防止移植中移植排斥和產生通用基因治療宿主細胞的方法

專利名稱：防止移植中移植排斥和產生通用基因治療宿主細胞的方法
技術領域：
本發明涉及防止移植的器官、組織或細胞發生移植(物)排斥的方法，尤其涉及這樣的方法，該方法包括對細胞類型進行遺傳工程改造使其植入宿主時會表達LAG-3蛋白。更具體地，本發明涉及產生在其表面表達LAG-3蛋白的通用基因治療宿主細胞。
背景技術：
的描述淋巴細胞活化基因(lymphocyte activation gene)(LAG-3)是免疫球蛋白超家族的一員，它在人的活化T細胞(CD4+和CD8+)和NK細胞中被選擇性地轉錄(Triebel等人，1990)。其序列數據以及經與內含子/外顯子組織結構和染色體定位相比較，揭示出LAG-3與CD4緊密相關(Baixeras等人，1992)。LAG-3和CD4之間的緊密關系還得到了進一步的證實，即兩者共享相同的配體即MHCⅡ類分子(Baixeras等人，1992)。然而，與CD4相反，LAG-3不與人免疫缺陷病毒gp120結合(Baixeras等人，1992)。在體內，LAG-3的表達既沒有在初級淋巴器官(如脾臟、與粘膜相關的淋巴組織)中發現，也沒有在正常淋巴結中發現。然而，可在受感染的扁桃體或濾泡增生的淋巴結中輕易地檢測到它，這一現象支持了這樣的觀點即使在體內，LAG-3的表達是在活化作用之后(Huard等人，1994A)。在抗-LAG-3單克隆抗體(mAb)存在下，對T細胞克隆進行抗原特異性刺激會導致胸苷摻入量增加、活化標記物CD25的表達更高以及細胞因子的產量增加(Huard等人，1994B)。
因此，添加可溶性重組LAG-3可抑制抗原特異性T細胞增殖，這暗示LAG-3在CD4+T-淋巴細胞激活作用中有調控作用(Huard,1996)而且涉及熄滅正進行的免疫應答反應。最近，已表明，LAG-3還作為NK細胞的協同受體，并且界定受先天免疫系統控制的殺傷腫瘤細胞的不同模式(Miyazaki等人，1996)。
T細胞對外來(同種異體或異種)蛋白或細胞或器官發生應答的機制，已經了解得相當清楚。抗原呈遞細胞(APC)會被吸引到炎癥或受傷區域(這可因手術移植而誘發)。在外周的全部T細胞會不停地檢查組織是否有病原體的證據或是否存在外來(同種異體或異種)組織。一旦識別任何警告信號，APC就會吞下蛋白，消化它并將其呈遞給宿主的免疫系統。
早已對異體的或同系的腫瘤細胞進行遺傳工程改造，以表達病毒性IL-10，這可誘導對腫瘤細胞局部無反應性。這種處理并不影響較遠部位處非轉導腫瘤發生排斥(SuZuki等人，1995)。局部IL-10給藥，被認為能夠將對移植細胞起反應的全部T細胞轉變為Th2表型，這種表型不導致細胞溶解而且甚至可起保護作用。
在無免疫抑制的情況下，天然表達Fas配體的細胞已經可移植通過異體或異源屏障。宿主T細胞對植入位點的監視，會在與Fas配體接觸時導致T細胞的殺傷(Bellgrau等人，1995)。此外，胰島異體移植物的排斥現象，已經可通過同時移植同系的、經遺傳工程改造而表達Fas配體的成肌細胞而得以防止(Lau等人，1996)。
免疫系統的裝備精良，可以快速地識別外來的、生病的或發炎的組織，并且快速加以摧毀。這一直是組織、器官和細胞移植中以及基因治療中的主要障礙。主要問題通常與長期免疫抑制、封閉或免疫隔離有關。長期免疫抑制的不利副作用包括對機會性感染和腫瘤形成的易感性上升。
在無須持續免疫抑制的情況下，希望長期接受移植組織，是人類醫學上一個久已存在的目標。
本文引用任一文獻，并不意味著承認該文獻是相關的已有技術，也不認為與本申請權利要求的專利性有關的材料。對于任何文獻的內容或日期的陳述，是以申請人在申請之時所能獲得的信息為基礎的，因而并不表示承認這一陳述的正確性。
發明概述現已發現，移植在其表面上表達LAG-3蛋白的細胞，可起保護作用以避免宿主免疫系統的移植排斥現象。
