制備阿霉素的方法

專利名稱：制備阿霉素的方法
技術領域：
本發明涉及從柔紅霉素中產生阿霉素(doxorubicin)的方法，使用的是經重組DNA轉化的宿主細胞中得到的一種酶。
柔紅霉素類的anthracyclines(例如阿霉素、洋紅霉素和阿克拉霉素)是抗癌治療中最廣泛應用的藥劑[F.Arcamone，Doxorubicin，A-cademic Press，New York，1981，pp.12-25；A.Grein，ProcessBiochem.1634(1981)；T.Kaneko，Chimicaoggi May11(1988)；C.E.Myers et al.，”Biochemical mechanisms of tumor cell kill”.見An-thracycline and Anthracenedione-Based Anti-Cancer Agents(Lown，J.W.，ed.)，Elsevier，Amsterdam，pp.527-569，1988；J.W.Lown，pharmac.Ther.60185-214(1993)]。已通過化學合成方法生產出柔紅霉素及阿霉素的改良性衍生物以提高其抗癌活性(特別是可通過口服途徑)，并可在癌癥治療中抵抗與使用這些藥物有關的急性毒性及慢性心臟毒力[Penco，Process Biochem，1512(1980)；T.Kaneko，Chimicaoggi May11(1980)]。這些類似物的實例有4′-表阿霉素(Epirubicin)、4-脫甲氧柔紅霉素(Idarubicin)以及甲氧基-嗎啉代阿霉素。
anthracyclines為自然發生的化合物。可由鏈霉菌屬的多種菌株產生(如波賽鏈霉菌、淺蘭淺紅鏈霉菌、加利利鏈霉菌、灰色鏈霉菌、灰淺紅鏈霉菌、S.insignis、綠色產色鏈霉菌、S.bifurcus以及鏈霉菌屬菌種C5)和放線菌屬A.carminata產生。阿霉素主要由波賽鏈霉菌caesius亞菌種產生，而柔紅霉素則由波賽鏈霉菌以及上述鏈霉菌菌種產生。可公開使用模式菌株波賽鏈霉素亞菌種caesius IM-RU 3920(其與ATCC 27952相同，因而下文中簡寫為波賽鏈霉菌3920”)、波賽鏈霉菌ATCC 29050(“波賽鏈霉菌29050”)、波賽鏈霉菌亞菌種caesius ATCC 27952(“波賽鏈霉菌27952”)和不生產柔紅霉素的波賽鏈霉菌dnrNaph II突變體[“波賽鏈霉菌dnrN”；S.L.Otten，J.Ferguson和C.R.Hutchinson，J.Bacteriol.1771216-1224(1995)]。特別是描述于US-A-3,590,028中的波賽鏈霉菌ATCC 27952，US-A-4,012,284中的波賽鏈霉菌29050以及保藏于美國標準培養物收藏所(美國馬里蘭州Rockville)的波賽鏈霉菌dnrN，序號為ATCC 55607。波賽鏈霉菌ATCC 55607是從波賽鏈霉菌ATCC 29050菌株中衍生得到，方法是用突變體dnrN基因來置換dnrN基因，使來自Tn5的aph II基因[J.M.Ward等.，Mol.Gen.Genet.203468-475(1986)]插入到突變體dnrN基因中SalI位點以破壞dnrN的功能。如在ISP4培養基(Difco實驗室，Detroit，MI，含50μg/ml的卡那霉素)上的生長所確定，波賽鏈霉菌ATCC 55607菌株對新霉素或卡那霉素具抗性，且并不產生阿霉素、柔紅霉素或其生物合成中的任何中間體(S.L.Otten等，待發表)。可通過波賽鏈霉菌27952從丙二酸、丙酸及葡糖中制成anthracyclines阿霉素，途徑如Grein[Advan.Appl.Microbiol.32203(1987)]和Eckardt及Wagner[J.Basic Microbiol.28137(1988)]所述。在這個過程中ε-紫紅霉酮、洋紅霉素及柔紅霉素為確定的中間體。該途徑中的最后步驟涉及到柔紅霉素向阿霉素的羥基化作用，這僅在波賽鏈霉菌27952中有過報導[F.Arcamone等.，Biotechnol.Bioeng.111101(1969)]。在EP-A-61737中描述過柔紅霉素向阿霉素生物轉化的方法(產率為30％)，使用的是波賽鏈霉菌ATCC 31847的不產生柔紅霉素的突變株，該突變株是用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理菌株ATCC 27952而得到的。不過，依據US-A-3,803,124，這種轉化通常是以化學法以工業規模進行的。
柔紅霉素生物合成及柔紅霉素抗性的基因已得自波賽鏈霉菌29050及波賽鏈霉菌27952中，方法是通過克隆實驗[Stutzman-Engwalland Hutchinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863135(1988)；Otten等.，J.Bacteriol.1723427(1990)]。這些研究表明，當引入進變鉛青鏈霉菌1326時，克隆化基因就使宿主具有了產生紫紅霉酮和對柔紅霉素及阿霉素具抗性的能力。
