專利名稱：：蛋白酶變體和組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及在配制洗滌劑組合物中有用的新的突變酶或酶變體，它們在保持或提高其洗滌性能的同時表現出改善的貯存穩定性；本發明也涉及含有所說的酶的清洗或洗滌劑組合物，本發明也涉及在插入到合適的宿主細胞或者微生物中時使得所說的酶表達的突變基因；本發明還涉及用該基因轉化的并且能夠表達所說的酶變體的宿主細胞。發明背景在洗滌劑工業中，酶用于洗滌劑制劑中已經有30多年了，應用于這種制劑中的酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纖維素酶和其它的酶或這些酶的混合物。在商業上最重要的是蛋白酶。盡管蛋白酶已經用于洗滌劑工業30多年了，這些酶是如何與底物和其它存在于如洗滌劑組合物中的物質相互作用的細節仍然不太了解。已經闡明了有關特異性殘基的一些因素和影響某些性質的因素(如一般意義上的氧化穩定性和熱穩定性)，但是仍然有許多還沒有研究出來。而且也不確切知道哪一個物理和化學性質影響好的洗滌性能或者特異性洗滌劑組合物中的蛋白酶穩定性。發現目前應用的蛋白酶大部分選自從天然蛋白酶中分離出來的，并且在洗滌劑制劑中檢驗它們。在商業上使用數量不斷增加的蛋白酶是相應的天然存在的野生型蛋白酶的工程化蛋白變體，例如DURAZYM(NovoNordiskA/S)、RELASE(NovoNordiskA/S)、MAXAPEM(Gist-BrocadesN.V.)、PURAFECT((GenencorInternational公司)。因此，本發明的目的是提供改善的蛋白質工程蛋白酶變體，特別是用于洗滌劑工業中的變體。蛋白酶在蛋白質底物中切割酰胺鍵的酶分類為蛋白酶，或(可互換的)肽酶(參見Walsh，1979，酶促反應機制。W.H.Freeman和公司，舊金山，第3章)。芽孢桿菌屬的細菌種分泌兩種細胞外蛋白酶，一種是中性的或金屬蛋白酶，一種在功能上作為絲氨酸內肽酶的堿性蛋白酶。通常被稱為枯草桿菌蛋白酶。這些蛋白酶的分泌和細菌周期相聯系，在穩定期具有最大的蛋白酶表達量，此時也發生孢子形成，Joliffe等在(1980)細菌學雜志1411199-1208中提出芽孢桿菌屬蛋白酶在細胞壁翻轉中起作用。枯草酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點有一個重要的絲氨酸殘基(White，Handler和Smith，1973“生物化學原理”第15版，McGraw-HillBook公司，NY，pp.271-272)。細菌絲氨酸蛋白酶具有20,000至45,000道爾頓范圍內的分子量，此酶被氟磷酸二異丙酯抑制。它們水解簡單的末端酯，并在活性上和胰凝乳蛋白酶(也是一種絲氨酸蛋白酶)相似。更狹義地講，一亞組的堿性蛋白酶具有一些絲氨酸蛋白酶的較高的最適pH(從pH0.9-11.0)(參見Priest(1977)細菌學綜述41711-753)。Siezen等人已經提出一亞組暫時命名為枯草酶(subtilase)的絲氨酸蛋白酶(蛋白質工程4(1991)719-737)。通過絲氨酸蛋白酶的40多個氨基酸序列的同源分析限定它們，這些絲氨酸蛋白酶原來稱為類枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶。以前把枯草桿菌蛋白酶定義為革蘭氏陽性細菌產生的絲氨酸蛋白酶，按照Siezen等人所述，現在是枯草酶的一個亞組。鑒別了各種枯草桿菌蛋白酶，也測定了一些枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。這些蛋白酶包括得自芽胞桿菌屬菌株的6種以上的枯草桿菌蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN′、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶Y、枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus和mesentericopeptidase(Kurihara等(1972)生物化學雜志2475629-5631；Wells等(1983)核酸研究117911-7925；Stahl和Ferrari(1984)細菌學雜志159811-819，Jacobs等(1985)核酸研究138913-8926；Nedkov等(1985)生物化學Hoppe-Seyler366421-430，Svendsen等(1986)FEBSLett.196228-232)；一種得自放線菌目的枯草桿菌蛋白酶；得自普通高溫放線菌的thermitase(Meloun等(1985)FEBSLett.198195-200)和一種真菌枯草桿菌蛋白酶，得自Tritirachiumalbum的蛋白酶K(Jany和Mayer(1985)生物化學Hoppe-Seyler366584-492)。為了進一步參考，下文重復了Siezen等的表I。已鑒定了枯草酶的物理和化學性質。除了已知這些酶的一級結構(氨基酸序列)外，已經測定了枯草酶的50多種高分辨率X光結構，這些結構描繪了底物結合、過渡狀態、產物、至少三種不同的蛋白酶抑制因子，并且限定了天然變異的序列結構((Kraut(1977)生物化學年度綜述46331-358)。在此申請中底物被以最廣泛的形式解釋為包括含有至少一個對枯草桿菌蛋白酶水解敏感的肽鍵的化合物。而且在本發明中應該將表達產物解釋為包括與枯草桿菌蛋白酶有關的水解反應產物。此產物可以是以后水解反應的底物。枯草酶的一個亞組(即I-S1)包括典型的枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN′、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASENOVONORDISKA/S)和枯草桿菌蛋白酶DY。Siezen等人鑒定了枯草酶的另一個亞組(即I-S2)(同上)。Siezen把I-S2亞組蛋白酶描述為高堿性枯草桿菌蛋白酶，其包括諸如枯草桿菌蛋白酶PB92(MAXACAL，Gist-BrocadesNV)、枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE，NOVONORDISKA/S)、枯草桿菌蛋白酶147(ESPERASE，NOVONORDISKA/S)和堿性彈性蛋白酶YaB的酶。在本發明中枯草酶變體或突變的枯草酶意指一種已由有機體產生的枯草酶，所述有機體表達來源于親本微生物的突變基因，這種微生物具有原始或親本基因并且產生相應的親本酶，為了產生突變基因，所述親本基因已被誘變，當在合適的宿主中表達時，所說的變突的枯草桿菌蛋白酶從這種突變體基因產生。酶的物理和化學性質的知識引起了枯草酶基因的隨機和定點突變，并且這些突變提供了和枯草酶催化性質、底物特異性、三級結構等有關的信息(Wells等(1987)美國科學院學報84；1219-1223；Wells等(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.317415-423；Hwang和Warshel(1987)生物化學262669-2673；Rao等，(1987)自然328551-554)。涉及這個領域的較新的出版物是Carter等(1989)在《蛋白質》6240-248，其涉及在底物酶中(24位和64位)切割特異性靶序列設計變體；Garter等(1992)紐約科學院年報67271-79，其討論了一些以前出版的結果；Takayi(1993)，國際生物化學雜志25307-312，其也評述了以前的結果。尤其是枯草桿菌蛋白酶基因定點突變引人關注，在下面的專利申請和專利中描述了各種突變EP公開號130756(GENENTECHL)(相應于美國專利34,606(GENENCOR))涉及“羰基水解酶”的特異性位點或隨機產生的突變和以后的突變酶的各種性質的篩選，如kcat/ka比率、pH-活性分布和氧化穩定性。這一出版物指出點特異性突變是可行的，也描述了枯草桿菌蛋白酶BPN′在某些持異位點(即-1Tyr、32Asp、155Asn、104Tyr、222Met、166Gly、64His、169Gly、189Phe、33Ser、221Ser、217Tyr、156Glu或152Ala)的突變提供了改變性質的酶，因為在申請之前已知除了-1位外的所有位點都與此酶的功能有關，所以此申請沒有試圖解決下面的問題，即確定在哪里引入突變以便獲得所需性質的酶。EP公開號214435(HENKEL)描述了枯草桿菌蛋白酶Carlsbery以及它的兩個突變體的克隆和表達。在這個申請中沒有提供由158Asp至158Ser和由161Ser至161Asp突變的原因。在國際專利公開號WO87/04461(AMGEN)中提出了減少存在于親本酶中的Asn-Gly序列的數量，以便獲得表現出改善的pH和熱穩定性的突變的酶，這一申請的重點是除去、突變或修飾枯草桿菌蛋白酶BPN′的109Asn和218Asn殘基，它沒有提供任何缺失或修飾Gly殘基的例子。在國際專利公開號WO87/05050(GENEX)中公開了隨機突變和大量的改善特性的枯草桿菌蛋白酶BPN的突變體的篩。這一申請描述了在218ASN、131Gly、254Thr、166Gly、116Ala、188Ser、126Leu和53Ser位點的突變。在EP公開號251446(GENENCOR)中描述了如何考慮應用一級結構和三級結構水平的同源性鑒定無論保守還是不保守的等價氨基酸殘基。這一信息和發明人的枯草桿菌蛋白酶BPN′的三級結構方面的知識使發明人選擇了大量的容易突變的位點，以期獲得改變性質的突變體。這樣鑒定的位置是124Met、222Met、104Tyr、152Ala、156Glu、166Gly、169Gly、189Phe、217Tyr、155Asn、21Tyr、22Thr、24Ser、32Asp、33Ser、36Asp、46Gly、48Ala、49Ser、50Met、77Asn、87Ser、94Lys、95Val、96Leu、107Ile、110Gly、170Lys、171Tyr、172Pro、197Asp、199Met、204Ser、213Lys、221Ser。鑒定這些位點，以期影響此酶的各種性質。而且例證了大量突變以支持這些觀點。除了在這些位置的單一突變外，發明人還進行了大量的多樣化突變。發明人進一步鑒定出215Gly、67His、126Leu、135Leu和片段97-103、126-129、213-215和152-172中的氨基酸殘基也有意義，但沒有例示在這些位點中的任何突變。對本發明的目的而言，尤其有益的是EP251446的發明人提出了取代170Lys(在枯草桿菌蛋白酶BPN′，I-SI型中)，特別是他們提出引入Glu或Arg取代原來的Lys。看來產生了Glu變體，并且發現它容易自溶降解(參見48、121、123頁(表XXI有一個明顯錯誤，但是表明裂解半衰期從86減少至13分鐘)和圖32)。EP公開號260105(GENENCOR)描述了從催化三聯體中通過選擇15A左右的氨基酸殘基和用另一種殘基取代選擇的氨基酸殘基修飾含有催化三聯體的酶的某些性質。特別提到在本說明書中描述的枯草酶型的酶屬于含有催化三聯體的酶類。還指出在枯草桿菌蛋白酶的222和217位是取代的優選位置。而且Thomas、Russell和Fersht(1985)《自然》318375-376已經表明在枯草桿菌蛋白酶BPN′中的99ASP變成99Ser改變了酶的pH特性。在同一作者后來的文章((1987)分子生物學雜志193803-813)中討論了156Ser取代156Glu的取代。所有這些突變都是在離活性64His15A的距離內產生的。在《自然》328496-500(1987)中，Russel和Fersht討論了他的實驗結果，并闡述通過酶突變獲得表面電荷發生變化來改變pH活性分布的規則。WO88/08028(Genex)和WO88/08033(Amgen)描述了枯草桿菌蛋白酶BPN′鈣結合位點中的氨基酸殘基的修飾。通過用更多的負電荷殘基取代原來的殘基使酶穩定。在WO89/06279(NOVONORDISKA/S)中表明170位具有意義，提出在這一位置用Tyr取代已有的殘基。然而沒有給出關于這樣一種變體的數據。在WO91/00345(NOVONORDISKA/S)中提出相同的建議，并且表明在枯草桿菌蛋白酶309(I-S2型)中的170位上的Tyr變體在洗滌劑中在pH大約為8時表現出改善的洗滌性能(表III、IV、V、VI、VIII、X中的變體S003)。根據所說申請的一般概念，同樣的取代連同在其它位置上的其它取代也指示改善的洗滌性能(在同一表和表VII中的S004、S011-S014、S022-S024、S019、S020、S203、S225、S227)。在EP525610Al(SOLVAY)中提出通過減弱某些表面區域的疏水性改善酶(和枯草桿菌蛋白酶PB92密切相關的I-S2型枯草酶)對離子性表面活性劑穩定性。它最后建議在164位(如果采用BPN′編號則為170位)用Glu取代Arg。在這一申請中沒有公開包含這種取代的變體。在WO94/02618(GIST-BROCADESN.V.)中描述了I-S2型枯草桿菌蛋白酶PB92的一些164位(如果用BPN′編號則為170位)變體。提供的例子表明用Met、Val、Try、Ile取代原來的Arg。