專利名稱：多核苷酸免疫原性劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一些可作為免疫原性劑的表達載體，它們編碼部分或完整長度的erbB蛋白(EGF受體)，尤其是her2/erbB-2/neu受體。
更具體講，本發明涉及上述載體用于制備引起宿主細胞特異性免疫應答的藥物的應用。
背景技術：
已知有多種不同的表皮生長因子受體(EGFR)，如EGFR1，HER-2/neu，HER-3，HER-4等。尤其是HER-2/neu已經被提出作為腫瘤治療的靶點(WO90/14357)。
原癌基因HER-2/neu編碼一種185kDa的膜受體蛋白(p185)(Schechter.A.等，1984，自然(Nature)312/513)。
HER-2/neu的功能目前尚不十分清楚，但似乎與酪氨酸激酶的活性增強有關(Di friore.P.等.1990分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)102749)。
已經提出用不同配體與這一受體相結合，依據配體種類與/或實驗條件的不同，它們能介導興奮性及抑制性信號(Peles.E.等.1992細胞(Cell.)69205)。
HER-2/neu在胎盤形成及器官發生時期表達(Kokay.Y等.1987美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)848498；Knezevic V.等.1994 J.Anat.1985181)。在許多具上皮/腺體的成熟組織中可以檢測到少量該受體(Press.M.等.1990癌基因(Oncogenes.)5953)。
p185的突變或過量表達與腫瘤的致病機理有關。點突變會導致原癌基因的激活(Bargmann.C.&Weimberg R.A.1988 EMBO J.72043)。在人類中尚未發現這類突變，但是已經在腺體源性的癌癥中發現(如乳腺、卵巢、肺及腎臟的腺體癌)，腫瘤轉移活性與具有正常結構的p185的擴增或過量表達有關。
p185的擴增與乳腺癌患者的預后不良有關(Yokota.J.等.1986 Lancet.I.765；Slamon.D.J.等.1987科學(Science)，2351772；Yonemura.Y.等，1991.癌癥研究(Cancer Research.)511034，Gustarson.B.A.等人.1992.歐洲癌癥雜志(Europ.J.Cancer.)28263)。
近來的研究還提出該受體過量表達與藥物抗性現象有關。
事實上過量表達HER-2/neu的癌癥對5-氟尿嘧啶治療不敏感(Paikj S.M.等.1991美國癌癥研究會進展(Proc.Am.Assoc.Cancer Resear.)32，291)。轉染實驗已證明了這一點，乳腺癌細胞系在導入HER-2/neu后對他莫昔芬和順鉑有了抗性(Benz C.C.等.1992乳腺癌的研究治療(BreastCancer Research Treat.)24，84)。
處于乳腺癌I期的患者，雖有良好的預后，但也有免疫化學方法可檢測到的HER-2/neu，這些患者化療之后又會復發(Alfred D.C.等.1992 J.Clin.Onc.10，599和Gusterson B.A.等.1992 J.Clin.Onc.10，1049)。而且，抗HER-2/neu的抗體可增加順鉑及腫瘤壞死因子(TNF)對乳房及卵巢癌的細胞毒性(Hancock M.C.等，1991，癌癥研究，51，4575和HudziacR.M.1989分子細胞生物學9，1165)。另一方面，在抗藥性細胞系中，EGFR數量增加(Meyers M.B.等.1986美國國家科學院進展83，5521)，針對上述受體的抗體增強了藥物的細胞毒性效果(Aboud-Pirak E.等.1988國家癌癥研究所雜志(J.Natl.Canc.Inst.)80，1605；Baselga J.等.1993國家癌癥研究所雜志85，1327)。
