新型dna聚合酶的制作方法

專利名稱：新型dna聚合酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及作為遺傳工程用試劑有用的DNA聚合酶及其制造方法，以及編碼該酶的基因。
背景技術：
DNA聚合酶是作為遺傳工程用試劑有用的酶，并被廣泛用于DNA堿基序列測定、標記、位點特異性誘變等方法。而且，由于近來聚合酶鏈反應(PCR)方法的發展，耐熱DNA聚合酶引起了人們的注意。已經有多種適用于PCR方法的DNA聚合酶得到了發展并獲得了商業化。
現在已知的DNA聚合酶根據核苷酸序列的同源性可大體上分為4個家族，其中家族A(pol I型酶)和家族B(α型酶)占大多數。雖然屬于各家族的DNA聚合酶一般具有相似的生物化學特征，但詳細的比較顯示，每種酶在底物特異性、底物類似物的整合、引物延伸性的強度和速度、DNA合成的模式、外切核酸酶活性的伴隨、溫度、pH等最適反應條件、以及對抑制劑的敏感性等方面都有獨特的性質。因此，在相應的實驗操作中應在各種現有的DNA聚合酶中選用具有最適性質的DNA聚合酶。
發明公開本發明的目的是提供不屬于上述家族的、且具有現有DNA聚合酶沒有的生物化學特性的新型DNA聚合酶。例如，引物延伸活性與3’→5’外切核酸酶活性被認為是相反的特性，現存的DNA聚合酶中具備強的引物延伸活性的酶不具有對合成忠實性起重要校正功能作用的3’→5’外切核酸酶活性。同時校正功能優秀的酶的引物延伸活性弱。因此，開發具有強的3’→5’外切核酸酶活性并且引物延伸活性也很強的DNA聚合酶，對試管內DNA合成是很有意義的。
本發明的另一目的是提供上述新型DNA聚合酶的制造方法。
本發明的另一目的是提供編碼本發明的DNA聚合酶的基因。
發明人銳意研究的結果是，在極端嗜熱性古細菌激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)中發現了新型DNA聚合酶的基因，在克隆之后，弄清楚了只有兩種新型蛋白質同時存在時，其新型DNA聚合酶活性才能顯示。而且，本發明還制備了導入了上述基因的轉化子，并成功地大量生產了這種復合型DNA聚合酶，至此本發明完成。
即，本發明的要點涉及(1)具有下列特性的DNA聚合酶①在以單鏈模板DNA與引物退火形成的復合物為底物時，測定的聚合酶活性比以活化的DNA為底物時顯示的活性高。
②具有3’→5’外切核酸酶活性。
③在按下述條件以λ-DNA為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)時，能夠擴增約20千堿基對的DNA片段。
PCR的條件(a)反應液組成含10 mM Tris-鹽酸(pH9.2)、3.5 mM MgCl2、75 mM KCl、400μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、0.01％小牛血清白蛋白、0.1％ Triton X-100、5.0 ng/50μlλ-DNA、10 pmol/50μl引物λ1(序列表的序列號8)、以及引物λ11(序列表的序列號9)、3.7單位/50μl DNA聚合酶。
(b)反應條件以每循環98℃、10秒～68℃、10分鐘進行30個循環的PCR反應。
(2)前面(1)記載的DNA聚合酶，其特征為與Taq DNA聚合酶相比，在DNA合成時的錯誤頻率低；(3)前面(1)或(2)記載的DNA聚合酶，用凝膠過濾法測得的分子量為約220千道爾頓或約385千道爾頓；(4)前面(1)～(3)記載的任何DNA聚合酶，其特征為在兩種DNA聚合酶組成蛋白(第1種DNA聚合酶組成蛋白和第2種DNA聚合酶組成蛋白)共存時能顯示活性；(5)前面(4)記載的DNA聚合酶，其特征是，第1種DNA聚合酶組成蛋白和第2種DNA聚合酶組成蛋白用SDS-PAGE測得的分子量分別為約90,000道爾頓和約140,000道爾頓；(6)前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶，其特征為，構成前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物；(7)前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶，其特征為，構成前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號3中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物；(8)前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶，其特征為，構成前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物；構成前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號3中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物；(9)構成前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白，包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列，或包括在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換且具有基本相同的活性的功能等價物的氨基酸序列；(10)構成前面(4)或(5)中記載的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白，包括序列表的序列號3中所示的氨基酸序列，或包括在