重組核酸序列和檢測樣品的基因毒性與誘變性以及基因毒性的動力學的方法

專利名稱：重組核酸序列和檢測樣品的基因毒性與誘變性以及基因毒性的動力學的方法
目前有多種不同的使用微生物篩選基因毒性和/或毒性化合物的方法。Ames測試(Maron and Ames,1983)似乎是一種最廣泛使用的測定毒性化合物的方法并因而在世界范圍內被推薦使用。但完成該測試要花費大約三天的時間，同時該方法還伴有一些明顯的缺點。
已引入了某些可短時間內完成的方法，這些方法包括，根據lacZ基因表達的β半乳糖苷酶的量來檢測因DNA損傷引起的SOS反應，其中所說的lacZ基因位于SOS調節的umuD、C或sfiA應激誘導型啟動子的下游。這些測試分別稱為使用鼠傷寒沙門氏菌作為宿主微生物的umu測試(Oda等，1985)和使用大腸桿菌作為宿主微生物的SOS顯色測試(Quillardat等，1982)。在umu測試和SOS顯色測試中，在待檢樣品存在下培養宿主微生物，繼之破壞該宿主微生物。然后加入β半乳糖苷酶的底物，約10分鐘后加入抑制劑終止隨后的反應，然后在兩個波長處進行OD測量并計算β半乳糖苷酶活性。這些測試克服了Ames測試耗時長的問題，但它們也有自身的缺點，即靈敏度低而且檢測時間仍需7-8小時，特別是硝基芳烴和多環芳烴的檢測靈敏度低。另外，該檢測方法還需要大量的操作和加入各種不同的試劑，從而使該方法很復雜并且花費高。由于為了檢測任何誘導作用而必須破碎細胞，所以只可能對細胞進行一種檢測。
EP-A-0649905述及，將SOS基因放在表達熒光素酶活性的基因上游，以使熒光素酶的表達與SOS基因的表達同時發生，從而可以克服上述測試的缺點。然后通過檢測發光可在短時間里檢測或測定誘變物質。據稱任何SOS基因都是有用的，并且在實施例中以umuD、C基因(當用于umu測試中時)為例作了說明。另外，與SOS顯色測試和umu測試等常規測試相比，由于該測試中檢測所需的樣品體積較小，所以認為其提高了檢測的靈敏度。除了其必須是SOS可誘導型外，再沒有與待用啟動子相連的序列。又因為發光是即刻的，所以可以比使用Lac系統更早地進行檢測，從而縮短了檢測時間。
WO94/13831(DuPont)中還公開了與發光基因復合物結合使用應激誘導型啟動子，以提供基因工程微生物。他們指出，“雖然已證明應激反應在檢測各種環境危害中是有用的，但它須與易于檢測的靈敏報道基因相連接”。DuPont公司提供了一個廣泛的現有技術中已知的應激誘導型啟動子清單，這些啟動子可能是有用的，但本發明不只限于這些。所列清單包括下列調節系統的啟動子熱休克、SOS、過氧化氫、超氧化物、脂肪酸饑餓、通用應激、靜止狀態、應急、分解代謝產物活化、P利用和N利用。在實施例中，他們使用了熱休克調節的蛋白質啟動子dnaK和grpE、SOS調節的啟動子recA和uvrA、氧化損傷調節的啟動子katG和micF、通用應激啟動子uspA、靜止期啟動子xthA、來自氨基酸饑餓系統的his啟動子、涉及碳饑餓系統的lac啟動子、來自磷酸鹽限制系統的phoA啟動子和來自氮限制系統的glnA啟動子。估計他們從很寬范圍的不同調節方式的啟動子中舉出如此多的例子，是要說明他們的系統具有寬范圍的適用性。其中未指出或可推斷中優選使用某個特定組的啟動子或任何個別啟動子。只在其中的一個實施例(專利申請的實施例12)中明顯地列舉了一個特定的SOS調節的啟動子，其中給出了SOS調節的啟動子recA得到的結果。使微生物與加有誘變劑溴乙錠(濃度為0.25mg/ml)的樣品接觸，于加入誘變劑后180分鐘測得誘導率為1.9。加入0.5μg/ml絲裂霉素C,100分鐘后測定誘導率。依據所用測試菌株的不同，誘導率在4.7至20之間變動。根據DuPont的專利申請的實施例12可明顯看到上述結果。
我們已不可預見地發現了一個應激誘導型啟動子的亞組，即一個SOS調節的啟動子的亞組，其與發光報道基因結合用于微生物系統估測致突變性得到了改善的結果。該亞組并不包括SOS調節的RecA啟動子。該亞組具有許多優于DuPont RecA-熒光素酶系統及本領域已知的其它微生物毒性測試系統的特點。在以特定方式使啟動子突變而進一步測試和開發這些新的系統中，我們能夠更大程度地改善其性能。此外還完成了新的測試方法。這些新測試方法使我們能夠獲得迄今任何已有的微生物毒性測試中未曾述及的、更多更好的數據。
本發明涉及包含誘導率高于40的、SOS調節的啟動子的重組核酸序列，所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號。在根據本發明，重組核酸序列中優選含有更高誘導率的、特別是高于50的誘導率的啟動子。可按照諸如M.Schnurr等人在Biochimie(1991)73,423-431中公開的方法檢測誘導率。另外，也可選用Peterson K.R.和Mount D.W.(1987)，分子生物學雜志，193,27-40中所述的方法。這些公開內容均列為本文參考文獻。現有技術中公開的與熒光素酶聯合使用的recA啟動子并不落入這一大類中，因為recA的誘導率要低得多。其在30°的誘導溫度下為11X。誘導率是一個本領域公認的術語，并且可按本領域技術人員已知的方法確定。該文獻的實施例中給出了如何確定誘導率的方法，并確定了大量啟動子的許多數值及誘導率。recA的低誘導率可能是它為什么不特別適用于基于啟動子誘導作用的靈敏檢測系統的原因。在SOS調節的系統中，RecA啟動子是最早被誘導的啟動子。因代謝物缺乏而產生的信號被RecA蛋白質所識別。其也可能在誘變中具有第二種功能即能輔助DNA聚合酶繞過損傷。在DNA損傷后的前20分鐘內，uvrA、B、C、D基因被激活，開始切割修復。然后在大約40分鐘的時間內稱為RecF重組途徑的重組性修復途徑很活躍。最后才得以誘導涉及umuD、C的SOS誘變途徑。
上述專利申請中舉例的DuPont系統所使用的絲裂霉素C的最低水平是500ng/ml。其中沒有給出可檢測更低誘變劑水平的指征和提示。而在本系統中則可以檢測到7ng/ml的絲裂霉素。因此本系統要比DuPont系統中所指出的靈敏度要高大約80倍。我們發現，在我們的系統中從7.5ng/ml的濃度得到的誘導率高于2。
我們第一次舉例說明了聯機檢測。因為用SOS或Ames系統需要破壞細胞，所以用這些系統進行聯機檢測是不可能的。所描述的其他測試也只是用于單一點檢測。我們現已發現，有可能分辨樣品中存在的多種誘變劑，并確定這些物質的誘導動力學。總體上不可預見的是，若定時檢測發光，多種誘變劑的存在將提供不同的可檢測信號。人們可能預計的是反面情況，即出現累積效應。但其清楚地說明，SOS調節的啟動子構成了一組表現出這種調節特征的啟動子，即對于各種不同的誘導性化學物質來說，誘導方式多有不同，因而存在著有差異的可檢測信號。該新的方法應用上極為簡單，而且可實現信號檢測的自動化。該新方法只需培養包含SOS調節的啟動子的微生物，所說的啟動子被可效連接到編碼報道分子的核酸序列上，所說的報道分子能產生可以發光形式測定的信號，并使微生物與待測樣品接觸，然后-測定培養物中的發光，所說的測定是在不同時間點進行的，-確定在所說時間點上的信號-噪音比，-對數據作圖，所說的數據代表所說樣品的基因毒性的動力學，其中多個峰指示具有不同的誘導動力學的多種基因毒性化合物。發光檢測最好是連續進行的。優選聯機完成該方法。實施例和


這樣一個事實在含有多種誘變劑的樣品中可檢測出多個峰。