類似于抗體，EGF也可增加烷化劑如順鉑、電離射線、絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶、阿霉素的細胞毒性效果(Christen R.D.1990臨床調查雜志(J.Clin.Inv.)86，1632；Kowk T.T.等.1989國家癌癥研究所雜志81，1020；Amagase H.等.1990藥物動力學雜志(J.Pharm.Dyn.)13，263；AmagaseH.等.XXX日本癌研究雜志(Jpn.J.Canc.Res.)80.670；Kowk T.T.等.1991 Int.J.Cancer 49，73)。
p185在正常上皮組織中少量表達，而在癌組織中大量表達，因此可推出在被動免疫治療中，此受體可以作為靶抗原(例如可以用單克隆抗體來治療)。比如已經知道某些抗p185的單克隆抗體在體外及裸鼠中都能抑制乳腺癌細胞的生長(Marx.J.1993科學259226)。
最近已經證實，抗erbB-2單克隆抗體可以通過對受體本身進行下調而具有抑制腫瘤細胞的效果(KatsumatuM.等，1985，自然醫學(NatureMedicine)1644-648)。
雖然已經提出用主動免疫(疫苗接種)來中和這種靶抗原，但這種方法的缺點是被引發的免疫反應有可能對正常表達這種抗原的上皮組織有毒性。
另一方面，將體內導入只表達neu原癌基因胞外部分的重組痘病毒，可以完全、特異地抑制表達這種抗原的腫瘤細胞而保護小鼠(Bernards R.等.1987美國國家科學院進展846854)。
由于在腫瘤發生和胚胎發育過程中，生長因子及其受體作為自分泌及旁分泌調節循環起重要作用，因此基于這兩個發育過程的實驗模型對本發明的目的尤為重要。
發明概要本發明涉及基本純的cDNA在制備用于腫瘤免疫治療的致免疫藥物中的應用，這些cDNA編碼同源性源HER-2/neu，或其它EGF受體，或上述受體的部分序列。
本發明也涉及包含有一種上述cDNA的表達載體如質粒。
本發明也涉及上述cDNA在分離篩選用于產生特異單克隆抗體的B-淋巴細胞中的應用。
附圖簡述
圖1 pCDneuNT構建體圖2 pCDneuNT免疫對妊娠的影響Swiss(遠交系)雌性小鼠(3至6只)用pCDneuNT免疫，最后一次加強給藥兩周后，與雄性小鼠交配一天。通過陰道涂片上精細胞的存在來分析交配情況(妊娠第一天)，報道的數據涉及懷孕過程中個體生長速率。1、2號小鼠未經免疫(對照)。發明的詳細描述按照本發明，通過體內注入編碼EGFR、尤其是HER-2/neu的非感染性cDNA可引發用于抗腫瘤治療的免疫應答。
事實上，這種治療方法能顯著減小腫瘤塊，并能抑制實驗誘發的同系腫瘤的生長。
妊娠模型也證實了這種體內免疫的效果，事實上，胚胎發育與腫瘤發生具有某些相關聯的生物學特點，至少在它們的起始階段是這樣。例如這一時期erbB-2/neu基因的表達量增加。
實際上已證實妊娠小鼠體內的免疫應答選擇性地抑制了這種抗原，從而阻礙了胚胎發育。但是對已分化的成熟上皮組織則沒有或只有極微弱的細胞毒性。依據這一特異性細胞毒性效果，上述選擇性與抗p185抗體的產生有關(這些抗體識別受體胞外結構域上的抗原決定簇)，而且還表現出對甲醛異乎尋常的抗性。這種選擇性通過下列實驗也得到進一步證實抗體能與pCDneuNT質粒轉化的NHI-3T3成纖細胞以及過量表達c-erbB-2的乳腺腫瘤細胞系SK-BR3進行反應，人乳腺浸潤性導管癌及neu轉基因小鼠結狀乳腺癌樣品進行的組織學染色也可證明這一點。
