專利名稱：：哺乳動物細胞中的基因表達的制作方法
技術領域：
：本發明涉及哺乳動物細胞中的基因表達，特別是那些體內生物活性受包括特定糖基化的各種因素影響的蛋白質的基因。這類基因的例子有人β干擾素(IFNβ)、人促紅細胞生成素(EPO)，人絨毛膜促性腺素、各種其它細胞因子和生長因子以及如Dengue病毒蛋白這種特定的病毒抗原，這些抗原的結構可關系到疫苗的開發。在此之前，基因已經在哺乳動物細胞系中被大規模表達，特別是按Urlaub等人在美國國家科學院院刊77，4216-4220，1980中表明的方法在缺失二氫葉酸還原酶基因(dhfr)的突變中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中進行表達。已使用過多種表達系統。因此在這些細胞中用于基因表達的多種載體是可得的。通常用于分離表達載體轉化細胞的篩選方法基于使用氨甲蝶呤篩選dhfr和靶基因被共同擴增的轉化株。dhfr基因，能使細胞耐受氨甲蝶呤，常常與希望表達的基因一起被摻入載體中。然后在增加濃度的氨甲蝶呤條件下進行細胞篩選。這樣因為有越多拷貝數目的細胞能耐受越高濃度的氨甲蝶呤，從而會導致細胞群的每個細胞中存在的dhfr基因數量擴增。隨著dhfr基因被擴增，目的基因的拷貝數則伴隨dhfr基因拷貝數而增加，由此使得目的基因表達增多。遺憾的是，據報道在沒有進行連續篩選時這些被擴增基因常常是不穩定的(Schimke，生物化學雜志263，5989-5992，1988)。這種不穩定性對現存的CHOdhfr細胞這一表達系統而言是固有的。多年來，一直使用幾個啟動子驅動靶基因的表達，如SV40早期啟動子、CMV早期啟動子和SRα啟動子。據稱CMV和SRα啟動子是最強的(Wenger等，分析生物化學221，416-418，1994)。在一篇報道中，還使用β-干擾素啟動子驅動β-干擾素基因在突變的CHOdhfr細胞中的表達(US-A-5376567)。但是在該系統中，必須通過Tan等人的方法(Tan等，美國國家科學院院刊67，464-471，1970；Tan等人，US-A-3773924)對所篩選的CHOdhfr細胞進行超誘導，以實現較高水平的β-干擾素的生產。在該系統中由CHOdhfr細胞生產的占顯著百分量的超誘導β-干擾素沒有被糖基化。小鼠金屬硫蛋白基因(mMT1)啟動子也曾被用于CHO細胞、BHK和LTK-小鼠細胞(Reiser等，1987，藥物研究，37，4，482-485)中β-干擾素基因表達。但是使用這種啟動子進行的β-干擾素表達不如用SV40早期啟動子在CHO細胞中表達得那么好。并且，由mMT1啟動子介導的這些細胞中β-干擾素的表達被重金屬誘導。然而重金屬對細胞極其有毒，因此放棄了使用該系統。取而代之的方法是，Reiser等人使用CHOdhfr表達系統與SV40早期啟動子結合(Reiser等，藥物研究，37，4，482-485(1987)和EP-A-0529300)以在由Urlaub等人的方法(1980)衍生的CHOdhfr細胞中生產β-干擾素。我們現在已在野生型CHO細胞中表達了β-干擾素。使用一載體轉染野生型CHO細胞，此載體包含一個在小鼠肉瘤病毒增強子和小鼠金屬硫蛋白啟動子(MSV-mMT1)控制下的β-干擾素基因、能驅動neo基因在大腸桿菌和哺乳動物細胞中表達的啟動子控制下的neo基因和一個具有其自身啟動子的人金屬硫蛋白基因。首先將細胞暴露于遺傳霉素(抗菌素G418)中由此除去缺失neo基因的細胞，然后再將存活細胞暴露于濃度增大的重金屬離子中，通過這種方法篩選出能表達β-干擾素的轉染細胞。重金屬離子增強β-干擾素基因的MSV-mMT1啟動子，由此增加β-干擾素的表達。重金屬離子也誘導人金屬硫蛋白基因啟動子，導致人金屬硫蛋白的表達。人金屬硫蛋白保護細胞不受重金屬離子的毒性影響。重金屬離子的存在確保了對細胞的連續篩選，這些細胞含有被整合入其基因組的轉染載體，或至少含有β-干擾素基因和人金屬硫蛋白基因及其各自的啟動子。已被成功轉染的篩選出的細胞表達β-干擾素。當細胞培養于Zn2+存在條件下時，表達水平驚人地提高。與原有的β-干擾素相比，這種β-干擾素具有改善的性質，特別是具有較高的生物利用度。這些發現具有普遍的適用性。因此，本發明提供了-一種核酸載體，包含(i)一個編碼目的蛋白質的編碼序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導該編碼序列在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；(ii)包含金屬硫蛋白基因的第一選擇性標記序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導該金屬硫蛋白基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；以及(iii)包含neo基因的第二選擇性標記序列，它與一個能指導neo基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；-攜帶核酸序列的哺乳動物細胞，該核酸序列包含(i)一個編碼目的蛋白質的編碼序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導該編碼序列在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；(ii)包含金屬硫蛋白基因的第一選擇性標記序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導該金屬硫蛋白基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；以及任選地(iii)包含neo基因的第二選擇性標記序列，它與一個能指導neo基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；-生產這種細胞的方法，該方法包含(a)用本發明的載體轉染哺乳動物細胞；(b)將被轉染的細胞暴露于遺傳霉素中由此除去缺失neo基因的細胞；并且(c)將承受步驟(a)存活的細胞暴露于濃度逐漸增大的重金屬離子中，由此選擇所需細胞。-neo基因和金屬硫蛋白基因在單一載體中作為選擇性標記的用途；及-制備目的蛋白質的方法，該方法包含在允許目的蛋白質表達的條件下培養本發明哺乳動物細胞，并回收由此表達的目的蛋白質。通過將neo基因和金屬硫蛋白基因用作一個載體中的兩個選擇性標記，有可能選擇已轉化的哺乳動物細胞，如野生型CHO細胞，它們含有被穩定整合入其基因組的表達載體多個拷貝。因此這種篩選系統便于制備和鑒別穩定轉化的哺乳動物細胞如野生型CHO細胞，并且避免了對dhfr細胞的需求。