在一個優選實施方案中，發光檢測是連續進行的。從實現檢測多種基因毒性劑存在的自動化和精確度的角度看，這一點是特別令人感興趣的。信號噪音比越高測試系統就越靈敏。感興趣的其他因素是誘導速度、表達程度和信號噪音比的波動程度。這些因素的變動不僅取決于所選擇的啟動子，而且取決于宿主菌株及基因毒性劑的性質。實際使用中，2種濃度毒性化合物的信號噪音比將等于或高于2。基于上述的一個或多個特征，本領域技術人員可選擇最適于它們的狀態的系統。下述實施例舉例說明了新的生物傳感器系統的廣泛適用性。本發明新的生物傳感器所顯示的結果構成大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中本發明新的DNA序列的各種實施方案。測試的所有新的生物系統都比基于鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌菌株的標準Ames和SOS顯色測試好。本發明的系統更快速、更準確而且更靈敏。我們針對那些在SOS顯色測試和Ames測試中已知給出假陰性結果的毒性劑作清楚的舉例說明，即已知測試確實給出假陰性結果的，本發明的系統提供陽性結果。特別是對新生霉素、疊氮化鈉、絲裂霉素C、萘啶酮酸(naladixic acid)、過氧化氫、芘和菲(phenantrene)作了舉例說明。本發明的測試系統特別適于檢測PAH(多芳烴)的存在。
此外本發明的系統不需要為了提供檢測而破壞細胞，因而可在繼后用于進一步的測試，并且更重要的是可在一定時間內提供可檢測的信號。因此可追蹤并確定樣品的誘導動力學。
本發明的一個重要實施方案是賴于這樣的事實，即現在首次可以獲得一種檢測樣品中多種基因毒性化合物存在的方法，所說的方法包括以下步驟-培養包含帶有SOS調節啟動子的核酸序列的宿主微生物，其中所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號，-測定培養物的發光，所說的測定是在各個時間點上進行的，優選是連續檢測，并且在所說的時間點上檢測信號噪音比，然后對這些數據作圖，所說的數據代表所說樣品的基因毒性動力學，其中多個峰表明存在多種具有不同的誘導動力學的基因毒性化合物。
由于選擇了新的DNA序列并將其應用于可提供新的生物傳感系統的宿主細胞中，我們還創造了很靈敏和快速的生物系統，可以在5分鐘至2小時的時間內確定樣品的基因毒性。
因此本發明的另一個實施方案包括確定樣品中基因毒性化合物存在的方法，所說的方法包括以下步驟-培養宿主微生物，所說的宿主微生物包括一包含誘導率大于20的SOS調節的啟動子的核酸序列，所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號；-在多個時間點上測定培養物的發光，-確定培養物的發光是否發生了改變，增加發光是存在基因毒性化合物的指征。優選啟動子的誘導率為40或更高，最適為50或更高。在前述檢測樣品中基因毒性化合物存在的方法中，優選的實施方案包括在多個時間點測定發光。連續檢測則更好。另外，最好還有下列步驟-在所說的時間點檢測發光的信號噪音比，-將發光信號對噪音數據作圖，所說的圖代表樣品的基因毒性動力學，可用于測定所說樣品的基因毒性動力學。最好用本發明的生物傳感器完成上述方法。這樣的生物傳感器包括宿主菌株，所說的菌株含有如本說明書中其它地方所限定的本發明的新核酸序列。宿主菌株較好是微生物，例如大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌菌株。具體地說，已應用標準的鼠傷寒沙門氏菌Ames測試菌株作為宿主菌株，并且為本發明的生物傳感器提供了很適當的實施方案。本發明的菌株具有吸引力在于其適用于基因毒性和毒性測試中。Ames測試菌株的例子是TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535和TA1538，或新的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA7001至TA7006和TA7046(Gee等，1994)。另外Ames菌株還是世界醫藥工藝中普遍接受的菌株。對于包含作為宿主菌株的Ames菌株的本發明生物傳感器來說，該菌株不僅能按照本發明用于基因毒性測試中，而且還可相繼用于Ames測試中。其他可成為多功能菌株的適用宿主菌株是本領域技術人員顯而易見的。
實施例中對適于應用于本發明的生物傳感器的本發明核酸序列的各種實施方案作了舉例說明。包含誘導率高于40的SOS調節的啟動子的核酸序列是本發明一部分，所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號。本發明的生物傳感器包含本文所公開的各個實施方案中任一個的核酸序列。另外，這樣的DNA序列可適用于完成本文所公開的本發明的所有方法。
重組性修復啟動子中的適用啟動子包括RecF、RecJ、RecN、RecO、RecQ、ruv和uvrD啟動子。實施例中舉例說明了RecN啟動子。另一個適用的啟動子是SfiA啟動子，它也在實施例中作了舉例說明。此外，可在重組修復期間誘導、誘導率高于40的上述SOS調節的啟動子組的突變啟動子也是本發明的適當實施方案。這樣的突變體可能具有更強的啟動子強度或調節作用，但極為重要的是SOS調節作用未被破壞。特別適用的突變的一個例子包括在至少一個LexA結合位點中發生的突變，而至少另有一個LexA結合位點保留活性。這種類型的優選突變將在所說的至少另一個LexA結合位點具有不改變野生型啟動子序列的突變。這種類型的突變體的例子是具有序列ID No.7的RecN突變體(RecN1-3)。帶有LexA突變這種類型的突變體特別適用于檢測有多個基因毒性劑存在的方法中，并適用于按本說明書別處公開的本發明方法來檢測這類樣品的誘導動力學。這樣的突變體也是極其靈敏和快速的。它們特別適用于檢測基因毒性中間體降解或代謝產物的出現和/或聚積。這可以是在污染物和其降解物的田間例如生物改造土壤中，也可用于藥物測試中。
已發現可提供有用特征的另一種類型的突變體是含有啟動子增效突變的突變體。啟動子增效突變是一個公認的技術術語，突變的結果是啟動子序列更加相似于RNA聚合酶結合位點的一致序列。這種類型的突變可在啟動子-35區域含有突變。實施例中以具有序列ID No.8的RecN2-4突變體形式提供了RecN啟動子的這類突變實例。我們還提供了具有LexA和啟動子增效突變的組合突變體的實例，其為具有序列ID No.9的RecN3-4突變體。原則上其他改進也是可能的，例如-10啟動子區域的突變以及-35和-10區域之間更好的間距。后兩種選擇對于recN來說并不相關，因為這種啟動子已表現出與σ35啟動子序列具有良好一致性。鑒于該-35不是最佳的，所以我們舉例說明能提供與σ35一致啟動子序列有更密切相符性的突變可導致功能的改善。
除了啟動子序列外，本發明的核酸序列還包括編碼報道分子的核酸序列，該核酸序列編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號。這樣的序列是本領域中已知的。由含有熒光素酶A和B基因的編碼報道分子的核酸序列構成了適當的實施方案。在一優選的實施方案中，所說的序列還包括熒光素酶C、D和E基因，這些基因是產生可用于再循環的有限脂肪酸底物所必需的。有關這些序列的詳細描述可見于1992年2月28日提交的PCT/EP專利申請9200445中。
本發明的優選方法包括在如本文所述的本發明的任何一種方法中應用適于作為Ames測試菌株的微生物，所說的微生物進一步包含本發明的新的核酸序列，然后進行傳統的Ames測試，從而提供一種使用同一菌株進行基因毒性誘變性和毒性測試的方法。