變體的粉未狀洗滌劑性能試驗表明洗滌性能有輕微的提高。尤其是Ile變體在可可(cacao)上的洗滌性能試驗表明提高大約20-30％。這一申請沒有提供穩定性方面的數據。在WO95/30011、WO95/30010和WO95/29979(PROCTER&GAMBLE公司)描述了6個區域，尤其是設計了在枯草桿菌蛋白酶BPN′和枯草桿菌蛋白酶309的199-220位(按BPN′編號)以改變(即減少)酶對表面結合的污物的吸收作用。這一申請建議利用酶對底物的吸附作用的減少產生更好的洗滌劑性能，它沒有提供所提出的變體的洗滌劑的詳細洗滌性能數據。WO95/27049(SOLVAYS.A.)中描述了帶有以下突變的枯草桿菌蛋白酶309型蛋白酶N43R+N116R+N117R(按BPN′編號)。數據表明和野生型相比，相應的變體具有改善的穩定性。枯草酶的工業應用發現蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶)在工業上非常有用，特別是在洗滌劑制劑中，因為它們對除去蛋白污點有用。目前發現從商業途徑可以得到至少以下蛋白酶，并且其中的很多蛋白酶在世界上許多國家都已大量上市。例如，可以從美國圣路易斯的西格瑪公司獲得枯草桿菌蛋白酶BPN′或Novo。枯草桿菌蛋白酶Carlsberg由NOVONORDISKA/S(丹麥)以ALCALASE銷售和由Gist-BrocadesN.V.(荷蘭)以MAXATASE銷售。這兩個都屬于枯草酶I-S1亞組。在枯草酶I-S2亞組中，已知上市了以下的酶。由NOVONORDISKA/S(丹麥)以SAVINASE銷售遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶即枯草桿菌蛋白酶309。這種酶的蛋白質工程化變體以DURAZYM銷售。與SAVINASE非常類似的酶(如枯草桿菌蛋白酶PB92)有由Gist-BrocadeN.V.銷售的MXACAL(這種酶的蛋白質工程化變體以MAXAPEM銷售)、由SOLVAYetCie.銷售的OPTICLEAN和國際GENENCOR銷售的PURFUFECT。遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶147由NOVONORDISKA/S(丹麥)以ESPERASE銷售；然而，在有效性方面，這樣的酶一定要不僅在洗滌時表現出活性，而且在洗滌劑的生產和貯存過程中要和洗滌劑的其它組分相容。例如，枯草桿菌蛋白酶可以和其它酶組合起來使用以作用于其它底物，選擇的枯草桿菌蛋白酶應該對這樣的酶具有穩定性，同時選擇的枯草桿菌蛋白酶最好不應催化其它酶的降解。而且選擇枯草桿菌蛋白酶應對洗滌劑制劑中的其它組分的反應具有抵抗性，如漂白劑、氧化劑等，特別是用于洗滌劑制劑中的酶對氧化力、鈣結合特性和在洗滌劑貯存期間和使用洗滌液的洗滌期間的其它非酶組分提供的pH值穩定。酶催化存在于要洗滌的物體上(例如在洗滌期間)的各種自然產生的底物的降解能力經常被稱為洗滌能力、洗滌力、去垢力或者洗滌性能。在整個申請中，洗滌性能這一術語將用于表述這種屬性。在使用洗滌劑之前(一般在洗滌過程中加水)在洗滌劑組合物的其它組分存在的條件下酶保持活性的能力通常稱為貯存穩定性或貨架壽命。經常測量的是半壽期t1/2。我們在此申請中仍將使用這種貯存穩定性表述法。發現仍然存在的枯草桿菌蛋白酶具有這樣的性質，就是在參數(如pH)變化的條件下他們的洗滌力或洗滌能力有很大的變化。實際上以上上市的一些洗滌劑蛋白酶比大約20年前上市的那些具有更好的性能，但就理想的性能來說在制劑和洗滌條件方面每一種酶具有自己的特定條件，如pH、溫度、離子強度(＝I)、活性體系(Tersides、表面活性劑、漂白劑等)、助洗劑等。結果發現在低pH值和低I值時具有理想特性的酶在更為堿性的條件和高I值時可能具有較小的吸引力，或者在高pH值和高I值表現較好特性的酶在低pH值和低I值時可能有較小的吸引力。而且發現在不同的酶之間的貯存穩定性也不同，但進一步發現不同洗滌劑制劑的特異酶在很多參數(如pH、PI、漂白體系、Tenside等)和洗滌劑組合物的物理狀態(可以為粉狀、粒狀或液體形式)方面表現出很大的變化，而且酶可以是濃縮的或稀釋的。重組DNA技術的出現和發展在蛋白質化學領域產生了深刻的影響。現在通過應用這種技術可以構建具有所需氨基酸序列的酶，而且開展了以上所列的一些研究以設計具有改變的性質的枯草桿菌蛋白酶。在這些申請中，如在EP公開號130756(GENENTECH)(美國專利34,606(GENENCOR))，和國際專利公開號WO87/05050(GENEX)中描述的生產和篩選大量突變酶技術在很大程度上相當于分離天然酶的經典方法，把天然酶用于經典誘變方法(利于輻射誘變和化學誘變)，并且篩選它們的特性，不同之處在于在知道一些特異性位置被取代的變體酶存在的條件下這些方法會更有效。枯草桿菌蛋白酶典型地包含大約275個氨基酸殘基。每個殘基可以是20種可能天然產生的氨基酸中的一種。因此在這一方法中一個非常嚴重的障礙是產生的大量突變要進行許多初步篩選以確定它們的性質。因而，在這些專利申請中概述的方法只比已經了解了多年的傳統隨機突變方法稍好一些。其它的已知技術涉及改變特定屬性，如氧化穩定性、熱穩定熱、Ca穩定性、酯基轉移作用和水解率(EP公開號260105(GENENCOR))、pH活性分布(Thomas、Pussell和Fersht，同上)和底物特異性(國際專利公開號WO88/07578(GENENTECH))。這些出版物沒有一個涉及改變酶的洗滌性能或它們的貯存穩定性。在國際專利申請PCT/DK88/00002(NOVONORDISKA/S)中提出使用同源性比較這一概念來確定應該選擇哪一個氨基酸位置用于突變及確定在這些位置上應該取代的氨基酸，以獲得洗滌性能的所需變化。通過使用這樣一種方法，篩選的工作量急劇減少，因為產生的變體的數量減少了。但是利用這種方法只能預見可以獲得表現出結合了親本酶和比較酶的有用特性的酶。問題似乎是，雖然許多研究的目的在于揭示酶活性的機制，但決定與它們的性質有關的酶的屬性(如在洗滌劑中貯存穩定性)的結構因子和氨基酸殘基的組合還知道得很少，尤其當酶存在于復雜的混合物中。因此還存在需要進一步改善的和制作洗滌劑體系的酶，也需要更好地了解在洗滌或洗滌劑組合物的實際應用中蛋白酶的作用機制以及降解機制。這種理解能夠產生用于選擇突變的規律，這種規律在十分合理的程度上會產生在洗滌劑組合物中在特定條件下表現出改善的貯存穩定性的酶。發明概述現在已令人驚奇地發現在洗滌劑中具有改善的貯存穩定性和/或改善的性能的枯草酶變體可以通過將位于親本枯草酶疏水區中或者其鄰近區中的一個或多個氨基酸殘基用一種比原來的殘基更為疏水的氨基酸取代而獲得，所說的疏水區包括相應于BLS309(按BASBPN編號)的殘基P129、P131、1165、Y167、Y171的殘基，所說的疏水區鄰近區中的殘基包括相應于BLS309(按BASBPN編號)的殘基E136、G159、S164、R170、A194和G195的殘基，除了BABP92的R170M、R170I和R170Y變體之外。因而在第一方面本發明涉及表現出在洗滌劑中改善的穩定性和/或改善的洗滌性能的酶變體。在第二方面本發明涉及能夠表達第一方面的酶的DNA構建體，當以一種合適的方式插入到宿主細胞中時可以產生第一方面的枯草桿菌蛋白酶的表達。在第三方面本發明涉及產生本發明的枯草桿菌蛋白酶的方法。該方法通過把第二方面的構建體插入到合適宿主中，并且培養宿主以表達所需的枯草酶；然后回收酶產品。本發明部分涉及但不限于表達以上所述的枯草酶I-S2亞組酶基因的突變體和產生的酶變體。本發明包括的其它枯草酶基因變體是例如枯草酶I-S1亞組的那些(如枯草桿菌蛋白酶BPN′、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg基因)和產生的變體枯草桿菌蛋白酶BPN′、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg酶，它們在濃縮的液體洗滌劑中表現出改善的穩定性。本發明包括的另一種枯草酶基因變體是例如蛋白酶K和其它的基因以及產生的變體蛋白酶K和其它的枯草酶，它們在濃縮的液體洗滌劑中表現出改善的穩定性。能夠按照本發明進行修飾的親本枯草酶的其它例子列于表I中。本發明還涉及在清洗組合物中的突變酶和包含突變酶的清洗組合物(尤其是含有突變的枯草桿菌蛋白酶的洗滌劑組合物)的用途。特別是本發明涉及含有這種酶變體的濃縮液體洗滌劑組合物。縮寫表氨基酸A＝Ala＝丙氨酸V＝Val＝纈氨酸L＝Leu＝亮氨酸I＝Ile＝異亮氨酸P＝Pro＝脯氨酸F＝Phe＝苯丙氨酸W＝Trp＝色氨酸M＝Met＝蛋氨酸G＝Gly＝甘氨酸S＝Ser＝絲氨酸T＝Thr＝蘇氨酸C＝Cys＝半胱氨酸Y＝Tyr＝酪氨酸N＝Asn＝天冬酰胺Q＝Gln＝谷氨酰胺D＝Asp＝天門冬氨酸E＝Glu＝谷氨酸K＝Lys＝賴氨酸R＝Arg＝精氨酸H＝His＝組氨酸X＝Xaa＝任何氨基酸核酸堿基A＝腺嘌呤G＝鳥嘌呤C＝胞嘧啶T＝胸腺嘧啶(只在DNA中)U＝尿嘧啶(只在RNA中)變體在描述本發明所產生或研究的各種酶變體時，為易于指稱采用了以下表示法原來的氨基酸位置取代的氨基酸按照這種表示法，在195位上的谷氨酸取代甘氨酸表示為Gly195Glu或G195E。在同一位置缺失甘氨酸表示為Gly195*或G195*。插入另外一種氨基酸殘基(如Lys)表示為Gly195GlyLys或G195GK。在與所使用的編號序列比較顯示缺失時，在這一位置上的插入表示為*36ASP或*36D，其表示在36位插入一個天冬氨酸。通過+分開多重突變，即Arg170Try+Gly195Glu或R170Y+G195E它表示在170和195位上的精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸取代的突變。位置在本申請和所附權利要求中描述變體時，使用了上述Siezen等人的各種枯草酶的排列方式。在其它與枯草酶有關的出版物中已采用了其它推定酶的排列方式和編號方式。對于技術人員來說用本文使用的編號方式確定特定殘基的位置是平常的事情。還參照了顯示與本發明的枯草酶相關大量枯草酶殘基的序列對比的圖1。還參照了WO91/00345的顯示與本發明的枯草酶相關大量枯草酶殘基的序列對比表I。表I目前已知的枯草酶(來源于Siezen等，同上)生物體cDNA基因酶縮寫原核生物細菌格蘭氏陽性枯草芽孢桿菌168aprA枯草桿菌蛋白酶I168，aprABSS168液解化淀粉桿菌apr枯草桿菌蛋白酶BPN′BASBPN(NOVO)枯草芽孢桿菌DY-枯草桿菌蛋白酶DYBSSDY地衣芽孢桿菌+枯草桿菌蛋白酶CarlsbergBLSCAR遲緩芽孢桿菌+枯草桿菌蛋白酶147BLS147嗜堿芽孢桿菌PB92+枯草桿菌蛋白酶PB92BAPB92芽孢桿菌DSM4828-堿性蛋白酶BDSM48芽孢桿菌YaBale堿性彈性蛋白酶YaBBYSYAB枯草芽孢桿菌168eprmin.胞外蛋白酶BSEPR枯草芽孢桿菌bpf芽胞桿菌肽酶FBSBPF枯草芽孢桿菌IF03013isp1胞內胞內絲氨酸蛋白酶1BSISP1枯草芽孢桿菌A50-胞內絲氨酸蛋白酶BSIASO蘇云金芽孢桿菌-胞外絲氨酸蛋白酶BTFINI蠟狀芽孢桿菌-胞外絲氨酸蛋白酶BCESPR達松維爾擬諾卡氏菌-堿性絲氨酸蛋白酶NDAPII普通高溫放線菌-thermitaseTVTHER糞腸球菌cylA溶細胞素組分AEFCYLA表皮葡萄球菌epiP表皮纖維引導蛋白酶SEEPIP釀膿鏈球菌scpAC5a肽酶SPSCPA乳乳球菌SK11prtPSK11細胞壁蛋白酶LLSK11細菌格蘭氏陰性節瘤偶蹄形菌+堿性蛋白酶蛋白酶DNEBPR野油菜黃單胞菌+胞外蛋白酶XCEXPR粘質沙雷氏菌+胞外絲氨酸蛋白酶SMEXSP水生棲熱菌YT-1pstI水劑細胞溶解酶ITAAQUA棲熱菌屬rT41A+T41A蛋白酶TRT41A解藻朊酸弧菌proA蛋白酶AVAPROA魯地鏈霉菌-蛋白酶DSRESPDArchaea嗜鹽菌株172P1-嗜鹽菌胞外蛋白酶ARB172藍細菌多變魚腥藍細菌prcACa依賴性蛋白酶AVPRCA低等真核生物真菌Tritirachiumalbum+蛋白酶KTAPROKLimberTritirachiumalbum+蛋白酶RTAPRORTritirachiumalbumproT蛋白酶TTAPROT米曲霉+堿性蛋白酶AOALPRMalbrancheapulchella-熱分支菌素MPTHMY枝頂孢霉alp堿性蛋白酶ACALPR酵母菌乳酸克魯維酵母kex1Kex1絲氨酸蛋白酶KLKEX1釀酒酵母kex2Kex2絲氨酸蛋白酶SCKEX2釀酒酵母prb1蛋白酶BSCPRB1Yarrowialipolyticaxpr2堿性胞外蛋白酶LXPR2高等真核生物蟲Caenorhabditiselegansbli4表皮蛋白酶CEBLI4昆蟲果蠅屬(果蠅)fur1弗林蛋白酶1DMFUR1果蠅屬(果蠅)fur2弗林蛋白酶2DMFIJR2植物甜瓜(甜瓜)-cucumisinCMCUCU哺乳動物人(也可以是大鼠，小鼠)fur弗林蛋白酶HSFURI人(也可以是小鼠)+胰島瘤PC2蛋白酶HSIPC2小鼠+粘液PC3蛋白酶MMPPC3人+三肽基肽IIHSTPP表I的參考文獻氨基酸序列的參考文獻(Genbank/EMBL數據庫登記號列于括弧中)ARB172Kamekura和Seno，(1990)生物化學細胞生物學68352-359(成熟蛋白酶殘基1-35的氨基酸測序；沒有確定殘基I4)BSS168Stahl.