本發明提供一種編碼柔紅霉素14-羥化酶的分離性DNA分子。柔紅霉素14-羥化酶可將柔紅霉素轉變為阿霉素。DNA分子主要由SEQ ID No1的序列構成，該序列將被稱為“dxrA”序列。由SEQ ID No1編碼的柔紅霉素14-羥化酶的推斷氨基酸序列如SEQ ID No2所示。
本發明的DNA分子可含有

圖1中3.4kbSphI片斷的全部或部分。編碼柔紅霉素14-羥化酶的序列界于SphI片斷的KpnI和BamHI位點之間。本發明的DNA分子可含有圖2中NdeI-BamHI片斷的全部或部分。圖2中NdeI-BamHI片斷衍生自圖1中略大的KpnI-BamHI片斷。
當本發明的DNA分子僅含有3.4kbSphI片斷的一部分或Nde-BamHI片斷的一部分時，該部分必須具有柔紅霉素14-羥化酶的功能(即其必須能把柔紅霉素轉化為阿霉素)。該部分長度一般至少為1.2kb，優選為1.2-3.4kb，更優選為1.2-1.4kb。該部分可以是限制性內切酶片斷，如圖1中的KpnI-BamHI片斷。
本發明包括一種DNA分子，其可以編碼柔紅霉素14-羥化酶，后者的序列至少有60％與SEQ ID No2的序列相同。本發明還可包括柔紅霉素14-羥化酶，其氨基酸序列至少有60％與SEQ IDNo2的序列相同。該序列至少有80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％與SEQ ID No2序列相同。
SEQ ID No2序列可通過取代、缺失、插入、擴展、功能化或化學修飾來加以修飾。取代、缺失、插入或擴展可涉及一個或多個氨基酸，例如一、二、三、四、五、八、十五或二十個氨基酸。一般而言，SEQID No2的物化特性可以保留在修飾后的序列之中。通常，修飾后的序列在電荷、疏水/親水性及大小方面是相似的。候選的取代作用為可引起下列組中之一的氨基酸被同組中不同氨基酸所取代H、R和KI、L、V和MA、G、S和TD、E、P和N可使用常規技術來制備編碼修飾序列的DNA分子。例如，可利用常規的DNA合成、定點誘變和重組DNA技術予以制備。合適的技術如Sambrook等所述(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborNY。可以用含衍生性序列的蛋白質很容易地檢驗柔紅霉素14-羥化酶的活性，例如可利用下列實施例中的方法。
為了使本發明的DNA分子編碼的柔紅霉素14-羥化酶得到表達，DNA可攜帶其自身的轉錄控制序列，特別是其自身的啟動子，后者可操作性聯接在編碼序列上并被宿主細胞RNA聚合酶所識別。另外，DNA可以正確的方式聯接到異源轉錄控制序列上，或在適當靠近載體的轉錄控制序列的限制性位點處克隆入載體。
編碼柔紅霉素14-羥化酶的DNA分子可以是一重組DNA克隆或表達載體。可以使用含有可加入一或多個其它DNA片斷的DNA分子的任何自復制和/或整合劑。不過，載體通常為質粒。優選質粒為高拷貝數質粒pWHM3或pIJ702[Katz等.，J.Gen.Micro-biol.1292703(1983)]。其它適宜的質粒為pIJ385[Mayeri等，J.Bacteriol.1726061(1990)]、pIJ680[Hopwood等，Genetic Manipu-lation of streptomyces.A Laboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，UK，1985]、pWHM 601[Guilfoile and Hufchinson，Proc.Natl，Acad，Sci，USA 888553(991)]或pSET 152[Bierman等，Gene 11643-49(1992)]。可使用任何適宜的技術把DNA插入到載體中。可通過把DNA在適當的限制性位點處聯接至線性載體中而實現插入。為此，可使用粘性或鈍末端、均聚體加尾直接配合，或利用接頭或街接分子。
重組載體可用來轉化或轉染適宜的宿主細胞。宿主細胞可以是柔紅霉素或阿霉素敏感性細胞(即在有一定數量柔紅霉素或阿霉素的條件下不能生長)，或者是柔紅霉素或阿霉素抗性細胞。宿主可以是微生物，如細菌。因而可使波賽鏈霉菌、特別是波賽鏈霉菌dnrN及其它鏈霉菌菌株(其可以或不產生anthracyclines)分別得到轉化。鏈霉菌菌株的轉化體一般由原生質體轉化而得到。載體可表達在非鏈霉菌中，如在大腸桿菌之中。
可使用由轉化宿主得到的柔紅霉素14-羥化酶蛋白質來把柔紅霉素生物轉化為阿霉素。該方法使得制備高純度阿霉素成為可能，其起始于由發酵方法產生并含有柔紅霉素的一種細胞提取物。
可直接使用游離式固定化轉化細胞或通過分離柔紅霉素14-羥化酶蛋白質來實施生物轉化過程，蛋白質可以游離態使用或按已有技術利用離子鍵或共價鍵固定在于樹脂、玻璃、纖維素上，或相似物質上，或嫁接在可滲透至底物的纖維或通過交聯而使其不溶。柔紅霉素14-羥化酶蛋白質可用于粗細胞抽取物中。本發明中的重組載體也可用于轉化能產生柔紅霉素的適當的宿主細胞，以便能加強柔紅霉素向阿霉素的生物轉化。宿主細胞可以是柔紅霉素或阿霉素抗性細胞，即在任意量的柔紅霉素或阿霉素條件下其可以生長。因而波賽鏈霉菌菌株、特別是波賽鏈霉菌29050及其它可產生an-thracyclines的鏈霉菌菌株可得到轉化。通常可通過原生質體轉化作用而得到鏈霉菌菌株的轉化體。