本發明的新的核酸序列另一個應用在于使用包含所說序列的微生物以檢測毒性。優選的宿主細胞是能夠產生高噪音信號的細胞。例如具有如上文所述啟動子增效突變的本發明的核酸序列似乎很適合于這一應用。這種應用可以得出毒性產物的IC50計算值。換句話說，這種應用可構成一種檢測樣品中毒性化合物存在的方法，該方法包括以下步驟-培養宿主微生物，所說的宿主微生物是本文任一個實施例中公開的本發明的宿主微生物，-測定培養物的發光，以及-確定培養物的發光是否已發生了改變，發光降低即指示存在包含于本發明范圍內的毒性化合物。
總之，本發明可能具有下列優點-有可能鑒別出樣品中存在的呈現不同誘導動力學的至少兩種基因毒性化合物。-有可能在代謝期間利用諸如S9或在降解期間如生物除污中及時鑒定出中間體基因毒性產物的形成。-可利用同一細胞聯機檢測基因毒性及一般毒性動力學。-可在5分鐘至4小時內，優選在3小時內，更優選在2小時內迅速完成測試，并給出明確的結果。-在信號檢測前不需對細胞培養物進行預先處理。-在聯機檢測基因毒性化合物或液態溶液的一般毒性時不需要破壞細胞。-可用根據本發明的菌株進一步檢查在4小時內，優選在3小時內，更優選在2小時內發現有基因毒性的選用物質，以用同樣的細胞按照Ames方法檢查移碼突變或堿基對取代。-由于基礎發光降低是一般毒性的指征，所以檢測毒性時不需內部對照。-由于實驗的測試時間有限，所以不需要嚴格的無菌條件。-由于實驗的測試時間有限，所以不需要對測試樣品進行化學穩定性測試。

圖1啟動子探針載體pMOL877(圖1a)和在該載體中克隆了sfiA啟動子的衍生物pMOL890(圖1b)的限制性圖譜。
圖2啟動子探針載體pMOL877和在該載體中克隆了recN啟動子(pMOL1066,recN1-2)、帶有失活的LexA2位點的recN啟動子(pMOL1067,recN1-3)、帶有啟動子增效突變的recN啟動子(pMOL1068,rec2-4)、以及同時帶有失活的Lex A2位點和啟動子增效突變的啟動子(pMOL1069,recN3-4)的衍生物pMOL1066(圖2a)、pMOL1067(圖2b)、pMOL1068(圖2c)和pMOL1069(圖2d)的限制性圖譜。
圖3以經64ppm MMS處理的含pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌ED8739的信號/噪音比給出的光誘導動力學。發光是在2小時的期間內測定的。
圖4以經64ppm MMS處理的含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌ED8739的信號/噪音比給出的光誘導動力學。發光是在5小時的期間內測定的。
圖5對含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌，以最大信號/噪音比對濃度的形式給出了MMS(濃度為0.5-128ppm)的劑量-效應曲線。
圖6對含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的大腸桿菌ED87391106，以最大信號/噪音比對照射時間的形式給出了紫外光(照射時間為2-10秒)的劑量-效應曲線。
圖7以經64ppm MMS處理的含有pMOL1067或pMOL1068的鼠傷寒沙門氏菌TA98和TA104的信號/噪音比形式給出的光誘導動力學。發光是在5小時的期間內測定的。
圖8以經25.6ppb 4-NQO處理的含pMOL1067或pMOL1068的鼠傷寒沙門氏菌TA98和TA104的信號/噪音比形式給出的光誘導動力學。發光是在5小時的時間內測定的。
圖9用TA98(pMOL1067)測試MMS和新生霉素的組合。在圖示符號中，第一個數值代表MMS的量(ppm數)，其后是新生霉素值(ppm數)。
圖10用TA104(pMOL890)測試MMS和新生霉素的組合。圖示符號中，第一個數值代表MMS的量(ppm數)，其后是新生霉素值(ppm數)。
圖11以使用菌株TA98(pMOL1067)得到的總信號/噪音比的函數形式排列的MMS和新生霉素組合的基因毒性。
圖12以使用菌株TA104(pMOL890)得到的總信號/噪音比的函數形式排列的MMS和新生霉素組合的基因毒性。
圖13當TA98(pMOL1067)與不同濃度的毒性產物R116一起保溫時，該菌株的信號/噪音比隨時間的降低情況。
圖14當TA98(pMOL1068)與不同濃度的毒性產物R116一起保溫時，該菌株的信號/噪音比隨時間的降低情況。
圖15在PAH污染的土壤的生物除污過程中取得的樣品的基因毒性值。該實驗的數據是使用TA104(pMOL890)得到的。經S9提取物代謝激活后檢測基因毒性。使用TA104(pMOL1067)或TA104(pMOL1068)得到相似的數據。
圖16在用菌株LB208降解熒蒽期間基因毒性降解中間體的出現。該實驗的數據是使用TA104(pMOL890)得到的，但使用TA104(pMOL1067)或TA104(pMOL1068)也獲得了相似的結果。基因毒性增加表明有基因毒性中間體降解產物形成。以最大信號/噪音比表示基因毒性。于pH2.5下提取基因毒性中間體。在不用或用(#)S9代謝激活的情況下確定基因毒性。實驗數據啟動子-lux融合體的構建大腸桿菌的sfiA啟動子sfiA-lux融合體的構建細菌SOS反應處于許多調節蛋白質的控制之下，其中最重要的是RecA蛋白質(蛋白酶)和LexA阻抑蛋白。基因毒性產物的存在導致DNA損傷。其將激活DNA修復系統，并且部分激活作用是從無活性的RecA蛋白質改變成有活性的蛋白酶。這種RecA蛋白酶對LexA阻抑蛋白具有高度親和性，由于RecA的蛋白酶解作用使之逐漸被失活。LexA失活后與其在LexA調節的啟動子上的結合位點解離，從而導致啟動子的活化和其相應基因的轉錄。處于LexA控制下的啟動子之一是sfiA啟動子。sfiA啟動子具有一個LexA結合位點，該位點與-10區域和該啟動子的轉錄起始點有所重疊，并且其轉錄激活需要LexA的解離。還知道sfiA啟動子是處于細菌SOS反應控制下的最強的啟動子，其誘導率為100。以PCR片段形式克隆sfiA啟動子。基于已公開的sfiA序列，按RCR片段將側翼接有HindⅢ和EcoRⅠ限制性位點的方式設計引物(Beck和Bremer,1980)。引物94C79(Seq.ID No.1)識別從位置59到87的sfiA序列TTTAAGCTTCCCGTCACCAACGACAAAATTTGCGAGGC下劃線部分是HindⅢ限制性位點，而sfiA序列則以斜體字母示出。引物94C96(Seq.ID No.2)識別從位置400到376的互補sfiA:AAGAATTCCCGACTCAGTTTTTGTTGCGG下劃線的是EcoRⅠ限制性位點，而互補sfiA序列則以斜體字母表示。
在大腸桿菌HB101染色體DNA上進行PCR擴增，產生352bp的平頭PCR片段。將此片段克隆到pMOL877的單一EcoRⅠ位點中。質粒pMOL877衍生于IncQ質粒RSF1010，并除了四環素抗性標記外還含有無啟動子的LuxCDABE操縱子。單一的EcoRⅠ位點位于該操縱子的上游。用EcoRⅠ消化后，使用Klenow DNA聚合酶將EcoRⅠ位點的粘性末端填成平頭。連接后用反應混合物轉化大腸桿菌ED8739的電感受態細胞(Murray等，1977)。根據細胞在含四環素的培養基上的生長能力選擇轉化體，用牙簽將轉化體轉接到兩份含有四環素的豐富培養基中，然后用紫外光照射一個平板。使用放射自顯影法可看到顯示紫外光誘導型發光的陽性克隆。分析(限制性酶切分析和PCR)4個陽性克隆的質粒包含物，所有克隆均顯示含有同樣的重組質粒。將含有處于sfiA啟動子轉錄控制下之LuxCDABE基因的基于pMOL877的衍生質粒定名為pMOL890。圖1a和1b中分別給出了pMOL877和pMOL890的限制性酶切圖譜。