轉化的細胞能使基因如人β-干擾素基因穩定表達，因為它們含有被穩定整合入其基因組的這些基因的多個拷貝，通常至少20-100個拷貝或更多。另外，在篩選步驟中使用相對高濃度的Cd2+(達200μM)能除去無意產生的微生物污染物如支原體，它們可能會在組織培養步驟中與轉染細胞結合。因此，本發明使轉染細胞中含微生物污染物的可能性減到最小。而且，與過去曾使用的強啟動子系統相比，本發明的一個特殊的啟動子/增強子系統表達水平出人意料地顯著提高。這一啟動子/增強子為MSV-mMT1，它包含在小鼠肉瘤病毒(MSV)增強子上游側翼小鼠金屬硫蛋白基因1(mMT1)。金屬硫蛋白基因啟動子，特別是結合的MSV-mMT1啟動子/增強子系統能與目的基因如人β-干擾素基因或人促紅細胞生成素基因可操縱連接。包含這種排列的載體能在野生型CHO細胞中獲得基因產物的高水平表達。因此，本發明人已經鑒別出一個新的、意料不到的強大的表達系統，適于應用在哺乳動物細胞，特別是野生型哺乳動物細胞中。表達產物如人β-干擾素和人促紅細胞生成素可具有出人意料的/新的生物學性質，如較高的生物利用度。這些性質能使產物具有較高的效力/其它用途。因此，根據本發明，在野生型哺乳動物細胞中如野生型CHO細胞中大量表達基因如β-干擾素基因及其它基因并且以穩定方式進行表達，無需進行連續篩選和依賴于CHOdhfr-氨甲蝶呤選擇系統，這是可能的。本發明能應用于多種哺乳動物細胞。這種方式能使合適靶基因的表達具有糖基化形式和對所用細胞類型特有的細胞環境。本發明的載體是一個表達載體。它包含三個能在哺乳動物細胞中表達的序列。因此本發明載體包含(i)一個包含要表達的目的基因，如人β-干擾素基因的編碼序列；(ii)一個包含金屬硫蛋白基因的第一選擇性標記序列，金屬硫蛋白基因賦予了表達目的基因的哺乳動物細胞對重金屬離子如鎘、銅和鋅的抗性；和(iii)包含neo基因的第二選擇性標記序列，neo基因賦予了表達基因的轉化的細菌細胞對抗菌素卡那霉素的抗性，并賦予了表達基因的哺乳動物細胞對遺傳霉素的抗性(抗菌素G418)。這三個序列中每個序列一般都與控制它們表達的其它元件相結合。關于每個序列，通常存在下列元件，從5′至3′排列指導序列表達的啟動子和啟動子的調節子或無此調節子、翻譯起始密碼子、編碼/標記序列、聚腺苷酸信號和轉錄終止子。并且，編碼序列和/或每個標記序列或兩個標記序列可以與增強子可操縱連接或不連接，增強子使啟動子控制下所得的表達增強。合適的增強子包括Rous肉瘤病毒(RSV)增強子和小鼠肉瘤病毒(MSV)增強子。另外，本發明的載體一般包含一個或多個復制起點，例如細菌復制起點，象pBR322起點，它允許在細菌細胞中的復制。或者，在載體中可包括一種或多種真核細胞復制起點，這樣便可能在酵母細胞和/或哺乳動物細胞這類細胞中進行復制。此載體還可以包含一個或多個內含子或編碼序列3′或5′端的非編碼序列或一個或多個標記序列。這種非編碼序列可以來自任何一種生物體或可以在自然界合成的。因此它們可具有任意序列。只要這些序列能增強或不損傷編碼序列或標記序列的正確表達，即可包括這些序列。在本發明載體中，編碼序列和標記序列均可與能指導它們在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接。或者，一個或多個這些啟動子也可在其它細胞中指導表達，例如非哺乳動物真核細胞，如酵母細胞或昆蟲細胞和/或原核細胞。“可操縱連接”是指一種并列位置，其中啟動子和編碼/標記序列間的關系使編碼/標記序列在啟動子控制下被表達。因此，在啟動子和編碼/標記序列間可以存在如5′非編碼序列這類元件。如果這類序列增強或不損害啟動子對編碼/標記序列的正確控制，那么它們可被包含在構建物中。在重金屬離子如Cd2+、Cu2+和Zn2+存在下能在哺乳動物細胞中增強表達的任意啟動子與編碼序列可操縱連接。合適的啟動子為金屬硫蛋白基因啟動子。優選小鼠金屬硫蛋白基因I(mMT1)啟動子。編碼序列的合適的啟動子/增強子結合物包括上游與MSV增強子相接的mMT1啟動子(MSV-mMT1)和RSV增強子與MMTV啟動子的結合物。優選MSV-mMT1。類似地，在重金屬離子如Cd2+、Cu2+和Zn2+存在下能增強哺乳動物細胞中表達的任意啟動子可以與金屬硫蛋白基因如人金屬硫蛋白基因可操縱連接。優選標記基因序列是人金屬硫蛋白基因，如人金屬硫蛋白基因IIA，它具有自身的啟動子。第二選擇性標記基因是neo基因。多于一種類型的這種基因存在于自然界中任意特定的neo基因均可用在本發明載體中。一種優選的neo基因是大腸桿菌neo基因。neo基因的啟動子能指導基因在哺乳動物細胞中的表達。合適的啟動子是巨細胞病毒(CMV)早期啟動子、SV40啟動子、小鼠乳腺瘤病毒啟動子、人延伸因子1α-P啟動子(EF-1α-P)、SRα啟動子和如mMT1金屬硫蛋白基因啟動子。啟動子還能在細菌如大腸桿菌中表達neo基因，其中可構建本發明載體。由neo基因賦予的抵御抗生素的這種保護作用從表達的neo基因即會賦予細胞抗生素抗性這種意義上講是定性的，而由金屬硫蛋白基因賦予的抵御重金屬的這種保護作用是定量的。細胞中金屬硫蛋白基因的表達水平越高，細胞對重金屬離子的抗性越強。因此，金屬硫蛋白基因拷貝數高的細胞會對重金屬具有高抗性。所以，含有許多拷貝本發明載體的細胞比含有一個或幾個拷貝的細胞具有更高的重金屬抗性。因此，通過將細胞暴露于濃度逐漸增加的重金屬中篩選具有高拷貝數本發明載體(因而具有高拷貝數編碼基因如人β-干擾素)的轉染細胞，這是可能的。由此，篩選出含本發明載體拷貝數逐漸增多的細胞。因此，本發明載體中發現的選擇性標記的組合允許兩步篩選法篩選目的轉染細胞。首先，細胞被暴露于遺傳霉素(抗菌素G418)中，這樣會除去缺失neo基因因而同時也缺乏本發明載體的細胞。此步之后，neo基因不再起作用。其次，使用水平逐漸提高的重金屬離子完成篩選，這樣篩選出具有載體多個拷貝的細胞，特別是具有整合入其基因組的多個拷貝的細胞。在該選擇法中，經受高濃度重金屬離子而存活下來的細胞高度表達金屬硫蛋白，例如，因為它們包含大量的本發明載體和/或因為載體或已整合入其基因組的載體處于增強表達的染色體位置上。可以使用任意合適重金屬離子。由此，可以使用對本發明細胞有毒的任意重金屬離子，其中表達的金屬硫蛋白基因賦予了該細胞保護作用。例如，可使用鋅離子(Zn2+)、銅離子(Cu2+)或優選鎘離子(Cd2+)。為完成篩選，可使用重金屬離子的濃度從5至100、甚至達200μM。濃度為130至170μM、優選約150μMZn2+是合適的。為使用重金屬離子完成篩選，這些離子可以鹽的形式提供，即與任意合適平衡離子結合如硫酸鹽或氯化物。因為被選擇的細胞對重金屬毒性具有抗性，抗性發生時重金屬離子是編碼序列啟動子的誘導劑，所以通過重金屬離子如作為啟動子誘導劑的130至170μMZn2+能使目的蛋白質的表達最大化。除neo和金屬硫蛋白基因外，載體還可含有一個或多個其它選擇性標記基因，如用于鑒別細菌轉化體的氨芐青霉素抗性基因。