因此，本發明提供了一種遺傳工程改造過的細胞，該細胞可以是待移植的組織或器官的一部分，該細胞含有編碼位于表面的跨膜LAG-3蛋白的DNA，從而起保護作用而免受宿主免疫系統的移植排斥作用，其中該DNA可以是基因組DNA或cDNA。該DNA可以是外源的、或者在本發明的一個具體例子中是內源的，該DNA的表達可利用同源重組通過定向插入調控序列和/或可擴增基因而得以激活或修飾。LAG-3蛋白是可被針對LAG-3的抗體所識別的蛋白質。
當這種細胞是待移植組織或器官的一部分時，可以直接在待移植組織或器官上實現LAG-3DNA的轉染。
具體地，這種細胞是通用的基因治療宿主細胞，它適用于例如任何種類的體細胞的或“活體外的”基因治療。
在一個具體例子中，基因治療宿主細胞還包括編碼感興趣治療劑的外源DNA，因而遺傳工程改造過的細胞被用作治療劑。如本文所用，術語“治療”包括療治和/或預防。
在另一例子中，編碼感興趣治療劑的基因位于細胞基因組中，而且該細胞還含有編碼調控序列和/或可擴增基因的外源DNA，以激活或修飾感興趣內源基因的表達。
然而，本發明的遺傳工程改造細胞可以僅含有外源LAG-3DNA，并與含有感興趣的治療性DNA的其他基因治療宿主細胞聯合使用。
本發明細胞宜選自成肌細胞、成纖維細胞、造血干細胞、胚胎干細胞、胎兒肝細胞、臍靜脈內皮細胞和CHO細胞。
如上所述的、衍生自轉基因動物的細胞也在本發明范圍之內。
本發明的另一目的是在細胞表面上表達的跨膜LAG-3蛋白(包括其突變蛋白和變異蛋白)的用途，它們被用于制造藥物，該藥物可引發防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
此外，本發明提供了含有編碼跨膜LAG-3蛋白(該蛋白在細胞表面上表達)的DNA的細胞的用途，它們被用于制造藥物，該藥物可引發防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
在本發明范圍之內的，還包括在其表面上表達LAG-3的細胞的用途，即用于制造與待移植的細胞、組織或器官相混合的藥物，該藥物可引發防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
附圖簡述

圖1-用LAG-3-CHO細胞或LH-CHO細胞致敏的(primed)小鼠脾細胞對于LH-CHO細胞的細胞毒性。平均值(±SD)來自如圖例所示進行致敏的5只小鼠；此外還評估了2只未致敏的小鼠。
圖2-用LAG-3-CHO細胞或LH-CHO細胞致敏的小鼠脾細胞對于LAG-3-CHO細胞的細胞毒性。平均值(±SD)來自如圖例所示進行致敏的5只小鼠；此外還評估了2只未致敏的小鼠。
圖3-Dα哺乳動物表達載體的結構圖。使用的縮寫如下DHFR，脫氫葉酸轉錄單元(Subraimani等人，1981)；pML,pBR322的衍生物(Lusky和Botchan,1981)；hAIVSA，人糖蛋白激素α亞基的內含子A的片段(Fiddes和Goodman,1981)；MMT-1，小鼠金屬硫蛋白1的啟動子(Hamer和Walling,1982)。
發明詳述每年，成千上萬的人因為心、腎、肝、肺和胰臟的衰竭而死亡。一種最有效的療法就是移植。
與移植細胞、組織或器官相關的療法，會在宿主中誘發針對植入的細胞、組織或器官的全身免疫保護狀態。需要建立對移植物的特異性保護以免受宿主免疫系統的排斥，尤其在異體移植、異種移植和基因治療中。此外，也需要抑制對腫瘤組織的耐受性，或否則讓宿主免疫系統攻擊腫瘤組織。
因此，本發明涉及所有的上述方法，這些方法利用了表達跨膜LAG-3蛋白的細胞或組織的移植，可保護移植物以避免宿主免疫系統發生移植排斥這一發現。
本發明采用新發現的LAG-3基因和蛋白，它通常是在活化的T細胞和活化的NK細胞上表達的。
如本文所用，定義“跨膜LAG-3蛋白”指任何含有LAG-3細胞質外結構域的跨膜蛋白，其鹽、功能性衍生物、前體或活性部分，以及其活性突變蛋白和其活性變異體，它們都在細胞表面上表達。
該定義還指這樣的跨膜蛋白，它以其天然狀態表達，或可通過例如遺傳工程而融合于其他蛋白(如糖基磷脂酰肌醇錨蛋白)或其他跨膜蛋白(如TNF受體、MPL-配體或跨膜免疫球蛋白)的任何有關片段。
