士林油。DNA在94℃變性5分鐘，然后進行30個循環，每一循環94℃變性1分鐘，65℃雜交1分鐘，72℃延伸1分鐘，然后72℃延伸5分鐘。該PCR反應在PERKINELMERCETUS的″DNA熱循環″儀上進行。氨仿抽提去除油。隨后沉淀含在反應體系中的DNA片段，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，用2種限制酶PstI和MscI酶切消化。PCR產生的并消化過的DNA經2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到載體pBIOC83的質粒DNA上。載體pBIOC83經BglII和PvuII的兩次酶切消化，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，進行乙醇沉淀，干燥。上述100ng載體和50ngPCR產生的并消化過的DNA片段進行連接，10μl反應體系如上述含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆測序加以驗證。BamHI位點的引入沒有影響HGL的遺傳編碼。實際上，天然HGL序列GGAGAC(Gly-Ser)變成了GGATCC(Gly-Ser)。所得質粒稱為pBIOC84。b)含HGLSP-HGL的二分質粒pBIOC85的構建經PstI和XbaI雙酶切從pBIOC83上將帶有HGLSP-HGL序列的PstI-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀和干燥。然后根據使用說明用T4DNA聚合酶(Biolabs)處理該DNA片段并連接到質粒pBIOC82的DNA上，pBIOC82質粒DNA經EcoRI位點酶切消化，并根據使用說明用Klenow酶(Biolabs)處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng上述帶有HGLSP-HGL的片段進行連接。20μl反應體系含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC85。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對編碼重組蛋白HGLSP-HGL的片段的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等的方法，雙載體pBIOC85的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌LBA4404中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。c)含HPLSP-HGL的二分質粒pBIOC86的構建質粒pBIOC84經PstI和BamHI的兩次酶切，以去除編碼信號肽HGLSP和成熟HGL蛋白的前8個氯基酸(Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)的序列。這一序列由編碼信號肽HPLSP的16個氨基酸的序列(ATGCTGCCACTTTGGACTCTTTCACTGCTGCTGGGAGCAGTAGCAGGA)所取代，并與編碼成熟HGL蛋白的序列的頭8個密碼子的序列相融合(″HPLSP-成熟HGL的頭8個密碼子″)。根據先前所述的PCR擴增的操作方法(見上文第I節)，應用兩個寡聚脫氧核苷酸5′aaactgcaggctcgagaacaATGC3′和5′CAGGggaTCCAGGATGTAATTTTCC3′，從基質5′aaactgcaggctcgagaacaATGCTGCCACTTTGGACTCTTTCACTGCTGCTGGGAGCAGTAGCAGGATTGTTTGGAAAATTACATCCTGGATCCCCTG3′中，PCR擴增序列″HPLSP-成熟HGL的頭8個密碼子″。調節雜交溫度。經PstI和BamHI的雙酶切后，PCR擴增得到的DNA片段進行2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pBIOC84質粒DNA上。載體pBIOC84已用PstI和BamHI雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng載體和50ngPCR產生的并酶切過的DNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆測序加以驗證。HPLSP和成熟的HGL的序列被克隆，并保持了其開放讀碼框架(就是說它們組成了唯一的開放讀碼框架)。HPLSP和成熟的HGL之間的剪接序列為Gly-Leu。該質粒稱為pBIOC86。經PstI和XbaI雙酶切從pBIOC86上將帶有HPLSP-HGL序列的PstI-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀和干燥。然后根據使用說明進行T4DNA聚合酶(Biolabs)處理該DNA片段并連接到質粒pBIOC82的DNA上，pBIOC82質粒DNA在EcoRI位點酶切消化，并根據使用說明用Klenow酶(Biolabs)處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng上述帶有HPLSP-HGL的DNA片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hahahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。該質粒稱為pBIOC87。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對編碼重組蛋白HPLSP-HGL的片段的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等(1978)的方法，雙載體pBIOC87的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌LBA4404中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。d)含RGLSP-HGL的二分質粒pBIOC89的構建質粒pBIOC84經PstI和BamHI的兩次酶切，以去除編碼信號肽HGLSP和成熟HGL蛋白的前8個氨基酸(Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)的序列。這一序列由編碼信號肽RGLSP的19個氨基酸的序列(ATGTGGGTGCTTTTCATGGTGGCAGCTTTGCTATCTGCACTTGGAACTACACATGGT)所取代，并與編碼成熟HGL蛋白的序列的前8個密碼子的序列相融合(″RGLSP-成熟HGL的頭8個密碼子″)。根據先前所述的PCR擴增的操作方法(見上文第I節)，應用兩個寡聚脫氧核苷酸5′aaactgcaggctcgagaacaATGTGG3′和5′AGGggaTCCAGGATGTAATTTTCC3′，從基質5′aaactgcaggctcgagaacaATGTGGGTGCTTTTCATGGTGGCAGCTTTGCTATCTGCACTTGGAACTACACATGGTTTGTTTGGAAAATTACATCCTGGATGGCCTG3′中，PCR擴增序列″RGLSP-成熟HGL的頭8個密碼子″。調節雜交溫度。經PstI和BamHI的雙酶切后，PCR擴增得到的DNA片段進行2％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.8)、2.5倍體積的無水乙醇，-80℃沉淀30分鐘，12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，然后連接到pBIOC84質粒DNA上。載體pBIOC84已用PstI和BamHI雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng載體和50ngPCR產生的并酶切過的DNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對部分克隆測序加以驗證。RGLSP和成熟的HGL的序列被克隆，并保持了其開放讀碼框架(就是說它們組成了唯一的開放讀碼框架)。RGLSP和成熟的HGL之間的剪接序列為Gly-Leu。該質粒稱為pBIOC88。經PstI和XbaI雙酶切從pBIOC88上將帶有RGLSP-HGL序列的PstI-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫(Sambrook等1989)，進行乙醇沉淀和干燥。然后根據使用說明進行T4DNA聚合酶(Biolabs)處理該DNA片段并連接到質粒pBIOC82的DNA上，pBIOC82質粒DNA在XbaI位點酶切消化，并根據使用說明用Klenow酶(Biolabs)處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的載體和200ng上述帶有RGLSP-HGL的DNA片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經12μg/ml四環素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。該質粒稱為pBIOC89。應用Pharmacia銷售的T7TM測序試劑盒，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，1977)對編碼重組蛋白RGLSP-HGL的片段的核苷酸序列進行測序加以驗證。