在本發明載體中，核酸可以是DNA或RNA，優選DNA。載體可以是任意類型的表達載體。當然載體必須與要轉染的哺乳動物細胞相容。載體可以呈線性或環形。例如，載體可以是質粒載體，通常為DNA質粒。優選的質粒載體是pMMTC(實施例2；圖2)。本領域技術人員能夠從廣泛可得的載體開始制備合適的載體，起始載體一般是通過基因工程技術如按Sambrook等人所述的方法，(分子克隆實驗指南；1989)進行修飾的。至于考慮到質粒載體，合適的起始載體是pRSN質粒(Low等(1991)JBC266；19710-19716)，可廣泛獲取該質粒。另外一個合適的質粒起始載體是pBR322。本發明的載體可以將其部分核苷酸序列或全部核酸序列整合入宿主細胞基因組中或它們的核酸序列在宿主細胞中可以是游離的。優選整合型載體。這是因為它們能給出編碼序列如人β-干擾素基因的穩定表達。轉染哺乳動物細胞可以是BHK、COS、VERO、人成纖維細胞樣細胞如C10、Hela或人淋巴母細胞樣細胞或人腫瘤細胞系細胞。但是優選這些細胞是CHO細胞，尤其是野生型CHO細胞。所需要的是，轉染細胞將具有被整合入其基因組的一個完整的本發明載體或載體的一部分。這類細胞是優選的，因為它們使包含在載體中的編碼序列穩定表達。優選完整載體的一個或多個拷貝是被整合的，同時具有多個整合的載體拷貝如20至100個拷貝或更多拷貝的細胞是特別優選的，因為這些細胞使包含在載體中的編碼序列高水平穩定表達。但是，本發明也包括在其基因組中整合有本發明載體不完全部分的細胞，條件是，整合的載體部分能使細胞表達編碼序列并根據上述方法通過使用重金屬能篩選細胞，從這個意義上講，如果這些細胞的功能等同于在其基因組中整合有完整載體的細胞。因此，如果被整合的一個元件或多個元件包括可操縱連接有其相關啟動子的編碼序列和可操縱連接著其相關啟動子的金屬硫蛋白標記序列，那么本發明包括整合有本發明載體一部分的細胞。可通過任意合適的方法轉染細胞，如Sambrook等人描述的方法分子克隆實驗室指南，1989。例如含有本發明核酸序列的載體可被包裝入感染性病毒顆粒，如逆轉錄病毒顆粒。可以通過電穿孔、磷酸鈣沉淀或通過將裸核苷酸載體在溶液中與細胞接觸將載體導入。優選的轉染方法包括Low等人描述的方法(生物化學雜志266；19710-19716；1991)。本發明還提供了由本發明載體中編碼序列編碼的蛋白質的制備方法。該方法包括將本發明載體轉染的細胞培養于允許編碼序列表達的條件下，并回收由此生產的蛋白質。可由這種方法生產的蛋白質優選包括干擾素，如人干擾素。優選β-干擾素，更優選人β-干擾素。其它蛋白質有白細胞介素(如白介素-12)、人絨毛膜促性腺激素、生長因子、人生長激素和人促紅細胞生成素、細胞膜成分、病毒蛋白以及其它生物醫學相關的蛋白質。被篩選的細胞可以培養在本領域所知的任意合適的條件下，依據細胞類型和被生產的蛋白質類型這些條件可以各不相同。用于編碼序列的啟動子可以是組成型啟動子，這樣由編碼序列編碼的蛋白質在重金屬離子不存在時被表達。但可以在重金屬離子存在時，特別是重金屬離子量對細胞無毒時培養細胞。這樣可得到所需蛋白質的較高水平的表達。培養基中重金屬離子的濃度通常為100至200μM。因此可在100至200μM選自Cd2+、Cu2+和Zn2+的重金屬離子存在下如130至170μM重金屬離子存在下培養細胞。使用濃度約150μM，特別是重金屬離子為Zn2+時。Zn2+的使用對β-干擾素和促紅細胞生成素的生產產率具有有益的效果。我們出人意料地發現人β-干擾素的生產被提高了2至3倍，人促紅細胞生成素的生產被提高了3至5倍。可通過本領域任意已知方法回收所生產的蛋白質，并且依據使用細胞的類型、培養條件和生產的蛋白質類型，回收方法可以各不相同。回收后需要將生產的蛋白質純化。由此可獲得基本純的蛋白質。本發明能提供新型人β-干擾素。此β-干擾素高度唾液酸(Sialylation)化。正如由原代二倍體人成纖維細胞生產的天然人β-干擾素一樣，它被很好地糖基化。然而它比天然β-干擾素或在大腸桿菌生產的重組β-干擾素(betaseron)具有更高的生物利用度。β-干擾素的較高的生物利用度可被特征化。當在約2kg的家兔背部皮下注射1.5×106國際單位(I.U.)的干擾素時(a)1小時后在家兔血清中可檢測出≥128I.U./ml的干擾素，和/或(b)5小時后在家兔血清中可檢測出≥64I.U./ml的干擾素。通常在1小時后觀察到干擾素的最高水平。因此，根據(a)，1小時后在家兔血清中可檢測出128至256I.U./ml如140至190I.U./ml的干擾素。根據(b)5小時后，在家兔血清中檢測出≥70I.U./ml如≥80I.U./ml的干擾素。通常根據(b)，可檢測量為60至120I.U./ml如80至110I.U./ml范圍內的干擾素。另外或者，可用比活性描述干擾素特征。它具有的比活性是4.8×108至6.4×109I.U.每毫克當量的牛血清白蛋白。比活性可以從5×108至6×108如5.2×108至5.8×108如5.3×108至5.5×108I.U.每mg當量牛血清白蛋白。可將比活性參照一標準，特別是美國NIH的過敏及傳染病國家研究院頒布的Gb23-902-531標準。根據改進的Armstrong法(1971)確定比活性，其中在病毒激發中包括0.2μg/ml的放線菌素D，并直接讀數病毒誘導的C.P.E.。分析細胞為MRC-5成纖維細胞。還可用下述一種或多種性質描述此β-干擾素特征1.通過15％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的本發明β-干擾素表觀分子量一般為26,300。2.當以一個干凈的靜脈內丸注射家兔，干擾素的半衰期通常在12至15分鐘，如約13分。將丸注入家兔耳靜脈，從家兔耳動脈取血樣，根據改進的Armstrong法(1971)分析兔血清抗病毒活性。3.在人肝胚細胞瘤細胞系(HepG2)中該干擾素抗病毒活性至少等于且通常約為1.5倍的來自原代二倍體人成纖維細胞的天然β-干擾素活性。在保護Hep2細胞不被病毒激發中，此干擾素還比betaseron效力多2.2倍。根據改性的Armstrong(1971)法再次確定抗病毒活性。在HepG2細胞內抗病毒活性的確定中省去放線菌素D。與本發明β-干擾素結合的寡糖也可以是β-干擾素的特征。β-干擾素帶有可用下述一個或多個特點描述的寡糖。1.中性(無酸性取代基)5至15％，優選約10％。酸性95至85％，優選約90％。2.總的去唾液酸化(desialylated)寡糖收集池為異質的，收集池中至少有6個不同結構的成分。3.基質輔助激光解析電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜和高分辨凝膠滲透色譜數據總結如下本發明β-干擾素的糖基由二、三或四觸角復合物型(artennarycomplex)N-連接的寡糖組成。