如本文所用，定義“鹽”指通過已知方法獲得的化合物的羧基鹽或氨基官能團的鹽。羧基鹽包括無機鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽，以及與有機堿形成的鹽，例如與三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸等胺形成的鹽。氨基的鹽包括例如與無機酸如鹽酸形成的鹽，以及與有機酸如乙酸形成的鹽。
如本文所用，定義“功能(性)衍生物”指可根據已知方法從氨基酸部分的側鏈上的功能基團或N-或C-末端基團制得的衍生物，而且當它們在藥學上可接受時(即它們不破壞蛋白質活性，也不使含有它們的藥物組合物具有毒性)，被包括在本發明內。這樣的衍生物包括例如，羧基所形成的酯或脂族酰胺、以及自由氨基的酰基衍生物、或自由羥基的O-酰基衍生物，它們可以通過與酰基基團例如alcanoyl基或芳酰基反應而形成。
“前體”是可在人體或動物體內轉變成LAG-3的化合物。
作為蛋白質的“活性部分”，本發明指化合物本身多肽鏈的任何片段或前體，它可以是單獨的也可以與相關分子或與其結合的殘基(例如糖殘基或磷酸根殘基)相混合，或者當這些片段或前體具有與作為藥物的LAG-3相同活性時可指多肽分子的聚集體。
優選的“活性部分”是LAG-3蛋白胞外部分的可溶性部分，它包括LAG-3的細胞質外結構域即D1、D2、D3和D4四個結構域中的一個或多個結構域。
如本文所用，定義“活性突變蛋白”指其他的蛋白質或多肽，其中結構中的一個或多個氨基酸被刪去或被其他氨基酸所置換，或者在序列中添加了一個或多個氨基酸，以便獲得具有與LAG-3相同活性的多肽或蛋白質。例如，Arg73和/或Arg75和/或Arg76可以被不同的氨基酸(較佳地被Glu)所替換。
LAG-3的“活性變異體”是剪接方式不同的變異體以及所有一級基因轉錄物，它們是在基因的不同切割位點因不同剪接機制而衍生得到的。優選的變異體是缺少LAG-3胞外部分的D3和/或D4結構域的可溶性蛋白或跨膜蛋白，它可任選地含有位于D2或D3結構域后的一些額外的氨基酸。
跨膜LAG-3蛋白在細胞表面的表達可以用免疫反應方法加以證實。跨膜蛋白可被例如抗-LAG-3抗體11E3(保藏號No.CNCM I-1612)、17B4(保藏號No.CNCM I-1240)或15A9(保藏號No.CNCM I-1239)所識別。
本發明還涉及一種如上所述的多肽和衍生物的混合物。
當用于本說明書和權利要求書時，詞語“LAG-3”、“LAG-3蛋白”、“LAG-3分子”指包括天然的、合成的和重組形式的該多肽，并且包括上述的所有定義。
本發明的細胞可選自原代或次代細胞。如本文所用，術語原代細胞包括存在于從脊椎動物組織源分離出的細胞的懸浮液中的細胞(在它們被平板接種之前，即在附著于組織培養基質如皿或瓶之前)，存在于衍生自組織的外植體中的細胞、被第一次接種的上述兩種細胞、和衍生自該接種細胞的細胞懸浮液。術語次代細胞或細胞株指在隨后的所有培養步驟中的細胞。即，第一次將接種的原代細胞從培養基質上取下并再接種(傳代)時，它在本文就被稱為次代細胞，在隨后傳代中的所有細胞也稱為次代細胞。次代細胞是由已傳代一次或多次的次代細胞所構成的細胞株。一個細胞株可由以下次代細胞構成(1)已經傳代一次或多次的次代細胞；(2)在培養中表現出有限的平均群體倍增次數的次代細胞；(3)表現出接觸抑制的、依賴于貼壁(“依賴于貼壁”并不適用于在懸浮培養中繁殖的細胞)生長的次代細胞；和(4)非無限增殖化的次代細胞。“克隆的細胞株”被定義為衍生自單個原始細胞(founder cell)的細胞株。“異源細胞株”被定義為衍生自兩個或多個原始細胞的細胞株。
本發明包括原代和次代體細胞，例如成纖維細胞、角質化細胞、上皮細胞、內皮細胞、膠質細胞、神經細胞、血液的有形成分、肌肉細胞和其他能夠被培養的體細胞以及體細胞前體，它們被外源DNA轉染，其中外源DNA可穩定地整合入基因組中或者以附加體方式在細胞中表達。形成的細胞被分別稱為轉染的原代細胞和轉染的次代細胞。