按照Holsters等(1978)的方法，雙載體pBIOC89的質粒DNA可通過直接轉化導入到根瘤土壤桿菌LBA4404中。有效克隆經導入質粒DNA的酶切加以鑒定。IV.編碼重組狗胃脂酶蛋白并可在玉米種子中表達的嵌合基因的構建a)含RGLSP-DGL并能在玉米種子中組成性表達的質粒pBIOC98和pBIOC99的構建編碼重組狗胃脂酶(DGL)的動物基因在玉米種子中組成型表達需要下列調控序列1.兩種允許組成型表達的啟動子之一-其后帶有水稻肌動蛋白內含子的水稻肌動蛋白啟動子，如McElroy(1992)等所述位于質粒pAct1-F4中；-CaMV(花椰菜花葉病毒)的雙結構組成型啟動子35S(pd35S)，該序列為位于天然啟動子35S的TATA元件上游并能激活轉錄的序列的重復(Kay等，1987)。2.兩種終止子之一-雙鏈環狀DNA的轉錄終止序列，多聚A35S終止子，其對應于花椰菜花葉病毒序列的3’端非編碼區，該終止子可形成35S的轉錄本(Frank等，1987)。-轉錄終止序列，多聚ANOS終止子，其對應于根瘤土壤桿菌胭脂堿株的Ti質粒中胭脂堿合成酶基因的3’端非編碼區。通過將帶有RGLSP-DGL編碼序列的BgllI-XbaI片段克隆至pBSII-pAR-IAR-tNOS的″NcoI和SalI″位點，得到RGLSP-DGL編碼序列由pAR-IAR調控的質粒pBIOC98。經BglII和XbaI雙酶切從pBIOC88上將帶有RGLSP-DGL序列的BglII-XbaI片段切下來，0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，進行乙醇沉淀，干燥并根據使用說明用Klenow酶處理。pBSII-pAR-IAR-tNOS質粒經SalI和NcoI雙酶切，純化，根據使用說明用綠豆芽核酸酶(Biolabs)處理和牛小腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng去磷酸化的載體和200ng上述帶有RGLSP-DGL的DNA片段進行連接。20μl反應體系如上述含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得質粒稱為pBIOC98。將帶有來自pAct1-F4，相當于″gus基因編碼序列的pAR-IAR-起點″序列的SnaBI-KpnI片段，克隆到pBSIISK+的″KpnI和Klenow處理的Eco01091″位點上，得到質粒pBSII-pAR-IAR-tNOS。上述100ng載體和50ngDNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。將帶有來自Clontech銷售的pBI121的帶tNOS序列的SacI-EcoRI片段，克隆到Stratagene銷售的pBSIISK+的去磷酸化EcoRV位點上，得到質粒pBSII-tNOS。質粒pBI121經SacI和EcoRV雙酶切，2％瓊脂糖凝膠電泳純并用T4DNA聚合酶處理。上述20ng去磷酸化的載體和200ng帶有tNOS序列的DNA片段進行連接。20μl反應體系含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。將帶有來自上述pBIOC41、相當于″pd35S-RGLSP-DGL″序列的Kpn1-BamH1片段，克隆到pBSIISK+的″Kpn1和BamHI″位點上，得到RGLSP-DGL編碼序列由pd35S調控的質粒pBIOC99。上述100ng載體和50ngDNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。將帶有來自pJIT163的帶t35S序列的Sma1-EcoRV片段，克隆到Stratagene銷售的pBSIISK+中Klenow處理過的去磷酸化EcoRV位點上，得到質粒pBSII-t35S。質粒pJIT163經SmaI和EcoRV雙酶切，2％瓊脂糖凝膠電泳純并用T4DNA聚合酶處理。上述20ng去磷酸化的載體和200ng帶有t35S序列的DNA片段進行連接。20μl反應體系含有2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃進行連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。b)分別含RGLSP-DGL和RGLSP-DGL-KDEL并能在玉米種子的胚乳中表達的質粒pBIOC100和pBIOC101的構建編碼重組狗胃脂酶(DGL)的動物基因在玉米種子中表達需要下列調控序列1.如Reina等，1990所述的質粒pγ63中帶有的玉米(pγzeine)γ-zeine基因啟動子。在質粒pUC18的HindIII和EcoRI之間含有pBI221的″p35S-gus-tNOS”表達盒，由Clontech銷售，在其HindIII和XbaI位點上克隆pγzeine，可以得到質粒pγ63。該啟動子能在玉米種子的胚乳中表達。2.轉錄終止序列，多聚ANOS終止子，其對應于根瘤土壤桿菌胭脂堿株的Ti質粒中胭脂堿合成酶基因的3’端非編碼區。將來自pBIOC41(上述)的″Klenow酶處理的XbaI-BglII″片段，克隆到質粒Pγ63的″BamHI和T4DNA聚合酶處理的SscI″位點上，得到RGLSP-DGL編碼序列由pγzeine調控的質粒pBIOC100。上述100ng載體和50ngDNA片段進行連接，10μl反應體系含有1μl10×T4DNA連接酶緩沖液(Amersham)、2.5UT4DNA連接酶(Amersham)，14℃連接16小時。轉化預先制備的大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。經50μg/ml氨芐青霉素篩選，用堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的質粒DNA，并進行限制性內切酶酶切分析。所得克隆稱為pBIOC100。按照上述的方法，通過PCR擴增，由帶有四肽KDEL(可定位于內織網)編碼序列的NcoI-AflII片段取代pBIOC100的NcoI-AflII片段并位于終止密碼子之前，可得到質粒pBIOC101。PCR反應中所用的兩個寡聚脫氧核苷酸為5′AATCACTTGGACTTTATCTGGGCCATGGATGCC3′(單一NcoI位點)和5′ATTCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCGGGGAAATTCGACGCGTCTAGAACTATAGCTCATCCTTATTATCTGTTCCCATCATGG3′(該序列編碼KDEL并有單一AflII位點)。雜交溫度為70C°。克隆過程如上所述。V.轉基因油菜植物的制備實例春季油菜(BrassicanapuscvWESTAR或Limagrain種)的種子在15％的Dometos溶液中消毒40分鐘。無菌水清洗4次后，在直徑7cm高10cm的罐中，以每罐20粒種子種于裝有含30g/l蔗糖并經5g/l瓊脂膠固化的MurashigeandSkoog礦物質培養基(SigmaM5519)中。這些罐置于26℃、光照期為16小時/8小時、光照強度為80μEm-2S-1的培養室中。萌發5天后，無菌條件下切下子葉節1mm上方的每一葉柄，取下子葉。同時，含質粒pBIOC29(或pBIOC25)的根瘤土壤桿菌LBA4404株在加有10ml細菌培養基2YT(Sambrook等，1989)的50ml錐形瓶中，28℃預培養36小時，培養基中添加了可用于篩選使用菌株的抗生素。質粒pBIOC29(或pBIOC25)為在質粒pGAEZ中插入了編碼狗胃脂酶并融合到導向信號PPS(或PS)的序列，該序列由啟動子pCRU或(pd35S)調控。預培養物以1％的量接種到同樣條件制備的新鮮細菌培養基中。14小時后，將培養物3,000g離心15分鐘，菌體用等體積的液體發芽培養基懸浮，該懸浮液以5ml/皿的量分到5cm培養皿中。葉柄的切斷端在上述的準備好的土壤桿菌培養物內浸泡幾秒鐘，插入再生培養基幾毫米。再生培養基具備萌發培養基的基本成分，并按4mg/l加入了一種可促進新芽萌生的植物激素芐基-氨基嘌呤(BAP)。每一直徑9cm的培養皿(Greiner貨號664102)種入十棵外植體(帶葉柄的子葉)。在與萌發相同的環境條件下共培養2天后，取出外植體并植入含上述培養基的Phytatray箱(Sigma，貨號P1552)，培養基中添加了選擇劑45mg/l硫酸卡那霉素(Sigma，貨號K4000)和600mg/l的制菌劑1/6(重量比)的棒酸鉀鹽和5/6的阿莫西林鈉鹽(Augmentin，可注射)的混合物。連續取出外植體并植入新的上述培養基中，間隔為三周。在第二或第三次移植時出現綠芽，將其從外植體上分離，于含有無BAP的上述培養基的直徑5cm高10cm的透明罐中單獨生長。生長三周后，將轉化幼芽的莖切斷并移植到新的培養基罐中。3-4周后，胚根充分發育可以適應人工氣候室。棄去不是綠色或無根胚芽。將這些胚芽移植到內有水飽和土壤的(標準NFU4455140％棕泥、30％精選石南灌叢和30％砂)7cm邊的碗中。在人工氣候室中兩周(溫度21℃，光照時間16h/8h，相對濕度84％)后，將胚芽移植到直徑12cm、含添加了慢作用肥料(Osmocote，4g/l土壤)的相同土壤的罐中，隨后移植到室溫18℃的溫室(S2級)中，每天澆水兩次，每次2分鐘。當花出現時，將花置于袋中(Crispac，貨號SM570y300mm*700mm)，以避免交叉受精。豆英成熟后，收獲、干燥并碾碎。所獲得的種子用以生化活性分析。轉基因子代通過萌發于含有100-150mg/l(決定于基因型)的硫酸卡那霉素的培養基上加以選擇。除了在玻璃試管中進行萌發并且每管一粒種子之外，操作條件與上述相同。