由于在腫瘤發生和胚胎發育這兩個過程中，免疫反應引起的抑制作用令人驚異地僅局限于正在發育組織中過量表達erbB-2/neu的結構，而對已分化的組織無效，因此可認為用編碼EGFR的序列進行DNA疫苗接種能作為一種特異而有效的抗腫瘤療法。
與已知免疫療法相比，本發明有幾個優點，例如與被動注入單克隆抗體相比，導入多核苷酸不僅可以引發抗體的產生，還能夠引起具有細胞毒性的CD8+MHCI型T-淋巴細胞的產生和擴散。
另一種免疫療法是導入某些含特異序列的肽，這些序列是引起免疫應答的蛋白的抗原決定簇。甚至與這種療法相比，本發明也具有顯著的優點，即它不局限于特定的同種異型，因為針對隱性亞優勢抗原決定簇的潛在T細胞可被同源性外源抗原激活，以在各主體中獲得根據其自身的同種異型自動選擇的Th免疫應答。
而且由于抗原濃度低時傳統免疫能產生高度親和性的抗體，因此正如在多核苷酸免疫實驗中所觀察到的，低濃度抗原的表達能使免疫起始階段就產生高親和性抗體。
與使用病毒載體進行免疫相比，用裸DNA進行操作更為安全。因為1)DNA無傳染性，2)抗原性DNA不會整合到宿主染色體中(表達載體以游離體形式存在約一周)。
病毒免疫產生的細胞毒性會減少表達病毒抗原的宿主細胞數量。
更不利的是很多病毒對宿主的轉錄因子有負調控作用，這一方面會減少細胞表面MHCI型分子的表達量，另一方面妨礙胞內蛋白的正常加工，同樣也會減少MHC分子上抗原決定簇的數目。因而本發明的另一優點是抗原DNA序列更易于獲得和控制。
按照本發明，可用已知方法制備這種免疫原性劑。由于EGFR或HER-2/neu的DNA序列已知，因此可用傳統的PCR、重組DNA等方法制備。也可選擇使用嵌合結構或基因的部分序列，只要其表達產物具有合適的免疫原性就行。例如可以把EGFR DNA與一段或幾段調控序列(啟動子及復制起始區)相連接，使之能在動物組織或用于該制備方法的微生物中得到表達。上述調控序列可以從質粒或病毒獲得，如SV40或巨細胞病毒(CMV)或Rons肉瘤病毒(1994年9月29日的WO94/21707)。
該制劑可按已知方法給藥(Donnelly J.J.等.1994，The immunologist2∶1)DNA肌肉注射被認為是治療傳染性疾病的一種新的免疫接種方法，除此方法，其它DNA導入途徑也是可行的，如非腸道的及粘膜途徑(美國國家科學院進展1986 83，9551；1990年10月4日的WO90/11092)。DNA也可以吸附于微金顆粒上，通過發射裝置透皮給藥(Johnston，1992自然356，152)。
而且如同前面所討論的，這一免疫方法在制備具有體內生物活性的單克隆抗體方面有顯著優點。事實上，用含有上述癌基因或相關原癌基因(neuNT，neu)的DNA對動物進行免疫后，可以直接從其脾中分離到淋巴細胞系以用于制備單克隆抗體。與之相似，所述疫苗可用于從人外周血分離淋巴細胞系以制備單克隆抗體，在被動免疫中作為佐劑，可與有細胞毒性的分子進行結合。