和Ferrari.(1984)細菌學雜志158，411-418(K01988)。Yoshimoto，Oyama等(I488)生物化學雜志103，1060-1065(枯草芽孢桿菌amylosacchariticus變種的成熟枯草桿菌蛋白酶不同之處在于具有T130S和T162S)。Svendsen，等(1986)FEBSLett.196，228-232(PIRA23624；氨基酸測序；腸膜芽孢桿菌的成熟堿性空腸肽酶不同之處在于具有S85A，A88S，S89A.S183A和N259S)。BASBPNWells，等(1983)核酸研究117911-7925(X00165)。Vasantha等，(1984)細菌學雜志159811-814(K02496)。BSSDYNedkov等(1983)Hoppe-Seyler′sZ.Physiol.Chem.3641537-1540(PIRA00969；氨基酸測序)。BLSCARJacobs等(1985)核酸研究138913-8926(X03341)。Smith等(1968)生物化學雜志2432184-2191(PIRA00968；氨基酸測序；成熟蛋白酶序列不同之處在于具有T103S，P129A，S158N，N161S和S212N)。BLS147Hastrup等(1989)PCT專利申請WO8906279。1989年7月13日出版。(遲緩芽孢桿菌的Esperase)。Takami等(1990)微生物生物技術應用，33519-523(Bacillussp.no.AH-101的成熟堿性蛋白酶殘基1-20的氨基酸測序；此序列在N11S上與BLS147不同)。BABP92vanderLaan等(1991)應用環境微生物學57901-909.(Maxacal)。Hastrup等(1989)PCT專利申請WO8906279。1989年7月13日出版。(枯草桿菌蛋白酶-309的Savinase，僅在N87S上不同)。Godette等(1991)第5界蛋白質協會討論會文摘，6月6日，巴爾的摩文摘M8(遲緩芽孢桿菌的高堿性蛋白酶不同之處在于具有N87S，S99D，S101R，S103A，V104I和G159S)。BDSM48Rettenmaier等(1990)PCT專利申請WO90/04022。1990年4月19日出版。BYSYABKaneko等(1989)細菌學雜志1715232-5236(M28537)。BSEPRSloma.等(1988)細菌學雜志1705557-5563(M22407)。Bruckner(1990)分子基因遺傳學221486-490(X53307)。BSBPFSloma等(1990)細菌學雜志1721470-1477(M29035；已校正)。Wu等(1990)生物化學雜志2656845-6850(J05400；由于移碼，此序列不同之處在于具有A169V和缺少C末端殘基的586)。BSISP1Koide等(1986)細菌學雜志167110-116(M13760)。BSIA50Strongin等(1978)細菌學雜志1331401-1411(成熟蛋白酶殘基1-54的氨基酸測序；沒有確定殘基3.39，40.45，46，49和50)。BTFINIChestukhina等(1985)Biokhimiya501724-1730(Bacillusthuringiensisvarietyisraeliensis的成熟蛋白酶殘基1-14和變種finitimus的1-16和223-243殘基的氨基酸測序)。Kunitate等(1989)農業生物化學533251-3256(變種kurstaki.BTKURS的成熟蛋白酶殘基6-20的氨基酸測序)。BCESPRChestukhina等(1985)Biokhimiya501724-1730(成熟殘基1-16和223-243的氨基酸測序)。NDAAPIITsujibo等(1990)農業生物化學542177-2179(成熟殘基1-26的氨基酸序列)。TVTHERMeloun等(1985)FEBSLett.183195-200(PIRA00973；成熟蛋白酶殘基1-274的氨基酸測序)。EFCYLASegarra等(1991)傳染免疫學591239-1246。SEEPIPSchnell等(1991)個人通訊(Siezen等(見上文))。SPSCPAChen等(1990)生物化學雜志2653161-3167(J05224)。DNEBPRKortt等(1991)第5界蛋白質協會討論會文摘，6月22-26日，巴爾的摩文摘S76。LLSK11Vos等(1989)生物化學雜志26413579-13585(J04962)。Kok等(1988)應用環境微生物學54231-238(M24767；菌株Wg2的序列在44位上不同，包括蛋白酶域的18種差異和殘基1617-1676的缺失)。Kiwaki等(1989)分子微生物學3359-369(X14130；菌株NCD0763在46位上不同，包括蛋白酶域的22種差異和殘基1617-1676的缺失)。XCEXPRLiu等(1990)分子基因遺傳學220433-440。SMEXSPYanagida等(1986)細菌學雜志166937-994(M13469)。TAAQUATerada等(1990)生物化學雜志2656576-6581(J054I4)。TRT41AMcHale等(1990)Abstracts5thEur.Congr.Biotechn，Christiansen，Munck和Villadsen(eds)，MunksgaardInt.出版社，哥本哈根。VAPROADeane等(1989)基因76281-288(M25499)。SRESPDLavrenova等(1984)蘇聯生物化學49447-454(殘基1-23的氨基酸測序；殘基13，18和19沒有確定)。AVPRCAMaldener等(1991)分子基因遺傳學22513-120(由于移碼閱讀錯誤，出版的序列在200-210位點上有28個不確定的殘基)。TAPROKGunkel和Gassen(1989)歐洲生物化學雜志179185-194(X14688/X14689).Jany等(1986)候普-賽勒氏生物化學雜志36787(PIRA24541；氨基酸測序；成熟蛋白酶不同之處在于具有S745G，SILST204-208DSL和VNLL264-267FNL)。TAPRORSamal等(1990)分子微生物學41789-1792(X56116)。TAPROTSamal等(1989)基因85329-333。AOALPRTatsumi等(1989)分子基因遺傳學21933-38。Cheevadhanarah等(1991)EMBL數據庫(X54726)。MPTHMYGaucher和Stevenson(1976)酶學方法45415-433(殘基1-28，和帶有活性位點絲氨酸的六肽LSGTSM的氨基酸測序)。ACALPRIsogai等(1991)農業生物化學55471-477。Stepanov等(1986)國際生物化學雜志18369-375(殘基1-27的氨基酸測序成熟蛋白酶不同之處在于具有H13[1]Q，R13[2]N和S13[6]A)。KLKEX1Tanguy-Rougeau，Wesolowski-Louvel和Fukuhara(1988)FEBSLett.234464-470(X07038)。SCKEX2Mizuno等(1988)生物化學生物物理學研究通訊156246-254(M24201)。SCPRB1Moehle等(1987)分子細胞生物學74390-4399(M18097)。YLXYPR2Davidow等(1987)細菌學雜志1694621-4629(M17741)。Matoba等(1988)分子細胞生物學84904-4916(M23353)。CEBL14Peters和Rose(1991)蟲飼養者公報1128。DMFUR1Roebroek等(1991)FEBSLett.289133-137(X59384)。DMFIJR2Roebroek等(1992)26717208-17215。CMCUCUKaneda等(1984)生物化學雜志95825-829(帶有活性絲氨酸的八肽NIISGTSM的氨基酸測序)。HSFURIvandenOuweland等(1990)核酸研究18664(X04329)(小鼠furin的序列在51個位置上不同，包括位于催化域中的5個位置A15E，Y21F，S223F，A232V和N258[2]D)。Misumi等(1990)核酸研究186719(X55660大鼠furin的序列在49個位置上不同，包括位于催化域中的3個位置A15E，Y21F，H24R)。HSIPC2Smeekens和Steiner(1990)生物化學雜志2652997-3000(J05252)。Seidah等(1990)DNA細胞生物學9415-424(小鼠粘液PC2蛋白酶的序列在23個位置上不同，包括蛋白酶域中的7個位置I4F，S42[2]Y，E45D，N76S，D133E，V134L和G239[1]D)。MMPPC3Smeekens等(1991)美國科學院學報88340-344(M58507)。Seidah等(1990)DNA細胞生物學9415-424(M55668/M55669；部分序列)。HSTPPTomkinson和Jonsson(1991)生物化學30168-174(J05299)。附圖簡要描述附圖中，圖1顯示了表1所列出的大量的枯草酶的序列對比；圖2是枯草桿菌蛋白酶309的三維結構，顯示疏水區位點和其鄰近區中的按照本發明將被取代的一些氨基酸殘基。發明詳述令人驚奇的是發現在洗滌劑中枯草酶的貯存穩定性和/或改善的性能在以下情況下通常得到提高，即位于疏水區中或者其鄰近區中的氨基酸殘基由一種更疏水的殘基取代時，所說的疏水區中的殘基包括枯草桿菌蛋白酶309的P129、P131、I165、Y167、Y171。所研究的殘基特別是E136、G159、S164、R170、A194和G195。而且，所說的變體表現出特別高的改善的穩定性(在液體洗滌劑和在成形的固體洗滌劑中)。圖2顯示了枯草桿菌蛋白酶309的疏水區中和其鄰近區中的殘基，其中一些殘基將被取代以增加疏水區的疏水性。這可以通過用疏水殘基取代非疏水殘基和/或通過取代使親本酶的殘基變得更疏水的殘基來完成。把相同的原則適用于其它枯草酶的相應區域，這些區域的鑒定在本
技術領域：
的普通人員的技術范圍內。可以產生其它枯草酶的類似于圖2的圖示以確定按照本發明將被取代的目標殘基。其編號如以下表II所示表II疏水區和其鄰近區中的氨基酸殘基位置\酶BRSBPNBLSCARBLS309IBLS147TVTHER疏水區129PAPTT131GGPGG165VIIVP167YYYYY171YYYYY鄰近區136KKEEQ159SSGGT164TTSGA170KKRRY194PAAPS195EEGEV用圖2所示的排列方式(algnment)構建了表II。顯然，技術人員可以很容易地制成包括其它枯草酶的相同的表或大一些的表。因此本發明涉及這樣的枯草酶變體，其中通過突變枯草桿菌蛋白酶的基因改變了氨基酸序列，對負責129、131、165、167、171、136、159、164、170、194和195位氨基酸殘基表達的密碼子(親本酶或基因)進行修飾是合乎需要的，這些殘基是比親本酶中的殘基更具有疏水性的殘基，尤其是包含較長疏水側鏈的疏水殘基(如Ile，Leu和Val)，因此，當突變的基因表達后，氨基酸殘基被更疏水的殘基取代，這樣增加了此區域的疏水性。疏水的氨基酸殘基一般為以下幾種Val(V)、Ile(l)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)和Trp(W)，在這些殘基中，Val、Ile和Leu是優選的。通過瀏覽表II和使用本發明的原則，可以清楚許多候選的取代。對于BASBPN和BLSCAR，似乎適合于在129、131、136、159、164、167、170、171和195位發生取代。在BLS309中136、164、167、170、171位是首選的位置，位置159和195是第二種選擇。在BLS147中129、131、136、167、170、171和195位是首選的位置，而159和164位是第二選擇的位置。最后在TVTHER中129、131、136、167、171和194位是首選的位置，而164位是第二選擇的位置。按照本發明，用更多和更疏水的殘基取代疏水區的Gly殘基是有利的。這種考慮可應用于任一種親水或疏水殘基，其可以占據以上提到的任何位置，也就是說任何疏水性的增加都是有利的。這就意味著，例如，一個非常親水的殘基如帶電荷的殘基Arg(R)、Asp(D)、Glu(E)或Lys(K)可以被任何一個不太親水的殘基取代，這樣的不太親水的殘基包括Gly(G)、Cys(C)、Ser(S)、Ala(A)、Thr(T)、Tyr(Y)、Gln(Q)、His(H)或Asn(N)殘基。這也意味著一個Tyr(Y)可以被更疏水的殘基如Phe(F)、Leu(L)或Ile(I)所取代。同樣的考慮可以應用于其它的在酶表面具有疏水區的枯草酶。在本發明中按照以上Siezen等人的方法限定枯草酶。在狹義的意義上講，適用于本發明的許多實施方案的興趣枯草酶是那些屬于I-S1和IS2亞組的。更具體地說，本發明的一些實施方案涉及革蘭氏陽性細菌的絲氨酸蛋白酶，這種絲氨酸蛋酶在一級結構上和上述表I所列的枯草酶實質上具有非常確切的同源性。本發明也包括任何以上提到的親本酶的氨基酸序列位置上的一個或多個取代以及任何其它的取代、缺失或添加。