只有前三周內長出二級根的胚芽在進入溫室前能適應人工氣候室。VI.轉基因茄科植物的制備實例a)轉基因煙草植物的制備用于轉基因實驗的煙草植物(Nicotianatabacumvar.XanthiNC和PBD6)體外培養于Murashige和Skoog(1962)的基礎培養基，按Gamborg等(1968，Sigma參考號M0404)，在培養基中加入維生素、20g/l蔗糖和8g/l瓊脂(Merck)。培養基的pH用事先120℃20分鐘滅菌的碳酸鉀調整到5.8。煙草胚芽每三十天一次從植物節間切取并移植到MS20復合培養基。所有體外培養在下列條件的氣候控制室內進行-光照強度為30μE·m-2·S-1；光照期為16小時；-白天保溫在26℃，夜間24℃。使用的轉化技術來自Horsch等(1985)。含質粒pBIOC29或pBIOC26或pBIOC25的根瘤土壤桿菌LBA4404株在LB培養基(Sambrook等，1989)中28℃振蕩預培養48小時，培養基中添加了適當的抗生素(利福平和四環素)。預培養物50倍稀釋到同樣的培養基中，在同樣的條件下培養。過夜后，離心培養物(10分鐘，3,000g)，菌體用等體積的液體培養基MS30(30g/l蔗糖)懸浮，該懸浮液稀釋10倍。從上述培養的葉切下1cm的外植體。隨后它們在菌懸液中浸泡1小時，然后在濾紙上快速干燥并置于共培養培養基中(固體MS30)。兩天后，外植體被轉至培養皿中的再生培養基MS30中，該培養基含有選擇劑卡那霉素(200mg/l)，抑菌劑Augmentin(400mg/l)和胚芽生長所需激素(BAP，1mg/l和ANA，0.1mg/l)。生長兩周后，外植體再移植到同樣的培養基中。再過兩周后，胚芽移植到培養皿中的生長培養基上，該培養基為加入了卡那霉素和Augmentin的MS20培養基。15天后，移植半數的芽。生根約需20天，最后，胚芽可通過節間切取而克隆或置于溫室。b)轉基因番茄植物的制備番茄種子cv.UC82B在10％的Dometos溶液中消毒15分鐘并用無菌水清洗3次。最后一次為振蕩10分鐘。消毒的種子在培養基MSSV/2(Murashige和Skoog的基礎培養基(1962，Sigma貨號M6899/2)，并按Nitsch(ThomasPratt，1981)添加了維生素、30g/l蔗糖和8g/l瓊脂(Merck)，pH5.9)中于氣候控制室7到8天(光照強度為30μE·m-2·S-1，光照期為16小時/8小時，26℃)萌發。使用的轉化技術來自Fillatti等(1987)。含質粒pBIOC25或pBIOC26的根瘤土壤桿菌LBA4404株在LB培養基中28℃振蕩預培養24小時，培養基中添加了適當的抗生素(利福平和四環素)。預培養物50倍稀釋到同樣的培養基中，在同樣的條件下培養過夜。于600nm測量OD，離心土壤桿菌(10分鐘，3,000g)，菌體用等體積的液體培養基KMCS(如Fillatti等，1987的文章所述)懸浮，使得600nm的OD為0.8。在操作中所使用的技術改進如Fillatti等(1987)所述。除了KCMS培養基中添加了乙酰丁香酮(200nM)之外，外植體的預培養和共培養如Fillatti等(1987)所述進行。2Z清洗培養基的區別在于添加了500mg/l氨噻肟頭孢霉素，以代替羧芐青霉素。所用的生長培養基為按Nitsch(ThomasPratt，1981)添加了維生素、20g/l蔗糖、50mg/l卡那霉素、200mg/laugmentin、1mg/lANA和0.5mg/l玉米素的Murashige和Skoog的基礎培養基(SigmaMS6899)。VII.轉基因玉米植物的制備a)作為遺傳轉化靶子的玉米愈傷組織的制備和應用不論應用哪種方法(電轉移；土壤桿菌；微管；基因槍)，玉米的遺傳轉化一般要求使用快速分裂的未分化的細胞，該細胞具有再生整個植物的能力。這類細胞包括玉米胚發生性愈傷組織(稱II型)。根椐Armstrong所述的方法和培養基(MalzeHandbook；(1994)M.Freeling，V.WalbotEds.；pp.625-671)，從未成熟的基因型H1II或(A188XB73)的胚獲得愈傷組織。用這種方法獲得的愈傷組織通過在初始培養基上每15天一次的連續種植進行增殖和保存。根據Vain等所述的方法(植物細胞組織和器官培養(1989)，18143-151)，通過調節細胞的激素和滲透平衡，從這些愈傷組織中再生小植物。然后，將這些植物適應溫室，它們可進行雜交和自受精。b)應用基因槍進行玉米的道傳轉化上一段描述了轉化所必須的細胞系的制備和再生；這里所描述的遺傳轉化方法將導致修飾基因穩定地整合在植物的基因組中。這種方法需應用與J.Finer(植物細胞報道(1992)11323-328)所述相同的基因槍；靶細胞為段落1中所述的愈傷組織碎片。在轟擊前4小時，將這些表面積為10-20mm2的碎片放在培養皿的中央，每個培養皿16個。培養皿中所含的培養基與初始培養基相同，其中添加了0.2M甘露醇和0.2M山梨醇。按操作說明，將帶有待導入基因的質粒進行Qiagen柱純化。然后按Klein所述的方法(自然(1987)32770-73)沉淀在鎢粒(M10)上。根據J.Finier(植物細胞報道(1992)11323-328)所述的方法，用基因槍將包被的顆粒射入靶細胞。裝有如此轟擊過的愈傷組織的平皿用Scellofrais封口，然后在27℃黑暗培養。24小時后第一次傳代，每15天一次傳3個月，培養基與初始培養基相同，其中添加了選擇劑，選擇劑的類型和濃度根椐所用基因而不同(見段落3)。可用的選擇劑一般為某些除草劑(Basta，Roundup)或抗生素(潮霉素，卡那霉素)的活性組分。三個月后或早一些，可得到生長未被選擇劑抑制的愈傷組織，通常該愈傷組織的大部分細胞是由一個將一個或多個拷貝的篩選基因整合到其基因中的細胞分裂而來。這種愈傷組織的收率約為每個轟擊平皿0.8個。這些愈傷組織被鑒定，獨立化，擴增然后培養，以再生小植物(參見段落a)。為了避免非轉化細胞的影響，所有的操作都在含選擇劑的培養基中進行。這些再生植物適應后并培養于溫室，它們可進行雜交和自受精。VIII.轉基因煙草植物中狗胃脂酶表達的分析a)方法從溫室煙草植物上摘取煙草葉提取脂酶的方法如下取1克(鮮重)煙草葉于液氮中研碎，4℃加入5mlpH7.5的含1mMEDTA及10mM巰基乙醇的25mMTris-HCI緩沖液(緩沖液A)，或pH3的含1mMEDTA10mMβ-巰基乙醇、0.2％TritonX-100及250mMNaCl的25mM甘氨酸-HCl緩沖液(緩沖液B)。全部的粉狀物立即10000g，4℃離心15分鐘。用緩沖液B提取煙草種子，每4ml緩沖液加0.1克煙草種子。在pH穩定劑存在的情況下，以丁酸甘油酯為底物，采用Gargouri等(1986)的滴定法測定脂酶活性。丁酸甘油酯乳劑(每30ml乳劑中加入4ml)是在膽鹽(1.04g/L)、牛白蛋白(0.1g/L)及NaCl(9g/L)中于振蕩器上制備的。分析是指當pH5.5和37℃時，用碳酸鈉溶液中和脂酶作用下所釋放的丁酸。1單位脂酶相當于在最佳pH值(5.5)和37C°時，作用1分鐘可釋放1mmol脂肪酸的酶量。天然(純化的)狗胃脂酶的比活性為570U/mg蛋白。全部粉沫、沉淀或離心上清的脂酶活性都可進行測定。離心上清(緩沖液A)中總可溶性蛋白的分析采用Bradford法(1976)。用兩批天然抗DGL多克隆抗體，對離心上清進行夾層ELISA實驗(Carrière等，1993)。第一批為與人胃脂酶反應的抗體，該抗體為總抗血清經連接有人胃脂酶的Affigel10柱(Aoubala等，(1993))親和純化的。這些抗體以1μg/ml的濃度用于包被ELISA板的孔。第二批抗體為不識別人脂酶的抗體。這些抗體依次進行瓊脂糖柱純化、結合蛋白A及結合生物素。固定后的抗體通過間接鏈抗生物素蛋白/過氧化物酶偶聯法檢測，其酶活性用底物鄰苯二胺來確定。得到的結果為定性值，結果采用+、-符號記錄。在提取緩沖液中加入CHAPS型去污劑(3-(3-膽酰胺丙)二甲基-銨基-1-丙烷磺酸鹽)(SIGMA)可提高提取產量。實際上，在這一條件下，上清中的提取產量可提高100％(參見表1)。表11％CHAPS存在下4株pBIOC25遺傳轉化而來的煙草植物的提取物中脂酶活性(U/g鮮重)</tables>b)利用植物信號肽的表達；對pBIOC25及pBIOC26轉化的煙草葉和種子分析；ELISA檢測表2所示為Xanthi基因型(15-20葉期)98株T0植物得到的結果。分析樣品均為離心前的葉或種子的粉末。每種類型的酶活性依轉化子的不同有很大差異。約20％的植物無酶活性或活性過低而無法檢測。平均活性和最大活性見表2。三種類型的蛋白總量是相似的，葉子中平均為7和8mg/g鮮重，種子中平均為34、31和38mg/g鮮重。pBIOC26轉化的葉子的平均脂酶活性為34U/g鮮重，即總蛋白中有0.8％的表達。種子的平均酶活性為36U/g，即0.2％表達。活性最高的轉化子其活性分別為146U/g鮮重(葉，2.5％表達)及148U/g鮮重(種子，0.7％表達)。對pBIOC25轉化植物的酶活性分析與此類似。葉中的平均活性為34U/g鮮重(0.8％表達)，最大活性為134U/g鮮重(總蛋白的3％)。種子中的平均活性為42U/g鮮重(0.3％)，最大活性為159U/g鮮重(1％)。pBIOC29轉化的植物中，葉內未檢測到酶活性(種子特異性啟動子)。種子內平均酶活性為12U/g鮮重(0.1％表達)，最大酶活性為137U/g鮮重(0.7％)。一般來說，同一轉化中的葉和種子的表達是平行的。ELISA檢測的結果也與酶活性分析是一致的，即具有酶活性的植物在ELISA檢測中為陽性。對于這些同樣的植物，隨后所得到的結果顯示脂酶的活性在植物的生長過程中可發生變化。確實，就總蛋白而言，有表達的植物12-15葉期時表達3％，此后的分析(有花的成熟植物)顯示6％表達。