實施例1.1pCDneuNT表達載體的克隆所有的DNA酶切操作、重組體的克隆及鑒定均嚴格按照Maniatis的方法(《基因克隆》)。質粒pSV2neuNT含有編碼全部neuNT產物蛋白的cDNA(ref，Weinberg)，用HindIII，SalI及EcoRI酶切這一質粒。EcoRI酶切后可產生原質粒(PSV2neo)的兩個片段，HindIII/SalI雙酶切則產生完整長度的cDNA(約4600bp)，再將這一HindIII/SalI雙酶切片段克隆進預先經HindIII/SalI雙酶切的中間載體pSP64。如前所述再對重組質粒pSP64neuNT(Amersham)進行克隆及鑒定。pSP64neuNT經HindIII/EcoRI雙酶切產生兩個片段1)3000bp片段(pSP64)，2)約4600bp片段(neuNT)，將片段2再克隆到預先制備并經HindIII/SalI雙酶切的pCDNAneo中，最后得到了可應用于免疫過程的重組載體。1.2小鼠及大鼠的免疫將幾種小鼠(雌性遠交系Swiss，CDl，Balb-c，近交系FVBN，Balb-cH2D)按0.3ml/100g體重的劑量用戊巴比妥-Equithesinain麻醉后，用胰島素注射器(1ml)注射100μl溶有DNA的鹽溶液(1mg/ml)，免疫注射共分三次進行，每次間隔兩周。Wister大鼠也用同樣的方法免疫。1.3抗原的體內表達為證明pCDneuNT質粒在體內表達了neuNT抗原，注射完畢后48小時殺死動物，完整取出其四頭股肌，加入蛋白抑制劑和非離子去垢劑勻漿。提出總蛋白，按標準步驟進行斑點雜交，用單特異性兔多克隆抗neuIgG抗體(K15)SC-07(Santa Kruz Biotecnology，USA)來檢測p185抗原(斑點雜交及所有下述其它免疫化學技術的操作都引自《抗體實驗操作手冊》1988，冷泉港實驗室Ed.Harlow/Darid Lane)。
實驗結果表明，只有從注射pCDneuNT的動物肌肉中提取的蛋白才能與抗p185抗體結合，而注射對照質粒則不行。因此，pCDneuNT質粒能夠指導肌肉纖維中p185分子的合成。1.4宿主體內的免疫反應性i)小鼠已知與外源抗原反應的能力很大程度上依賴于實驗動物的種系。關于大鼠neu在小鼠體內的免疫原性，據文獻報道(BernardsR.等1987.美國國家科學院進展896854-6858)，用病毒疫苗免疫后，能針對原癌基因胞外結構域(ECD)產生抗體的僅限于屬于雜合種群的宿主。因此有必要在以這一基因進行免疫后，檢測不同種系動物的抗p185的免疫反應性。
八周齡的實驗動物(遠交系Balb-c，CD1，Swiss，近交系Balb-cH2D或FVBN小鼠)按前面所述步驟注入100ug對照質粒或等量的pCDneuNT質粒。對照質粒來源于從相同實驗動物取出的免疫前血清。
用Western雜交檢測抗p185抗體的產生及其特異性，以pCDneuNT轉化的3T3細胞裂解產物作為抗原來源(BernardsR.等1987.美國國家科學院進展846854-6858)。結果表明，純種及雜種小鼠均能識別pCDneuNT免疫產生的大鼠蛋白。
通過對過量產生受體的轉基因MMTV、neuN小鼠的乳腺瘤進行免疫化學分析，進一步證實了抗原抗體復合物的形成(C.T.Guy等.1992 PNAS 8910578-582)。
用前面所述方法制備MMTV、neuN轉基因小鼠的乳腺瘤組織切片(3-5u)，并加入用pCDneuNT或對照質粒免疫后的抗血清孵育(稀釋度1/30)，而后加入與過氧化物酶(1/100稀釋)結合的羊抗小鼠抗體，結果只有pCDneuNT抗血清才能在腫瘤細胞膜上形成清楚的著色區。ii)大鼠pCDneuNT免疫小鼠是一種典型的異源免疫反應，因為它是一種動物(大鼠)的免疫原性蛋白在另一種動物(小鼠)宿主中引起反應。為證實基因在完全同源的系統中是否可以引起抗p185免疫反應，按照與小鼠免疫相同的方法，把pCDneuNT質粒注入大鼠(遠交系)。