本發明包括產生阿霉素的方法，該方法包括(i)在柔紅霉素存在的條件下，對用本發明載體所轉化或轉染的宿主細胞進行培養，培養條件為能使柔紅霉素轉化為阿霉素，以及(ii)從培養物中分離出阿霉素。
在該方法中，在20-40℃下(如30-37℃)對宿主細胞進行培養。在柔紅霉素存在的條件下培養持續時間為6-96小時，如12-72小時。最好在攪拌條件下進行培養。培養物中柔紅霉素的濃度為2-200μg/ml，如10-100μg/ml。可在培養開始時向培養基中加入柔紅霉素或在培養期間由宿主細胞生產出柔紅霉素。
本發明的DNA分子可得自波賽鏈霉菌29050的基因組DNA。該菌株已保藏在the American Type Culture Couection，Rockville，MD，USA，保藏號為ATCC 29050。還可以使用得自波賽鏈霉菌29050的菌株(如波賽鏈霉菌27952)，其通常也可把柔紅霉素轉化為阿霉素。DNA分子因而可通過下述方法得到(a)制備出波賽鏈霉菌29050或其衍生菌株的基因組DNA文庫；
(b)從文庫中選擇出有能力把柔紅霉素轉化為阿霉素的克隆；(c)從選擇出的克隆中分離出本發明的DNA分子。
在步驟(a)中可通過部分消化波賽鏈霉菌29050或其衍生菌株的基因組DNA來制備出文庫；或者通過篩選已富集化或專門含有柔紅霉素生物合成基因族的波賽鏈霉菌基因組DNA文庫來制備文庫。限制性內切酶MboI優選用于基因組DNA，而對于含柔紅霉素生物合成基因族的文庫來說，優選使用限制性內切酶BamHI或SphI。如此得到的DNA片斷可進行大小分級；大小在3-5kb的片斷最好用于基因組DNA，而13.5kb的BamHI或3.4-4.9kb的SphI則用于得自含柔紅霉素生物合成基因族的文庫的DNA片斷。把這些片斷聯接至線性化載體中，例如pWHM3、pIJ702或pKC505[M.A.Richardson等，Gene 61231(1987)]。用聯接混合物來轉化宿主細胞。通常，宿主細胞不能產生柔紅霉素，并可以是柔紅霉素及阿霉素敏感性的；例如，對每ml中的10微克或以下的柔紅霉素或阿霉素為敏感性的。比如，可轉化變鉛青鏈霉菌JI 1326原生質體(Hopwood等，Genetic Manipulation of Streptomyces.A LaboratoryManual，John Innes Foundation，Norwich，UK，1985)。
在步驟(b)中，對所得轉化體進行吸收柔紅霉素、將其轉化成阿霉素和分泌阿霉素能力的篩選。通過對含柔紅霉素的培養基提取物中阿霉素存在的色譜分析，來檢驗能將柔紅霉素轉化為阿霉素的克隆。對這種克隆進行分離，對其中含有的重組載體進行提取。步驟(c)中，在用適宜的限制性內切酶消化重組載體時，可對插入每一載體的波賽鏈霉菌29050 DNA進行鑒定、測量大小及圖譜測定。這樣，就可核對出該載體含有本發明的DNA分子。
另外，還可分離出兩種或多種重疊插入子，其全部或部分地屬于本發明的DNA。它們可通過在一共同限制性位點的裂解及隨后的聯接而相互融合，以得到本發明的DNA，如果需要的話則使用適宜的限制性內切酶進行長度配對。也可以用適宜的限制性內切酶來裂解插入DNA，在步驟c中得到一插入DNA的限制性片斷，所述插入DNA含有編碼柔紅霉素14-羥化酶蛋白質的基因。
下列實施例可闡述本發明。
在附圖中圖1表示本發明的DNA的限制性圖譜。這是重組質粒pIS70中的一個插入子，其構建方法是通過將一個含柔紅霉素14-羥化酶(dxrA)基因的3.4kbSphI DNA片斷(通過用SphI對其部分消化而從重組質粒pIS62中得到)插入到pWHM3質粒(一個大腸桿菌—鏈霉菌穿梭載體的SphI位點而構造成的[Vara等，J.Bacteriol，1715872(1989)]。圖1中的圖譜并不必提供DNA片斷中所有限制性位點的詳細目錄。不過，所報導的位點已足以清晰識別這些片斷。
圖2也顯示出本發明的DNA的限制性圖譜。這是一個重組質粒pWHM 969中的插入子，其構建方法是將一個1.33kb的NdeI/BamHI DNA片斷(經定點誘變而得自pIS 70的1.36kb KpnI/BamHI DNA片斷)插入pET14B大腸桿菌表達質粒載體的NdeI及BamHI位點[Novagen，Madison，WI]。特別是，通過對柔紅霉素-14-羥化酶基因的GTG啟動密碼子以及緊靠在該啟始密碼子之前的兩個核苷酸進行誘變，把NdeI限制性位點(5′-CAT ATG-3′)插入到1.36kb KpnI/BamHI DNA片斷之中，以便能再生出NdeI限制性內切酶所識別的靶序列。為了能使柔紅霉素-14-羥化酶基因在大腸桿菌中有效表達，根據大腸桿菌的密碼子使用對SEQID No1中所示野生型序列適宜地進行誘變。圖2所示的圖譜不必提供DNA片斷中所有限制性位點的詳細目錄。不過，所報導的位點已足以清晰識別這些片斷。