表2XANTHI煙草葉及種子的脂酶表達鮮重新鮮重量；最低轉化物中表達的最低值；最高轉化物中表達的最高值；n，所分析的轉化物數量b)利用RGL信號肽的表達；煙草葉脂酶活性分析。44株Xanthi及pBD6基因型T0植物的分析結果如下所有分析均使用離心前的葉混合粉末。酶活性分析顯示不同轉化體間差異很大。約20％植無活性或活性過低無法檢出。對于pBIOC41轉化的葉的平均脂酶活性，Xanthi基因型為38U/g鮮重，pBD6型為48U/g鮮重。最大活性分別為152及226U/g鮮重。IX.轉基因蕃茄植物中狗胃脂酶表達的分析a)方法除將1g新鮮樣品浸于4ml緩沖液B中之外，由番茄的葉和果實中提取脂酶的方法與煙草葉所述的相同。脂酶活性的測定按煙草葉所述。b)番茄果實的分析對三十個原代轉化物的果實進行了分析。相同的轉化物不同果實所分析的脂酶的活性是不同的。成熟果實平均為5U/g鮮重，不成熟的果實為35U/g鮮重，而與試驗的構建物類型無關(pBIOC25或pBIOC26)。應該指出的是，在果實成熟的過程中，活性下降。例如，對于給定的原代轉化物，直徑10cm的綠色果實其脂酶的活性為132U/g鮮重，直徑33mm的紅綠色果實為44U/g鮮重，直徑45mm的紅色果實為36U/g鮮重。X.″WESTERN″型重組DGL的免疫檢測a)轉基因煙草和油菜的葉和種子所表達的DGLa.1)用植物信號肽表達；pBIOC25、pBIOC26和pBIOC29轉化的煙草和油菜的葉和種子的免疫檢測對煙草和油菜的葉和種子用緩沖液A和B提取(提取方法見上文)的蛋白，進行狗胃脂酶的″Western′型的免疫檢測實驗(″蛋白印跡法″)(Renart和Sandoval，1984)。為了進行這些實驗，首先按照LaemmliU.K.(1970)的技術，將提取的蛋白(每個樣本30μg總蛋白)于12.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠中分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上。由幾內亞豬得到的抗狗胃脂酶的多克隆抗體作為探針，利用堿性磷酸酶標記的抗幾內亞豬的IgG抗體進行檢測。對照蛋白為天然狗胃脂酶(LC.圖6)，該蛋白以單一條帶的形式遷移至表觀分子量約50kDa處。狗胃脂酶在非轉化的煙草葉提取物中的遷移速度稍慢(圖6，LC+T)。非轉化的煙草和油菜的葉和種子的蛋白提取物沒有檢測到條帶。煙草葉所產生的脂酶為兩條帶。量最大的條帶具有約37kDa的表觀分子量，與上述的多肽(Δ54)相一致。量小的條帶具有約49kDa的表觀分子量，與上述的多肽(Δ4)相一致(圖6，F)。在種子的蛋白提取物中，只能看到低分子量的條帶(圖6，GT和GC)。a.2)用RGL的信號肽表達；pBIOC41轉化的煙草葉和種子的免疫檢測對煙草葉和種子用緩沖液B提取(提取方法見上文)的蛋白，進行蛋白印跡(Renart和Sandoval，1984)。首先按照LaemmliU.K.(1970)的技術，將提取的蛋白于12.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上。由幾內亞豬得到的抗狗胃脂酶的多克隆抗體作為探針，利用堿性磷酸酶標記的抗幾內亞豬的IgG抗體進行檢測。圖7所示為一個煙草葉的蛋白印跡實例。對照蛋白為天然狗胃脂酶(LC.圖6)，該蛋白以單一條帶的形式遷移至表觀分子量約50kDa處。非轉化的煙草葉的蛋白提取物無檢測條帶(T)。葉子提取物中所得的脂酶為具有約48-49kDa的表觀分子量的主帶，與上述的多肽(D4)相一致。在pBIOC41轉化的煙草種子中，重組脂酶與葉子的形式相同。b)轉化煙草葉蛋白提取物中的DGL去糖基化實驗用于去糖基化實驗的蛋白的提取方法如下0.5g葉子(鮮重)在液氮中磨碎，然后加入1ml變性緩沖液(100mM磷酸緩沖液，pH7.5，加入1％β-巰基乙醇，25mMEDTA和1％SDS)，置于4℃。磨碎的樣品10000g、4℃離心15分鐘。上清液100℃孵育5分鐘，以變性蛋白，接著10000g離心2分鐘。然后上清液用去糖基化緩沖液(100mM磷酸緩沖液，pH7.5，加入1％β-巰基乙醇，25mMEDTA，1％SDS和1％辛基葡糖苷)稀釋10倍。以每100μl上清液1U的量加酶(N-糖苷酶F，PNGaseBoehringer)。每份樣品設置一無酶對照。對照蛋白(狗或兔的胃脂酶)的去糖基化反應在同樣的條件下進行。各種蛋白樣品室溫下孵育8小時。然后如上段所示，將這些蛋白經聚丙烯酰胺膠電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。根據″蛋白印跡″的結果所示，作為對照的胃脂酶的表觀分子量約為50kDa。去糖基化以后其表觀分子量僅約為43kDa。煙草葉所形成的脂酶，除了沒有PNGase外，在上述的條件下孵育后，出現表觀分子量為49(多肽(Δ4))，37(多肽(Δ54))和28kDa的三條帶。分子量為28kDa的條帶無疑是室溫孵育8小時過程中發生蛋白降解的結果。去糖基化反應之后，三條帶的分子量減少了約1-2kDa，這表明煙草葉所形成的蛋白被糖基化。c)轉基因番茄的葉和果實中表達的DGL對番茄的葉和果實用緩沖液B提取(提取方法見上文)的蛋白，進行狗胃脂酶的″Western″型的免疫檢測實驗。為了進行這些實驗，如段落X.a)所示，將提取的蛋白(葉和果實分別為15μg和6μg可溶性總蛋白)于變性聚丙烯酰胺膠中分離。對照蛋白為天然狗胃脂酶(泳道4，圖8)，該蛋白以單一條帶的形式遷移至表觀分子量約50kDa處。非轉化的番茄的葉和果實的蛋白提取物沒有檢測到條帶。番茄的葉和果實所產生的脂酶為兩條帶，無論使用哪種質粒(pBIOC25或pBIOC26)。量大的條帶具有約37kDa的表觀分子量，與上述的多肽(Δ54)相一致。量小的條帶具有約49kDa的表觀分子量，與上述的多肽(Δ4)相一致(圖8)。XI.植物中狗胃脂酶的純化a)煙草葉中DGL的純化煙草葉所產生的狗胃脂酶的活性采用滴定法測定，應用pH穩定劑(Mettler-Toledo-DL25)調節pH保持在5.5，溫度為37℃，以三丁酸甘油酯為底物1ml三丁酸甘油酯經渦旋振蕩器乳化至29ml0.15MNaCl的水溶液中。此分析為在劇烈機械振蕩以保持乳化狀態的同時，通過加入0.02的碳酸鈉中和脂酶作用下釋放的丁酸。一脂酶單位相當于在這些pH和溫度條件下，每分鐘釋放1毫摩爾脂肪酸。首次層析后，參照Gargouri等(1986)所示的分析方法，取1ml三丁酸甘油酯和29ml的0.15MNaCl，2mM牛璜脫氧膽酸和1.5μM牛血清白蛋白的溶液形成的乳劑0.5ml，作為分析樣本，來確定脂酶的活性。1克凍干的葉于4℃，在30mlpH5.2的20mM甘氨酸緩沖液中磨碎，溫和攪拌混合物15分鐘。浸泡過程中，加入1NHCL，以保持pH為2.5。浸泡物15000g離心5分鐘。加入1NNaOH調節上清液的pH到4。經MIRACLOTH(Calbiochem)過濾后，所有上清液以每分鐘1ml的流速上樣于10ml(直徑1.6cm)陽離子交換樹脂柱(S-瓊脂糖快流速樹脂Pharmacia)，柱子已用pH4.0的20mM乙酸鈉緩沖液和20mMNaCl平衡過。以2ml一份收集。上清液濾過后，用40ml平衡緩沖液洗柱，滯留在柱子上的蛋白按照下列方法洗脫-以20mM，pH4.0的乙酸鈉緩沖液中20mM至210mMNaCl的線性梯度在30分鐘的過程中洗脫第一組無脂酶活性的蛋白峰，取1ml分析樣本進行測定，-210mMNaCl穩定20分鐘-以20mM，pH4.0的乙酸鈉緩沖液中210mM至500mMNaCl的線性梯度在30分鐘的過程中洗脫第二組蛋白峰。用0.5ml分析樣本測出脂酶活性在第二梯度中離子強度為300-400mM時被洗脫。收集活性流份，用分子量限為30kDa的OMEGACELL濃縮室(Filtron技術公司)進行濃縮。在10mMTris-HCl，pH8緩沖液中透析濃縮物12小時，然后上樣于經10mMTris-HCl，pH8緩沖液平衡的陰離子交換樹脂柱(MonoQHR5/5，直徑0.5cm，高5cm-Pharmacia)。取0.5ml分析樣本測定脂酶活性。流速保持在每分鐘1ml，即壓力為2.0mPa。洗脫未滯留的組份之后，用10ml10mMTris-HCl，pH8緩沖液沖洗，于60分鐘內進行離子強度為0mM至400mMNaCl的線性梯度洗脫。具有脂酶活性的部分在100mM至200mM之間洗脫。收集活性部分，并用分子量限為30KDa的OMEGACELL濃縮器濃縮。濃縮物為純化的煙草葉提取的狗胃脂酶。按M.Bradford(1976)的方法，測定濃縮上清中蛋白的濃度，并根據O.H.Lowry(1951)的方法測定第一次離子交換層析后的溶液。按照U.K.Laemmli(1970)的技術，在純化過程的各階段進行變性聚丙烯酰胺膠(SDS-PAGE)電泳分析。聚丙烯酰胺膠電泳分離的蛋白，一方面用考馬斯亮藍染色，另一方面在20mMTris堿，150mM亮氨酸和20％乙醇中以每cm22.3mA電流經半干電轉移技術(TransblotSD，BIORAD)轉移到硝酸纖維素膜上。轉移到硝酸纖維素膜上的重組狗胃脂酶按下述方法進行免疫檢測-用來自幾內亞豬的狗胃脂酶多克隆抗體標記靶蛋白，抗體用加入5％脫脂奶粉和0.1％的Tween20的PBS緩沖液1/5000稀釋，室溫標記一小時。-用加入5％脫脂奶粉和0.1％的Tween20的PBS緩沖液水浴，連續浸膜三次，每次10分鐘。-用加入5％脫脂奶粉和0.1％的Tween20的PBS緩沖液1/2000稀釋的結合了過氧化物酶(Sigma)的抗-幾內亞豬抗體，室溫標記1小時。-用加入5％脫脂奶粉和0.1％的Tween20的PBS緩沖液水浴，連續浸膜三次，每次10分鐘。-在H2O2中，過氧化物酶作用于4-氯-1-萘酚(Sigma)，能產生長時間穩定的藍色，以此進行檢測。葉中產生的脂酶為約49(多肽(Δ4))kDa和37(多肽(Δ54))kDa的兩條帶。