當編碼LAG-3分子的基因被插入哺乳動物細胞，而該細胞被植入異體或異種宿主時，它們會被宿主免疫系統所識別但是不會引發免疫應答。
宿主免疫系統變得不能排斥這些細胞，而如果這些細胞沒有被改造以在表面表達LAG-3分子的話，它們原本是會被排斥的。LAG-3還可在不相關的細胞類型的細胞表面上表達，然后與待移植的細胞或組織混合，這也可獲得與上述相類似的結果。因此，本發明涉及在無全身免疫抑制下對細胞、組織或器官進行移植。
可移植這些細胞、組織或器官，以提供蛋白質或發揮某些功能來治療某些疾病。通過使用這一技術，即將LAG-3呈遞給宿主免疫系統，可以使移植物被宿主接受。
還可以通過共同施用已改造過從而表達LAG-3的成纖維細胞或其他原代或次代細胞，來防止對特定細胞、組織或器官的移植排斥。這種保護性狀態可歸咎于對介導免疫應答的機制進行了局部抑制或全身抑制。這種保護性狀態可歸咎于細胞介導的細胞毒性的無變應性、缺失、無應答性、耐受性或預防性。一旦建立了保護狀態，它可持續長時間，甚至因例如感染耐受性之類的現象而永久保持(Qin等人，1993)。
本發明可以用于移植細胞、組織、器官或宿主細胞，以便為了各種人體醫療需要而輸送基因或基因產物。
可通過標準的重組DNA技術或通過利用同源重組激活內源LAG-3基因的技術，來誘導LAG-3基因的表達。細胞類型可用任何方法從轉基因動物獲得，而該轉基因動物在其特定組織或無關細胞中表達LAG-3基因。然后可將該這些細胞與需要保護以防止移植排斥的細胞相混合。這提示，免疫保護性分子LAG-3的局部分泌并不在全身發揮作用。用LAG-3轉導但沒有轉化的成纖維細胞會在體內產生類似的應答。用LAG-3轉導的成纖維細胞接種物的免疫保護效應是依賴于劑量的，但是不依賴于LAG-3分子的來源。
共同施用表達LAG-3的細胞，可使供體T細胞失活，同時防止宿主免疫系統的攻擊。這種治療可誘導特異性的無變應性、耐受性，或否則誘導保護作用以免受受體中細胞介導的細胞毒性，這會導致免疫微環境的長期改變從而可以起保護作用以免受自身反應性T細胞。這可以通過如下方式實現共同施用來自健康供體的少量異體骨髓細胞和已改造過以表達LAG-3的人異體細胞。這導致通過微嵌合性(microchimerism)的發展而使自身反應性T細胞下降(Delaney等人，1996)。
患有具體疾病或缺陷的人，可以因異體移植許多不同的細胞、組織或器官而受益。例如，諸如肝、腎、心、胰臟、小腸之類的器官是經常移植的，而細胞也適用于移植，例如胰島，可用于治療帕金森氏病或病灶性癲癇的神經組織，作為化療或放療的治療手段的造血干細胞，治療高膽固醇血癥的正常肝細胞，治療心肌梗塞的心臟細胞，治療肌營養不良的肌肉細胞。
出于多種原因，異體骨髓移植一直難以實現。這些原因包括移植排斥、因機會感染而導致的感染(由移植物或免疫抑制藥物的污染而造成)、或其他原因。排斥可歸咎于受體對供體骨髓植入物的抗性以及競爭性免疫細胞有進攻受體的傾向(即移植物抗宿主疾病)(graft-versus-host disease,GVHD)。通過除去移植物中的T細胞，或者通過同時施用免疫抑制藥物，可以控制GVHD。當T細胞被消除時，移植物就復原(reduced)了。
作為消除T細胞的后果，移植失敗率就更高。據認為，T細胞可能對移植發揮重要作用，例如產生細胞因子(Kernan等人，1987)。
已表明，僅需少量異體的但健康的骨髓細胞，就可在實驗模型中減少甚至防止自身免疫疾病的發生。然而，照此進行的治療卻導致了移植物抗宿主疾病。
骨髓移植已被用作根治某些腫瘤的方法。這主要是因為異體T細胞能夠識別和殺滅腫瘤組織，例如在移植物抗白血病中。
在所有上述情況下，可以避免全身免疫抑制，如果用編碼LAG-3的基因來改造待移植的細胞或器官，從而移植入宿主中時能夠表達LAG-3蛋白并引發對移植物的保護作用。