結果表明，既使將導入質粒的量增至0.8mg也沒出現抗p185血清陽性。這一結果與報道相一致(BernardsR.等.美國國家科學院進展846854-6858 1987)，并進一步證實鼠模型對自身抗原具有更強的耐受性(相對于人)(Floughton A.N.實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)1801-4(1994))。如果用同樣或其它方法同時注射載體與藥物，仍有可能減少或消除針對自身p185的耐受現象。1.5抗體特異性i)抗大鼠p185IgG作為自身抗體如果注入大鼠pCDneuNT能引起抗大鼠受體的抗體產生(抗neuNT反應)，那么單從系統原因考慮，同樣可認為小鼠抗體應該能識別小鼠自身的受體(自身抗原)，也能識別同源的人的erbB-2，組織化學方法已經證實了小鼠抗p185循環抗體與自身抗原發生免疫反應。
如同成年大鼠一樣，小鼠中neu原癌基因在上皮/內分泌組織如肺、肝、腎、腸及表皮細胞底層中是生理上正常表達的(KnerewikV.等.1994J.Anat.1811985)。在實驗中，用過量醚蒸氣處死動物。按照Carnoix的方法，用其組成型表達erbB-2/neu的組織(如腎)來制備組織切片(3-5μ)，并進行標準的組織學分析。樣品加入抗p185抗血清或對照血清(1∶60稀釋度)孵育，然后加入與堿性磷酸酶(1/100稀釋)結合的羊抗小鼠抗體，結果清楚表明a)p185循環抗體能針對同種動物腎細胞反應，b)對照質粒pCDNA-3免疫產生的抗體不能識別同種細胞。將小鼠腎勻漿抽提物與上述免疫小鼠血清或兔抗neuK15 SC-07抗體混合孵育，進行Western雜交，證實了鼠p185可作為靶抗原的特性。ii)抗大鼠p185IgG與人受體的交叉反應對過量表達p185erbB-2的人乳腺瘤細胞系衍生的SKBR3細胞(106受體分子/細胞，KrausM.H.等.1987 EMBO J.6606-610)進行免疫熒光顯微檢測，證明經pCDneuNT免疫的小鼠產生的抗p185抗體可以識別人的與p185同源的erbB-2蛋白。
SKBR3細胞經蓋片培養后，用冷甲醇/丙酮混合物(1∶1 V/V)固定(滲透細胞)，或用2％多聚甲醛固定(非滲透細胞)，制成載片，然后把細胞樣品與抗p185抗血清(1/30終稀釋度)混合孵育，用與熒光素FITG(Boehringer)(1∶60)結合的綿羊抗小鼠IgG抗體可證實抗原抗體反應的發生。載片置于激光同焦顯微鏡上檢查(BioRad MRC800K)(三重氬氣激光，60×油浸物鏡)。
經檢查，非滲透細胞的反應中，熒光較強并以分散方式分布于質膜的細胞外側部分；滲透細胞的反應中，熒光只分布于核周區域。這說明抗p185抗體是由能分別識別抗原胞內及胞外結構域的免疫球蛋白組成的混合物。
把SKBR3，T23.1(反轉錄病毒erbB-2DNA轉染的3T3NIH成纖維細胞)及對照3T3細胞的溶胞產物進行Western雜交，證實鼠抗p185抗體能識別人的同源抗原。用與辣根過氧化物酶-鏈霉親和素(1∶200)結合物相反應的生物素化羊抗小鼠IgG抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc)來檢測，結果證明，在pCDneuNT免疫的小鼠血清中有抗p185抗體。
抗p185抗體能與人erbB-2反應，還可識別這一蛋白的胞外結構域(即使經歷強烈的固定過程)。由這一結果可推出下列可能性即利用這些抗體來檢測一些人乳腺癌中erbB-2/neu的過量表達。