這些寡糖包含(多個)重復的乳糖胺。約30至80％如35至60％或35至50％的寡糖是二觸角寡糖(bi-antennaryoligosaccharides)。約15至65％如25至60％或25至40％的寡糖是三觸角寡糖。約5至55％如15至45％或20至40％的寡糖是四觸角寡糖。本發明β-干擾素顯示出抗病毒活性、細胞生長調節劑活性和調節胞內酶生產及其它由細胞產生的物質的能力。因此，β-干擾素可被用于治療各種病毒和腫瘤疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性腦炎、病毒性肺炎、病毒性疣、AIDS/鼻咽癌、肺癌、黑素瘤、CML腎細胞癌和腦腫瘤以及如多發性硬化、血管瘤、頸上皮肉瘤形成。根據使用的特殊給藥形式，含本發明β-干擾素作為主要活性成分的藥物組合物通常用合適的藥學上可接受載體或稀釋劑配制。例如，非腸道制劑一般是可注射的液體，使用藥學上和生理學上可接受的液體如生理鹽水、平衡鹽溶液等作為載體。另一方面，口服制劑可以是如片劑和膠囊這種固體或液體溶液或懸浮液。本發明干擾素一般被配制為單位劑量形式，每劑含104至109I.U.，更常見的含106至107I.U.。可以各種形式給人服用干擾素，如以口服、靜脈內、肌內、腹膜內、鼻內、皮內和皮下形式給藥。治療醫生通過考慮病人的詳細情況，所患疾病及病況，選擇出給藥的具體方式和劑量制度例如治療病毒性感染通常使用一日量或二日量，治幾天至幾周；而腫瘤或癌癥的治療則包括一日量或多日量，治數月或數年。此干擾素可以與其它治療方法結合，可以與其它化學治療藥物或化學預防藥物結合或相連使用，以提供對病毒感染、腫瘤或其它疾病有效的療法。例如，在治療皰疹病毒角膜炎中，已在熱烙術，清創術和三氟胸苷療中補充了干擾素療法。下面的實施例說明本發明。附圖中圖1顯示了用各種不同啟動子控制下的DPPIV序列轉染的CHO細胞進行的免疫印跡分析結果；圖2至4是載體質粒pMMTN、pMMTC和pBPV的圖譜；圖5(a)是純化的GS38-IFNβ的SDS-PAGE(15％)分析結果。分子量標記來自BioRad(California)以kda表示標記的分子量。泳道1、2和3中的GS38-IFNβ分別為0.8×106I.U.0.2×106I.U.和1.1×106I.U.。泳道a、b、c、d、e和f中牛血清白蛋白的量為5μg、3.5μg、2.5μg、1.5μg、0.5μg和0.25μg。圖5(b)是純化的GS38-IFNβ的Western印跡結果。將原代人二倍體成纖維細胞生產的純化IFNβ(泳道1和2)和GS38-IFNβ(泳道3和4)進行SDS-PAGE(15％)。然后將蛋白質在硝酸纖維素膜上印跡，并以抗-IFNβ單克隆抗體(AccurateChem，NewYork)探測。各泳道中IFNβ活性值即在1、2、3和4泳道為0.1×105、0.05×106、0.14×106和0.56×106I.U.。以kda表示的分子量示于圖中，圖6是與GS38-IFNβ結合的寡糖的hplc陰離子交換色譜圖；圖7是GS38-IFNβ結合寡糖在用神經氨酸酶處理后的hplc陰離子交換色譜圖8是GS38-IFNβ結合寡糖的高分辨凝膠滲透色譜圖；圖9是通過MALDI-TOF質譜釋放出的脫酸聚糖的分子量分布。圖10(a)是家兔經皮下注射由GS38細胞(◆)、原代人二倍體成纖維細胞(■)或大腸桿菌〔betaseron(▲)〕生產的IFNβ0.7×106I.U.后，IFNβ的血清水平。被注射家兔的體重約1.5kg。圖10(b)是家兔經皮下注射由GS38細胞(◆)、原代人二倍體成纖維細胞(■)或大腸桿菌〔betaseron(▲)〕生產的IFNβ1.5×106I.U.后，IFNβ的血清水平。被注射家兔體重約2.0kg。圖11是家兔(約2kg)經靜脈注射由GS38細胞(◆)、原代人二倍體成纖維細胞(■)或大腸桿菌〔betaseron(▲)〕生產的三種不同IFNβ0.7×106I.U.后，IFNβ的血清水平的衰減。圖12是皮下注射GS38-IFNβ的劑量對循環GS38/IFNβ的血清水平的劑量效應。皮下注射1.2×106I.U.(◆)、2.5×106I.U.(■)和10.1×106I.U.(▲)的GS38IFNβ，家兔(2kg)中GS38產IFNβ的血清水平。圖13為含EPO而非IFNβ基因的新載體轉染野生型CHO細胞中人促紅細胞生成素的表達。已表明克隆的細胞(泳道1至14)接種于35mm(直徑)的培養皿中。匯合時，向每一個培養皿中均加入1ml培養基并培養24小時。收集培養基，每種取10μl與對照樣50ng的人促紅細胞生成素(泳道15)一起通過SDS-PAGE進行分離，使用AmershamECL探測系統通過Western印跡分析。實施例1MSV-mMT1作為用于野生型CHO細胞中強啟動子的鑒定對比了5個啟動子/增強子系統的強度。它們是-在小鼠肉瘤病毒增強子上游側翼的小鼠金屬硫蛋白基因1啟動子(MSV-mMT1mMT1由Glanville等人(1981)于自然292，267-269中描述；MSV由Dhar等人在美國國家科學院院刊77，3937-3941中描述)；-巨細胞病毒早期啟動子(CMV)；-RSV-SV40(Rous肉瘤病毒〔RSV〕增強子和SV40早期啟動子的融合基因)；-RSV-小鼠乳腺瘤病毒長末端增強子/啟動子(RSV-MMTV)；和-SR-α啟動子(YutakaTakebe等人(1988)，分子細胞生物學8，466-472)。為進行上述對比，在各自的表達載體中克隆入編碼全長二肽基肽酶IV(DPPIV)的EcoRI-XhoIcDNA(Hong和Doyle(1988)，生物化學雜志263，16892-16898)，這樣DPPIV的表達分別受控于MSV-mMT1，CMV、RSV-SV40、RSV-MMTV或SR-α。對于MSV-mMT1，DPPIV片段被插入到pMMTN載體(圖2)的XhoI-NotI位點；對于CMV此片段被插入到pXJ41neo載體(Zheng和Pallen(1992)；自然，359，336-339)的EcoRI和XhoI位點；對于RSV-SV40，參見Low等人(1991)的生物化學雜志，266，19710-19716；對于RSV-MMTV，此片段被插入到pMAMneo載體(來自Clontech目錄號6104-1；由Lee等人(1981)，自然，294，228和Sardet等人(1989)；細胞雜志，56，271中描述)的NhoI-XhoI位點；對于SR-α，此片段被插入到pSRalpha/neo載體(YutakaTakebe等人(1988)分子細胞生物學8，466-472；Nilsson等人細胞生物學雜志120，5-13，1993)的XhoI-BamHI位點。將每個表達載體轉染入CHO細胞，且收集穩定轉染的細胞用于每個載體。