作為sfiA啟動子的適當的可代用物，可以將處于LexA控制下的并可在SOS反應期間被激活的其他啟動子序列克隆到Lux報道基因系統的上游。如此可得到作為發光的函數顯示基因毒性的新的構建體。特別有用的是具有高于40的誘導率的SOS-啟動子。令人感興趣的是不參與SOS誘變，但部分地參與RecF重組修復途徑的SOS-啟動子。這一組啟動子包括recF、recJ、recN、recO、recQ、ruv和uvrD(以前稱為recL)。鑒于SOS誘變啟動子RecA和umu分別只有11和28的低誘導率，所以認為它們不是太有用的。在研究了文獻之后，選擇下列候選啟動子序列作進一步的研究-大腸桿菌的recN啟動子；-大腸桿菌的ruv啟動子；-大腸桿菌質粒pHM101的muc啟動子。
從這些候選啟動子中選擇recN進行進一步的實驗工作，因為RecN是誘導SOS反應后細胞的主要構成成份，并且已知道LexA對它具有嚴格調節作用(Finch等，1985；Picksly等，1985)。大腸桿菌的recN啟動子recN-lux融合體的構建recN啟動子具有三個LexA結合位點，一個與-35區域重疊，另一個與-10區域和該啟動子的轉錄起始點重疊。推測第三個LexA結合位點位于編碼區內。在這方面它不同于只有一個LexA結合位點的sfiA啟動子。recN啟動子具有下列序列(Seq ID No.3；Rostas等，1987)，其中指出了-35和-10區域(斜體字)的位置及兩個LexA結合位點(下劃線部分)的位置GCCTCTTTACTTGTATATAAAACCAGTTTATACTGTACACAATAACAGTAA-35 LexA1-10 LexA2該啟動子與一致的啟動子序列(Seq.ID No.4)“TTGACA-16/17bp-TATAAT”具有相似性，但-35區的重要的G被T取代。因此，在誘導條件下recN的表達可能比-35區域的序列為TTGATC的sfiA啟動子稍弱。
根據這一信息進行下列克隆實驗-用PCR擴增法克隆野生型recN啟動子。合成兩個均引入EcoRⅠ限制性位點的引物，即啟動子區上游的引物1序列ID No.5和下游的引物2序列ID No.6。引物1位于recN序列的位置28-49。引物2位于recN序列的位置550-526(互補的)。引物中的GAATTC指示EcoRⅠ位點。Rostas等人(1987)公開了recN序列。這些限制性位點是在pMOL877 lux報道基因載體中克隆啟動子片段所需要的。-從啟動子序列中除去LoxA2結合位點。為此目的，選擇具有序列IDNo.7(AAAGAATTCTTATTGTGTACAGTATAAACTGG)的引物3，該引物在LexA2結合位點的最后三個堿基對處作了修飾。這三個堿基對構成一個一致序列，并且在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的所有Lex結合位點上都是保守的。引物3的5′末端以斜體字顯示的堿基對并不符合野生型DNA序列，選擇這種序列以引入一個EcoRⅠ限制性位點。為了PCR擴增recN啟動子，必須將此引物與引物1結合使用。引物3互補于recN序列的位置360-338(Rostas等，1987)。
使用具有序列ID No.8(相當于Rostas等1987所述的recN上的位置294-331)AAAAGAATTCTAATTTTACGCCAGCCTCTTGACTGTAT的引物4導入“啟動子增效”突變。該引物在-35區的一致位置上引入一個G(黑體字)并且還在啟動子區的5′末端引入一個EcoRⅠ限制性位點。這樣，引物4的5′端以斜體字表示的堿基對就不與野生型DNA序列相符合。recN啟動子的PCR擴增中，必須聯合使用該引物與引物2。-從啟動子序列中除去LexA2結合位點，并導入“啟動子增效”突變。為此可使用引物3和4聯合進行recN啟動子的PCR擴增。
使用上述各對引物擴增recN基因的啟動子區。也導入了額外的突變。由此得到下列PCR片段*recN1-2，野生型recN啟動子(=序列ID No.3)*recN1-3，缺少LexA2位點的recN啟動子(=序列ID No.9)*recN2-4，帶有啟動子增效突變的recN啟動子(=序列ID No.10)*recN3-4，帶有缺少LexA2位點之啟動子增效突變的recN啟動子(=序列ID No.11)。
用EcoRⅠ消化這些PCR片段并克隆到用EcoRⅠ切成線性的luxCDABE表達載體pMOL877中。用連接混合物轉化大腸桿菌ED8739(Met-,RecA+)。RecA+表型是獲得啟動子-lux融合體的SOS誘導表達所必需的。使用如前所述用于檢測sfiA-lux融合體的紫外光照射誘導光發射，以鑒定含有所需的啟動子-lux融合體的轉化體。對于每種啟動子構建體，均分別鑒定出顯示有紫外光誘導之光發射的陽性克隆。如此得到下列質粒和大腸桿菌菌株*菌株CM2081中的pMOL1066，其含有recN1-2 lux融合體(野生型recN啟動子)。*菌株CM2082中的pMOL1067，其含有recN1-3 lux融合體(缺少LexA2位點的recN啟動子)。*菌株CM2083中的pMOL1068，其含有recN2-4 lux融合體(帶有啟動子增效突變的recN啟動子)。*菌株CM2084中的pMOL1069，其含有recN3-4 lux融合體(帶有缺少LexA2位點之啟動子增效突變的recN啟動子)。
圖2a-d中給出了recN-lux融合體質粒pMOL1066至pMOL1069的限制性酶切圖譜。使用啟動子-lux構建體在大腸桿菌中進行發光測試為了使用細菌SOS系統檢查不同的啟動子構建體的可誘導性，按照下文提供的方法，使用64ppm MMS進行誘導實驗。取未經誘導的細胞作為對照。結果以信號/噪音比示于圖3和4中。
根據這些結果可得出以下結論*含有野生型sfiA啟動子的pMOL890(sfiA)在SOS誘導后得到很好的誘導和表達(圖3和圖4)。此外，誘導曲線與使用recN-lux融合體pMOL1066(recN1-2)和pMOL1067(recN1-3)觀察到的曲線十分相似(見圖4)。
*含有野生型recN啟動子的pMOL1066(recN1-2)，在SOS誘導后比其衍生物的表達要差一些(也是關于總發光量)(圖3和圖4)。誘導曲線與使用sfiA-lux融合體pMOL890和pMOL1067(recN1-3)觀察到的曲線十分相似(見圖4)。
*含有缺少LexA2位點之recN啟動子的recN1-3，在SOS誘導后得到很好的誘導和表達。此外，其誘導曲線與用sfiA-lux融合體觀察到的曲線很相似(圖3和圖4)。
*含有帶啟動子增效突變之recN啟動子的recN2-4，在SOS誘導后得以很好地誘導和表達。使用該構建體的總發光量以及起始誘導動力學甚至比使用pMOL890和pMOL1067更快(圖3)。然而，由信號/噪音比表示的誘導曲線比使用pMOL890和pMOL1067時表現有更大的波動(見圖4)。因此該構建體是檢測基因毒性化合物存在的很好的候選構建體，但它似乎不太適合用于檢測混合物中的單個基因毒性化合物的存在。
*含有缺少LexA2位點之啟動子增效突變的recN啟動子的recN3-4具有很強的發光，但信號噪音比例較差。因此，該構建體不適于用作基因毒性生物傳感器(圖3和圖4)。