21例導管浸潤性腫瘤經外科切除后得到其病變組織樣品(來源于Macerata的Ospedale Civile的病理解剖部)，將樣品按與鼠組織同樣步驟進行固定，用石蠟塊包埋，制成切片后進行組織化學檢測。
這21份樣品以絕對成熟的方法加入商品抗體進行反應時，都呈erbB-2陽性結果，當用pCDneuNT免疫的雌性小鼠的血清進行免疫反應時，有8例呈現抗p185的免疫反應陽性。
為證實小鼠抗erbB-2/neu抗體能否與EGFR家族的其它成員反應(如EGFR-1)，將小鼠抗體與細胞表面高表達EGFR-1受體分子(2-3×106個/細胞)的人A431表皮癌細胞系混合孵育。通過熒光激光細胞分類掃描(FACSscann)對抗p185neu抗體與p170ECFR-1的免疫反應進行熒光免疫分析。分別制備抗原及抗體的對照，以淋巴細胞CEM(從一個急性淋巴細胞白血病人中分離衍生而來，不表達EGFR-1)作為陰性對照，以對erbB-2/neu的胞外結構域專一且不與EGFR-1抗原交叉反應的單克隆抗體W600作為陽性對照(Dr.P.G.Natali，Istituto di ricerca sperimentale Regina Elena，Roma)。細胞樣品與二次免疫的與熒光素異硫氰酸(FIT)結合的抗小鼠抗體混合孵育后，用Bekton Dickinson FACS進行檢測(氬激發激光488nm，發射光在525nm)，結果清楚地表明，免疫小鼠抗血清中的抗p185抗體與W600單克隆抗體呈同樣的反應性質，亦即它們都不與p170ECFR-1發生反應。1.6p185抗血清的體外活性抗p185血清對SKBR3細胞生長的抑制作用以103細胞/平皿的濃度將SKBR3細胞加入35mm培養皿，加入30μl(約300μg總IgG)抗p185抗血清及對照血清(第零天)，一周后取出平皿中細胞用血球計數器計數。結果表明pCDneuNT免疫小鼠中提出的IgG同型免疫球蛋白能抑制SKBR3細胞生長。1.7免疫接種的生物學效果i)免疫療法的毒性用以高濃度牛胸腺雙螺旋DNA作抗原的商品ELISA試劑盒(INOVDiasgnostics Inc；San Diego.CA)，證明進行DNA疫苗免疫后，不產生抗DNA循環抗體。沒有觀察到IgM與IgG含量的特別變化。
對血色素、VES白細胞系列，蛋白血等血液學及血清學參數進行檢測，結果均在正常范圍內。ii)組織病理學檢測由于免疫過的動物具有能與自身組織neu受體反應的循環抗體，因此有可能發生自身免疫病。介導這一過程的可以是補體系統(補體依賴性細胞毒性CDC)與/或天然殺傷細胞(抗體依賴的細胞毒性ADCC)(Stribling等.美國國家科學院雜志8911277-11281(1992))。
為證實這一假說，用過量醚蒸氣處死實驗動物，取出組成型表達erbB-2/neu的組織(腎、腸、卵巢、胎盤、乳腺)，用傳統方法固定，包埋入石蠟塊，按上述標準步驟制成切片(3-5μ)，脫蠟，然后用蘇木精及伊紅染色。
對pcDNAneuNT免疫的動物重復進行了組織學檢測，結果在免疫小鼠中均未發現即使是最微小的病變(如壞死區，淋巴細胞浸潤或其它)，因而可以說DNA免疫不會產生明顯的系統或組織水平的毒性。雖然動物的確有自身受體的抗體，但未觀察到系統或器官特異的自身免疫病現象。
現概括如下i)免疫治療后一年動物仍可正常進食，ii)動物毛皮質量優良，個體及社會行為無改變，iii)幾種血液學參數均正常，iv)組織學檢測未發現表達neu的組織有病變，v)免疫療法未產生可以檢測到的抗DNA的循環抗體IgM及/或IgG的增加。iii)pCDneuNT免疫接種對小鼠妊娠的影響83％的免疫雌性Swiss小鼠(n＝16)產生抗p185循環抗體。將10只血清陽性雌鼠與雄鼠同籠進行交配，此后(妊娠第一天后)通過陰道涂片上的精細胞來確定交配。孕鼠體重每兩天記錄一次，其中七只表現出每胎子代數量的減少(5±2只，對照組為13±3只)，而其余三只切除子宮檢查后發現胚胎全部被重吸收。