b)煙草葉中DGL的純化的另一方案參照Gargouri等(1986)所述的滴定法，應用pH穩定劑(Mettler-Toledo-DL25)測定煙草葉所產生的狗胃脂酶的活性。以三丁酸甘油酯為底物，對短鏈甘油三酯進行分析1ml三丁酸甘油酯乳化至29ml0.15MNaCl，2mM牛璜脫氧膽酸鈉(NaTDC)和1.5μM牛血清白蛋白(BSA)的水溶液中。調節pH保持在5.5，溫度為37℃。此分析為在劇烈機械振蕩以保持乳化狀態的同時，通過加入0.02N的碳酸鈉中和脂酶作用下釋放的丁酸。對長鏈甘油三酯進行的分析以30％純化的大豆油、1.2％純化的卵磷脂、1.67％無水甘油(IntralipidTM30％-PHARMACIAABStockholm，Sweden)的水相乳劑為底物。10ml該懸液被乳化到20ml的0.15MNaCl、30μMBSA和3.5mMCaCl2的水溶液中。調節pH保持在4.0，溫度為37℃。該分析為在劇烈機械振蕩以保持乳化狀態的同時，pH值從4躍升至9之后，通過加入0.2N的碳酸鈉中和脂酶作用下釋放的脂肪酸。一脂酶單位相當于在這些pH和溫度條件下，每分鐘釋放1毫摩爾脂肪酸。2克凍干的葉于4℃，在60mlpH3的0.2MNaCl中磨碎，溫和攪拌混合物15分鐘。浸泡過程中，加入1NHCL，以保持pH為3。浸泡物10000g離心10分鐘。加入1NNaOH調節上清液的pH到4。經MIRACLOTH(Calbiochem)和0.45μ的MILLIPORE過濾后，所有上清液以每分鐘8ml的流速(240cm/h)上樣于陽離子交換樹脂柱(RESOURCES6ml-Pharmacia-16mmi.d.x30mm)，柱子已用pH3的20mM乙酸鈉緩沖液和0.2MNaCl平衡過。未滯留的組份通過之后，用30倍柱體積的平衡緩沖液洗柱，滯留在柱子上的蛋白以7個柱體積的20mM(pH3)的乙酸鈉緩沖液中0.2M至0.5MNaCl的線性梯度洗脫。以4ml一份收集。用0.5ml分析樣本測出脂酶活性在離子強度為0.35MNaCl時被洗脫。收集活性部分，并用分子量限為30kDa的OMEGACELL濃縮器濃縮。按O.H.Lowry(1951)方法，測定濃縮上清中蛋白的濃度。顯示了聚丙烯酰胺膠和該膠轉移到硝酸纖維素膜并用抗狗胃脂酶抗體進行檢測的結果的一個實例(圖9和10)。通過在激活劑中過氧化物酶對魯米那(ECL蛋白印跡-AMERXHAMLIFESCIENCE)的作用進行檢測并記錄于光敏膠片上。-采用以下方法測定蛋白上的多糖殘基.將蛋白固定于硝酸纖維素膜上.用過碘酸處理.與堿性磷酸酶偶聯的鏈親和素進行特異性反應.用堿性磷酸酶(GLYCOTARCKOXFORDGLYLOSYSTEM)進行顯色反應。顯示了檢測多糖殘基的膜的一個實例(圖11)。經高效液相色譜確定組份的純度。色譜WATERS625LC二極管射線檢測器WATERS991柱VYDACC4洗脫條件緩沖液A89.9％H2O、10％乙氰、0.1％三氟乙酸緩沖液B100％乙氰純化表重組DGL*三丁酰甘油酯單位天然狗胃脂酶和重組狗胃脂酶(r-DGL)比活性的比較*參考Carrière等，(1991)歐洲生化雜志，202，75-83c)油菜籽中DGL的純化油菜籽產生的重組DGL的活性測定與葉提取物的方法相同。10克油菜籽在液氮中磨碎。粉狀物先浸于4℃的己烷中輕振脫脂12小時。傾析后，去除己烷。然后粉狀物兩次浸于4℃100ml己烷中輕振，每次1/2小時。傾析去除己烷。粉狀物于旋轉蒸發器上干燥(HEIDOLPH94200)。脫脂粉末儲存于-20℃。將脫脂粉末浸于4℃的pH3(1NHCl)0.2MNaCl溶液中30分鐘來提取DGL，每0.1g粉末加入2mlNaCl溶液。浸泡生成的產物10000g4C°離心10分鐘。棄去沉淀。上清含有菜籽提取物。菜籽提取物經含10mM乙酸鈉(pH4)、140mMNaCl、3mMKCl的緩沖液透析，然后通過免疫親和柱，該柱由結合有從幾內亞豬所得到的抗狗胃脂酶多克隆抗體的樹脂(hydrazideAvidgel-BIOPROBEINTERNATIONAL，Inc.)構成。樹脂和菜籽提取物在溫和振蕩下4℃結合30分鐘。然后浸泡在10倍柱體積的10mM乙酸鈉(pH4)、150mMNaCl、3mMKCl的緩沖液中。用5倍柱體積的0.2M甘氨酸(pH2.8)、150mMNaCl的緩沖液洗脫DGL。收集的部分為1倍的柱體積，并含有1/20(V/V)的1MTris(pH9)緩沖液。變性聚丙烯酰胺膠電泳分析顯示出一分子量為37kDa的蛋白(參見圖12)。XII.脂肪酸酯的合成用非轉化的油菜籽進行測定，提供的脂酶為-固定化酶制劑(lipozyme(NOVO))或游離形式(兔胃脂酶(J04002))，-或以狗胃脂酶基因轉化的煙草種子的形式(煙草T14-440.85％的表達)在旋轉臺(250rpm)上的密閉瓶塞玻璃瓶中，37℃進行酯化反應12小時。所用有機溶劑為己烷，脂肪酸在己烷中是可溶的。據菜籽中三酰甘油酯的理論含量加入計量的甲醇。油菜中脂肪酸的主要成分為油酸，所選擇的參照也為油酸的甲基酯。合成反應用薄層層析(TLC)來檢測。展開劑為己烷、乙醚和水(70∶10∶1)的混合物。將溶于乙醇的5％硫酸溶液噴于層析板后，加熱進行檢測。第一項實驗中，27μl甲醇(0.66mmol)和0.02g脂酶(lipozyme)加入到0.2g菜籽油(0.22mmol)中與油酸甲酯參照的水平相比，無點出現(圖13，第2欄)。第二項實驗中，菜籽油被0.5g干的油菜籽粉末代替，加入1ml己烷合成了甲基酯(圖13，欄5)。在下列實驗中，經下列修改后重復上述條件脂酶(lipozyme)的量減少到0.006g而且脂酶(lipozyme)換成兔胃脂酶(0.007g的JO4002)。有脂酶(lipozyme)存在時，油酸甲酯才被合成，而JO4002存在則無合成(圖14，欄2)。最后，在最后的實驗中，脂酶由轉化的煙草種子所提供(1g煙草種子)。出現一甲酯特定的點(圖15，欄3)。總之，上述結果證實了，如果將油菜籽提取物、醇和轉基因煙草所產生的狗胃脂酶混合，可產生導致用作生物燃料的甲酯合成的酯化反應。圖表注釋-圖1編碼DGL的cDNA核苷酸序列，-圖2DGL的氨基酸序列，-圖3由編碼DGL的cDNA核苷酸序列所衍生的、編碼圖2所示的DGL的核苷酸序列，圖4編碼HGL的cDNA核苷酸序列和HGL的氨基酸序列，圖5HGL的氨基酸序列-圖6pBIOC26、pBIOC25和pBIOC29轉化的Xanthi煙草葉和種子及油菜籽所產生的重組多肽的免疫檢測；E，分子量范圍；LC，狗胃脂酶；F，煙草葉；GT，pBIOC25轉化的煙草種子；GC，pBIOC29轉化的油菜籽；T，非轉化的煙草葉，-圖7pBIOC25和pBIOC41轉化的煙草葉所產生的重組多肽的免疫檢測；E，分子量范圍；LC，狗胃脂酶；1和3，pBIOC41轉化的煙草葉；2，pBIOC25轉化的煙草葉；T，非轉化的煙草葉，-圖8pBIOC25和pBIOC26轉化的番茄的葉和果實所產生的重組多肽的免疫檢測T1非轉化的番茄果實1和3轉化的番茄果實2轉化的番茄的葉R分子量范圍LC狗胃脂酶T2非轉化的番茄的葉-圖9變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)1油菜籽提取物2煙草葉所產生的重組狗胃脂酶3天然狗胃脂酶4分子量范圍-圖10轉移到硝酸纖維素膜后進一步的免疫檢測分析1天然狗胃脂酶2煙草葉所產生的重組狗胃脂酶3油菜籽提取物-圖11從聚丙烯酰胺凝膠轉移到硝酸纖維素膜后的多糖殘基的檢測1油菜籽提取物2煙草葉所產生的重組狗胃脂酶3天然狗胃脂酶-圖12油菜籽產生的r-DGL的免疫純化物的SDS-PAGE分析1天然狗胃脂酶2重組狗胃脂酶3-6從免疫純化柱洗脫的非保留部分-圖13TLC板檢測；1菜籽油，無酶；2菜籽油+脂酶；3油酸甲酯；4油菜籽，無酶；5油菜籽+脂酶，-圖14TLC板檢測；1和4油菜籽，無酶；2菜籽油+J04002；3油酸甲酯；5油菜籽+脂酶，-圖15TLC板檢測；1單油酸甘油酯，二油酸甘油酯，三油酸甘油酯；2油酸甲酯；3油菜籽+轉化的煙草種子。參考文獻An等，植物生理學，81，301-305(1986)AnG.，植物生理學，81，86-91(1986)AoubalaM.，DanielC.，DeCaroA.，IvanovaM.G.，HirnM.，SardaL.和VergerR.，歐洲生化雜志，211，99-104(1993)Barta等，植物分子生物學，6，347-357(1986)BednarekS.Y.和RalkhelN.V.，植物細胞，3，1195-1206(1991)BergD.E.，BergC.M.，生物技術，1，417-435(1983)BernardC.，C.R.Acad.Sci.