特別是包括與其它的已知給出酶性質改善的取代的組合。這樣的組合包含的位置有222位(提高氧化穩定性)、218位(提高熱穩定性)、在能穩定酶的鈣結合位置上的取代(如76位)和從現有技術來看明顯的其它位置。而且也特別涉及與EP405901中提到的變體的組合。變體A單一變體枯草桿菌蛋白酶BPN′、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶168和枯草桿菌蛋白酶DY變體A129V，A129I，A129L，A129M，A129FG131V，G131I，G131L，G131M，G131FK136V，K136I，K136L，K136M，K136F，S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167FK170V，K170I，K170L，K170M，K170F，Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171FA194V，A194I，A194L，A194M，A194FE195V，E195I，E195L，E195M，E195F，Thermitase變體A129V，A129I，A129L，A129M，A129FG131V，G131I，G131L，G131M，G131FQ136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167FY171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171FY170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，S194V，S194I，S194L，S194M，S194F，枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和芽孢桿菌屬PB92蛋白酶變體T129V、T129I、T129L、T129M、T129FG131V、G131I、G131L、G131M、G131FE136V、E136I、E136L、E136M、E136F、G159V、G159I、G159L、G159M、G159F、G164V、G164I、G164L、G164M、G164F、(BLS147)S164V、S164I、S164L、S164M、S164F、(BLS309和BAPB92)Y167A、Y167H、Y167N、Y167P、Y167C、Y167W、Y167Q、Y167S、Y167T、Y167G、Y167V、Y167I、Y167L、Y167M、Y167F、R170W、R170A、R170H、R170N、R170P、R170Q、R170S、R170T、R170Y(對BLS309放棄)、R170V(對BAPB92放棄)、R170I(對BAPB92放棄)、R170L、R170M(對BAPB92放棄)、R170F、R170G、R170C、Y171A、Y171H、Y171N、Y171P、Y171C、Y171W、Y171Q、Y171S、Y171T、Y171G、Y171V、Y171I、Y171L、Y171M、Y171F、A194V、A194I、A194L、A194M、A194F、(BLS309和BAPB92)P194V、P194I、P194L、P194M、P194F、(BLS147)E195V、E195I、E195L、E195M、E195F、(BLS147)G195V、G195I、G195L、G195M、G195F、(BLS309和BAPB92)B.組合變體上述任何一種變體如果和其它在以下任何一個位置上的變體組合預期是有用的，這些位置是27、36、57、76、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274。特別是以下的BLS309和BAPB92變體被認為適合于組合K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、A194P、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。而且包含以下任何一種或二種取代以及以上提到的任何一種或多種其它取代、缺失和或插入的變體是有利的X167V、X167M、X167F、X167L、X167I、X170V、X170M、X170F、X170L和/或X170。此外包含任何一種變體V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A或這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、J123S、T274A、N76D、V104A)與以上提到的任何一種或多種取代、缺失和/或插入的其它組合的變體被認為能表現出改善的性質。要提到的特定組合是a)S57P+R170La′)S57P+R170Ib)R170L+N218Sb′)R170I+N218Sc)S57P+R170L+N218Sc′)S57P+R170I+N218Sc＂)S57P+V104Y+R170L+N218Sc)S57P+V104Y+R170I+N218Sd)R170L+N218S+M222Ad′)R170I+N218S+M222Sd＂)R170L+N218S+M222Ad)R170I+N218S+M222Se)S57P+R170L+S188P+A194Pe′)S57P+R170I+S188P+A194Pf)Y167L+R170Lf′)Y167L+R170Ig)Y167I+R170Lg′)Y167I+R170Ih)N76D+R170L+N218Sh′)N76D+R170I+N218Si)S57P+N76D+R170L+N218Si′)S57P+N76D+R170I+N218Sj)N76D+R170L+N218S+M222Aj′)N76D+R170I+N218S+M222Sj＂)N76D+R170L+N218S+M222Aj)N76D+R170L+N218S+M222Sk)S57P+R170I+S188P+A194P+N218Sk′)S57P+R170I+S188P+A194P+N218S1)*36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L1′)*36D+N76D+H120D+R170I+G195E+K235L1＂)*36D+N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235L1)*36D+N76D+H120D+Y167I+R170I+G195E+K235Lm)N76D+H120D+R170L+G195E+K235Lm′)N76D+H120D+R170I+G195E+K235Lm＂)N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235Lm)N76D+H120D+Y167I-R170I+G195E+K235Ln)*36D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+K235Ln′)*36D+G97N+V104Y+H120D+R170I+A194P+G195E-K235Lo)S57P+R170L+Q206Eo′)S57P+R170I+Q206Ep)R170L+Q206Ep′)R170I+Q206Eq)Y167I+R170L+Q206Eq′)Y167I+R170I+Q206Er)Y167F+R170Lr′)Y167F+R170It)Y167I+R170L+A194Pt′)Y167I+R170I+A194Pt＂)Y167L+R170L+A194Pt)Y167L+R170I+A194Pu)Y167I+R170L+N218Su′)Y167I+R170I+N218Su＂)Y167L+R170L+N218Su)Y167L+R170I+N218Sv)Y167I+R170L+A194P+N218Sv′)Y167I+R170I+A194P+N218Sv＂)Y167L+R170L+A194P+N218Sv)Y167L+R170I+A194P+N218Sx)R170L+P131Vx′)R170I+P131Vy)*36D+Y167I+R170Ly′)*36D+Y167I+R170Iz)Y167I+Y171Iaa)Y167V+R170Laa′)Y167V+R170Ibb)R170L+Y171Ibb′)R170I+Y171Lbb＂)R170L+Y171Lbb)R170I+Y171Icc)Y167I+Y171L+N218Scc′)Y167I+Y171I+N218S含有突變酶的洗滌劑組合物本發明也包括本發明的突變酶在清洗劑和洗滌劑組合物中的用途以及含有突變枯草桿菌蛋白酶的組合物。在原則上這樣的清洗劑和洗滌組合物可以有任意的物理形式，但是枯草酶變體優選地加入到液體組合物中或加入到柱狀、片狀、棒狀等形式的直接應用的組合物中。在其中它們表現出改善的酶穩定性或性能。在本發明的液體組合物中，含水的液體洗滌劑具有均一的物理性狀，例如它們都是由不斷連續的含水相的表面活性劑的分子溶液構成，即所謂的各向同性的液體。另外，它們可以具有均一的物理狀態，可以制備它們，例如它們可以由分散在連續水相的薄層微滴構成，例如在EP-A-346995(Unilever)中描述的(本文一并參考)包括具有親水骨架和至少一條疏水側鏈的懸浮聚合物。后面這些液體是多相的，并且可以含有懸浮的固體顆粒(如以下提到的助洗劑物質顆粒)。對粉未狀洗滌劑組合物而言，這種組合物只包含本發明以上的任何方面的任何一種或多種枯草桿菌蛋白酶變體或者與任何一種包括進組合物的常規組分組合，這種組分是本領域技術人員熟知的。這樣的組分包括助洗劑(例如磷酸鹽或者沸石助洗劑)、表現活性劑(如陰離子、陽離子、非離子或兩性離子型的表面活性劑)、聚合物(如丙烯酸的或等價的聚合物)、漂白體系(如過硼酸鹽或含氨基的漂白前體物或催化劑)、結構物(如硅酸鹽結構物)、調節pH的堿或酸、濕潤劑和/或中性無機鹽。而且，在本發明的組合物中通常存在許多其它的組分，如A.輔助表面活性劑B.酒石酸鹽丁二酸鹽助洗劑C.中和系統D.泡沫抑制劑E.其它酶F.其它可有可無的組分陰離子表面活性劑和非離子表面活性的比值優選的是1∶1至5∶1。組合物10％(重量比)的水溶液在20℃的pH的值為7.0至9.0，臨界微膠粒濃度小于或等于200ppm，在臨界微膠粒濃度下在35℃的蒸餾水中空氣/水表面張力小于等于32達因/cm。組合物最好是澄清、均質和相穩定的，并且具有良好的洗滌性能和酶穩定性。各種組分1.陰離子表面活性劑本發明的組合物含有從大約10％至50％(重量比)的天然或合成的陰離子表面活性劑，優選的陰離子表面活性劑的含量為大約15％至50％，更優選的為大約20％至40％，最優選的從20％至大約30％，合適的天然或合成的陰離子表面活性劑是如肥皂和如在美國專利4,285,841和美國專利3,929,678中公開的物質。有用的陰離子表面活性劑包括下列酸的水溶性鹽，特別是堿金屬、銨和烷基醇銨(例如一乙醇銨和三乙醇銨)鹽在分子結構中含有大約10至20個碳原子的烷基和磺酸或硫酸酯基團的無機硫酸反應產物。(芳基的烷基部分包括在術語“烷基”中)。合成的表面活性劑的基團的例子是烷基硫酸酯，特別是通過高級醇(C8-C18碳原子)的硫酸化作用獲得的基團，如通過還原動物脂或椰子油甘油酯產生的基團；烷基苯磺酸酯，其中的烷基基團含有直鏈或支鏈結構的大約9至15個碳原子，例如在美國專利2,220,099和2,477,383中描述的那些類型。尤其有價值的是線性直鏈的烷基苯磺酸酯，其中在烷基基團中碳原子的平均數為大約11至14。本文的其它的陰離子表面活性劑是水溶性的鹽含有8至24個(優選的大約12至18個)碳原子的石蠟磺酸酯；烷基甘油醚磺酸酯，尤其那些C8-C18醇醚(例如比動物脂和椰子油中分離出來的)；每個分子含有1至4個單位的環氧乙烷和在烷基基團中含有8至12個碳原子的烷基苯酚環氧乙烷醚硫酸酯；每個分子含有1至4個單位的環氧乙烷和在烷基基團中有10至20個碳原子的烷基環氧乙烷醚硫酸酯。其它有用的陰離子表面活性劑包括在脂肪酸基團中含有6至20個碳原子和在酸基團中含有1至10碳原子的a-磺化的脂肪酸酯的水溶性鹽；在烷基基團中含有2至9個碳原子和在烷烴方面含有9至23個碳原子的2-酰氧-烷烴-1-磺酸的水溶性鹽；含有12至14個碳原子的石蠟磺酸酯的水溶性鹽，在烷基基團含有1至3個碳原子和在烷烴部分含有8至20個碳原子的b-烷氧基烷烴磺酸酯。優選的陰離子表面活性劑是肥皂、C10-C18烷基硫酸酯和每mol烷基硫酸酯分子平均含有4個環氧乙烷單位的烷基乙氧基硫酸酯、C11-C13線性烷基苯磺酸酯和它的混合物。2.非離子表面活性劑另一種選擇性組分是2％至14％(重量比)、優選的是2％至8％、更優選的是3％至5％的乙氧基化的非離子表面活性劑。天然或合成的陽離子表面活性劑(在酸的基礎上的)和非離子表面活性劑的重量比從1∶1至5∶1，優選的從2∶1至5∶1，更優選的從3∶1至4∶1。這能保證在空氣/水的界面形成和吸收足夠硬度的表面活性劑以便很好地除去脂/油污物。可以選擇的乙氧基化的陰離子表面活性劑具有分子式R1(OC2H4)nOH，其中R1是C10-C16的烷基基團或者C8-C12的烷基苯基基團，n從3至9，所說的離子表面活性劑具有從6至16的HLB(疏水-親水平衡)，優選的具有10至13的HLB。