然后利用免疫印跡分析，通過DPPIV蛋白質水平測量每一個表達載體的長度，所探測DPPIV的量表示出每個表達系統的長度。根據Hong等人(1989)生物化學28，8474-8479所述方法，進行這些轉染細胞中探測DPPIV的免疫印跡分析。簡單來說，用Tris緩沖鹽水(TBS)(20mMTris，pH7.2，150mMNaCl)洗滌細胞，然后用有1mMPMSF的TBS中1％的TritonX-100進行提取。離心清除提取物中細胞碎片。用BSA盒(PierceChemicalCo.)確定提取物中蛋白質濃度。用SDS-PAGE分離從各個轉染細胞提取的約100μg的蛋白質，然后根據上述方法(Hong等人(1989)生物化學28，8474-8479)通過免疫印跡進行分析。示于圖1的結果表明，MSV-mMT1表達系統(泳道2)比現存的廣泛使用的系統強得多。實施例2描述質粒pMMTC根據上述方法，使用MSV-mMT1構建一個強力表達載體pMMTC，以驅動結合兩個選擇性標記(用于轉染細胞的neo基因和用于細胞的人金屬硫蛋白基因，已在細胞基因組中整合有多個拷貝載體)的外源基因的表達。pMMTC(圖3)是哺乳動物細胞表達載體。被表達基因被克隆入XhoI和/或NotI位點，由此，基因的表達受含小鼠肉瘤病毒增強子(MSV)和小鼠金屬硫蛋白基因1啟動子的控制區(MSV-mMT1)驅動。SV40剪接區和聚腺苷酸化位點，用來終止轉錄，并確保轉錄后事件的正確控制。細菌的neo基因上游與SV40復制起點和SV40早期啟動子連接，下游與SV40剪接區和聚腺苷酸位點連接。此neo表達單元賦予了轉染的哺乳動物細胞對遺傳霉素(G418)的抗性，也賦予了被轉染的大腸桿菌對卡那霉素的抗性。pSR322復制起點(Ori)用作大腸桿菌中質粒DNA的自主復制的起點。賦予哺乳動物細胞重金屬離子如Cd2+抗性的人金屬硫蛋白結構基因IIA被用來篩選含整合的質粒多拷貝的哺乳動物轉染株。哺乳動物表達載體pMMTC的構建用限制酶BamHI切割質粒pRSN(Low等，生物化學雜志266，19710-19716，1991)，并用瓊脂糖凝膠電泳分離。約2685bp的DNA片段被凝膠純化。此BamHI片段包含用于哺乳動物細胞和大腸桿菌中的大腸桿菌neo基因的表達單元。用限制酶BamHI切割質粒pBPV(Phamacia產品號27-4390；見圖4及以下的詳細描述)，然后用小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)處理。在用瓊脂糖凝膠電泳分離后，約4570bp的BamHI片段被凝膠純化。該4570bp片段包含大腸桿菌中pBR322復制起點、氨芐青霉素(Amp)抗性基因及一個由小鼠肉瘤病毒增強子和小鼠金屬硫蛋白基因1啟動子、隨后是多克隆位點和SV40剪接接頭和聚腺苷酸化信號組成的表達盒。此4570bp片段與上述2685bpBamHI片段相連接。所得質粒稱為pMMTC(圖2)。用HindIII切割質粒phMT(Karih等(1982)自然299，797-802)，并用DNA聚合酶I的Klenow片段使末端平齊，含人金屬硫蛋白基因IIA的3100bp片段被凝膠純化。用ScaI(它在氨芐青霉素抗性基因內)切割質粒pMMTN，用CIAP處理，然后與獲自phMT的3100bp片段連接。這樣連接的產品被轉化入大腸桿菌。進行卡那霉素抗性(由neo基因賦予)和氨芐青霉素敏感性(由于3100bp片段插入氨芐青霉素抗性的結構基因)的篩選。通過限制酶消化確定最終的質粒構建物，并稱之為pMMTC。pMMTC長度約10350bp。基因學(Geneology)pBPV(12516bp)(核苷酸編號參照參考文獻中編號)·MSV增強子(388bp)Dhar.R.等，美國國家科學院院刊77，3937(1980)，Nuc529-142·BamHI/BglII接頭CCGGATCTG·金屬硫蛋白啟動子的5′末端(295bp)Nuc1-295·金屬硫蛋白啟動子的3′末端(368bp)Glanville，N.等，自然292267(1981)Nuc300-68·多克隆位點和來自構建物CTCGAGCCGCGGCCGCTTCAGG的附加核苷酸·SV40小T-抗原剪接(612專利公報號)及聚腺苷酸化(235專利公報號)信號Buchman，A.R.等DNATumorViruses(DNA腫瘤病毒)，ColdSpringHabourLaboratory(冷泉港實驗室)，pg799(1980)，Nuc4713-4102和2772-2538·BPV基因組(7945bp)ChenE.Y.等，自然299，529(1982)Nuc4451-7945和1-4450·pML2pBR322衍生物，缺失1095至2485間(2632bp)的堿基(1)Balbas，P.，等基因50.3(1986)(2)Sarvor.N.等美國國家科學院院刊79，7147(1982)Nuc376-1095，2485-4363和1-33·BgIII/BamHI接頭GAGATCCGG實施例3在pMMTC中人β-干擾素表達DNA的插入通過PCR用兩個寡核苷酸從人基因組DNA中釣出β-干擾素編碼序列。5′寡(GGGGTACCATGACCAACAAGTGTCTCCTC)以此種方式修飾，使得含起始ATG密碼子的序列(CCACCATG)利于高效的翻譯起始(Kozak(1984)NAR12，857-872)。3′寡序列為GGAATTCTTCAGTTTCGGAGGTAACCTGT。將這種修飾的)β干擾素表達序列插入到pMMTCXhoI和NotI位點。通過限制圖譜，PCR或測序來確定插入和正確的方向。所得質粒稱為pMMTC/IFNβ。實施例4組成性分泌高水平的功能人β-干擾素的CHO細胞克隆的建立根據所述方法(Low等，生物化學雜志266；19710-19716，1991)用pMMTC/IFNβ轉染CHO細胞。在G418(800μg/ml)中篩選細胞7-10天，以使穩定轉染的細胞生長。然后，細胞在含50-100μMZn2+離子的培養基中溫育24至48小時，以誘導人金屬硫蛋白的表達，接著在具有逐步增強濃度的Cd2+(終濃度200μM)培養基中溫育。將單個菌落克隆并擴大培養。克隆細胞的培養基中積累β-干擾素，至濃度為106I.U./ml或更多，106個細胞在近24小時內分泌了106I.U.或更多的β-干擾素。實施例5在CHO細胞中生產人β-干擾素野生型中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1系(ATCCCCL-61)在含10％胎牛血清的Dulbecco極限必需培養基(DMEM)中增殖。細胞生長于37℃5％二氧化碳的空氣中。用pMMTC/IFNβ質粒轉染這些細胞以組成分泌高水平的功能人β-干擾素。根據上述實施例4的方法篩選細胞。