，28，249-253(1849)Be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snLeuTyrTyrSerProAspSerValGluPhe505560TrpAlaPheSerPheAspGluMetAlaLysTyrAspLeuProAlaThr65707580IleAspPheIleLeuLysLysThrGlyGlnAspLysLeuHisTyrVal859095GlyHisSerGlnGlyThrThrIleGlyPheIleAlaPheSerThrAsn100105110ProLysLeuAlaLysArgIleLysThrPheTyrAlaLeuAlaProVal115120125AlaThrValLysTyrThrGluThrLeuLeuAsnLysLeuMetLeuVal130135140ProSerPheLeuPheLysLeuIlePheGlyAsnLysIlePheTyrPro145150155160HisHisPhePheAspGlnPheLeuAlaThrGluValCysSerArgGlu165170175ThrValAspLeuLeuCysSerAsnAlaLeuPheIleIleCysGlyPhe180185190AspThrMetAsnLeuAsnMetSerArgLeuAspValTyrLeuSerHis195200205AsnProAlaGlyThrSerValGlnAsnValLeuHisTrpSerGlnAla210215220ValLysSerGlyLysPheGlnAlaPheAspTrpGlySerProValGln225230235240AsnMetMetHisTyrHisGlnSerMetProProTyrTyrAsnLeuThr245250255AspMetHisValProIleAlaValTrpAsnGlyGlyAsnAspLeuLeu260265270AlaAspProHisAspValAspLeuLeuLeuSerLysLeuProAsnLeu275280285IleTyrHisArgLysIleProProTyrAsnHisLeuAspPheIleTrp290295300AlaMetAspAlaProGlnAlaValTyrAsnGluIleValSerMetMet305310315320GlyThrAspAsnLys325(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度1198堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..1125(xi)序列描述SEQIDNO5CTTCATCCCACAAACCCTGAAGTGACCATGAATATAAGTCAGATGATC48LeuHisProThrAsnProGluValThrMetAsnIleSerGlnMetIle151015ACCTACTGGGGATACCCAGCTGAGGAATATGAAGTTGTGACCGAAGAC96ThrTyrTrpGlyTyrProAlaGluGluTyrGluValValThrGluAsp202530GGTTATATCCTTGGGATCGACAGAATTCCTTATGGGAGGAAAAATTCA144GlyTyrIleLeuGlyIleAspArgIleProTyrGlyArgLysAsnSer354045GAGAATATAGGCCGGAGACCTGTTGCATTTTTGCAACACGGTTTGCTC192GluAsnIleGlyArgArgProValAlaPheLeuGlnHisGlyLeuLeu505560GCATCAGCCACAAACTGGATCTCCAACCTGCCCAACAACAGCCTGGCC240AlaSerAlaThrAsnTrpIleSerAsnLeuProAsnAsnSerLeuAla65707580TTCATCCTGGCCGACGCCGGGTACGACGTGTGGCTGGGGAACAGCAGG288PheIleLeuAlaAspAlaGlyTyrAspValTrpLeuGlyAsnSerArg859095GGCAACACCTGGGCCAGGAGGAATCTGTACTACTCGCCCGACTCCGTC336GlyAsnThrTrpAlaArgArgAsnLeuTyrTyrSerProAspSerVal100105110GAATTCTGGGCTTTCAGCTTTGACGAGATGGCTAAATATGACCTTCCC384GluPheTrpAlaPheSerPheAspGluMetAlaLysTyrAspLeuPro115120125GCCACCATTGACTTCATCTTGAAGAAAACGGGACAGGACAAGCTACAC432AlaThrIleAspPheIleLeuLysLysThrGlyGlnAspLysLeuHis130135140TACGTTGGCCATTCCCAGGGCACCACCATTGGTTTCATCGCCTTTTCC480TyrValGlyHisSerGlnGlyThrThrIleGlyPheIleAlaPheSer145150155160ACCAATCCCAAGCTGGCGAAACGGATCAAAACCTTCTATGCATTAGCT528ThrAsnProLysLeuAlaLysArgIleLysThrPheTyrAlaLeuAla165170175CCCGTTGCCACCGTGAAGTACACCGAAACCCTGTTAAACAAACTCATG576ProValAlaThrValLysTyrThrGluThrLeuLeuAsnLysLeuMet180185190CTCGTCCCTTCGTTCCTCTTCAAGCTTATATTTGGAAACAAAATATTC624LeuValProSerPheLeuPheLysLeuIlePheGlyAsnLysIlePhe195200205TACCCACACCACTTCTTTGATCAATTTCTCGCCACCGAGGTATGCTCC672TyrProHisHisPhePheAspGlnPheLeuAlaThrGluValCysSer210215220CGCGAGACGGTGGATCTCCTCTGCAGCAACGCCCTGTTTATCATTTGT720ArgGluThrValAspLeuLeuCysSerAsnAlaLeuPheIleIleCys225230235240GGATTTGACACTATGAACTTGAACATGAGTCGCTTGGATGTGTATCTG768GlyPheAspThrMetAsnLeuAsnMetSerArgLeuAspValTyrLeu245250255TCACATAATCCAGCAGGAACATCGGTTCAGAACGTGCTCCACTGGTCC816SerHisAsnProAlaGlyThrSerValGlnAsnValLeuHisTrpSer260265270CAGGCTGTTAAGTCTGGGAAGTTCCAAGCTTTTGACTGGGGAAGCCCA864GlnAlaValLysSerGlyLysPheGlnAlaPheAspTrpGlySerPro275280285GTTCAGAACATGATGCACTATCATCAGAGCATGCCTCCCTACTACAAC912ValGlnAsnMetMetHisTyrHisGlnSerMetProProTyrTyrAsn290295300CTGACAGACATGCATGTGCCAATCGCAGTGTGGAACGGTGGCAACGAC960LeuThrAspMetHisValProIleAlaValTrpAsnGlyGlyAsnAsp305310315320TTGCTGGCCGACCCTCACGATGTTGACCTTTTGCTTTCCAAGCTCCCC1008LeuLeuAlaAspProHisAspValAspLeuLeuLeuSerLysLeuPro325330335AATCTCATTTACCACAGGAAGATTCCTCCTTACAATCACTTGGACTTT1056AsnLeuIleTyrHisArgLysIleProProTyrAsnHisLeuAspPhe340345350ATCTGGGCCATGGATGCCCCTCAAGCGGTTTACAATGAAATTGTTTCC1104IleTrpAlaMetAspAlaProGlnAlaValTyrAsnGluIleValSer355360365ATGATGGGAACAGATAATAAGTAGTTCTAGATTTAAGGAATTATTCTTTTA1155MetMetGlyThrAspAsnLys370375TTGTTCCAAAATACGTTCTTCTCTCACACGTGGTTTTCTATCA1198(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度375氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO6LeuHisProThrAsnProGluValThrMetAsnIleSerGlnMetIle151015ThrTyrTrpGlyTyrProAlaGluGluTyrGluValValThrGluAsp202530GlyTyrIleLeuGlyIleAspArgIleProTyrGlyArgLysAsnSer354045GluAsnIleGlyArgArgProValAlaPheLeuGlnHisGlyLeuLeu505560AlaSerAlaThrAsnTrpIleSerAsnLeuProAsnAsnSerLeuAla65707580PheIleLeuAlaAspAlaGlyTyrAspValTrpLeuGlyAsnSerArg859095GlyAsnThrTrpAlaArgArgAsnLeuTyrTyrSerProAspSerVal100105110GluPheTrpAlaPheSerPheAspGluMetAlaLysTyrAspLeuPro115120125AlaThrIleAspPheIleLeuLysLysThrGlyGlnAspLysLeuHis130135140TyrValGlyHisSerGlnGlyThrThrIleGlyPheIleAlaPheSer145150155160ThrAsnProLysLeuAlaLysArgIleLysThrPheTyrAlaLeuAla165170175ProValAlaThrValLysTyrThrGluThrLeuLeuAsnLysLeuMet180185190LeuValProSerPheLeuPheLysLeuIlePheGlyAsnLysIlePhe195200205TyrProHisHisPhePheAspGlnPheLeuAlaThrGluValCysSer210215220ArgGluThrValAspLeuLeuCysSerAsnAlaLeuPheIleIleCys225230235240GlyPheAspThrMetAsnLeuAsnMetSerArgLeuAspValTyrLeu245250255SerHisAsnProAlaGlyThrSerValGlnAsnValLeuHisTrpSer260265270GlnAlaValLysSerGlyLysPheGlnAlaPheAspTrpGlySerPro275280285ValGlnAsnMetMetHisTyrHisGlnSerMetProProTyrTyrAsn290295300LeuThrAspMetHisValProIleAlaValTrpAsnGlyGlyAsnAsp305310315320LeuLeuAlaAspProHisAspValAspLeuLeuLeuSerLysLeuPro325330335AsnLeuIleTyrHisArgLysIleProProTyrAsnHisLeuAspPhe340345350IleTrpAlaMetAspAlaProGlnAlaValTyrAsnGluIleValSer355360365MetMetGlyThrAspAsnLys37037權利要求1.