在異體移植中的第一個問題是缺少可供移植的人組織，目前對于器官的需求遠遠超過了供應量。盡管仍被認為是一種實驗程序，但是異種移植被認為是異體移植的有力替代形式。諸如豬或狒狒之類的動物目前正考慮作為器官或細胞供體。建立免受移植排斥的保護作用，對于臨床上成功使用不同物種的器官是至關重要的。通過例如使用抗人CD4、CD8、NK細胞的抗體，或者將待移植的動物細胞進行微囊化處理，可以至少部分克服宿主的抗性。根據本發明，動物可以被轉基因式地改變，以便在某些細胞類型中表達LAG-3基因，例如胰島細胞，可使用胰島素基因啟動子和導向系統或其他組織特異性的標記系統。
據認為，在腫瘤組織中表達LAG-3，在其對抗宿主免疫系統對腫瘤組織的細胞介導式攻擊中起重要作用。
根據本發明的一個具體實施例，通過使用基因治療或活體外處理少量腫瘤組織并再植入，可以對腫瘤組織進行改造以表達反義LAG-3分子或對LAG-3信使特異的核酶。這樣可使免疫系統能夠與腫瘤組織反應并學會摧毀它。還可用抗LAG-3的抗體來處理少量腫瘤組織，以防止LAG-3所誘發的T細胞抑制作用，從而引發針對腫瘤組織的細胞或體液免疫。
目前，非常需要基因治療來治療各種不同疾病，其中包括(但并不限于)腺苷脫氨酶缺陷癥(ADA)、鐮形細胞貧血、地中海貧血、血友病、糖尿病、α-抗胰蛋白酶(α-antitripsin)缺陷癥、腦疾病如早老性癡呆病(Alzheimer’s disease)和其他疾病如生長疾病和心臟病(比如膽固醇代謝途徑改變所導致的疾病)，以及免疫系統缺陷。
可將不同細胞用于個體移植，例如成肌細胞可用于肌營養不良，分泌諸如TPO、GH、EPO、因子Ⅸ或其他因子之類物質的細胞和血細胞可用于治療遺傳性血液病，以及其他原代人或動物細胞，例如內皮細胞、上皮細胞、結締組織細胞、成纖維細胞、間充質細胞、間皮細胞和實質細胞(parenchymal cell)。
由于許多問題，基因治療的結果還不十分令人滿意。即使是最先進的試驗，在該試驗中用腺苷脫氨酶(ADA)基因來治療一位年輕女孩，但是因為害怕僅用基因治療還不足以有效，病人仍然每周接受PEG-ADA注射。
目前，基因治療方案的缺點之一是，為了防止宿主免疫系統排斥細胞，需要單獨地生產宿主細胞。基因治療必須以個體為基礎在個體上進行治療。此外，即使在基因治療中使用自身的細胞，仍經常發現轉基因的表達是短暫的，因為表達的其他病毒蛋白會引起宿主免疫系統的反應。
可使用缺陷型腺病毒載體，但是仍有問題，因為被表達的其他病毒蛋白仍會引發免疫應答。高濃度的病毒，即使是缺陷型病毒，也會刺激炎癥應答和免疫攻擊。宿主細胞免疫系統會記住病毒載體，這樣將來給藥的效力就更低了。
缺失了病毒蛋白E1的復制缺陷型腺病毒，被常規地用于基因治療方案中。不幸的是，它們在成年的且免疫能力的宿主中僅暫時有效，這可能是針對腺病毒或重組蛋白的免疫應答所造成的(Kozarsky和Wilson,1993；Barr等人，1992；Stratford等人，1992；Rosenfeld等人，1992；Lemarchand等人，1992)。因此，迫切需要開發免疫原性不那么強的新載體，或者可以免疫保護遺傳工程改造過的細胞的方法。
這些載體可制成效價高達1011噬斑形成單位/毫升，并且感染許多復制階段和非復制階段的細胞。可使用復制缺陷型腺病毒來將生理濃度的重組蛋白輸送給全身的循環系統。LAG-3基因宜在普遍存在的活化性細胞EFlα啟動子和4F2HC增強子的轉錄控制之下(Tripathy等人，1994)。
已經嘗試通過包裹細胞或免疫抑制宿主來避免該問題。
使用此處所述的方法，可將異種或異體細胞用作在表面上表達LAG-3分子的基因治療宿主細胞，從而引發保護作用以免宿主免疫系統發生移植排斥。它們包括例如，成肌細胞、成纖維細胞、造血干細胞、胚胎干細胞、胎兒肝細胞、臍靜脈內皮細胞和CHO細胞。基因治療宿主細胞還可被改造以表達單純皰疹腺苷激酶基因。通過添加9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(gancylovir)可特異性地摧毀這些細胞。
tk-“9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤”敏感型細胞具有優于非敏感型細胞的明顯優勢，即它們可以隨時被摧毀(Bi等人，1993)。