在用Cd2+篩選過程中，測量轉染細胞克隆的β-干擾素抗病毒活性，以顯示它們組成性分泌高水平的功能性人β-干擾素。根據改進的Armstrong法(Armstrong應用微生物學21，723，1971)，通過在病毒激發中加入0.2μg/ml的放線菌素D并與病毒誘導的C.P.E.直接反應，測量抗病毒活性。通過這些測量，分離出單個菌落并擴大培養。事實上，發現幾個細胞系生長于塑料瓶中時能產生106I.U./ml至107I.U./ml的β-干擾素。將這些細胞系中的一個GS38保持培養12個月，以測試其保持生產一致的高水平β-干擾素的能力。將GS38細胞系保持在塑料培養瓶(80cm2)中的DMEM中，DMEM含10％胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2.5μg/ml兩性霉素和150μM硫酸鋅(“正規培養基”)。通過向一個1700cm2滾瓶中加入一燒瓶GS38細胞培養物進行滾瓶接種，且細胞保持在200ml正規培養基中。在第2天和第4天棄去滾瓶中的培養基，并且每次補充200ml新鮮的正規培養基。第6天，將此正規培養基棄去，在滾瓶中補充300ml無血清DMEM培養基，它含2.5mg/ml人血清白蛋白，所述人血清白蛋白中含表1所列的一系列附加成份(“無血清培養基”)。表1成份濃度青霉素100μg/ml鏈霉素100μg/ml兼性霉素B2.5μg/mlZnSO4150μMEX-CYTE(商標)*1∶1000轉鐵蛋白2.5-5.0μg/ml胰島素5μg/ml*EX-CYTE是一種來自人血清的水溶液補充液體，由Bayer，IllinoisUSA出售。第7天，棄去無血清培養基，重新補充300ml無血清培養基。第8天，再將無血清培養基棄去，并重新補充300ml無血清培養基。第9天，收集無血清培養基(300ml)，并又補充300ml無血清培養基，每天重復這一收集步驟，再進行14天。從每一滾瓶中收集總量約4.2升的GS38產β-干擾素(或GS38-IFNβ)。從每ml來自GS38細胞的粗收集物獲得24×106至3.6×106I.U.的β-干擾素。這相當于每天從一滾瓶GS38細胞中獲得1.35mg至2mg的GS38-IFNβ，每天從1升粗收集物中獲得5mg至6.7mgGS38-IFNβ。以Gb23-902-531標準(由國立過敏與傳染病研究所，NIH，USA頒布的NIH參考標準)為準，此粗GS38-IFNβ，當純化至均一時，比活性為5.37×108I.U./ml蛋白(牛血清白蛋白)。合并GS38-IFNβ粗收集物，并結合使用親和柱和離子交換柱將此收集物進行色譜純化(Tan等，生物化學雜志，254，8067-8073，1979；Edy等，252，5934-5935，1977；Knight等美國國家科學院院刊73，520-523，1976)。得到純的GS38-IFNβ，回收約70-80％。按下述均一性標準，經分析發現此純的GS38-IFNβ是均一的-在SDS-PAGE(15％)上發現表觀分子量為26,300的單一分子物質(圖5a)。這與Tan等人(1970和1973)利用原代人二倍體包皮成纖維細胞在超誘導步驟后生產的天然β-干擾素的分子量相似(見圖5b)。注意，從BIO-RAD獲得的寬范圍分子量標記與我們及他人先前報道所用的標記稍有不同。由Western印跡證明這些β-干擾素(GS38-IFNβ和人成纖維細胞產β-干擾素)的性質屬于平均分子量為26,300的單一物質。-當進行phlc(HewlettPackard1090)C18柱色譜時，物質的蛋白質峰與干擾素抗病毒活性直接相關。-進行氨基酸測序時，物質具有β干擾素序列。發現培養12個月的GS38細胞生產的GS38-IFNβ量沒有很大變化。在整個過程中，細胞生產GS38-IFNβ量為2.35至3.6×106I.U./ml。分析了GS38-IFNβ的五種生物活性。按Tan等人(1970)的超誘導法另外在超誘導前用100I.U.的β-干擾素激活細胞16小時，從早期至中等傳代的初級人包皮成纖維細胞生產出來自下述初級人成纖維細胞的β-干擾素。所得β-干擾素用親和層析純化。分析測定的5種活性為1.在改進的Armstrong(1971)法后的人MRC5成纖維細胞或人肝胚細胞瘤細胞系(hepG2)上分析β-干擾素的抗病毒活性。據在MRC5人成纖維細胞上進行分析，參照NIHβ-干擾素標準，GS38-IFNβ的比活性為5.37×108I.U./mg蛋白質。HepG2細胞中GS38-IFNβ的抗病毒活性與來自人成纖維細胞的天然β干擾素的活性至少相等或高1.5倍。GS38-IFNβ在保護HepG2細胞免受病毒VSV激發中有效性比betaseron(產自大腸桿菌的重組人β-干擾素)也高約2.2倍。2.根據用于初級人細胞所述但是是應用于HepG2細胞上的方法進行人肝胚細胞瘤細胞上β-干擾素的細胞生長抑制分析(Tan，自然260，141-143，1976)。但是，在含1ml正規培養基和初始HepG2細胞數為3至5×104細胞/孔的2cm2孔中進行此項分析。因此，GS38-IFNβ與使用相同方法體外測量的天然原代人二倍體成纖維細胞β-干擾素在抑制HepGI細胞生長中的效果一樣。3.在家兔身上進行皮下注射β-干擾素的藥代動力學實驗。將來自GS38或初級人成纖維細胞純化的β干擾素或來自大腸桿菌的betaseron分別重新置于pH7.0含20mg海藻糖的1ml磷酸緩沖鹽水(0.15MNaCl)4mg人血清白蛋白中。分別在體重為約1.5kg和約2kg的患白化病的家兔背部皮下注射0.7×106或1.5×106I.U.的干擾素。在15分鐘、30分、1h、2h、3h、4h和5h從家兔上取全血。然后根據改進的Armstrong法(1971)分析取血血清的β-干擾素抗病毒活性。圖10(a)和(b)中所示結果表明GS38-IFNβ比初級人成纖維細胞生產的β干擾素和betaseron具有更高的生物利用度。在家兔中注射1.5×106I.U.的GS38-IFNβ，1小時后觀察到血清中GS38-IFNβ的最高水平(128-256I.U./ml)，觀察到GS38-IFNβ的顯著水平(64-128I.U./ml)至少5小時。這是出人意料的。通常已知皮下或靜脈注射人β干擾素會導致無血清水平或低血清水平的循環人β干擾素。4.在家兔身上還進行了β干擾素干凈靜脈丸的藥代動力學。約等于β干擾素0.7×106I.U.的各種β-干擾素1ml(GS38-IFNβ，初級人成纖維細胞生產的干擾素和大腸桿菌betaseron)被注射入家兔耳靜脈，在5分、10分、15分、30分和90分取血(500μl)。按Armstrong(1971)的改進方法分析測定血清的β-干擾素抗病毒活性。結果示于圖11，與初級人成纖維細胞產的β-干擾素(t1/2＝4.4分)或betaseron(t＝3.8)相比，GS38-IFNβ的半衰期為13.6分鐘，按標準方法學，將注射的β-干擾素總量除以血體積評估出β干擾素在0時刻的初始濃度。