圖3是經dxr A表達載體的轉化并由IPTG誘發4小時的大腸桿菌中得到的細胞提取物的Comassie色SDS-聚丙烯酰胺凝膠。巷1，經表達載體pWHM 969轉化的大腸桿菌(DxrA分子量42，280)；巷2，經pET-14b轉化的大腸桿菌(陰性對照)；巷3，分子量標準。材料與方法細菌菌種及質粒把對氨芐青霉素及阿泊拉霉素敏感的大腸桿菌菌株DH5α用于DNA片斷的亞克隆化。把變鉛青鏈霉素ZX1[Zhou等，Nucleic Acids Res、164341(1988)]及波賽鏈霉菌dnrN[S.L.Otten，J.Ferguson and C.R.Hutchinson，J.Bacteriol.，1771216-1224(1995)]用于dxrA基因的表達。質粒克隆載體為pUC18/19[(Yansch-Perron等，Gene 33103(1985)]及pWHM3[Vara等，J.Bacteriol.1715872(1989)]。
培養基及緩沖液把大腸桿菌DH5α保持在LB瓊脂上(Sam-brook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，2nd ed.ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。當選擇轉化體時，將氨芐青霉素或阿泊拉霉素加入，濃度分別為100μg/ml及50μg/ml。把變鉛青鏈霉菌保持在R2YE瓊脂上(Hopwood等，Ge-netic Manipulation of Streptomyces.A Laboratory Manual，John InnesFoundation，Norwich，UK，1985)，用于孢子的制備以及原生質體的再生。
亞克隆化DNA片斷用適宜的限制性內切酶消化DNA樣品，并以標準法在瓊脂糖凝膠上分離(Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor NY，1989)。從凝膠上把含欲研究物的DNA片斷的瓊脂糖切片剪下，利用GENECLEAN設備(Bio101，La Jolla，CA)或相當設備從這些切片中分離出DNA。運用標準技術(Sambrook等，Molec-ular Cloning.A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)把所分離的DNA片斷分別亞克隆入大腸桿菌中和用于表達及生物轉化試驗的大腸桿菌/鏈霉菌穿梭載體中。
鏈霉菌菌種及大腸桿菌的轉化作用利用CaCl2方法制備大腸桿菌的感受態細胞(Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，并用標準技術進行轉化(Sambrook等，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。變鉛青鏈霉菌ZX1菌絲體在YEME培養基上生長(Hopwood等，Genetrc Manipulation of Streptomyces.A Labora-tory Manual，John，Innes Foundation，Norwich，UK，1985)，48小時后進行收獲。用10.3％的蔗糖溶液將菌絲體粒狀沉淀物沖洗兩次，并根據Hopwood手冊中描述的方法來制備原生質體(Hopwood等，Genettc Manipulation of Streptomyces.A Laboratory Manual，JohnInnes Foundation，Norwich，UK，1985)。把原生質體粒狀沉淀物懸浮在約300μl的P緩沖液中(Hopwood等，Genetic Manipulation ofStreptomyces.A Laboratory Manual，John Innes Foundation，Nor-wich，UK，1985)，將50μl該懸浮液的等分試樣用于每一次轉化作用。根據Hopwood等人的小規模轉化方法，用質粒DNA對原生質體進行轉化(Hopwood等，Genetic Manipulation of Streptomyces.ALaboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，UK，1985)。在R2YE培養上再生培養(溫度30℃)17小時之后，用50μg/ml的硫鏈絲菌肽覆蓋平板，任其在30℃下生長直至孢子形成。
柔紅霉素向阿霉素的生物轉化將含有本發明質粒的變鉛青鏈霉菌ZX1及波賽鏈霉菌dnrN轉化體接種至含10μg/ml硫鏈絲菌肽的液體R2YE培養基中。在30℃下生長兩天之后，將2.5ml該培養物轉移至含25μg/ml硫鏈絲菌肽的25ml生產培養基中[MC Gurire等，Process Biochem.142-5(1979)]。30℃下將培養物在置于旋轉振蕩器(280rmp)上的錐形瓶中生長72小時，其后，把柔紅霉素(5mg/ml水溶液)加入10ml該培養物中以達到終濃度為20μg/ml。在振蕩器上進一步培養24小時之后，加入25mg/ml草酸以水解anthracyclines代謝物的糖苷形式，之后，把培養物在水浴中培養60分鐘，溫度條件為55℃。把培養物置于旋轉振蕩器上(280rpm)，在30℃條件下用10ml乙腈∶甲醇(1∶1)從其中提取代謝物30分鐘。將提取物過濾，用反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)來分析過濾物。