一種重組核苷酸序列轉化植物細胞以從這些細胞或從這些細胞所獲植物中獲得活性酶形式的哺乳動物重組前十二指腸脂酶或一種(或多種)從后者衍生而來的如下定義的多肽的用途，所述重組核苷酸序列一方面含有編碼任何哺乳動物前十二指腸脂酶的cDNA，即其編碼核苷酸序列有至少約75％，特別是約77％-85％同源性，其氨基酸序列具有至少70％，特別是約80％-90％的同源性，且具有耐酸特性，在pH約1-5以下，特別是pH約1.5-2以下具有活性的脂酶，特別是編碼任何哺乳動物胃脂酶的cDNA，或編碼從上述前十二指腸脂酶經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的任何多肽的cDNA，該衍生多肽具有如上所述的前十二指腸脂酶的特征；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA編碼的前十二指腸脂酶、或產生如上所定義的衍生多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。2.根據權利要求1的一種重組核苷酸序列轉化植物細胞以從這些細胞或從這些細胞所獲得植物中獲得活性酶形式的重組DGL或一種(或多種)從后者衍生而來的如下定義的多肽的用途，所述重組核苷酸序列一方面含有編碼如圖2所示狗胃脂酶(DGL)的如圖1所示cDNA，或從該cDNA衍生的核苷酸序列，特別是經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)核苷酸而衍生，所述衍生序列能夠編碼一種氨基酸序列與圖2所示DGL的相同的多肽，或編碼從DGL經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA或上述衍生序列所編碼多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。3.根據權利要求1的一種重組核苷酸序列轉化植物細胞以從這些細胞或從這些細胞所獲得植物中獲得活性酶形式的重組HGL或一種(或多種)從后者衍生而來的如下定義的多肽的用途，所述重組核苷酸序列一方面含有編碼如圖5所示人胃脂酶(HGL)的如圖4所示cDNA，或從該cDNA衍生的核苷酸序列，特別是經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)核苷酸而衍生，所述衍生序列能夠編碼一種氨基酸序列與圖5所示HGL的相同的多肽，或編碼從HGL經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA或上述衍生序列所編碼多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。4.重組核苷酸序列，其特征為它一方面含有編碼如圖2所示狗胃脂酶(DGL)的如圖1所示cDNA，或從該cDNA衍生的核苷酸序列，特別是經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)核苷酸而衍生，所述衍生序列能夠編碼一種氨基酸序列與圖2所示DGL的相同的多肽，或編碼從DGL經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA或上述衍生序列所編碼多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。5.重組核苷酸序列，其特征為它一方面含有編碼如圖5所示人胃脂酶(HGL)的如圖4所示cDNA，或從該cDNA衍生的核苷酸序列，特別是經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)核苷酸而衍生，所述衍生序列能夠編碼一種氨基酸序列與圖5所示HGL的相同的多肽，或編碼從DGL經插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允許植物細胞產生所述cDNA或上述衍生序列所編碼多肽的元件，特別是被植物細胞轉錄機制所識別的轉錄啟動子和轉錄終止子。6.根據權利要求4或5的重組核苷酸序列，其特征為它含有-在所述cDNA或其衍生序列的下游，含花椰菜花葉病毒(CaMV)的多聚A35S終止子或土壤根瘤桿菌的多聚ANOS終止子。-在所述cDNA或其衍生序列上游，含CaMV的35S啟動子或雙結構35S啟動子(pd35S)或小蘿卜cruciferin基因pCRU啟動子或Arabidopsisthaliana的pGEA1或pGEA6啟動子或根瘤土壤桿菌超級啟動子pSP或稻的pAR-IAR啟動子或玉米的pγzeine啟動子7.根據權利要求4到6之一的重組核苷酸序列，其特征為它含有一個負責將重組DGL和/或衍生多肽引向植物細胞特定腔室中的肽的編碼序列。8.根據權利要求4、6和7之一的重組核苷酸序列，其特征為它們是從下列序列中選擇-在5’→3’方向上含有CaMVpd35S啟動子，sporaminA信號肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pd35S-PS-DGL)，-在5’→3’方向上含有CaMVpd35S啟動子，sporaminA前原肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pd35S-PPS-DGL)，-在5’→3’方向上含有CaMVpd35S啟動子，RGL信號肽的一部分(即如下述實施例中所示的其頭19個氨基酸組成的序列，編碼最后3個C末端氨基酸的9個核苷酸缺失)，緊隨后者的圖1所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pd35S-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU啟動子，sporaminA信號肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pCRU-PS-DGL)，-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU啟動子，sporaminA前原肽編碼序列，緊隨后者的圖3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pCRU-PPS-DGL)，-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pCRU-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有Arabidopsisthaliana的pGEA1啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pGEA1-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有Arabidopsisthaliana的pGEA6啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pGEA6-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有稻pAR-IAR啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S或根瘤土壤桿菌的多聚ANOS終止子的重組核苷酸序列(稱為pAR-IAR-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pγzeine-RGLSP-DGL)，-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如上所述)，緊隨后者的圖1或圖3所示cDNA，四肽KDEL的編碼序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL)。9.根據權利要求5到7之一的重組核苷酸序列，其特征為它們是從下列序列中選擇-在5’→3’方向上含有根瘤土壤桿菌的pSP啟動子，HGL信號肽的編碼序列，緊隨后者的圖4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pSP-HGLSP-HGL)，-在5’→3’方向上含有根瘤土壤桿菌的pSP啟動子，HPL信號肽的編碼序列，緊隨后者的圖4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pSP-HPLSP-HGL)，-在5’→3’方向上含有根瘤土壤桿菌的pSP啟動子，RGL信號肽的一部分的編碼序列(如權利要求8所述)，緊隨后者的圖4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A35S終止子的重組核苷酸序列(稱為pSP-RGLSP-DGL)。