在另一個實驗系列中，分別針對MMS(濃度為0.5-128ppm)和紫外光照射(照射時間為2-10秒)檢測含有pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069之大腸桿菌1106的劑量-效應曲線。這些實驗的結果示于圖5和6中。
在兩實驗中，用pMOL1068(recN2-4)得到了最好的結果，而pMOL1069(recN3-4)則給出最低的信號/噪音比。使用pMOL890中的sfiA-lux融合體得到了相似的結果。基于這些結果，決定在鼠傷寒沙門氏菌Ames測試菌株TA98、TA100、TA104、TA1535和TA1538中導入這四個recN啟動子-Lux融合構建體(pMOL1066-pMOL1069)，以及sfiA-lux融合體(pMOL890)，并測試它們的作為SOS反應(由于基因毒性產物的存在而誘發的)的函數的誘導作用。在鼠傷寒沙門氏菌中導入啟動子-lux融合構建體并進行測試在Ames測試用鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98、TA100、TA104、TA1535和TA1538中導入所有五種質粒，pMOL890和pMOL1066至pMOL1069。由此說明Ames測試菌株的總體轉化的普遍可行性。在鼠傷寒沙門氏菌中進行誘變性測試為了檢查導入pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069是否對用于誘變測試的鼠傷寒沙門氏菌的特征有所影響(根據在存在或不存在誘變產物的情況下從His-到His+的回復頻率所確定的)，用原始Ames測試菌株和它們的含有上述質粒的衍生菌株進行標準Ames測試。按照Maron和Ames(1983)所描述的步驟，對MMS、4-NQO、呋喃唑酮(furazolidone)、2-AF和苯并-α-芘進行測試。結果示于表1A至1G中。并未全部給出用原始Ames測試所得到的結果，但從表中給出的結果以及表1A與1B、1C與1D之間的比較可以得出這樣的結論導入質粒并沒有改變重組菌株的His回復特征。因此，可以使用重組菌株進行傳統的Ames測試。在鼠傷寒沙門氏菌中進行發光測試為了用鼠傷寒沙門氏菌的細菌SOS系統檢查不同的大腸桿菌啟動子構建體的可誘導性，按照下述公開的方法使用64ppm MMS或25.6ppb4-NQO進行誘導實驗。取未經誘導的細胞作為對照。圖7和8中給出了使用recN-lux融合體pMOL1067和pMOL1068得到的以信號/噪音比表示的結果。
從這些附圖(圖7和圖8)中可以看出，用pMOL1068(RecN2-4)測得的誘導動力學稍快于就pMOL1067(RecN1-3)所觀察到的誘導動力學，但用pMOL1067(RecN1-3)得到的最大信號/噪音比要高于pMOL1068(RecN2-4)。因此對于基因毒性測試，兩構建體都是有用的并且是互為補充的。發現用pMOL890(sfiA)觀察到的結果與用pMOL1067的結果相似。
測定13種產物的最小可檢測濃度(MDC,nmol/測定)，其中使用含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門氏菌Ames測試菌株。表2中給出了用含有pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門氏菌TA104，以及含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的鼠傷寒沙門氏菌TA98得到的結果。此外還給出了文獻中用SOS顯色測試和Ames測試測得的MDC值。對于某些產物，無法計算出Ames測試的MDC值，而只指示出陽性(pos)或陰性(neg)反應。表1A用鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98,TA100,TA104,TA1535和TA1538對MMS進行Ames測試
表1B用含有pMOL890的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98*,TA100*,TA104*,TA1535*和TA1538*對MMS進行Ames測試
表1C用鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98,TA100,TA104,TA1535和TA1538對4-NQO進行Ames測試
表1D用含有pMOL890的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98*,TA100*,TA104*,TA1535*和TA1538*對4-NQO進行Ames測試<
表1E用含有pMOL890的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98*,TA100*,TA104*,TA1535*和TA1538*對呋喃唑酮進行Ames測試
表1F用含有pMOL890的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98*,TA100*和TA104*對2-AF進行Ames測試
在有(+S9)或沒有(-S9)進行代謝活化的情況下進行測試表1G用含有pMOL890的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98*,TA100*和TA104*對苯并-α-芘進行Ames測試
在有(+S9)或沒有(-S9)進行代謝活化的情況下進行測試
表2用含有pMOL890,pMOL1066,pMOL1067,pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA104，和含有pMOL890,pMOL1066,pMOL1067,pMOL1068或pMOL1069的鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98確定13種產物的最小可檢測濃度(MDC，以nmol/測試表示)。還給出了SOS顯色測試和Ames測試的文獻值。表3
藥物
抗微生物劑
殺蟲劑、除草劑
無機化合物
多環芳烴(PAH)<
實驗室化學物質
不可測*由于存在組氨酸溶劑，燃料，…
電磁波
>
選擇兩種產物，即酪蛋白氨基酸和CdCl2作為陰性對照。因為酪蛋白氨基酸中含有組氨酸，所以不可能用Ames測試檢測它。
從表2中可以看出，用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株可得到最好的結果。用所有構建體得到的結果均好于用SOS顯色測試得到的結果，其中例外的是ICR191給出相似的結果。這些結果也大大好于用Ames測試得到的結果，其中例外的是2,4,5,7-四硝基-9-芴酮。因此可以認為，在鼠傷寒沙門氏菌Ames測試菌株中使用sfiA和recN-lux基因融合體(pMOL890、pMOL1066、pMOL1067、pMOL1068或pMOL1069)檢測基因毒性時提供了一條比SOS顯色測試和Ames測試更快速、更靈敏的途徑。
表3給出了用含有pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株進行的基因毒性測試的結果。因為用這些菌株得到的測試結果相似，所以只給出最后的測試結果(陽性或陰性)。SOS顯色測試(SOS)和Ames測試也得到相似的結果。所測試的試劑是下面幾類中的通常視為代表性的試劑藥物、抗微生物劑、殺蟲劑、除草劑、無機化合物、多芳烴、實驗室化學物質、溶劑、燃料及電磁射線。從該表中可以看出，可使用雜合的TA Ames測試菌株檢測所有各類被試產物的基因毒性，并且與使用SOS顯色測試和Ames測試得到的結果只有很小差異。