使用Vydac C18柱(4.6×250mm；5μM顆粒大小)來實施反相高壓液相色譜法，流速為0.385ml/分鐘。流動相A為在水中的0.1％三氟乙酸(TFA，來自Pierce ChemicalCo.)，流動相B為乙腈中的0.078％TFA(來自J.T.Baker ChemicalCo.)。用相A中20-60％相B的線性梯度進行洗脫，時間為33分鐘，用488nm二極管陣列檢測裝置進行監測(帶寬12μm)。用柔紅霉素及阿霉素(10μg/ml甲醇液)做為外標來定量測定分離自培養物的這些代謝物的量。實施例1編碼柔紅霉素14-羥化酶的dxrA基因的克隆化對Stutzman-Engwall及Hutchison所述的多種粘粒克隆[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863135(1989)]例如pWHM337及pWHM338，或者類似菌種中得到的相似克隆(分別代表波賽鏈霉菌29050基因組DNA的約20-90kb)，用BamHI部分消化，結合DNAs并再聯接，把所生成的質粒混合物(含pKC505載體或等同載體，其在大腸桿菌及鏈霉菌菌種中都具復制能力)用于轉化大腸桿菌DH5達到阿泊拉霉素抗性(或達到適于選擇所用載體的抗性)。把來自16種阿泊拉霉素抗性大腸桿菌克隆的質粒DNAs引入變鉛青鏈霉菌ZX1中，依據材料及方法部分中所述的方法來分析轉化體的柔紅霉素向阿霉素的生物轉化。從將所加入的柔紅霉素的3％轉變為阿霉素的轉化體中分離出質粒pIS23，發現其含有包括圖1所示的限制性圖譜區域的一段13.5kb插入子。將pIS23中的插入子用于亞克隆一段4.9kb Bgll II/ClaIDNA片斷至BamHI及AccI肖化過的pUC18中。從所生成的質粒中得到4.9kb EcoRI/HindIII片斷，并亞克隆入EcoRI及HindIII消化過的pWHM3中以得到質粒pIS62。如材料與方法部分所述來制備變鉛青鏈霉素ZX1(pIS62)轉化體，并檢測其柔紅霉素向阿霉素的生物轉化能力。其可以把所加入柔紅霉素的高達16％轉化為阿霉素。把pIS62中3.4kb SphIDNA片斷克隆至pWHM3的SphI位點以得到質粒pIS70(圖1)。依據材料與方法部分所述來制備變鉛青鏈霉菌ZX1(pIS70)轉化體，并檢測其柔紅霉素向阿霉素的生物轉化能力。其可以把所加入的柔紅霉素的高達22％轉化為阿霉素。實施例2利用含柔紅霉素14-羥化酶但缺少其它柔紅霉素基因產物的細胞來把柔紅霉素轉化為阿霉素依據材料與方法部分所述的方法，利用硫鏈絲菌肽抗性的選擇，以轉化作用把pIS62及pIS70質粒導入波賽鏈霉素dnrN菌種中。檢測所生成的波賽鏈霉素dnrN(pIS62)轉化體把柔紅霉素生物轉化為阿霉素的能力。其可以把所加入的柔紅霉素的高達58％轉變為阿霉素。檢測所生成的波賽鏈霉素dnrN(pIS70)轉化體把柔紅霉素生物轉化為阿霉素的活力。其可以把所加入的柔紅霉素的100％轉化為阿霉素。實施例3大腸桿菌中DxrA的表達表達載體pET-14b(商業來源Novagen-Madison，WI)依據的是T7啟動子驅動系統。當使用限制性位點NaeI時，pET-14b使在N末端與His-Tag相融合的克隆蛋白質得以表達。
來自含有整體dxrA基因的載體pIS70(圖1)的1373bp KpnI-BamHI片斷克隆入pUC19中[Yanish-Perron C等，(1985)Gene33，103-119]。從所生成的質粒中去除Sal I-BamHI片斷并聯接到利用兩個合成的寡核苷酸(51-mer Seq.ID NO.3及59-merseq.ID.No.4)制備的KpnI-SalI接頭上，以使dxrA的第一個密碼子轉變為ATG(其產生Nde I位點)，而使第4、第6及第7密碼子的第3部位轉變為能在高度表達的大腸桿菌基因中反映最常用的密碼子，做為一種提高dxrA表達之手段。把所生成的NdeI-BamHI片斷克隆入pET-14b中。
用于dxrA基因表達的大腸桿菌宿主是菌種BL21的入DE3溶源菌(商用來源Novagen-Madison WI)。依據下列程序，通過加入IPTG來誘導dxrA的表達。從新近劃線的平板pWHM 969(圖2)中簡單菌落性地接種100ml 2xYT及氨芐青霉素(50μg/ml)。細胞在30℃條件下生長直至OD600＝0.4-1.0。加入4mM IPTG來誘導dxrA的表達，連續培養3-4小時。
在微離心機中以14,000rpm離心0.5ml培養物，時間1分鐘，棄置上清液，將粒狀沉淀物再懸浮于50μl的Laemmli緩沖液中[Laemmli，Nature(London)，227680(1970)]，并煮沸5分鐘。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上對煮沸樣品中含有的蛋白質進行分析(圖3)，方法為標準法[Laemmli，Nature(London)，227680(1970)]，是通過與不含dxrA基因的pET14b載體相比較而進行的。
柔紅霉素14-羥化酶蛋白質在Mr42,280處發生移動。
序列一覽表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名PHARMACIA S.P.A.