10.在其復制非關鍵性位點上插入了權利要求4、6、7和8之一的核苷酸序列的載體，特別是質粒。11.在其復制非關鍵性位點上插入了權利要求5、6、7和9之一的核苷酸序列的載體，特別是質粒。12.用權利要求10或權利要求11的載體轉化的細胞宿主，特別是細菌如根瘤土壤桿菌。13.活性酶形式重組DGL和/或一種(或多種)尤其通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸而從中衍生的具有脂酶活性的多肽的制備方法，其特征在于它包括-植物細胞的轉化，特別是用根據權利要求12的細胞宿主轉化，該細胞宿主本身被根據權利要求10的載體轉化，這樣使得權利要求4、6、7和8之一的重組核苷酸序列被整合在這些細胞的基因組中，-適當時從上述轉化細胞產生轉化植物，-特別通過提取，然后適當時純化，回收所述細胞中或上述轉化植物中產生的重組DGL和/或上述衍生多肽。14.活性酶形式重組HGL和/或一種(或多種)尤其通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸而從中衍生的具有脂酶活性的多肽的制備方法，其特征在于它包括-植物細胞的轉化，特別是用根據權利要求12的細胞宿主轉化，細胞宿主本身被根據權利要求11的載體轉化，這樣使得權利要求5、6、7和9之一的重組核苷酸序列被整合在這些細胞的基因組中，-適當時從上述轉化細胞產生轉化植物，-特別通過提取，然后適當時純化，回收所述細胞中或上述轉化植物中產生的重組HGL和/或上述衍生多肽。15.遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，其特征為它們含有在其基因組中穩定地整合的一種(或多種)根據權利要求4到9之一的重組核苷酸序列和適當時的重組DGL和/或重組HGL和/或一種(或多種)衍生多肽，其也稱為酶活性植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，其特別選自油菜、煙草、玉米、豌豆、番茄、胡蘿卜、小麥、大麥、馬鈴薯、大豆、向日葵、萵苣、稻、苜蓿和甜菜根(beetroot)，或這些植物的某些部分。16.氨基酸序列如圖2所示的酶活性重組DGL或從中衍生的多肽，特別是通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸衍生的，例如圖2中位于55和379位的氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ54)，和/或圖2中位于5和379位氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ4)，這些衍生多肽具有脂酶活性，例如它們是通過實施根據權利要求13的方法以基本純的形式獲得的，這方法包括重組DGL和/或上述衍生多肽的純化步驟，特別是對得到的酶提取物進行層析。17.氨基酸序列如圖5所示的酶活性重組HGL或從中衍生的多肽，特別是通過插入和/或缺失和/或取代一個(或多個)氨基酸衍生的，例如圖5中位于74和398位的氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ54HGL)，和/或圖5中位于24和398位氨基酸界定的多肽，也稱為多肽(Δ4HGL)，這些衍生多肽具有脂酶活性，例如它們是通過實施根據權利要求14的方法以基本純的形式獲得的，這方法包括重組DGL和/或上述衍生多肽的純化步驟，特別是對得到的酶提取物進行層析。18.實施根據權利要求13的方法所得到的酶活性植物提取物，其特征為含有重組DGL和/或一種(或多種)衍生多肽，例如權利要求16中所定義的多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。19.實施根據權利要求14的方法所得到的酶活性植物提取物，其特征為含有重組HGL和/或一種(或多種)衍生多肽，例如權利要求17中所定義的多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)。20.根據權利要求18或權利要求19的酶活性植物提取物，其特征為酶活性重組多肽的重量百分比為這些提取物中總蛋白重量的約0.1-20％，特別是約1-15％，這相當于0.5U/克葉鮮重(FW)到1000U/g葉鮮重，特別是約10-300U/g葉鮮重，或約1-5000U/g種子鮮重，特別是約10-1000U/g種子鮮重的酶活性水平。21.根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞或根據權利要求16的重組DGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求17的重組HGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求18到20之一的酶活性植物提取物，用于制備有利于促進健康個體或患有一種或多種可能或可能不影響胃脂酶和/或胰脂酶產生水平的病變的個體，特別是正在進行改變脂肪吸收機制的醫學治療的個體或老年人吸收所攝取的動物和植物脂肪的藥物，更特別的是制備有利于治療與器官內脂酶(特別是胃和/或胰脂酶)缺乏相關的病變及更特別的是如膽囊纖維樣變性和胰腺外分泌不足的病變的藥物的用途。22.藥物組合物，其特征為含有根據權利要求16或17的重組DGL和/或重組HGL和/或一種(或多種)衍生多肽，和/或一種(或多種)根據權利要求18到20之一的酶活性提取物，其適當時可與藥物可用的載體組合。23.根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，或根據權利要求16的重組DGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求17的重組HGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求18到20之一的酶活性植物提取物，用于生產食品、特別是功能性食品，更特別是用于促進健康個體或患有一種或多種可能或可能不影響胃脂酶和/或胰脂酶產生水平的病變的個體吸收所攝取的動物和植物脂肪的食品的用途。24.功能性食品，其特征為含有根據權利要求15的一種(或多種)植物和/或該(這些)植物部分，和/或根據權利要求16或17的重組DGL和/或重組HGL和/或一種(或多種)衍生多肽，和/或一種(或多種)根據權利要求18到20之一的酶活性提取物。25.根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，或根據權利要求16的重組DGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求17的重組HGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求18到20之一的酶活性植物提取物，用于進行工業、農業食品和農用工業領域中，特別是在脂肪工業、脂肪化學及奶品工業中的酶促反應的用途。26.特別是工業、農業食品和農用工業領域中，特別是在脂肪工業、脂肪化學及奶品工業中，通過一個或多個酶促反應而進行的酶促生物轉化或生物催化的方法，利用根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，或根據權利要求16的重組DGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求17的重組HGL或從其中衍生的多肽，或根據權利要求18到20之一的酶活性植物提取物進行這些酶促反應。27.可在工業、農業食品和農用工業中使用的酶制劑，其可用于實施根據權利要求26的方法并含有一種(或多種)根據權利要求18到20之一的酶活性植物提取物和/或根據權利要求16或17的重組DGL和/或重組HGL和/或一種(或多種)從其中衍生的多肽。28.根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞，進行工業規模的生物轉化或生物催化酶促反應的用途，例如酶促水解或酯基轉移作用。29.應用根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是植物的葉和/或果實和/或種子和/或植物細胞進行生物催化的方法，所述植物或植物碎片或細胞同時用作酶源和反應底物。30.根據權利要求15的遺傳轉化植物或植物部分，特別是葉和/或果實和/或種子或植物細胞生產生物燃料的用途。31.制備生物燃料的方法，其中通過加入醇，尤其是甲醇或乙醇，到根據權利要求15的轉化植物全部或部分的研碎材料中，并回收生物燃料，特別是通過過濾。32.通過實施根據權利要求31的方法而得到的植物脂肪酸的酯，特別是油酸的甲酯。33.通過實施根據權利要求31的方法而得到的生物燃料，其含有植物脂肪酸的酯，特別是油酸的甲酯。全文摘要本發明涉及應用含編碼重組前十二指腸脂酶的cDNA或任何衍生自該cDNA的序列的重組核苷酸序列,轉化植物細胞以獲得重組前十二指腸脂酶或多肽衍生物。本發明還涉及遺傳改造植物或其部分,或這些植物的提取物或重組前十二指腸脂酶或所得多肽衍生物在食品、或藥物生產、或工業領域中的應用。文檔編號C12N1/21GK1185178SQ96194076公開日1998年6月17日申請日期1996年4月19日優先權日1995年4月20日發明者P·萊尼,V·格魯伯,S·鮑迪諾,B·默洛特,C·貝尼庫特,C·卡德雷申請人:朱維納爾公司