這些表面活性劑在美國專利4,285,841和4,284,532中已有詳細描述，尤其優選的是C12-C15的醇每摩爾與3至8摩爾的環氧乙烷的縮合產物，例如每摩爾C12-C13醇與大約6.5摩爾的環氧乙烷的縮合產物。要提到的其它非離子表面活性是APG、EGE和葡糖酰胺表面活性劑。3.洗滌助洗劑可以以常規量存在于本發明的洗滌劑組合物的常規洗滌組分如下所述組合物可以是復配的或非復配的，并且其可以是0-P型(也就是不含有任何含磷助劑)。因此，組合物可以總共含有例如1-50％(重量)的一種或多種有機的和/或無機的助洗劑，如至少大約5％，通常多達30-40％。助洗劑典型的例子包括那些以上提到的物質，更廣義一些包括堿金屬正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三磷酸鹽、堿金屬碳酸鹽，單獨的或與方解石、堿金屬檸檬酸鹽、堿金屬次氮基三乙酸鹽、羧甲基氧琥珀酸鹽、沸石、聚乙縮醛羧酸鹽等。更具體地，本發明的組合物含有5％至20％(重量)、優選的為10％至15％的洗滌劑助洗劑，助洗劑可以是含有10-18個碳原子的脂肪酸和/或聚羧酸鹽、沸石、聚膦酸鹽和/或磷鹽助洗劑。優選的是0-10％(更優選的是3％至10％)(重量)的含有12至14個碳原子的飽和脂肪酸和0-10％(優選的是2％-8％、更優選的是2％至5％)(重量)的聚羧酸鹽(更優選檸檬酸)助洗劑，兩者的重量比為1∶1至3∶1。由于當助洗劑和水的硬度比接近于1時，相對于其它酶本文的蛋白水解酶似乎提供了最佳貯存穩定性，因此，組合物優選含有足夠的助洗劑以便螯合每加侖2至10，優選的是3-8格令/加侖的硬度。可以從天然來源，如植物或動物酯(例如棕櫚核油、棕櫚油或椰子油)或通過合成制備獲得飽和脂肪酸(如通過石油的氧化或通過一氧化碳經FisherFropsoh方法的氫化作用)。用于本發明的合適的飽和脂肪酸的例子包括癸酸、月桂酸、十四烷酸、椰子和棕櫚核脂肪酸。優選的是飽和的椰子脂肪酸；月桂酸和十四烷酸的5∶1至1∶1(優選的是大約3∶1)(重量)混合物；以上提到的脂肪酸和少量(如1％-30％總脂肪酸)油酸的混合物；和棕櫚核脂肪酸。而且本文的組合物優選含有在美國專利4,284,532中描述的聚羧酸鹽、聚膦磷酸鹽和聚磷酸鹽助洗劑，水溶性的聚羧酸鹽助洗劑(特別是檸蒙酸)在這一組中是優選的。合適的聚羧酸鹽助洗劑包括各種氨基聚羧酸鹽、環烷聚羧酸鹽、醚聚羧酸鹽、烷基聚羧酸鹽、環氧聚羧酸鹽、四氫呋喃聚羧酸鹽、苯聚羧酸鹽和多縮醛聚羧酸鹽。這樣的聚羧酸鹽助洗劑的例子包括乙二胺四乙酸鈉和鉀；次氮基三乙酸鉀和鈉、植酸的水溶性鹽(如美國專利1,739,942中公開的植酸鈉和鉀，在美國專利3,364,103中描述的聚羧酸鹽物質)；聚羧酸鹽聚合物的水溶性鹽和在美國專利3,308,067中描述的共聚物。其它有用的洗滌助劑包括具有以下結構和物理性狀的聚合脂肪聚羧酸的水溶性鹽(a)以酸的形式計算，最小分子量大約為350；(b)以酸的形式計算，當量為50至80；(c)至少45摩爾百分比的單體具有由不多于2個碳原子相互分隔的至少2個羧基；(d)任何含羧基基團的聚合物鏈的連接位點，其與下一個含羧基基團連接位點被沿聚合物鏈的三個以下的碳原子隔開。這樣的助洗劑的具體的例子是衣康酸、阿康酸、馬來酸、中康酸、富馬酸、亞甲丙二酸、檸康酸的聚合物和共聚物。其它合適的聚羧酸鹽助劑包括水溶性鹽，特別是苯六羧酸、檸檬酸、焦苯六羧酸、苯五羧酸、氧化雙乙酸、羧甲基氧琥珀酸、羧甲基氧丙二酸、順環己烷六羧酸、順環戊烷四羧酸和氧化雙琥珀酸的鈉和鉀鹽。其它的聚羧酸鹽是美國專利4,144,226和4,146,495中描述的聚縮醛羧酸鹽。其它的洗滌助劑包括沸石，例如在美國專利4,405,483中描述的硅鋁酸鹽離子交換物質。其它優選的助洗劑是通式為RCH(COOH)CH2(COOH)的物質，即琥珀酸的衍生物，其中的R是C10-C20(優選的是C12-C16)烷基或鏈烯基，或者其中的R可以用羥基、磺基、亞砜或砜取代基取代。這些琥珀酸鹽助洗劑最好以它們水溶性鹽的形式使用，包括鈉、鉀和烷醇銨鹽。琥珀酸鹽助洗劑的具體例子包括十二烷基琥珀酸鹽、十四烷基琥珀酸鹽、十六烷基琥珀酸鹽、2-十二碳烯基琥珀酸鹽等。4.蛋白水解酶本發明的酶可以以已知的標準量用于洗滌劑組合物中。使用量的范圍很大，例如大約每克洗滌劑組合物0.0002-0.1或大約0.005-0.05Anson單位。以另一種單位表示，所說的組合物中所包含的蛋白酶的量在每毫克洗滌劑制劑大約0.1至100GU(例如1-50，特別是5-20GU/mg)的水平上，或者以大約0.01-4(例如每克洗滌劑制劑0.1-0.4)KNPU為中心的寬范圍的量。例如以每升洗滌液用大約0.25mg的蛋白酶(相當于每升0.08KNPU水平的酶活性)來使用本發明的酶是合適的。相應的洗滌劑制劑可以含有例如0.1-0.4KNPU/g數量級的酶量。以不同的方式表示，本發明的組合物含有大約0.01％至大約5％，優選的是大約0.1％至大約2％(重量)的本發明的蛋白水解酶。包含在組合物中的所描述的蛋白水解酶優選地是每克組合物含有足以提供0.05至大約1.0，更優選的從0.1至0.75，最優選地從大約0.125至大約0.5mg的活性酶的量。可以以任何方便的形式(如溶液、漿、LDP漿或晶體)向其它組分中加入所說的酶組分。5.酶穩定系統本發明的液體洗滌劑可以含有一種酶穩定系統，其包含鈣離子、硼酸、丙二醇和/或短鏈羧酸。所說的酶穩定系統包含大約0.5％至大約15％(重量)的組合物。優選地，每升組合物包含從大約0.01至大約50，優選地從大約0.1至大約30，更優選地從大約1至20毫摩爾的鈣離子。應該選擇鈣離子水平，以便在與組合物中的助洗劑等混合后，對酶而言總有某些可利用的最小水平。可以使用任一水溶性鈣鹽作為鈣離子源，其中包括氯化鈣、甲酸鈣、醋酸鈣。在組合物中，也經常存在少量的鈣離子(一般為0.05至0.4毫摩爾/升)，這是由于酶懸浮液和水中存在鈣的緣故。大約0.03％至大約0.6％的甲酸鈣是優選的。第二種優選的酶穩定劑是只含有碳、氫和氧原子的多元醇。這些多元醇優選地含有2至6個碳原子和2至6個羥基。例子包括丙二醇(1，2-丙二醇是尤其優選的)、乙二醇、甘油、山梨醇、甘露糖醇和葡萄糖。多元醇一般以組合物重量的大約0.5％至15％、優選地大約1.5％至8％(重量)的量存在。優選地，多元醇和任何加入的硼酸的重量比為至少1，更優選地為至少1.3。優選地，組合物也包含在美國專利4,318,818中描述的水溶性短鏈羧酸鹽。甲酸鹽是優選的，并且以組合物重量的大約0.05％至大約5％，優選地從大約0.2％至大約2％，最優選地從大約0.4％至1.5％(重量)的量使用。甲酸鈉是優選的。本文的組合物也可以包含或不包含大約0.25％至大約5％，更優選地從大約0.5％至大約3％量(重量)的硼酸。硼酸可以(但不是優選的)由在組合物中能夠形成硼酸的化合物來形成。雖然其它化合物如含硼的氧化物、硼砂和其它堿金屬硼酸鹽(例如原硼酸鈉、偏硼酸鈉、焦硼酸鈉和五硼酸鹽)是合適的，但硼酸是優選的。取代的硼酸(如苯基硼酸、丁烷硼酸和對溴苯基硼酸)也可以取代硼酸。6.水本發明的液態組合物可以是含水的液體或不含水的液體。當是含水的液體時，其含有大約15％至大約60％，優選地含有大約25％至大約45％(重量)的水。可有可無的其它組分A.輔助表面活性劑可有可無的與上述的非離子表面活性劑一起使用的輔助表面活性劑包括下式的酰胺其中的R1是含有8至20個碳原子的烷基、羥烷基或鏈烯基基團，R2和R3選自由下列基團組成的組氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、2-羥乙基、2-羥丙基、3-羥丙基，所說的基團還含有最多5個環氧乙烷單元，條件是R2和R3至少之一含有羥基基團。優選的酰胺是C8-C20脂肪酸烷基醇酰胺，其中每個烷基醇基團含有1至3個碳原子，還可以含有多達2個的環氧乙烷單元。尤其優選的是C12-C16脂肪酸的一乙醇酰胺和二乙醇酰胺。如果使用的話，酰胺優選的是以這樣的水平存在，即使得上述的乙氧基非離子表面活性劑和酰胺表面活性劑的重量比達到4∶1至1∶4，優選的是3∶1至1∶3。優選地并且可以任選地以0.15％至1％的水平使用的輔助表面活性劑是美國專利4,507,219中描述的季銨、胺和胺氧化物。綜上所述，C10-C14烷基三甲銨鹽是優選的，例如癸烷基三甲銨甲基硫酸鹽、十二烷基三甲銨氯化物、十四烷基三甲銨溴化物和椰子烷基三甲銨氯化物和甲基硫酸鹽。大約0.2％至0.8％的一烷基三甲銨氯化物是優選的。B.酒石酸鹽丁二酸鹽助洗劑本文的組合物最好包含0至大約10％、優選的是0至大約6％(以酸為基礎的重量)的酒石酸鹽丁二酸鹽助洗劑物質，這種物質選自由下列物質組成的組i)其中的X是形成鹽的陽離子；其中的X是形成鹽的陽離子；iii)它們的混合物。美國專利4,463,071中描述了這里使用的酒石酸鹽丁二酸鹽化合物。C.中和系統每100克組合物中也可以包含或不包含0至大約0.04摩爾，優選的是大約0.01至0.035摩爾，更優選的是大約0.015至大約0.03摩爾的烷醇胺，所說的烷醇胺選自由下列物質組成的組一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和它們的混合物。低級烷醇胺，特別是一乙醇胺是優選的，以便增加產物的穩定性、洗滌性能和氣味。然而，為了更好地和氯漂白劑兼容，應該最大限度地減少烷醇胺的量。此外，組合物含有鈉離子，優選的是鉀離子，其水平足以平衡陰離子，并提供所需的產物pH。D.泡沫抑制劑另一種可有可無用于液體洗滌劑的組分是0至大約1.5％，優選的是大約0.5％至大約1.0％(重量)的以聚硅氧烷為基礎的泡沫抑制劑。人們已經十分熟知聚硅氧烷，并且知道把它用作泡沫控制劑。例如，美國專利3,435,839涉及通過加入少量的聚二甲基硅氧烷液體使水溶液脫泡的組合物和方法。例如，有用的控制泡沫的聚硅氧烷是如德國專利申請DOS2,124,52中描述的聚硅氧烷和硅烷化二氧化硅的混合物。如在美國專利3,933,672和美國專利4,652,392中所述的通過使用聚硅氧烷去泡沫劑和抑泡沫劑不受洗滌劑表面活性劑的破壞，已經成功地把它們加入到粒狀洗滌劑組合物中。本文所使用的以聚硅氧烷為基礎的優選的泡沫抑制劑是泡沫抑制量的泡沫抑制劑，其實質上含有下列物質i)在25℃具有大約20cs.至大約1500cs.粘度的聚二甲基硅氧烷液體；ii)每100份(重量)(i)大約5至50份的聚硅氧烷樹脂，這種硅氧烷樹脂由比例為大約0.6∶1至大約1.2∶1的(CH3)3SiO1/2單位和SiO2單位組成。iii)每100份(重量)(i)大約1至大約20份的固體硅膠。“泡沫抑制量”的意思是組合物的配制人可以選擇的把泡沫控制到所需程度的泡沫控制劑的量。控制泡沫的劑量隨著選擇的洗滌劑表面活性劑的變化而異。例如，和低泡沫表面活性劑相比，使用高泡沫表面活性劑，就應使用相對更多的泡沫控制劑以達到所需要的泡沫控制程度。E.其它的酶本發明的洗滌劑組合物也可以包含其它的酶。例如，可以以帶有載體物質的脂解酶的溶液或懸浮液的形式有用地加入脂酶(例如，EP專利公開號258,068(NovoNordiskA/s))。加入的脂酶量可以在大的范圍內選擇，例如每克表面活性劑體系或洗滌劑組合物中加入50至30,000LU/g，經常使用的是至少100LU/g，非常有用的是至少500LU/g，有時優選的是1000、2000LU/g以上或4000LU/g以上或者更多一些，因此經常在50-4000LU/g的范圍內，并且盡可能地在200-1000LU/g范圍內。在本說明書中，脂酶的單位是按照EP專利公開號258,068定義的。可以在廣泛的脂酶范圍內選擇脂解酶。特別地，以下專利說明書描述的脂酶EP專利公開號214,761(NovoNordiskA/S)、258,068，尤其是與抗ThermomyceslanuginosusATCC22070脂酶的抗血清表現出免疫交叉反應的脂酶；EP專利公開號205,208和206,390，尤其是與抗ChromobacterviscosumvarlipolyticumNRRLB-3673脂酶或抗產堿菌屬(Alcaligenes)PL-679、ATCC31371和FERM-P3783脂酶的抗血清表現出免疫交叉反應的脂酶；以及WO87/00859的說明書(Gist-Brocades)和EP專利公開號204,284(SapporaBreweries)描述的脂酶。具體地說，以下市售的脂酯制劑是合適的LipolaseNovoNordiskA/S，Amano脂酶CE、P、B、AP、M-AP、AML和CES和Meito脂酶MY-30、OF和FL，以及EsteraseMM(NovoNordiskA/S)、Lipozym、SP225、SP285，(均為NovoNordiskA/S產品)，Saiken脂酶，Enzeco脂酶，ToyoJozo脂酶和Diosynth脂酶(商標)，Lumafast(Genencor公司)，Lipomax(Gist-BrocadesN.V.)和WO94/03578描述的脂酶(Unilever)。如果需要，例如可以使用淀粉酶，使用的量為每克洗滌劑組合物中大約1至大約100MU(麥芽糖單位)(或0.014-1.4，例如0.07-0.7KNU/g(Novo單位))。例如，合適的淀粉酶是Termamyl和BAN(NovoNordiskA/S)。需要時可以使用纖維素酶，使用的量為每克洗滌劑組合物中含有大約0.3至大約35CEVU單位。