(B)街道VIA KOCH 1.2(C)城市米蘭(E)國家意大利(F)郵編(ZIP)20152(G)電話)NE*39-2-48385045(H)電傳*9-2-48300578(ii)發明標題制備阿霉素的方法(iii)序列數目4(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM 兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特性(A)長度1269個堿基對(B)類型核酸(C)性況雙鏈(D)拓撲線性(ix)特點(A)名稱/檢索CDS(B)位置1..1269(xi)序列描述SEQ ID NO1GTG AGC GGC GAG GCG CCC CGG GTG GCC GTC GAC CCG TTC GCG TGT CCC48Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Val Ala Val Asp Pro Phe Ala Cys Pro1 5 10 15ATG ATG ACC ATG CAG CGC AAG CCC GAG GTG CAC GAC GCC TTC CGG GAG96Met Met Thr Met Gln Arg Lys Pro Glu Val His Asp Ala Phe Arg Glu20 25 30GCG GGC CCG GTC GTC GAG GTG AAC GCC CCC GCG GGC GGA CCC GCC TGG 144Ala Gly Pro Val Val Glu Val Asn Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ala Trp35 40 45GTC ATC ACC GAT GAC GCC CTC GCC CGC GAG GTG CTG GCC GAT CCC CGG 192Val Ile Thr Asp Asp Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Pro Arg50 55 60TTC GTG AAG GAC CCC GAC CTC GCC CCC GCC GCC TGG CGG GGG GTG GAC 240Phe Val Lys Asp Pro Asp Leu Ala Pro Ala Ala Trp Arg Gly Val Asp65 70 75 80GAC GGT CTC GAC ATC CCC GTT CCG GAG CTG CGT CCG TTC ACG CTC ATC 288Asp Gly Leu Asp Ile Pro Val Pro Glu Leu Arg Pro Phe Thr Leu Ile85 90 95GCC GTG GAC GGC GAG GCC CAC CGG CGC CTG CGC CGC ATC CAC GCA CCT 336Ala Val Asp Gly Glu Ala His Arg Arg Leu Arg Arg Ile His Ala Pro100 105 110GCG TTC AAC CCG CGC CGG CTG GCC GAG CGG ACG GAT CGC ATC GCC GCG 384Ala Phe Asn Pro Arg Arg Leu Ala Glu Arg Thr Asp Arg Ile Ala Ala115 120 125ATC GCC GGC CGG CTG CTC ACC GAA CTC GCC GAC GCC TCC GGC CGG TCG 432Ile Ala Gly Arg Leu Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala Ser Gly Arg Ser130 135 140GGC AAA CCG GCC GAG CTG ATC GGC GGC TTC GCG TAC CAC TTC CCG CTG 480Gly Lys Pro Ala Glu Leu Ile Gly Gly Phe Ala Tyr His Phe Pro Leu145 150 155 160TTG GTC ATC TGC GAG CTG CTC GGT GTG CCG GTC ACC GAT CCG GCG ATG 528Leu Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Val Thr Asp Pro Ala Met165 170 175GCC CGC GAG GCC GTC AGC GTT CTC AAG GCA CTC GGC CTC GGC GGC CCG 576Ala Arg Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Ala Leu Gly Leu Gly Gly Pro180 185 190CAG AGC GGC GGG GGT GAC GGC ACG GAC CCT GCC GGG GGC GTG CCG GAC624Gln Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Asp Pro Ala Gly Gly Val Pro Asp195 200 205ACC TCG GCC CTG GAG AGC CTG CTC CTC GAA GCC GTG CAC TCA GCC CGG672Thr Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val His Ser Ala Arg210 215 220CGG AAC GAC ACC CCG ACC ATG ACC CGC GTG CTG TAC GAG CGC GCG CAG720Arg Asn Asp Thr Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Tyr Glu Arg Ala Gln225 230 235 240GCC GAG TTC GGC TCG GTC TCC GAC GAC CAG CTC GTC TAC ATG ATC ACC768Ala Glu Phe Gly Ser Val Ser Asp Asp Gln Leu Val Tyr Met Ile Thr245 250 255GGG CTC ATC TTC GCC GGC CAC GAC ACC ACC GGC TCC TTC CTG GGC TTC816Gly Leu Ile Phe Ala Gly His Asp Thr