當將用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株得到的結果與用SOS顯色測試得到的結果相比較時，可以得出如下結論當產物在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測試中是陰性時，用SOS顯色測試也是陰性。然而，可能有基因毒性的新生霉素和疊氮化鈉在SOS顯色測試中是陰性，但在使用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的測試中則是陽性。因此可以認為用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的測試，對于基因毒性測試來說，因為沒有得到假陰性結果，所以比SOS顯色測試更為準確。當產物在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測試中是陰性時，其在Ames測試中也是陰性。所不同的是環磷酰胺和亞乙基硫脲在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測試中是陰性的。這一現象是可以理解的，因為這些產物并不誘發細菌SOS反應。
發現在Ames測試中呈假陰性的基因毒性產物，例如絲裂霉素C、萘啶酮酸、過氧化氫、芘和菲，在用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作測試中為陽性。因此可以認為，用含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的TA98和TA104菌株所作的測試不僅如Ames測試一樣好，而且在PAH等環境污染物的測試中要更加準確。組合的基因毒性產物的測試檢查測試樣品中存在一種以上基因毒性產物時不同構建體的反應。這是一個很重要的方面，因為環境樣品常常含有一種以上的基因毒性污染物。另外，有許多必須進行基因毒性測試的藥物產品可能是不同的活性基因毒性物質(如抗腫瘤或抗愛滋病藥物)的組合。使用含有pMOL1067或pMOL890的TA98和TA104進行實驗。選擇這兩種構建體是因為它們在鼠傷寒沙門氏菌中顯示有相似的誘導動力學和最好的信號/噪音比(見圖7和圖8)。作為測試產物，可采用MMS與新生霉素的幾種組合。選擇使用這些產物是因為我們發現它們有不同的誘導動力學(例如，用pMOL1067,MMS在2小時后給出最大值，而用新生霉素則在4小時后觀察到最大信號噪音比)。圖9和10中列出了這些實驗的結果實例。
從這些結果可以看出，用含有pMOL890(sfiA-lux)或pMOL1067(recN 1,3-lux)的菌株，可在基因毒性化合物的混合物中檢測出至少兩種單個基因毒性化合物。這正好與所預期的情況相反，因為預期的是最大信號的增加而不是兩個單個的最大值。
還檢查了在以前實驗中用MMS與新生霉素組合得到的數據是否會產生所用不同組合的基因毒性排序，并且這種排序是否與用不同的測試菌株[例如用TA98(pMOL1067)和TA104(pMOL890)]所得結果一樣。為此，計算所測試的每種組合的總信號/噪音比，然后將它們從低至高進行排序。結果可見不同的測試菌株產生合理的、完全相同的排序。有關例子示于圖11和12中。毒性測試不同的構建體在沒有基因毒性產物的情況下也產生本底光信號，這稱為噪音。這種噪音信號可用作檢測毒性而不是基因毒性化合物的度量信號。特別是認為可顯示相對較高噪音的、含pMOL890和pMOL1068的菌株很適合于這種毒性測試(在4小時實驗過程中它們的噪音可從100升高到13000相對光單位)，而具有低噪音的含pMOL1066或pMOL1067的菌株則用處不大(在4小時實驗過程中它們的噪音從20升高到750相對光單位)。如圖13和14中所示，當用不同濃度的毒性產物R116處理時，觀察到含有pMOL1067或pMOL1068的TA98菌株的發光量降低。
比較圖13和14可見，用TA98(pMOL1068)觀察到的信號/噪音比例遠比用TA98(pMOL1067)所檢測到的更為恒定。由于菌株TA98(pMOL1068)有高得多的基礎發光量，所以發光量的測量中的誤差重要性不太大，進而導致計算的信號/噪音數據的波動也較小。菌株TA98(pMOL1068)，還有其他含有pMOL890或pMOL1068的菌株對于毒性產物的IC50計算值是很有用的。優選的菌株將表現出至少與菌株TA98(pMOL1068)一樣的基礎發光量。環境樣品的測試因為對純的產物所作測試顯示含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株在測試潛在的環境污染物(如PAH)時比傳統的Ames測試更靈敏，所以使用這些菌株來測試環境樣品。給出的實例是-估測對PAH污染的土壤的生物除污-水溶性PAH降解產物的出現用500ppm混合物(含有萘、菲、蒽、熒蒽、芘和苯并-α-芘的Borneff混合物)污染土壤樣品。然后在生物反應器中處理該土壤以刺激細菌降解PAH。為了估計對土壤的生物除污并檢查基因毒性的降低，在3周的期間內取10g土壤樣品。用己烷(1ml/g土壤)提取這些樣品，并將提取物濃縮100倍。將濃縮的提取物稀釋1至8倍，并用于基因毒性測試中(有或沒有代謝激活)。作為(最高陽性稀釋度時高于2的信號/噪音比)×(稀釋倍數)的乘積計算每種樣品的基因毒性值。例如，如果稀釋4倍時發現信號/噪音比為2.8，則該樣品的基因毒性值為11.2。對基因毒性值作圖，這可對此被污染土壤的基因毒性作出很好的評價。圖15中給出了有關的實驗數據。
從圖15中可以看出，隨著時間的推移，PAH污染的土壤的基因毒性出現降低。這證明含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株很適用于跟蹤和估測污染了基因毒性產物的土壤的生物除污效果。一般含具有誘導率高于40之SOS調節的啟動子的序列的菌株均可用于本發明的優選實施方案中，其中所說的啟動子與編碼報道分子的核酸序列有效相連，所編碼的報道分子會產生可以發光形式測定的信號。權利要求的任何宿主微生物均適用于這樣的測試中。
為了分析水溶性中間體PAH降解產物的生成，對菲、芴和熒蒽的降解進行了檢測。為此，用0.1％PAH飽和未加額外碳源的基本M9培養基，并接種能夠降解PAH的菌株。每3天取出樣品(200ml)，并按照Grifoll等人(1994)的方法濃縮之。在pH2.5或pH7條件下進行提取并將樣品濃縮至5ml。于37℃干燥每種樣品各1ml，并重新懸浮于100μl DMSO中。取其中1μl用于基因毒性測試中。觀察到菲的基因毒性先是增加，然后又降低；芴未顯示出基因毒性的明顯增加，但可見熒蒽的基因毒性增加。這表明有基因毒性中間體化合物的形成和聚積。圖16中給出了估測菌株LB208降解熒蒽的結果。只給出pH2.5條件下進行提取的數據。