合適的纖維素酶例如Celluzyme和Carezyme(NovoNordiskA/S)。本發明考慮使用的其它酶是氧化酶和過氧化物酶。F.可有可無的其它組分用于本發明的液體洗滌劑中的其它可有可無的組分包括污物排除劑、污物釋放聚合物、抗再沉積劑如四亞乙基乙氧基戊胺(從大約0.5％至3％，優選地從大約1％至大約3％(重量))、泡沫調節物、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、粘土和水浮助劑(如異丙基苯磺酸鈉)、遮光劑、抗氧化劑、殺菌劑、染色劑、芳香劑和本領域熟知的增白劑。這些任選的組分一般占組合物重量的大約15％以下，優選的是大約0.5％至10％，更優選的是大約1％至大約10％。所說的組合物可以含有0％至大約8％、優選地從0％至大約5％(重量)的C12-C14鏈烯基琥珀酸或它的鹽。這些物質的通式為RCH(COOX)CH2(COOX)，其中的R是C12-C14鏈烯基基團，每個X是H或合適的陽離子，例如鈉、鉀、銨或者烷醇銨(例如一、二、三乙醇胺)。具體的例子是2-十二碳烯基琥珀酸鹽(優選的)和2-十四碳烯基琥珀酸鹽。本發明的組合物任選地含有大約0.1％至大約1％，優選的是大約0.2％至大約0.6％(重量)的乙二胺四亞甲基膦酸、二亞乙基三胺五亞甲基膦酸、乙二胺四乙酸(優選的)或二亞乙基三胺五乙酸(最優選的)的水溶性鹽，以便在預處理織物時提高洗滌性能。并且，洗滌劑組合物可以含有1-35％的漂白劑或漂白劑前體或者含有漂白劑和/或帶有自身激活物的前體的體系。還可以任選的組分是泡沫促進劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、螯合劑和抗污物再沉積劑等。本發明組合物優選含有至多約10％的乙醇。6.其它性質在20℃10％(重量)的本發明組合物的水溶液中，其通常具有大約7.0至9.0的pH，優選地從8.0至8.5的pH。本發明的組合物也具有小于或等于200ppm的臨界膠束濃度(CMC)，而且35℃時在高于CMC的蒸餾水中，空氣/水界面的張力小于或等于32，優選地小于或等于30達因/厘米。在“界面張力和表面張力的測量-實踐者的一般評述”C.Weser，GITFachzeitschriftfurdasLaboratorium，24(1980)642-648和734-742，FITVerlagErnstGiebeler，Darmstad，和＂界面現象-平衡和動力效應＂，C.A.Miller和P.Neogi，第1章，pp.29-36(1985)(MarcelDekker公司，NewYork.)中描述了這種測量方法。本發明的組合物也可以用于洗滌紡織材料，尤其是(但不限于)棉以及以聚酯為基礎的紡織品及它們的混合物。例如在大約60-65℃或更低溫度(如大約30-35℃或更低一些)下進行的洗滌過程是特別合適的。如果必須的話，雖然能使用低一些或高一些的濃度，但在洗滌液體中使用足以提供大約0.4-0.8g/L的表面活性劑的組合物比例是合適的。在沒有限制時，當制劑基本上是如實施例中的制劑時，例如可以提出使用比例為洗滌制劑大約1至10g/l，如為大約3-6g/l是合適的。在這一方面本發明尤其涉及a)一種配制成含水的洗滌液的洗滌劑組合物，其包含陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑、濕潤劑、有機酸、苛性堿，其pH值調整為9至10。b)一種配制成不含水的洗滌液的洗滌劑組合物，其包含液態的非離子表面活性劑(實質上由線性的烷氧基化伯醇組成、甘油三乙酸酯、三磷酸鈉、苛性堿、過硼酸鹽一水合物漂白前體和叔胺漂白激活物，其pH值調整為大約9和10之間。c)一種配制的酶液體洗滌劑組合物，當以相當于0.4-0.8g/l表面活性劑的比例使用時，其能給洗滌液提供9或更低的pH值。d)一種配制的酶液體洗滌劑組合物，當以相當于0.4-0.8g/l表面活性劑的比例使用時，其能給洗滌液提供8.5或更高的pH值。e)一種配制的酶液體洗滌劑組合物，當以相當于0.40.8g/l表面活性劑的比例使用時，其能給洗滌液提供0.03或更低(例如0.02或更低)的離子強度。f)一種配制的酶液體洗滌劑組合物，當以相當于0.4-0.8g/l表面活性劑的比例使用時，其能給洗滌液提供0.01或更高(例如0.02或更高)的離子強度。發現本發明的枯草酶變體可以加入到以條狀、片狀、棒狀和以類似的方式直接應用到織物、硬表面或其它任何表面上的洗滌劑組合物中。具體地說，它們可以加入到條狀形式的肥皂或肥皂/合成組合物中，在這些物質中，它們表現出較好的酶穩定性。南非專利93/7274描述了直接應用的條狀、片狀、棒狀和其它形式的洗滌劑組合物(本文一并參考)。因此，除了枯草酶變體，本發明優選的條狀洗滌劑組合物包含i)25-80％，更優選的是25至70％(重量)的活性洗滌劑(以無水的形式計)，這種活性洗滌劑是肥皂或肥皂與合成活性洗滌劑的混合物；ii)0％至50％，更優選的是10％至30％(重量)的水；iii)0至35％，更優選的是0.1至30％(重量)的填充物。一般地，包含在本發明的組合物中的枯草酶變體的量是相當于0.1至100GU/mg組合物，優選的是0.5至20GU/mg，更優選的是1.0至10GU/mg的蛋白酶解活性的量，其中的GU/mg是甘氨酸單位/毫克。在枯草酶基因中產生突變的方法許多把突變引入基因的方法在本領域是已知的。在有關克隆枯草酶基因的簡短討論后，將討論在枯草酶基因的隨機位點和特定位點產生突變的方法。克隆枯草酶基因可以通過各種本領域公知的方法從表1所示的任何生物體中克隆編碼枯草酶的基因，尤其是利用革蘭氏陽性細菌或真菌。首先必須利用能產生所要研究的枯草酶的生物體的染色體DNA或信使RNA構建基因組和/或cDNA的DNA文庫。然后，如果枯草酶的氨基酸序列是已知的，可以合成同源的標記的寡核苷酸探針，并利用它們從細菌DNA基因組文庫或cDNA文庫鑒定編碼枯草酶的克隆。另外，含有另一種細菌或生物體菌株枯草酶的同源序列的標記寡核苷酸探針可以在較低嚴格度的雜交和洗滌條件下作為鑒別編碼枯草酶克隆的探針。目前，另一種用于鑒定產生枯草酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入到表達載體(如一種質粒)中；用得到的基因組DNA文庫轉化蛋白酶陰性細菌，然后將轉化的細菌在含有枯草酶底物(如脫脂奶)的瓊脂上接種。由于排出的枯草酶對脫脂奶的消化，那些包含帶有枯草酶的質粒的細菌將產生由清晰的瓊脂暈圈圍繞的菌落。枯草酶基因中隨機突變的產生一旦將枯草酶基因克隆到適合載體(例如質粒)中，就可以利用幾種方法在基因中引入隨機突變。一種方法是將克隆的枯草酶基因作為可回收載體的一部分摻入到大腸桿菌的突變菌株上。另一個方法包括產生枯草酶基因的一種單鏈形式，然后將含有此枯草酶基因的DNA片段和另一個DNA片段退火，這樣枯草酶基因的一部分仍然是單鏈。然后可以將所說的不連續的單鏈區暴露在眾多誘變劑的任何一種中，這些誘變劑包括但不限于亞硫酸氫鈉、羥胺、亞硝酸、蟻酸或肼苯噠嗪。Shortle和Nathans描述了將這種方法用于產生隨機突變的特定例子(1978，美國科學院學報，752170-2174)。根據Shortle和Nathans的方法，將攜帶枯草酶基因的質粒用在此基因內切割的限制酶切口。利用DNA聚合酶I的外切核酸酶作用將此切口擴展成缺口。然后利用以上提及的任何一種誘變劑誘變所形成的單鏈缺口。另外，可以將芽孢桿菌屬的各個種的包括天然啟動子和其它控制序列的枯草桿菌蛋白酶基因克隆到這樣一種載體中，這種載體包含大腸桿菌和枯草桿菌的復制子、可選擇的表型標記、在輔助噬菌體IR1重復感染的基礎上用于產生單鏈質粒DNA的M13復制起點。分離包含克隆的枯草桿菌蛋白酶基因的單鏈質粒DNA，并與包含非枯草桿菌蛋白酶基因編碼區的載體序列的DNA片段退火，結果形成有缺口的雙螺旋分子。利用亞硫酸氫鈉、亞硝酸或蟻酸，或者通過如上所述在大腸桿菌突變體菌株中進行復制而將突變引入到枯草桿菌蛋白酶基因中。因為亞硫酸氫鈉專一地與單鏈DNA中的胞嘧啶反應，所以以這種誘變劑產生的突變只限制在編碼區。在不同的實驗中變化反應時間和亞硫酸氫鈉濃度，這樣在每個枯草桿菌蛋白酶基因上平均產生一至五個突變。將10毫克的缺口雙螺旋DNA在4M亞硫酸氫鈉(pH6.0)中，37℃下溫育9分鐘，反應體積為400毫升，結果使單鏈區的大約1％的胞嘧啶脫去氨基。成熟的枯草桿菌蛋白酶的編碼區包含大約200個胞嘧啶，取決于所說的DNA鏈。有利的是，反應時間在大約4分鐘(產生約200分之1的突變頻率)到大約20分鐘(約200分之5)之間變化。誘變后，體外利用DNA聚合酶I(克列諾片段)處理缺口分子，以便獲得完全的雙鏈分子并固定突變。然后利用突變的DNA轉化感受態的大腸桿菌，以便產生突變枯草桿菌蛋白酶擴增文庫。也可以通過在大腸桿菌MutD菌株中繁殖所說的質粒DNA來產生擴增突變體文庫，由于它的錯誤作用于DNA聚合酶，這種文庫增加了突變的范圍。也可以利用誘變劑亞硝酸和蟻酸產生突變體文庫。因為這些化學藥品與亞硫酸氫鈉不同，對于單鏈DNA不是特定的，所以按照下列方法進行誘變反應。在M13噬菌體中通過標準方法克隆枯草桿菌蛋白酶基因的編碼部分，并制備單鏈噬菌體DNA。然后使單鏈DNA與1M亞硝酸(pH4.3)在23℃下反應15-60分鐘，或者與2.4M的蟻酸在23℃下反應1-5分鐘。這些范圍的反應時間產生千分之一至千分之五的突變頻率。在誘變之后，將通用引物與M13DNA退火，利用誘變的單鏈DNA作為模板合成雙螺旋DNA，這樣枯草桿菌蛋白酶基因的編碼部分成為完全雙鏈。因此可以利用限制酶從M13載體上切割編碼區，并將其連接到非誘變的表達載體上，這樣突變僅在限制片段中發生(Myers等，科學229242-257(1985))。枯草酶基因中點突變的產生一旦克隆了枯草酶基因，鑒定了所需突變位點，并確定了取代原來殘基的殘基，就可以利用合成的寡核苷酸引進這些突變。這些寡核苷酸包含位于所需突變位點兩側的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期間插入了突變體核苷酸。在更為理想的方法中，在含有枯草酶基因的載體中產生DNA的單鏈缺口(橋連枯草酶基因)。然后將含有所期望突變的合成核苷酸與所說的單鏈DNA的同源部分退火。然后通過DNA聚合酶I(克列諾片段)填補余下的缺口，并利用T4連接酶連接構建體。Morinaga等描述了此方法的具體例子(1984，生物技術2646-639)。按照Morinaga等的方法，利用限制性核酸內切酶除去基因中的片段。然后使此時含有缺口的載體/基因變性，并與一個不含有缺口的，由另一個限制性核酸內切酶在所說的缺口區外的位點上切割的載體/基因雜交。然后可以得到用于與突變的寡核苷酸雜交的所說的基因的單鏈區，通過DNA聚合酶I的克列諾片段填補余下的缺口，由T4DNA連接酶連接所說的插入物，并且在一個復制循環后，產生含有期望突變的雙鏈質粒。Morinaga方法排除了構建新的限制位點的額外操作，并且有助于在多位點產生突變。在Estell等的美國再公告專利34,606(1994年5月10日發布)中，通過將所說的盒進行較少的改變能夠引進含有多個突變的寡核苷酸，而利用Morinaga的方法在任何時間都可以引進更多的突變，這是因為可以引進多種不同長度的寡核苷酸。枯草酶突變體的表達按照本發明，通過上文描述的方法或本領域任何已知的其它方法產生的突變的枯草酶基因可以在表達載體中以酶的形式表達。因為表達載體通常包含典型的克隆載體的組分(即一種在微生物中使得所說的載體能夠獨立于這種微生物的基因組而進行自主復制的元件)和用于選擇目的的一種或多種表型標記，所述表達載體一般落在克隆載體的定義范圍內。表達載體包括編碼啟動子的控制序列、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始信號、及可以包含也可以不包含阻遏物基因或者各種激活物基因。為了分泌表達的蛋白，可以在所說的基因的編碼序列前插入編碼“信號序列”的核苷酸。為了在控制序列的指導下進行表達，可操作地將按照本發明處理的靶基因與合適讀框中的控制序列連接。可以組合在質粒載體中的并且能夠支持突變枯草酶基因轉錄的啟動子序列包括但不限于原核生物β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff，等(1978)美國科學院學報753727-3731)和tac啟動子(DeBoer，等(1983)美國科學院學報8021-25)。從“來自重組細菌的有用蛋白質”(SeientificAmerican(1980)24274-94)中可以找到其它的參考文獻。按照一個實施方案，通過含有突變的DNA的表達載體轉化枯草桿菌。如果表達將發生在一種分泌微生物(如枯草桿菌)中，信號序列就可以在翻譯起始信號之后，而在目標DNA序列之前。信號序列的作用是將表達產物運輸到細胞壁，在此通過分泌從所說的產物中切除信號序列。上文限定的術語＂控制序列＂意欲包括信號序列(當其存在時)。也考慮了技術人員已知的其它宿主系統用于本發明蛋白酶變體的表達和產生。這些宿主系統包括真菌(包括絲狀真菌)、植物、鳥類和哺乳動物細胞等。材料和方法菌株枯草桿菌309和147是遲緩芽孢桿菌的變體，保藏在NCIB，保藏號為NCIB10309和10147，并且在美國專利3,723,250(本文一并參考)中有描述。大腸桿菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物學雜志138179-207)由常規方法制成r-，m+，在美國專利申請039,298中有此大腸桿菌的描述。