Thr Gly Ser Phe Leu Gly Phe260 265 270CTG CTC GCG GAG GTC CTG GCG GGC CGC CTC GCG GCG GAT GCC GAC GAG864Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Ala Asp Glu275 280 285GAC GCC GTC TCC CGG TTC GTG GAG GAG GCG CTG CGC TAC CAC CCG CCG912Asp Ala Val Ser Arg Phe Val Glu Glu Ala Leu Arg Tyr His Pro Pro290 295 300GTG CCC TAC ACG TTG TGG AGG TTC GCT GCC ACG GAG GTG ACC ATC GGC960Val Pro Tyr Thr Leu Trp Arg Phe Ala Ala Thr Glu Val Thr Ile Gly305 310 315 320GGC GTC CGG CTG CCC CGC GGA GCG CCG GTG CTG GTG GAC ATC GAG GGC 1008Gly Val Arg Leu Pro Arg Gly Ala Pro Val Leu Val Asp Ile Glu Gly325 330 335ACC AAC ACC GAC GGC CGC CAT CAC GAC GCC CCG CAC GCC TTC CAC CCG 1056Thr Asn Thr Asp Gly Arg His His Asp Ala Pro His Ala Phe His Pro340 345 350GAC CGT CCC TCG TGG CGG CGG CTC ACC TTC GGC GAC GGG CCG CAC TAC 1104Asp Arg Pro Ser Trp Arg Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Pro His Tyr355 360 365TGC ATC GGG GAG CAG CTC GCC CAG CTG GAG TCG CGC ACG ATG ATC GGC 1152Cys Ile Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Glu Ser Arg Thr Met Ile Gly370 375 380GTA CTG CGC AGC AGG TTC CCC GAG GCC CGA CTG GCC GTG CCG TAC GAC 1200Val Leu Arg Ser Arg Phe Pro Glu Ala Arg Leu Ala Val Pro Tyr Asp385 390 395 400GAG TTG CGG TGG TGC CGG AAG GGG GCC CAG ACG GCG CGG CTC ACC GAA 1248Glu Leu Arg Trp Cys Arg Lys Gly Ala Gln Thr Ala Arg Leu Thr Glu405 410 415CTG CCC GTC TGG CTG CGC TGA 1269Leu Pro Val Trp Leu Arg *420(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特性(A)長度423個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Val Ala Val Asp Pro Phe Ala Cys Pro1 5 10 15Met Met Thr Met Gln Arg Lys Pro Glu Val His Asp Ala Phe Arg Glu20 25 30Ala Gly Pro Val Val Glu Val Asn Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ala Trp35 40 45Val Ile Thr Asp Asp Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Pro Arg50 55 60Phe Val Lys Asp Pro Asp Leu Ala Pro Ala Ala Trp Arg Gly Val Asp65 70 75 80Asp Gly Leu Asp Ile Pro Val Pro Glu Leu Arg Pro Phe Thr Leu Ile85 90 95Ala Val Asp Gly Glu Ala His Arg Arg Leu Arg Arg Ile His Ala Pro100 105 110Ala Phe Asn Pro Arg Arg Leu Ala Glu Arg Thr Asp Arg Ile Ala Ala115 120 125Ile Ala Gly Arg Leu Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala Ser Gly Arg Ser130 135 140Gly Lys Pro Ala Glu Leu Ile Gly Gly Phe Ala Tyr His Phe Pro Leu145 150 155 160Leu Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Val Thr Asp Pro Ala Met165 170 175Ala Arg Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Ala Leu Gly Leu Gly Gly Pro180 185 190Gln Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Asp Pro Ala Gly Gly Val Pro Asp195 200 205Thr Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val His Ser Ala Arg210 215 220Arg Asn Asp Thr Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Tyr Glu Arg Ala Gln225 230 235 240Ala Glu Phe Gly Ser Val Ser Asp Asp Gln Leu Val Tyr