從該實驗中可以看出，含有pMOL890、pMOL1067或pMOL1068的菌株適用于估測基因毒性污染物的降解，以及基因毒性中間體降解產物的出現和聚積。總之，可將含具有誘導率高于20、優選高于40、最優選高于50之SOS調節的啟動子的序列的菌株用于優選實施方案中，其中所說的啟動子與編碼報道分子的核酸序列有效相連，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號。權利要求的任一種宿主微生物均可適用于這樣的測試中。正如對gazoline污染之土壤的DMSO提取物的分析所證明的，也有可能對環境樣品進行毒性測試。提取物的濃度越高使毒性越趨增加(數據未示出)。用recN-lux細菌測試基因毒性的標準操作方法1．引言該測試是基于含有作為SOS系統一部分的費氏弧菌lux操縱子的細菌，其中所說的lux操縱子處于recN基因的轉錄控制下。將細胞與基因毒性產物一起保溫后，recN啟動子將解除阻抑，導致lux操縱子的表達。這種表達基因以毒性的函數形式產生發光。然而，使用sfiA-lux菌株完成的測試也按同樣的方法進行。本領域技術人員也能夠使用這一方法，對本發明的含有SOS調節的啟動子的其它系統進行測試。
2．菌株-TA104 recN1-3-TA104 recN2-4-TA98 recN1-3-TA98 recN2-43．材料3.1培養基3.1.1869培養基(pH=7)每升去離子水含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl 5g，葡萄糖D1g,CaCl2·2H2O 0.345g，半胱氨酸30mg。
將培養基于120℃高壓滅菌20分鐘。加入四環素(20μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)。將培養基貯存于4℃備用。
3.1.2貧瘠869培養基(pH=7)每升去離子水含有胰蛋白胨2g，酵母提取物1g,NaCl5g，葡萄糖D1g,CaCl2·2H2O 0.345g，半胱氨酸30mg。
3.2 S9成分3.2.1 S9使用標準方法從大鼠肝中得到芳氯物誘導的微粒體組分S9。可從藥廠得到之。
3.2.2 KCl/MgCl2溶液
KCl6.15g,MgCl2·6H2O 4.7g，加蒸餾水至100ml。高壓滅菌并于室溫下貯存。
3.2.3 0.1M β-NADPβ-NADP 500mg，加無菌蒸餾水6.53ml，以每份500μl于冷凍管中貯存于-20℃。
3.2.4 1M葡萄糖-6-磷酸(G6P)G6P 282mg，加無菌蒸餾水1ml，在冷凍管中貯存于-20℃。
3.2.5磷酸鹽緩沖液0.2M(pH=7.4)60ml 0.2M NaH2PO4·H2O,440ml 0.2M Na2HPO4，調pH至7.4并以100ml等份高壓滅菌，貯存于室溫下。
3.3化學物質-DMSO疏水產物的溶劑-MMS未經代謝情況下所作測試的陽性對照-4NQO未經代謝情況下測試疏水產物的陽性對照-2AF經S9代謝情況下所作測試的陽性對照3.4設備96孔微量滴定板光度計，其為計算機控制的，可將數據記錄在工作行程紙上。
4．測試方法4.1培養物的維持和起始4.1.1維持刮下很少量冷凍的永久培養物并接種于25ml 869培養基(見3.1.1)中。在旋轉搖床(170rpm)上37℃培養過夜(ON)。次日早晨加入2.5mlDMSO。將細菌懸液分裝到冷凍試管中并于-80℃保存。取一個試管用于測試作為推薦為Ames菌株(rfa、pKM101等)的細菌。
4.1.2起始測試培養物用40μl細菌原液(見4.1.1)接種5ml 869培養基(見3.1.1)，并于37℃在旋轉搖床(170rpm)上培養過夜。次日早晨，將20μl過夜培養物接種于2.5ml貧瘠869培養基(見3.1.2)中。37℃晃動(170rpm)下培養1小時。
4.2測試產物的稀釋4.2.1貯備溶液作為溶解度和所需最高濃度的函數選擇貯備液的濃度。在小瓶內稱入幾毫克產物(Amg)并加入所需體積(Vml)的溶劑，以得到所需的濃度(Smg/ml)，計算式為V=A/S。
4.2.2測試產物的稀釋向8個小瓶(1-8號)內各加入50μl溶劑(H2O或DMSO)。向1個小瓶(9號)內加入100μl貯備液。從9號小瓶轉移50μl至8號小瓶中，用取液器混合5次并取50μl轉移到7號小瓶內依此類推，直到2號小瓶。混合后從2號(#2)中棄去50μl。
向各小瓶內加入450μl貧瘠869培養基。從各小瓶取10μl轉入96孔板內-從1號小瓶移入欄1、2和3(=溶劑對照)，-從2號小瓶移入欄4，從3號小瓶移入欄5，如此直到欄11。
4.2.3陽性對照物的制備陽性對照物的應用參見3.3節。
2AF(8ppm)制備在DMSO中的6400ppm溶液；在50μl DMSO中兩倍稀釋直至800ppm；加入450μl貧瘠869培養基(=80ppm)；向孔E12、F12、G12、H12中各轉移10 l。
4NQO(4ppb)制備在DMSO中的1000ppm溶液；向40μl該溶液內加入960μl DMSO(=40ppm)；向10μl該溶液內加入990μl DMSO(=0.4ppm)；向50μl該0.4ppm溶液內加入450μl貧瘠869培養基(=40ppb)；轉移10μl至孔A12、B12、C12、D12中。
MMS(16ppm)將5μl MMS加到995μl H2O(=6400ppm)；在50μl H2O中稀釋2倍直至1600ppm；向50μl該1600ppm溶液內加入450μl貧瘠869培養基；轉移10μl至孔A12、B12、C12、D12中。
4.3加或不加S9混合物進行實驗
4.3.1加S9混合物一般在加入到細菌中之前新鮮制備S9混合物在管中輕輕混合100μl KCl:MgCl2(3.2.2)、100μl β-NADP(3.2.3)、50μl G6P(3.2.4)、2500μl磷酸鹽緩沖液(3.2.5)、2500μl貧瘠869培養基(3.1.2)、132μl S9。-加入細菌輕輕混合140μl細菌懸液(4.1.2)、860μl貧瘠869培養基、400μl S9混合物。
轉移90μl至孔E1到E12:TA104 recN1-3孔F1到F12:TA104 recN2-4孔G1到G12:TA98 recN1-3孔H1到H12:TA98 recN2-44.3.2不加S9混合物向140μl細菌懸液(4.1.2)中加入1260μl貧瘠869培養基。
轉移90μl至孔A1到A12:TA104 recN1-3孔B1到B12:TA104 recN2-4孔C1到C12:TA98 recN1-3孔D1到D12:TA98 recN2-45．測定將96孔平板放在光度計上并開始測定(1秒/孔；每循環一次300秒；60個循環；30℃)。
6．計算完成測定后，將數據貯存在工作進程表上。將這組數據轉移到自動計算信/噪比的大紙上，制作圖表并作出最后報告。
7．評價在下列情況下認為產物是有基因毒性的1)至少在2個濃度下，信號/噪音比等于或高于2；