假設血體積是家兔體重的5％，衰減至此初始濃度50％時的對間為t。5.我們研究了GS38-IFNβ注射量增加的劑量效應。對約2kg的家兔皮下注射增加量的GS38-IFNβ，具體數值為1.2×106I.U.、2.5×106I.U.和10.1×106I.U.的GS38-IFNβ。圖2的結果表明，皮下注射增加劑量的GS38-IFNβ，在被注射的家兔血清中可測水平的GS38-IFNβ成正比例增加。實施例6與GS38-IFNβ結合的寡糖的分析GS38-IFNβ是糖蛋白。與GS38-IFNβ結合的寡糖被定量釋放、復原。通過無水肼處理釋放出N聯和O聯聚糖。在此步驟中，蛋白質骨架被轉化成氨基酸腙。完整的還原聚糖被分離、復原并以2-氨基苯甲酰胺進行了熒光測定標記。更具體來講，將一個GS38-IFNβ(1-2mg)樣品進行劇烈的樣品制備，包括冷凍干燥(＜50millTorr(毫米汞柱)，＞24小時)。導入GlyoPrep1000(OxfordGlycoSystems，GB)以及利用“N+O”方案使寡糖釋放并復原。通過還原胺化作用使用2-氨基苯甲酰胺對樣品進行熒光標記。將樣品置于Whatman3mm層折紙，并使用1-丁醇/乙醇/水(4∶11)進行上行紙層析。隨后用水洗脫保持在原起點的被標記樣品。該方法使所有收集樣品GS38-IFNβ結合寡糖以2-氨基苯甲酰胺標記的寡糖形式定量(且非選擇性)地復原。將合并的標記寡糖進行分級分離，并按下述方法進行分析通過hplc陰離子交換色譜分析標記寡糖的電荷分布。這樣，在GlycoSepC柱(OxfordGlycoSystems，GB)對2-氨基苯甲酰胺標記寡糖總收集樣中的一等份試樣進行hplc陰離子交換色譜，使用乙腈和乙酸胺作洗脫劑。用熒光計在λex＝356mmλem＝450mm處探測從柱中洗脫的標記聚糖。所得色譜示于圖6。圖6顯示出GS38-IFNβ結合寡糖由中性和酸性兩種成分組成。為確定酸性取代基的性質，將熒光標記寡糖總收集樣的一等份試樣與神經氨酸酶(來自產脲節桿菌)一起溫育。再將一等份試樣進行GlycoSepC色譜。所得色譜示于圖7。在與神經氨酸酶一起溫育后，沒有檢測出酸性寡糖。由此，攜帶酸性取代基的寡糖之所以呈這種情況，僅僅是因為它們擁有一個共價相連的非還原末端外臂唾液酸殘基。通過對色譜峰(圖6)積分確定出總收集樣中中性和酸性寡糖的相對摩爾含量。結果如下中性10％±0.8％(至1s.d.)酸性90％±0.6％(至1sd.)s.d.＝標準偏差2.由GS38-IFNβ釋放的脫酸寡糖總收集樣中的大小分布使用RAAM2000(OxfordGlycoSystemsGB)，對脫酸的2-氨基苯甲酰胺標記寡糖總收集樣中的一等份試樣進行高分辨凝膠滲透色譜。所得凝膠滲透色譜示于圖8。要說明的是，熒光標記的脫酸寡糖被懸浮于葡聚糖部分水解物的水溶液中，并用于RAAM2000(水為洗脫溶劑，保持于55℃，恒定流速80μl/min，10.6小時)。用序列式(in-line)熒光流式探測儀(探測熒光標記樣品)和序列式差示折光計(探測個體葡萄糖寡聚物)進行探測。圖8中的數字上標代表非熒光、其提供(co-applied)的以葡萄糖為單位(gu)的葡萄糖寡聚物的洗脫位置，與同時以折射率檢測的結果一樣。測量個體2-氨基苯甲酰胺標記寡糖的流體動力學體積，以葡萄糖單元表示，正如在與熒光標記寡糖緊接的兩個葡萄糖寡聚物間通過立方仿樣內插(splineinterpolation)計算出的結果。明顯可見，在葡聚糖標定范圍內至少6個分離的寡糖是可辨認的，它們有效流體動力學體積如下20.7gu14.5％17.6gu23.4％14.5gu29.8％12.2gu26.4％11.1gu2.1％1.0gu3.8％總體積≤20gu的流體動力學體積準確度至±0.1gu。聚糖與2-氨基苯甲酰胺(2-AB)的結合使聚糖的流體動力學體積減少了一個恒定值。利用下面等式從未減少的聚糖流體動力學體積(λ)計算出2-AB標記聚糖的流體動力學體積(λf)λf＝1.2λ-1.963.從GS38-IFNβ釋放的脫酸聚糖的分子量分布因為是在葡聚糖校準曲線外探測出了峰(圖8)特別是在空隙體積中探測出峰，必須獲得一個分子量分布以確定存在的糖的種類。在3，5-二羥基苯的基質(matrix)上準備一等份試樣的脫酸聚糖收集樣。獲得基質輔助激光解析電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜呈陽離子形式(即，分子離子加鈉)。下述離子可被分配給糖(圖9)分子離子鈉(MolecularIonNa)1929.92292.52660.13019.14.總結糖蛋白GS38-IFNβ攜帶的寡糖具有下列特征(i)中性(非酸性取代基)10％±0.8％酸性90％±0.6％(ii)脫唾液酸寡糖總收集樣是異質的，至少有6個可辯結構成分存在于總收集樣中。(iii)MALDI-TOFL質譜數據和RAAM2000數據可總結如下</tables>Hex＝己糖，dHex＝脫氧己糖，HexNAc＝N-乙酰己糖胺，2AB＝2-氨基苯甲酰胺，Na＝鈉離子注意在1.0gu洗脫的峰會包含在MALDLI-TOF質譜中的基質(matrix)內，因此檢測不出來。實施例7使用pMMTC在CHO細胞中表達人促紅細胞生成素通過PCR，利用pfu聚合酶，從已被逆轉錄的人腎mRNA得到編碼人促紅細胞生成素(EPO)的cDNA。5′和3′PCR引物核苷酸序列如下5′PCR引物5′-GTGGATCCGCCACC/ATG/GGG/GTG/CCAC/GAA/GT/CCT/GCC/TG-3′(設計ATG起始Met密碼子前的CCGCCGCCACC序列使所得mRNA能被最佳翻譯)；3′PCR引物5′-GATCTAGACAGTTCTTGTCAATGAGGTTGAAG-3′此PCR產物被凝膠純化，用限制酶BamHI和XbaI切割，然后連接入已被BamHI和XbaI切割的pGEM-11Z質粒。在確認了EPO編碼區的核苷酸序列后，pGEM-11Z質粒通過用XhoI和NotI切割從中查到cDNA。將EPOcDNA用凝膠純化，并插入pMMTC的XhoI-NotI位點，得到質粒為pMMTC/EPO。用pMMTC/EPO轉染野生型CHO細胞(CHO-K1)，起初用G-418篩選7天，然后再用濃度逐漸增加的Cd(4、8、16、32、64和92μM)篩選。在初始的G418篩選后得到大約幾千個菌落。當Cd濃度為64μM時，大約仍存活有100個菌落。在這100個菌落中，將60個單獨分離并擴大培養，通過Western印跡分析其培養基中EPO水平，得到8個高表達菌落的鑒定(分別為E15/1、E15/3、E15/8、E15/10、E15/13、E15/18、E15/26和E15/30)。