Met Ile Thr245 250 255Gly Leu Ile Phe Ala Gly His Asp Thr Thr Gly Ser Phe Leu Gly Phe260 265 270Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Ala Asp Glu275 280 285Asp Ala Val Ser Arg Phe Val Glu Glu Ala Leu Arg Tyr His Pro Pro290 295 300Val Pro Tyr Thr Leu Trp Arg Phe Ala Ala Thr Glu Val Thr Ile Gly305 310 315 320Gly Val Arg Leu Pro Arg Gly Ala Pro Val Leu Val Asp Ile Glu Gly325 330 335Thr Asn Thr Asp Gly Arg His His Asp Ala Pro His Ala Phe His Pro340 345 350Asp Arg Pro Ser Trp Arg Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Pro His Tyr355 360 365Cys Ile Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Glu Ser Arg Thr Met Ile Gly370 375 380Val Leu Arg Ser Arg Phe Pro Glu Ala Arg Leu Ala Val Pro Tyr Asp385 390 395 400Glu Leu Arg Trp Cys Arg Lys Gly Ala Gln Thr Ala Arg Leu Thr Glu405 410 415Leu Pro Val Trp Leu Arg *420(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特性(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓撲線性(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCGCGGCGG CGGGCGGTGC CATATGAGCG GCGAAGCGCC GCGTGTGGCC G51(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特性(A)長度59個堿基對(B)類型核酸(C)鏈況單鏈 (xi)序列描述SEQ ID NO4TCGACGGCCA CACGCGGCGC TTCGCCGCTC ATATGGCACC GCCCGCCGCC GCGGGGTAC59
權利要求
1.編碼柔紅霉素14-羥化酶的一種分離性DNA分子。
2.依據權利要求1的一種DNA分子，含有圖1中全部或部分3.4kbSphI片段。
3.依據權利要求1的一種DNA分子，含有圖2中全部或部分NdeI-BamHI片段。
4.依據權利要求1的一種DNA分子，其編碼具有SEQ ID No2序列的柔紅霉素14-羥化酶。
5.依據權利要求1的一種DNA分子，其編碼與SEQ ID No2序列至少有60％相同序列的柔紅霉素14-羥化酶。
6.依據權利要求1的一種DNA分子，主要含SEQ ID No1的序列。
7.一種編碼柔紅霉素14-羥化酶的載體。
8.依據權利要求7的一種載體，含有圖1中全部或部分3.4kbSphI片段。
9.依據權利要求7的一種載體，含有圖2中全部或部分NdeI-BamHI片段。
10.依據權利要求7的一種載體，其編碼具有SEQ ID No2序列的柔紅霉素14-羥化酶。
11.依據權利要求7的一種載體，其編碼具有與SEQ ID No2序列至少60％相同的序列的柔紅霉素14-羥化酶。
12.依據權利要求7的一種載體，含有基本由SEQ ID No1序列組成的序列。
13.依據權利要求7的一種載體，其為一種質粒。
14.依據權利要求13的一種質粒，其為pIS23、pIS62或pIS70。
15.由權利要求7中要求的載體所轉化或轉染的一種宿主細胞。
16.依據權利要求15的一種宿主細胞，其為一種產生柔紅霉素的細菌細胞。
17.依據權利要求16的一種宿主細胞，其為一種鏈霉菌細胞。
18.產生阿霉素的一種方法，其包括(i)在柔紅霉素存在的條件下培養權利要求15中所要求的宿主細胞，培養條件為使柔紅霉素轉化為阿霉素，以及(ii)從培養物中分離出阿霉素。
19.產生阿霉素的一種方法，其包括(i)培養權利要求16中所要求的宿主細胞，培養條件為使柔紅霉素轉化為阿霉素，以及(ii)從培養物中分離出阿霉素。
20.一種柔紅霉素14-羥化酶，其具有與SEQ ID No2序列至少60％相同的氨基酸序列。
21.依據權利要求20的柔紅霉素14-羥化酶，其具有SEQ IDNo2的氨基酸序列。
22.含有柔紅霉素14-羥化酶的一種細胞抽提物，其中所述柔紅霉素14-羥化酶含有與SEQ ID No2所示氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。
23.依據權利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子的長度至少為1.2kb。
24.依據權利要求23的DNA分子，其中所述DNA分子長度在1.2-2.4kb之間。
25.依據權利要求20的柔紅霉素14-羥化酶，其中所述氨基酸序列具有與SEQ ID No2相同的疏水性/親水性及大小。
26.編碼柔紅霉素14-羥化酶的一種DNA分子，其中所述DNA分子含有如圖1的3.4kb SphI片斷或者在遺傳密碼簡并性范圍內與如圖1的3.4kb SphI片段相當的一段片段。
27.產生權利要求1的分離性DNA分子的一種方法，該方法包括(a)制備波賽鏈霉菌29050或其衍生菌種的基因組DNA文庫；(b)從文庫中選擇出一種能將柔紅霉素轉化為阿霉素的克隆；(c)從所選擇出的克隆中分離出本發明的DNA分子。
全文摘要
通過含有編碼柔紅霉素14-羥化酶的DNA的一重組載體的轉化作用，賦予宿主細胞把柔紅霉素轉化為阿霉素的能力。該宿主細胞可用來生產阿霉素。
文檔編號C12P19/56GK1147835SQ96190128
公開日1997年4月16日 申請日期1996年2月20日 優先權日1995年2月27日
發明者A·索拉里英萬逖, U·布里姆, A·L·科羅姆伯, C·R·胡奇英桑, S·奧坦, C·斯科逖 申請人:法瑪西雅厄普約翰公司