因此，根據本發明制得的能夠在其細胞表面上表達LAG-3和Hsv-tk基因的通用宿主細胞，可以產生一種通用的基因治療宿主細胞，該細胞可以在無免疫抑制的情況下植入，并且可以在不再需要其活性的任何時候加以摧毀。
通過使用任何基因轉移方法，本發明的異體或異種基因治療宿主細胞可被改造以表達轉基因和/或LAG-3基因。這些方法有例如(但并不限于)復制缺陷型病毒法、腺伴隨病毒法、高效逆轉錄病毒法、將DNA直接注射入骨髓，電穿孔法、磷酸鈣轉染法，微注射法、包裹入脂質體或紅細胞血影法。表達LAG-3的細胞，如成肌細胞或CHO細胞，可以與表達感興趣蛋白的待永久移植的細胞一起施用。如果瞬時暴露于LAG-3已足夠，那么被LAG-3轉染的成肌細胞或CHO細胞可含有自殺基因(如上面所述的tk基因)，從而可以通過用9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤處理而除去。
該方法可用于回復正常功能，即通過施用基因或基因產物，或通過去除或滅活對身體有害的基因(如癌基因)。這一目的可以這樣實現植入輸送核酶或反義cDNA的細胞，從而抑制不利蛋白質(如HIV蛋白或生長因子)的產生。該方法可用于糾正酶缺陷，如在Gaucher氏病或ADA缺陷癥中。
根據另一實施例，本發明涉及一種基因治療方法，它包括(ⅰ)在選定的人或動物細胞中插入治療所需基因和編碼LAG-3分子的基因；和(ⅱ)將步驟(ⅰ)中得到的細胞引入病人中。或者，上述基因可以被插入到病人的組織器官中，這可以在體內進行，或通過基因的直接轉染或通過針對該組織或器官的定向載體來進行。
例如，所述的表達系統可以將裸DNA或病毒載體直接注射入細胞群(如肌肉細胞)中，或者直接施用于導氣管(airway)中(例如治療囊性纖維變性)。構建物不僅含有感興趣基因(例如傳導調節子(conductance regulator,CFTR)cDNA)，還含有LAG-3基因，以便在該細胞類型上共表達，從而防止可能發生的針對例如腺病毒衣殼蛋白的體液免疫應答(針對腺病毒衣殼蛋白的免疫應答會限制重復給藥時的效力)。將基因轉入造血干細胞可用于輸送多種藥物抗性基因，以便與化療時抑制快速分裂免疫細胞的副作用相斗爭。逆轉錄病毒載體可與細胞因子組合使用以促進干細胞分裂，這些因子有例如青灰因子(steel factor)、kit配體、IL3、GM-CSF、IL-6、G-CSF、LIF、IL12等。
除了LAG-3基因之外，選定的細胞還可用編碼其他免疫抑制物質如IL10、TGFβ、Fas配體等的基因進行共轉染。
作為本發明的一個具體例子，上述方法可用于治療受體，即用少量感興趣的且改造過以表達LAG-3基因的細胞來治療受體，這會使宿主因宿主免疫系統的感染耐受性而能夠耐受下一次給予的細胞、組織或器官。
下面僅以闡述方式，結合下列實施例來描述本發明。
實施例1方法產生表達跨膜LAG-3的CHO細胞從pCDM8質粒(Invitrogen,San Diego,CA)中，將LAG-3cDNA以1620bp片段形式切下，并用瓊脂糖凝膠電泳進行純化。
將該片段亞克隆人用Xho消化的pCLH3AXSV2DHFRhαIVSA(Dα)哺乳動物表達載體(圖3)。通過磷酸鈣沉淀法，用DαLAG-3構建物轉染CHO-DUKX(DHFR-)細胞。轉染后的細胞在選擇培養基(MEM培養基，不含脫氧核糖核酸和核糖核酸，并加有10％透析過的胎牛血清和1％L-谷氨酰胺+0.02μM氨甲蝶呤)上生長。LAG-3的表達是通過Western印跡法對裂解的細胞膜制劑進行檢查，并定期用抗-LAG-3的單克隆抗體17B4，通過流式細胞分析進行檢查。