更為重要的是上述免疫療法對近交系小鼠如Balb/cH2D的影響，免疫后的動物都表現出抗p185抗體的明顯增加。19只免疫雌鼠中有14只根本來產下幼鼠，而其余5只僅產下數目很少的子代(1-2只)，而對照組15只鼠均產下18±3只后代。
與上述結果相反的是，未免疫小鼠與經對照質粒免疫的小鼠或pCDneuNT免疫的大鼠(同源基因免疫)在受胎能力方面沒有明顯差異。iv)乳房組織及胎盤的組織病理學檢測7只p185血清陽性孕鼠在妊娠第18天殺死，用于進行胎盤及乳腺的組織學檢測。如前所述對富爾馬林固定組織的切片(3-5μ)進行染色。所有標本中均未發現組織(病理學)病變。v)對小鼠腫瘤的效果為證實針對erbB-2/neu的免疫接種對過量表達這種原癌基因的腫瘤的治療效果，按下述步驟誘發遠交系小鼠的腫瘤Swiss CD1小鼠免疫周期結束兩周后，將CMVneuNT轉染的、細胞表面大量表達受體的NIH3T3成纖維細胞注入小鼠體內。注射部位瘤塊的生長按標準方法隨時間進行測定。在未免疫小鼠或對照質粒免疫的小鼠中，腫瘤細胞保持持續生長約三周(如表)，而用pCDneuNT免疫的小鼠注入轉化的成纖維細胞后，結果相反，注射部位沒有發現腫瘤塊的生長。
以上結果均表明，將CMVneuNT質粒以裸DNA的形式溶于注射用生理溶液中，用其進行的免疫接種能夠有效、特異地抑制過量表達neu癌基因的腫瘤細胞的粘附與擴散。
表腫瘤面積(mm2)1W 2W 3WA 150±60 380±50580±70B 150±60 410±65550±40Cnd nd nd對腫瘤生長的抑制10周齡的Swiss CD1(Charles River)雌性小鼠(每組12只)用質粒DNA進行免疫，C組用編碼neuNT的質粒，B組用編碼無關基因(p24-FIV)的質粒，A組注射生理鹽水。兩周后將neuNT轉染的107個3T3NIH細胞注入小鼠體內。W注射后的周數，表內數據為腫瘤的面積(±SD)。nd未發現腫瘤。
權利要求
1.一種多核苷酸免疫原性劑，其包括編碼一種表皮生長因子受體(EGFR)的cDNA，該cDNA與當肌肉注射或其它方法給藥時能指導cDNA表達的調控序列功能連接。
2.如權利要求1中所述的免疫原性劑，其中cDNA編碼HER-2/erbB-2/neu癌基因。
3.如權利要求1或2中所述的免疫原性劑，其中cDNA編碼EGFR家族中的原癌基因或癌基因。
4.如權利要求1、2或3中所述的免疫原性劑，用于腫瘤的預防或治療。
5.如權利要求4中所述的疫苗，用于乳腺及/或卵巢、肺和腎的腺癌以及其它表達上述癌基因的腫瘤的預防及治療。
6.如上述權利要求之一所述的免疫原性劑，其中調控序列來自于質粒或病毒。
7.如權利要求1、2、3、6中之一所述的免疫原性劑，用于從免疫原處理的動物中提產生抗受體單克隆抗體。
8.如權利要求7中所述的免疫原性劑，用于制備人單克隆抗體，該單克隆抗體與細胞毒藥物(免疫毒素)混合或連接后用于免疫治療。
9.如權利要求1、2、3、4、5中所述的免疫原性劑，用于在腫瘤治療中增強輔助治療。
全文摘要
本發明公開了一種多核苷酸免疫原性劑,它能引起針對表皮生長因子受體(EGFR)家族成員的免疫應答。
文檔編號C12P21/08GK1183806SQ96193756
公開日1998年6月3日 申請日期1996年4月3日 優先權日1995年4月4日
發明者A·阿米西, A·康塞提, F·M·瓦南希 申請人:卡米利諾國立大學