蛋白酶解活性在本發明中以KiloNOVO蛋白酶單位(KNPU)表示蛋白酶解活性。相對于酶標準物(SAVINASE)確定所說的活性，并且這種測定是以在標準條件(即50℃，pH8.3，9分鐘反應時間，3分鐘測量時間)下所說的蛋白酶對二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化作用為基礎的。可以向NovoNordiskA/S(丹麥)索取卷宗220/1，因此參考文獻包括了所說的卷宗。GU是甘氨酸單位，限定為蛋白酶解酶活性，即在標準條件下，在40℃中經過15分鐘溫育，以N-乙酰酪蛋白作為底物，產生相當于1毫摩爾甘氨酸的NH2基的量。也可以利用PNA測定，按照與可溶底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯酚的反應測量酶活性，在美國石油化學家協會雜志，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.，和Smith，L.A.，(1988)描述了這種方法。實施例用與WO89/06279(NovoNordiskA/S)；EP130,756(Genentech)；EP479,870(NovoNordiskA/S)；EP214,435(Henkel)；WO87/04461(Amgen)；WO87/05050(Genex)；EP申請87303761(Genentech)；EP260,105(Genencor)；WO88/06624(Gist-BrocadesNV)；WO88/07578(Genentech)；WO88/08028(Genex)；WO88/08033(Amgen)；WO88/08164(Genex)；Thomas等(1985)自然，318375-376；Thomas等(1987)分子生物學雜志，193，803-813；Russel和Fersht(1987)自然328496-500中描述的同樣的材料和方法產生按照本發明的酶變體。也可以采用本領域已成熟的其它方法。實施例1酶變體的構建和表達構建了適合于編碼枯草酶309和其突變體的合成基因的載體。其實質上是pUC19質粒[Yanish-Perron和Messing(1985)基因；33103-119]，其中已由一個接頭取代了多克隆位點，這種接頭含有用于分離組成此基因的5個亞片段的限制位點。將這種新的接頭插入到EcoRI-HindIII切割的pUC19中，進而破壞了這些位點。WO92/19729的25-26頁和其圖1(圖1/7-7/7)描述了此構建的細節，因此其內容包括在這里作為參考。每個亞片段由6至12寡核苷酸組成。在自動DNA合成儀上利用氨基亞磷酸酯化學在控制的玻璃支持物上合成這些寡核苷酸[Beaucage和Carruthers(1981)；四面體通訊(TetrahedronLetters)221859-1869]。在2％瓊脂糖凝膠上分離五個亞片段，并將其插入到pSX191中。通過雙脫氧核苷酸測序法證實所說的序列。分離了片段A-E，并與KpnI-BamHI切割的pSX191連接在一起。利用連接混合物轉化感受態大腸桿菌MC1000r-，m+，進行氨芐青霉素抗性選擇。然后用850bpKpnI-BamHI片段(此片段組成了編碼所說酶的成熟部分的枯草桿菌蛋白酶309基因的部分)取代pSX212中的野生型基因，產生pSX222，將該質粒轉化進感受態枯草桿菌菌株中。在轉化的菌株發酵和所說的酶純化后，所得的產物和野生型產物無法區別。通過利用在需要突變的位置上具有改變的序列的寡核苷酸(如具有下文給出的序列)，并將它們和適于合成基因的其它寡核苷酸混合來制備來源于合成基因的蛋白酶變體。利用變體材料以不類似于以上所述的方式進行所說的變體基因的裝配。在Agarval等(1970)；自然；22727-34中可以獲得有關合成基因的其它信息。將KpnI位點引入到編碼此酶成熟部分的枯草酶309合成基因的起點處。所用的方法稱為寡核苷酸引導的雙鏈斷裂修復誘變法，Mandecki(1986)在美國科學院學報837177-7181中描述了這種方法。由NcoI在枯草酶309基因成熟部分的起點處切開pSX172，并與寡核苷酸NOR789混合(參見92/19729)，加熱到100℃，冷卻到0℃，并轉化大腸桿菌。再轉化后，利用32-P-標記的NOR789通過菌落雜交篩選重組體。在篩選期間證明是陽性的重組體具有通過改變兩個堿基而不改變氨基酸序列正好引入在NcoI前的KpnI位點。EP專利公開號405901描述了pSX172。將如此產生的KpnI位點以400-bpPvnI-NheI片段插入到pSX120中，產生pSX212。在EP專利公開號405901中也描述了pSX120。將合成基因插入到pSX212的KpnI和BamHI之間，產生pSX222。寡核苷酸的突變和相應序列的例子如下R170L(片段D1)5′-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGCTCTAT-3′||||||||||||||||||||||||||||||*||||5′-GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCGAGATACGCTTG-3′R170I(片段D1)5′-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGATCTAT-3′|||||||||||||||||||||||||||||**||||5′-GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCTAGATACGCTTG-3′S57P片段(B1)5′-AGCTTTGTACCAGGGGAACCGCCGACTCAAGATGGG-3′|||||||||||||||||*||||||||||||||3′-AACATGGTCCCCTTGGCGGCTGAGTTCTACCCTTACCC-5′這些寡核苷酸與沒有改變的合成基因的其余寡核苷酸組合。實施例2酶變體的純化此方法涉及10升體積的枯草桿菌蛋白酶147酶、枯草桿菌蛋白酶309酶或者它們的變體的發酵液的純化。將大約8升發酵液在1升燒杯中以5000rpm離心35分鐘。用10％醋酸將上清液調至pH6.5，并在SeitzSupraS100過濾平板上過濾。利用裝備有AmiconS1Y10UF柱體的AmiconCH2AUF裝置濃縮濾液至大約400毫升。在室溫下吸附到桿菌肽親和柱(pH7)上之前，離心并過濾UF濃縮液。在室溫下用25％2-丙醇和1M氯化鈉緩沖液(由0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣調至pH7)從桿菌肽柱中洗脫蛋白酶。將從桿菌肽純化步驟中得到的具有蛋白酶活性的流份合并，并加到750毫升SephadexG25柱上(直徑5cm)，此柱用含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液(調至pH6.5)平衡過。合并由SephadexG25柱中得到的具有蛋白酶解活性的流份，并將其加到150毫升CMSepharoseCL6B陽離子交換柱(直徑5厘米)，此柱用含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液(調至pH6.5)平衡過。用在2升同樣的緩沖液中的0-0.1M氯化鈉線性梯度(對于枯草桿菌蛋白酶147使用0-0.2M氯化鈉)洗脫蛋白酶。在最后的純化步驟中，將從CMSepharose柱中得到的含有蛋白酶的流份合并，并在裝備有GR81PP膜(來自丹麥食糖工廠公司)的Amicon超濾池中濃縮。通過利用實施例1的構建技術和上述分離方法，產生和分離了下列枯草桿菌蛋白酶309變體AG159IBS164ICY167IDR170IER170LFR170MGR170FHG195FIS57P+R170LJR170L+N218SKS57P+R170L+N218SLR170L+N218S+M222AMS57P+R170L+S188P+A194PNY167I+R170LOS57P+R170L+Q206EPR170L+Q206EQY167I+R170L+Q206ERY167I+R170L+A194PSY167I+R170L+N218STY167I+R170L+A194P+N218SUY167I+Y171IVR170GWR170CXY171IYY167I+R170L+N218S實施例3含有酶變體的洗滌劑組合物的穩定性實施例D1配制含有下列組分的按照本發明的一個實施方案的含水(各向同性的)洗滌液</tables>將pH調至7.1。表III含有BLS309變體S57P+R170L+N218S的實施例D1在37℃貯存后的殘留酶活性(以原有活性的百分比表示)貯存時間(天)野生型S57P+R170L+N218S010010034474711501053614727從表III可以很明顯地看出，在這種類型洗滌劑中變體S57P+R170L+N218S顯示出顯著改善的穩定性。此外，變體S57P+R170L+N218S與脂酶具有極好的相容性。表IV含有BLS309變體S57P+R170L+N218S和LIPOLASE的實施例D1在37℃貯存后的殘留脂酶活性(以原有活性的百分比表示)貯存時間(天)LIPOLASE加野生型S57P+R170L+N218S01001003386772444102233142127從上表IV明顯地看出，除了蛋白酶的穩定性外，蛋白酶的相容性也得到改善。實施例D2利用由4.9mol/mol環氧乙烷和2.7mol/mol環氧丙烷烷氧基化的38.5％C13-C15線性伯醇、5％甘油三乙酸酯、30％三磷酸鈉、4％小蘇打灰、包含少量氧化硼酸鹽的15.5％過硼酸鈉一水合物、4％TAED、0.25％EDTA(其1％為膦酸)、0.6％二氧化硅氣凝膠、1％SCMC和0.6％蛋白酶配制按照本發明一個實施方案的不含水的洗滌液。將pH調至9-10之間，例如大約9.8。實施例D3復配液體洗滌劑除含本文所描述的蛋白酶之外，例如可以包含2-15％非離子表面活性劑、5-40％總表面活性劑(包含非離子和可有可無的陰離子表面活性劑)、5-35％包含磷酸鹽或者非磷酸鹽的助洗劑、0.2-0.8％聚合物增稠劑(如分子量超過106的交聯丙烯酸聚合物)、至少10％硅酸鈉(例如中性水玻璃)，用堿(例如含鉀的堿)調整至所需的pH，優選的是9-10或更高(如pH11)，并且陽離子鈉和陰離子硅酸鹽(以游離二氧化硅計)的(重量)比小于0.7∶1，粘度為0.3-30Pas(20℃和203-1)。合適的例子包含大約5％的非離子表面活性劑C13-15醇(由每摩爾大約5個EO基團和每摩爾大約2.7個PO基團烷氧基化)、15-23％的中性水玻璃(二氧化硅和氧化鈉之間的重量比為3.5)、13-19％的KOH、8-23％的STPP、0-11％的碳酸鈉、0.5％的Carbopol941(TM)。蛋白酶可以以例如0.5％的量摻合。實施例D4(解耦聚合物液體)Priolene69074.5KOH10乙氧基化醇.7EO(SynperonicA7)4.5乙氧基化醇.3EO(SynperonicA3)4.5沸石4A15熒光劑TinopalCBS-X0.08NarlexDC11檸檬酸8.23防泡劑聚硅氧烷DB1000.3LAS酸16.5香味劑0.5加水至100表V含有BLS309的R170L變體的實施例D4在37℃貯存后的殘留酶活性(以原有活性的百分比表示)貯存時間(天)R170L野生型010010029873496661094463387881782.1101710從表V明顯地看出，R170L變體在這種類型洗滌劑中顯示出顯著改善的穩定性。表VI</tables>從表VI可以看出，在這種類型洗滌劑中，所實驗的變體與野生型相比，顯示出提高的穩定性。實施例D5(解耦聚合物液體)Priolene69074.5KOH10乙氧基化醇.7EO(SynperonicA7)4.5乙氧基化醇.3EO(SynperonicA3)4.5沸石4A15熒光劑TinopalCBS-X0.08NarlexDC11檸檬酸8.23防泡劑聚硅氧烷DB1000.3LAS酸16.5Lipolase100L0.6香味劑0.5加水至100表VII含有BLS309變體S57P+R170L+N218S的實施例D5在37℃貯存后的殘留酶活性(以原有活性的百分比表示)貯存時間殘留的蛋白酶活性殘留的脂酶活性(天)S57P+R170L+N218S野生型R170LS57P+R170L+N218S01001001001002-27419459791576887477112912.41278281002.41270從表VII明顯地看出，在這種類型洗滌劑中變體S57P+R170L+N218S顯示出顯著改善的穩定性。此外，變體S57P+R170L+N218S與脂酶具有極好的相容性。實施例D6產生包含49.7wt.80/20牛羊脂/椰子肥皂、49.0％水、20％檸檬酸鈉、1.0％檸檬酸和0.031％蛋白酶的肥皂條。制備后，將肥皂條貯存在環境溫度下，一定時間后，取出樣品并測量其蛋白酶活性。下表給出穩定性數據表VIII從上表明顯地看出，在這種類型洗滌劑中枯草酶變體R170L，R170L+N218S+S57P和R170L+Y167I顯示出顯著改善的穩定性。