將CHO細胞移植入小鼠將未轉染的(野生型)，或者是用全長的人LAG-3或人LH cDNA轉染過的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，從塑料瓶上脫離下來，并以1.75×107細胞/毫升的濃度懸浮于Dulbeceo改進的極限必需培養基(DMEM)。將26頭鼠齡為7-9周的C57BL/6雌性小鼠如表Ⅰ分成7組，然后將200毫升所示的細胞懸浮液(含3.5×106細胞)皮下注射于每頭動物的右側。在第3、6和7組中，同一小鼠在右側接受LAG-3轉染過的細胞，在另一側接受對照細胞(LH-轉染過的細胞或未轉染細胞)。在注射后4天，用二氧化碳吸入法殺死小鼠，然后剖開皮膚檢查注射部位。
表1-實驗組

評估對CHO細胞的細胞毒性對每組5頭C57BL/6雌性小鼠皮下注射4×105個用人LH或人LAG-3cDNA轉染過的CHO細胞。在14天后，殺死小鼠，取出脾臟，制得脾細胞懸浮液。用培養液(RPMI1640+10％胎牛血清+抗生素)將107細胞/毫升的脾細胞懸浮液(效應子)進行稀釋，然后在不同稀釋度下接種一式3份，以獲得不同的效應子(effector)靶細胞之比。對于每種懸浮液，制備2塊板。將5×103細胞/100微升用51Cr標記過的靶細胞(被LH或LAG-3轉染過的細胞)加至板中(每種靶細胞一塊平板)。在37℃20小時后，從每個孔中取出20微升上清液，通過液閃法評估51Cr的釋放情況。根據下式計算細胞毒性，以裂解的百分比表示

其中，“自發”和“最大”分別表示培養液孔(靶細胞自發釋放Cr)和用TritonⅩ1％替換效應子懸浮液的孔(最大的Cr釋放量)。
結果將CHO細胞移植入小鼠大多數接受LAG-3轉染型細胞的小鼠，在注射部位有白色小結(nodule)，而用野生型CHO處理或接受LH轉染型CHO細胞的動物卻沒有出現小結。在大多數小鼠中，注射野生型CHO細胞導致在注射部位出現彌漫性出血。這一現象在接受LH轉染型CHO細胞的動物中較不明顯。在不同部位同時注射野生型和LAG-3轉染型CHO細胞的動物中，該小結僅在注射LAG-3轉染型CHO細胞的部位出現，而在注射野生型的部位出現出血(表2)。
早先在類似實驗中進行的組織學分析表明，在該小結中存在異源細胞。該實驗結果示于附圖(對于小鼠的識別編號可見表1)并總結于表3。
表2

每種細胞類型單獨注射于一側(a)=LAG-3一側(b)=LH一側(c)=野生型一側表3

對CHO細胞的細胞毒性在CHO細胞表面上表達LAG-3，并不影響小鼠對異種細胞進行免疫致敏的能力。事實上，來自注射LAG-3-CHO細胞的小鼠脾細胞會使兩種靶細胞裂解，而且與用LH-CHO細胞致敏(primed)的小鼠同樣有效并優于未致敏的小鼠。然而，在細胞表面上表達LAG-3，伴隨著對細胞毒性(由小鼠對靶細胞的免疫所誘導)敏感性的下降，這可從圖1和圖2中裂解百分比的比較看出。由非致敏小鼠脾細胞所產生的“天然”細胞毒性，并不因表面表達LAG-3而下降。這表明，LAG-3的表面表達降低了細胞毒T淋巴細胞(CTL)活性的輸出部分(efferent branch)。CTL是效應子中的一種，它在移植器官的排斥現象中起主要作用(G.Berke,1993)，因此抑制它們的功能可延長異體移植物的存活期。
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權利要求
1．一種遺傳工程改造過的細胞，其特征在于，它含有編碼位于該細胞表面的跨膜LAG-3蛋白的DNA，從而起到防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
2．如權利要求1所述的細胞，其特征在于，該編碼LAG-3蛋白的DNA是外源的。
3．如權利要求1所述的細胞，其特征在于，該編碼LAG-3蛋白的DNA是內源的，并且通過同源重組從而定向插入調控序列和/或可擴增基因，來激活或修飾它的表達。
4．如權利要求1-3中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，該細胞是待移植的組織或器官的一部分。
5．如權利要求1-3中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，該細胞是基因治療宿主細胞。
6．如權利要求5所述的細胞，其特征在于，該基因治療是體細胞基因治療，或是“在活體外”基因治療。