2)有清楚的劑量-效果反應。參考文獻-Beck E.，和Bremer E.(1980)。編碼大腸桿菌K12的外膜蛋白Ⅱ*的ompA基因的核苷酸序列。核酸研究，8:3011-3027。-Finch P.W.,Chambers P.和Emmerson P.T.1985.大腸桿菌recN基因產物鑒定為主要的SOS蛋白。細菌學雜志，164:653-658。-Gee P.,Maron D.M.，和Ames B.N.(1994).突變劑的檢測和分類一套堿基特異性沙門氏菌測試菌株。美國國家科學院院報，91:11606-11610。-Grifoll M.,Selifonov S.A.和Chapman P.J.(1994)。由假單胞菌種降解芴的新途徑的證據。應用環境微生物學，60:2438-2449。-Maron D.M.和Ames B.N.(1983).沙門氏菌誘變性測試的改進方法。突變研究，113:173-215。-Murray N.E.,Brammar W.J.和Murray K.(1977).可簡化體外重組體回收的λ噬菌體。Mol.Gen Genet.,150:53-61。-Oda Y.,Nakamura S.,Oki I.,Kato T.和Stinagawa H.(1985)。檢測環境突變劑和致癌劑的新系統(umu測試)的評估。突變研究，147:219-229。-Peterson K.R.和Mount D.W.(1987).不穩定的LexA41(Ts1-1)蛋白對SOS基因的分化阻抑導致大腸桿菌K12的分裂表型。分子生物學雜志，193:27-40。-Picksly S.M.,Morton S.J.和Lloyd R.G.(1985).大腸桿菌K12的recN位點其基因產物的分子分析和鑒定。Mol.Gen.Genet.,201:301-307。-Quillardet P.,Huisman O.,D′Ari.R.和Hofnung M.(1982).SOS顯色測試，一種在大腸桿菌K12中SOS功能誘導直接測定基因毒性的方法。美國國家科學院院報，79:5971-5975。-Rostas K.,Morton S.J.,Picksley S.M.和Lloyd R.G.(1987).大腸桿菌recN基因的核苷酸序列和LexA調控。核酸研究，15:5041-5049。-Schnarr M.,Oertel-Buchheit P.,Karmaier M.和Granger-Schnarr M.(1991)LexA阻抑蛋白的DNA結合特性。Biochemie,73:423-431。
權利要求
1．包含誘導率高于40的SOS調節的啟動子的重組核酸序列，所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號。
2．根據權利要求1的重組核酸序列，其中啟動子選自一組由可在重組性修復期間被誘導的啟動子組成的SOS調節的啟動子。
3．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子選自RecF、RecJ、RecN、RecF途徑的特殊成員、RecO、RecQ、ruv和uvrD。
4．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子是RecN(Seq.ID.No.3)。
5．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子含有可改善啟動子強度或調節作用的突變，所說的突變不破壞SOS調節作用。
6．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子含有至少一個活性LexA結合位點并在至少另一個LexA結合位點中具有突變。
7．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子含有至少一個活性LexA結合位點，并且在至少另一個LexA結合位點中具有突變，所說的突變不改變野生型啟動子序列。
8．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子是有下列核酸序列ID.No.7的突變RecN啟動子(=rec1-3)。
9．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子含有啟動子增效突變。
10．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子含有在所說的啟動子-35區域中的啟動子增效突變。
11．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中啟動子是具有下列核酸序列ID.No.9的突變的RecN啟動子(=rec2-4)。
12．根據權利要求1的重組核酸序列，其中啟動子是sfiA。
13．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中編碼報道分子的核酸序列中含有熒光素酶A和B基因。
14．根據前述權利要求中任何一項的重組核酸序列，其中編碼報道分子的核酸序列中含有熒光素酶A和B基因，以及產生用于再循環的有限脂肪酸底物所需的熒光素酶C、D和E基因。
15．含有前述權利要求中任何一項的重組核酸序列的宿主微生物。
16．根據權利要求15的宿主微生物，所說的宿主微生物是大腸桿菌。
17．根據權利要求15的宿主微生物，所說的宿主微生物是鼠傷寒沙門氏菌。
18．根據權利要求17的宿主微生物，所說的宿主微生物還具有適當的Ames測試微生物的特征。
19．根據權利要求17或18的宿主微生物，所說的宿主微生物選自TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535、TA1538、TA7001至TA7006，以及TA7041至TA7046。
20．檢測樣品中多種基因毒性化合物存在的方法，所說的方法包括以下步驟-培養宿主微生物，所說的宿主微生物包含帶有SOS調節的啟動子的核酸序列，所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子會產生可測定為光發生的信號，-測定培養物的發光，所說的測定是在各個時間點上進行的，最好是連續地測定，并在所說的時間點上檢測信號/噪音比，對所得數據作圖，所說的數據代表所說樣品的基因毒性動力學，其中多個峰表明存在有多種具有不同誘導動力學的基因毒性化合物。
21．檢測樣品中基因毒性化合物存在的方法，所說的方法包括以下步驟-培養宿主微生物，所說的宿主微生物包含帶有誘導率高于20的SOS調節的啟動子的核酸序列，所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上，所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號，-在多個時間點上，最好是連續地測定培養物的發光，并-確定培養物的發光是否發生了改變，增加發光即表明存在基因毒性化合物。
22．檢測樣品的基因毒性動力學的方法，所說的方法包括完成權利要求21中所限定的步驟，其中在多個時間點上、最好是連續地測定發光，另外還完成下述步驟-在所說的時間點上檢測發光的信號/噪音比，以及-將發光信號/噪音數據作圖，所說的圖代表所說樣品的基因毒性的動力學。
23．根據權利要求20、21或22的方法，其中宿主微生物是根據權利要求15-19中任何一項的宿主微生物。
24．檢測樣品的基因毒性和誘變性的方法，所說的方法包括完成權利要求23的方法，然后完成傳統的Ames測試。
25．檢測樣品中毒性化合物存在的方法，所說的方法包括以下步驟-培養宿主微生物，所說的宿主微生物是根據權利要求15-19中任何一項的宿主微生物，-測定培養物的發光，以及-確定培養物的發光是否發生了改變，發光降低即表明存在毒性化合物。
全文摘要
公開了包含誘導率高于40的SOS調節的啟動子的重組核酸序列,所說的啟動子被有效地連接到編碼報道分子的核酸序列上,所編碼的報道分子能產生可以發光形式測定的信號。還公開了包含這樣的核酸序列的生物傳感器,以及使用這種生物傳感器檢測基因毒性和多種基因毒性化合物的存在的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1219974SQ96180308
公開日1999年6月16日 申請日期1996年4月25日 優先權日1996年4月25日
發明者D·范德勒列, B·M·F·伯雷曼斯, A·I·A·普羅沃斯特, L·A·L·J·B·里格尼爾斯, L·P·E·沃斯查夫 申請人:佛蘭芒技術研究所