實施例D7產生包含63.88％80/20牛羊脂/椰子肥皂、1％椰子脂肪酸、25.1％水、10％鈉檸檬酸和0.021％蛋白酶的肥皂條。將該洗衣肥皂條在37℃貯存，一定時間后，取出樣品并測量其蛋白酶活性。表IX，穩定性數據</tables>從上表明顯地看出，在這種類型洗滌劑中枯草酶變體R170L+N218S+S57P顯示出顯著改善的穩定性。實施例4包含酶變體的洗滌劑組合物的洗滌性能下列例子提供了在所指出的實驗條件下進行的大量洗滌實驗的結果。實驗條件表X用于評價枯草桿菌蛋白酶309變體的實驗條件</tables>洗滌后，布料在自來水下沖洗并風干。上述類型的洗滌劑是一種簡單洗滌劑制劑。其最典型的特征是使用了STP作為助洗劑，并且陰離子表面活性劑(LAS)的含量很高。另外，pH被調至9.5，對于粉沫洗滌劑來說，這種pH是較低的。表XI此類型洗滌劑的組分如下25％STP(Na5P3O10)25％Na2SO410％Na2CO320％LAS(Nansa80S)5％NI(Dobanol25-7)5％Na2Si2O50.5％羧甲基纖維素(CMC)9.5％水劑量3g/lpH調至9.5在460nm用Elrepho2000光度計(沒有UV)完成了實驗材料的反射(remission)(R)測定。測定值用于下式ΔR=a·ΔRmax·cΔRmax+a·c]]>通過利用曲線的初始斜率計算改善因子IF=aaref]]>DR是以反射單位表示的酶的洗滌效果。a是適配曲線的初始斜率(c0)。arer是參考酶的初始斜率。c是以毫克/升表示的酶濃度。DRmax是以反射單位表示的酶的洗滌效果的理論最大值(cY)。表XII枯草桿菌蛋白酶309的變體和改善因子</tables>*WO91/00345中描述的從表XII可以看出，本發明所有的枯草桿菌蛋白酶309變體在洗滌性能方面都有改善。表XIII如實施例D4所描述的洗滌劑中的枯草桿菌蛋白酶309的變體和改善因子</tables>*WO91/00345中描述的從表XIII可以看出，本發明所有的枯草桿菌蛋白酶309變體在洗滌性能方面都有改善。權利要求1.一種在洗滌劑中具有改善的貯存穩定性和改善的性能的枯草桿菌蛋白酶變體，其中位于親本枯草酶疏水區中或者其鄰近區中的一個或多個氨基酸殘基已由一種比原來的殘基更為疏水的氨基酸所取代，所說的疏水區包括相應于BLS309(按BASBPN編號)的殘基P129、P131、1165、Y167、Y171的殘基，所說的疏水區鄰近區中的殘基包括相應于BLS309(按BASBPN編號)的殘基E136、G159、S164、R170、A194和G195的殘基，但BABP92的R170M、R170I和R170V變體和BLS309的R170Y變體除外。2.權利要求1的變體，其中所說的變體在液態洗滌劑中顯示出改善的穩定性。3.權利要求1的變體，其中所說的變體在成形的固體形式的洗滌劑中顯示出改善的穩定性。4.權利要求1的變體，其中所說的變體表現出改善的洗滌性能。5.權利要求1至4任一之變體，其中所說的原來的氨基酸殘基被增加其疏水性的任何其它氨基酸殘基所取代，這里被取代的殘基優選地選自包括Val(v)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)和Trp(W)的組，特別是Val、Ile或Leu。6.權利要求1至5任一之變體，其中所說的親本枯草酶選自I-S1亞組。7.權利要求6的變體，其中所說的親本枯草酶選自包括ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR的組。8.權利要求1至5任一之變體，其中所說的親本枯草酶選自I-S2亞組。9.權利要求8的變體，其中所說的親本枯草酶選自包括BLS147、BLS309、BAPB92和BYSYAB的組。10.權利要求8的變體，其中所說的的親本枯草酶是TVTHER。11.權利要求1至10任一之變體，其中所說的取代與任何其它位置的取代、插入或缺失相結合。12.權利要求11的變體，其中所說的取代與36、222、218、76任一位置上的取代、插入或缺失相結合。13.權利要求1至12任一之變體，其可以是下列任一變體T129V，T129I，T129L，T129M，T129FA129V，A129I，A129L，A129M，A129FG131V，G131I，G131L，G131M，G131FK136V，K136I，K136L，K136M，K136F，S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，K170V，K170I，K170L，K170M，K170F，Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，Y171Q，Y171S，Y171T，Y171GY171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171FS194V，S194I，S194L，S194M，S194F，E136V，E136I，E136L，E136M，E136F，G159V，G159I，G159L，G159M，G159F，G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W，Y167Q，Y167S，Y167T，Y167GY167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167FR170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170WR170Q，R170S，R170T，R170Y，R170GR170V，R170I，R170L，R170M，R170F，A194V，A194I，A194L，A194M，A194F，P194V，P194I，P194L，P194M，P194F，E195V，E195I，E195L，E195M，E195F，G195V，G195I，G195L，G195M，G195F，14.權利要求1至13任一之變體，其中所說的變體進一步地與下列一個或多個位置上的取代、缺失和/或插入相結合27、36、57、76、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274。15.權利要求14的變體，其中所說的枯草酶屬于I-S2亞組，并且所說的進一步的改變選自包括K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、A194P、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A的組。16.權利要求15的變體，這種變體包含任何一種或兩種下列取代以及權利要求1至15之任一中所提到的任何一種或多種其它的取代、缺失和/或插入X167V、X167M、X167F、X167L、X167I、X170V、X170M、X170F、X170L和/或X170I。17.權利要求15的變體，這種變體包括任何一種下列變體或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V1D4A)與權利要求1至15之任一中提到的任何一種或多種取代、缺失和/或插入的其它組合體V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或者N76D+V104A。18.權利要求15或16的變體，這種變體選自包括下列變體的組a)S57P+R170La′)S57P+R170Ib)R170L+N218Sb′)R170I+N218Sc)S57P+R170L+N218Sc′)S57P+R170I+N218Sc＂)S57P+V104Y+R170L+N218Sc)S57P+V104Y+R170I+N218Sd)R170L+N218S+M222Ad′)R170I+N218S+M222Sd＂)R170L+N218S+M222Ad)R170I+N218S+M222Se)S57P+R170L+S188P+A194Pe′)S57P+R170I+S188P+A194Pf)Y167L+R170Lf′)Y167L+R170Ig)Y167I+R170Lg′)Y167I+R170Ih)N76D+R170L+N218Sh′)N76D+R170I+N218Si)S57P+N76D+R170L+N218Si′)S57P+N76D+R170I+N218Sj)N76D+R170L+N218S+M222Aj′)N76D+R170I+N218S+M222Sj＂)N76D+R170L+N218S+M222Aj)N76D+R170L+N218S+M222Sk)S57P+R170I+S188P+A194P+N218Sk′)S57P+R170I+S188P+A194P+N218S1)*36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L1′)*36D+N76D+H120D+R170I+G195E+K235L1＂)*36D+N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235L1)*36D+N76D+H120D+Y167I+R170I+G195E+K235Lm)N76D+H120D+R170L+G195E+K235Lm′)N76D+H120D+R170I+G195E+K235Lm＂)N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235Lm)N76D+H120D+Y167I+R170I+G19SE+K235Ln)*36D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+K235Ln′)*36D+G97N+V104Y+H120D+R170I+A194P+G195E+K235Lo)S57P+R170L+Q206Eo′)S57P+R170I+Q206Ep)R170L+Q206Ep′)R170I+Q206Eq)Y167I+R170L+Q206Eq′)Y167I+R170I+Q206Er)Y167F+R170Lr′)Y167F+R170It)Y167I+R170L+A194Pt′)Y167I+R170I+A194Pt＂)Y167L+R170L+A194Pt)Y167L+R170I+A194Pu)Y167I+R170L+N218Su′)Y167I+R170I+N218Su＂)Y167L+R170L+N218Su)Y167L+R170I+N218Sv)Y167I+R170L+A194P+N218Sv′)Y167I+R170I+A194P+N218Sv＂)Y167L+R170L+A194P+N218Sv)Y167L+R170I+A194P+N218Sx)R170L+P131Vx′)R170I+P131Vy)*36D+Y167I+R170Ly′)*36D+Y167I+R170Iz)Y167I+Y171Iaa)Y167V+R170Laa′)Y167V+R170Ibb)R170L+Y171Ibb′)R170I+Y171Lbb＂)R170L+Y171Lbb)R170I+Y171Icc)Y167I+Y171L+N218Scc′)Y167I+Y171I+N218S19.一種方法，該方法包括在編碼枯草酶或者其前酶或前酶原的DNA的一個或多個位點上實施突變，并試驗在洗滌劑中改善的貯存穩定性和/或洗滌性能，在所述突變中，在親本枯草酶疏水區中或者其鄰近區中的所述位點上的氨基酸殘基由一種比原來的殘基更為疏水的氨基酸所取代，所說的疏水區包括BLS309的殘基P129、P131、I165、Y167、Y171的殘基，所說的疏水區鄰近區中的殘基對BLS309是E136、G159、S164、R170、A194和G195，但BABP92的R170M、R170I和R170V變體除外。20.一種方法，該方法包括在按照權利要求19的方法對這種酶進行鑒定后，制造具有所需改善的貯存穩定性或洗滌性能的突變枯草酶。21.一種編碼權利要求1至18任一之枯草酶變體的DNA序列。22.一種包含權利要求21的DNA序列的載體。23.用權利要求22的載體轉化的微生物宿主。24.權利要求23的微生物宿主，這種宿主是一種細菌，優選的是芽孢桿菌屬的細菌。25.權利要求23的微生物宿主，這種宿主是一種真菌或者酵母菌，優選的是絲狀真菌，尤其是曲霉屬的真菌。26.一種用于產生權利要求1至18任一之變體的方法，其中在有助于表達和分泌所說的變體的條件下，培養權利要求23至25任一之宿主，并回收所說的變體。全文摘要一種在洗滌劑中具有改善的貯存穩定性和改善的性能的枯草桿菌蛋白酶,其中位于親本枯草酶疏水區中或者其鄰近區中的一個或多個氨基酸殘基已由一種比原來的殘基更為疏水的氨基酸所取代,所說疏水區包括相應于BLS309(按BASBPN編號)的殘基P129、P131、I165、Y167、Y171的殘基,所說的疏水區鄰近區中的殘基包括相應于BLS309(按BASBPN編號)的殘基E136、G159、S164、R170、A194和G195的殘基(BLS309的R170M、R170I和R170Y變體除外)。文檔編號C12R1/19GK1183800SQ9619373公開日1998年6月3日申請日期1996年5月2日優先權日1995年5月5日發明者L·N·希爾克斯特拉,J·克魯格基斯特,P·馬克瓦德森,C·馮德奧斯坦,P·巴迪茲申請人:諾沃挪第克公司