7．如權利要求1-6中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，還含有額外的免疫抑制物，如IL-10、TGFβ或Fas配體。
8．如權利要求1-7中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，還含有腺苷激酶(tk)基因，該基因對tk-9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤自殺系統敏感。
9．如權利要求1-8中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，該細胞衍生自轉基因動物。
10．如權利要求1-9中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，它選自成肌細胞、成纖維細胞、造血干細胞、胚胎干細胞、胎兒肝細胞、臍靜脈內皮細胞和CHO細胞。
11．如權利要求5-10中任一權利要求所述的細胞，其特征在于，還含有編碼感興趣治療劑的外源DNA。
12．如權利要求5或10所述的細胞，其特征在于，還含有外源DNA，該DNA編碼調控序列和/或可擴增基因，來激活或修飾感興趣的內源基因的表達。
13．在細胞表面上表達的跨膜LAG-3蛋白的用途，其特征在于，它被用于制造藥物，該藥物可引起防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
14．如權利要求1-12中任一權利要求所述的細胞的用途，其特征在于，被用于制造藥物，該藥物可引起防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
15．如權利要求1-10中任一權利要求所述的細胞的用途，其特征在于，被用于制造藥物，該藥物與待移植的細胞、組織或器官相混合，從而引起防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
16．一種引起特異性保護作用，以防止宿主免疫系統對移植的細胞、組織或器官發生移植排斥的方法，其特征在于，包括向宿主病人施用權利要求1-12中任一權利要求所述的細胞。
17．如權利要求16所述的方法，其特征在于，該細胞是待移植組織或器官的一部分。
18．如權利要求16所述的方法，其特征在于，該細胞是基因治療宿主細胞。
19．如權利要求18所述的方法，其特征在于，包括(ⅰ)在選定的宿主細胞中插入治療所需基因和編碼LAG-3分子的基因；和(ⅱ)將步驟(ⅰ)中得到的細胞引入需要治療的宿主病人中。
20．如權利要求16-19中任一權利要求所述的方法，其特征在于，包括用少量改造過以表達LAG-3基因的細胞來治療需治療的宿主病人，以引起防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用，從而能再次施用待移植的細胞、組織或器官。
21．一種排斥腫瘤組織的方法，其特征在于，對該腫瘤組織細胞進行改造，使其表達反義LAG-3分子或對LAG-3信使特異的核酶。
22．一種遺傳工程改造的細胞，其特征在于，它含有DNA，該DNA編碼位于細胞表面的跨膜LAG-3蛋白以用作藥物。
全文摘要
描述了一種在無全身免疫抑制的情況下,防止對移植的細胞、組織或器官發生移植排斥的方法。該方法利用了新發現的蛋白質LAG－3。當異體或異種細胞被基因改造從而在表面上表達LAG－3并且被移植時,可防止對植入的細胞、組織或器官發生免疫摧毀,同時宿主免疫系統仍保留其功能。該方法的一種具體應用是制備在表面上表達LAG－3的通用基因治療宿主細胞,從而起防止宿主免疫系統發生移植排斥的保護作用。
文檔編號C12N15/11GK1234834SQ96180510
公開日1999年11月10日 申請日期1996年11月29日 優先權日1996年11月29日
發明者M·比弗尼, R·帕波恩 申請人:應用研究系統Ars股份公司