將存活菌落進一步在92μMCd的培養基中篩選，此步篩選后，幾個菌落存活，其中將6個菌落(分別稱之為C5、C10、C11、C12、C14和C15)單獨分離并分析測定EPO表達水平。通過Western印跡進一步比較64μMCd篩選后8個高表達菌落的EPO分泌水平和92μMCd篩選后的6個菌落的EPO分泌水平。所選菌落的細胞接種于35mm(直徑)培養皿中，長至匯合，在每一培養皿中加入1ml培養基，并培養24小時。然后收集培養基，每份10μl與對照樣50gEPO(泳道15)一起進行SDS-PAGE分離，利用AmershamECL探測系統通過Western印跡進行分析。Western印跡B示于圖13。權利要求1.一種核酸載體，包含(i)一個編碼目的蛋白質的編碼序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導此編碼序列在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；(ii)包含金屬硫蛋白基因的第一選擇性標記序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導此金屬硫蛋白基因在哺乳動物細胞表達的啟動子可操縱連接；和(iii)包含neo基因的第二選擇性標記序列，它與一個能指導neo基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接。2.根據權利要求1的載體，其中用于編碼序列的啟動子是金屬硫蛋白基因啟動子。3.根據權利要求2的載體，其中啟動子是小鼠金屬硫蛋白基因I啟動子。4.根據前述任一項權利要求的載體，其中用于編碼序列的啟動子還與一增強子可操縱連接。5.根據權利要求4的載體，其中增強子是小鼠肉瘤病毒增強子。6.根據前述任意一項權利要求的載體，其中用于第一標記序列的啟動子是金屬硫蛋白基因啟動子。7.根據前述任意一項權利要求的載體，其中第一標記序列含一個人金屬硫蛋白基因。8.根據權利要求7的載體，其中用于第一標記序列的啟動子是用于人金屬硫蛋白基因的天然啟動子。9.根據前述任意一項權利要求的載體，它是一個DNA質粒。10.根據前述任意一項權利要求的載體，其中編碼序列編碼人β干擾素或人促紅細胞生成素。11.攜帶有一種核酸序列的哺乳動物細胞，所述序列包含(i)一個編碼目的蛋白質的編碼序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導此編碼序列在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；(ii)包含金屬硫蛋白基因的第一選擇性標記序列，它與一個能在重金屬離子存在下指導此金屬硫蛋白基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接；及可任選地含有；(iii)包含neo基因的第二選擇性標記序列，它與能指導neo基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接。12.根據權利要求11的細胞，它們是野生型中國倉鼠卵巢細胞。13.根據權利要求11或12的細胞，其中用于編碼序列的啟動子是金屬硫蛋白基因啟動子。14.根據權利要求13的細胞，其中啟動子是小鼠金屬硫蛋白基因I啟動子。15.根據權利要求11至14任意一項的細胞，其中用于編碼序列的啟動子還與一增強子可操縱連接。16.根據權利要求15的細胞，其中增強子是小鼠肉瘤病毒增強子。17.根據權利要求11至16任意一項的細胞，其中用于第一標記序列的啟動子是金屬硫蛋白基因啟動子。18.根據權利要求11至17任意一項的細胞，其中第一標記序列包含人金屬硫蛋白基因。19.根據權利要求18的細胞，其中用于第一標記序列的啟動子是用于人金屬硫蛋白基因的天然啟動子。20.根據權利要求11至19任意一項的細胞，其中核酸序列是一個DNA序列。21.根據權利要求11至20任意一項的細胞，其中編碼序列編碼人β干擾素或人促紅細胞生成素。22.一種權利要求11所定義的細胞的制備方法，該方法包括(a)用權利要求1至10任意一項定義的載體轉染哺乳動物細胞；(b)將被轉染的細胞暴露于遺傳霉素，由此排除缺失neo基因的細胞；并(c)將經步驟(a)存活下來的細胞暴露于濃度逐漸增加的重金屬離子中，由此篩選出所需要的細胞。23.根據權利要求22的方法，其中步驟(c)中的細胞被暴露于達200μM的選自Cd2+、Cu2+和Zn2+的重金屬離子。24.neo基因和金屬硫蛋白基因在一個載體中用作選擇性標記的用途。25.一種制備目的蛋白質的方法，此方法包括在允許所述蛋白質表達的條件下培養如權利要求11至21任意一項定義的哺乳動物細胞，并回收由此表達的所述蛋白質。26.根據權利要求25的方法，其中在重金屬離子存在時培養細胞。27.根據權利要求26的方法，其中在100至200μM的選自Cd2+、Cu2+和Zn2+的重金屬離子存在下培養細胞。28.根據權利要求27的方法，其中在約150μMZn2+存在下培養細胞。29.人β-干擾素，其特征在于當在重約2kg家兔的背部皮下注射1.5×106I.U.的干擾素時(a)1小時后在家兔血清中可檢測到≥128I.U./ml的干擾素；和/或(b)5小時后在家兔血清中可檢測到≥64I.U./ml的干擾素。30.人β-干擾素，其比活性為相對于牛血清白蛋白每毫克當量4.8×108到6.4×108I.U。31.人β-干擾素，其可根據權利要求25至28任意一項的方法獲得。32.人促紅細胞生成素，可根據權利要求25至28任意一項的方法獲得。33.一種藥物組合物，包含一種藥學上可接受的載體或稀釋劑和一種作為主要活性成分的權利要求29至31任意一項中所定義的人β-干擾素。34.一種藥物組合物，包含一種藥學上可接受的載體或稀釋劑和一種作為主要活性成分的如權利要求32定義的人促紅細胞生成素。全文摘要通過培養攜帶核酸序列的哺乳動物細胞制備諸如人β－干擾素或人促紅細胞生成素這類蛋白質,所述核酸序列包含:(i)一個編碼目的蛋白質的編碼序列,此序列與一個能在重金屬離子存在時指導此編碼序列在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接;(ii)包含金屬硫蛋白基因的第一選擇性標記序列,此序列與一個能在重金屬離子存在時指導此金屬硫蛋白基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接;及可任選地含有(iii)包含neo基因的第二選擇性標記序列,與能指導neo基因在哺乳動物細胞中表達的啟動子可操縱連接。文檔編號C12N15/22GK1185180SQ96194053公開日1998年6月17日申請日期1996年3月22日優先權日1995年3月24日發明者陳英輝,方遠真申請人:分子和細胞生物學研究所