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換且具有基本相同的活性的功能等價物的氨基酸序列；(11)含有編碼前面(9)中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有編碼序列表的序列號1中所示的氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分，或者編碼含有在序列號1的氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換的氨基酸序列且具有第1種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質；(12)含有編碼前面(9)中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有序列表的序列號2中所示的堿基序列的全部或一部分，或者含有在嚴格條件下能與該序列雜交的堿基序列；(13)含有編碼前面(10)中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有編碼序列表的序列號3中所示的氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分，或者編碼含有在序列號3的氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換的氨基酸序列且具有第2種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質；(14)含有編碼前面(10)中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有序列表的序列號4中所示的堿基序列的全部或一部分，或者含有在嚴格條件下能與該序列雜交的堿基序列；(15)DNA聚合酶的制造方法，其特征為，培養含有編碼前面(11)或(12)中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因和編碼前面(13)或(14)中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的基因兩者的轉化子，從該培養物中收集DNA聚合酶；和(16)DNA聚合酶的制造方法，其特征為分別培養含有編碼前面(11)或(12)中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因的轉化子和含有編碼前面(13)或(14)中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的轉化子，混合培養物中所含的DNA組成蛋白，收集DNA聚合酶。
附圖簡述

圖1是實施例1中獲得的粘粒克隆No.264和粘粒克隆No.491中插入的DNA片段的限制酶切圖譜。
圖2是質粒pFU1001中插入的XbaI-XbaI DNA片段的限制酶切圖譜。
圖3是本發明的DNA聚合酶的最適pH的示意圖。
圖4是本發明的DNA聚合酶的熱穩定性示意圖。
圖5是本發明的DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性的示意圖。
圖6是本發明的DNA聚合酶的引物延伸活性的放射性自顯影圖。
發明的優選實施方案(1)本發明的DNA聚合酶及其組成蛋白本發明的DNA聚合酶的一個例子具有以下性質
①在以單鏈模板與引物退火形成的復合物為底物時測定的聚合酶活性，比以活化的DNA(DNase I處理的小牛胸腺DNA)作模板時顯示的聚合酶活性高。
②具有3’→5’外切核酸酶活性。
③最適pH6.5-7.0(磷酸鉀緩沖液中、75℃)。
④80℃、30分鐘熱處理后能顯示80％的殘存活性。
⑤并且，在以λ-DNA為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)時，能夠擴增約20千堿基對的DNA片段而不需要添加其他的酶。PCR的條件如下(a)反應液組成含10mM Tris-鹽酸(pH9.2)、3.5mM MgCl2、75mM KCl、400μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、0.01％小牛血清白蛋白(BSA)、0.1％Triton X-100、5.0 ng/50μlλ-DNA、10 pmol/50μl引物λ1(序列表的序列號8)、以及引物λ11(序列表的序列號9)、3.7單位/50μl DNA聚合酶。在這里，DNA聚合酶的1個單位按如下方法確定。制備50μl含有待測定活性樣品的反應液[20mM Tris-鹽酸(pH7.7)、15mM MgCl2、2mM 2-巰基乙醇、0.2mg/ml活化DNA、40μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、60nM[3H]dTTP(Amersham公司生產)]，在75℃反應15分鐘。將此反應液40μl點于DE濾紙(Whatman公司生產)，用5％Na2HPO4洗滌5次，然后用液閃計數器測定DE濾紙上殘留的放射活性，在30分鐘內將10nmol的[3H]dTMP摻入底物DNA的酶量定義為1個單位。
(b)反應條件以每循環98℃、10秒～68℃、10分鐘進行30個循環的PCR反應。
⑥本發明的DNA聚合酶在引物延伸活性、DNA合成的正確性兩方面與Taq DNA聚合酶比較都更優秀。即，本發明的DNA聚合酶的DNA合成反應的延伸活性，例如在PCR反應中被擴增DNA的鏈長，和反應的正確性(DNA合成時錯誤頻率低)與作為耐熱性DNA聚合酶代表的Taq DNA聚合酶(例如寶酒造社生產的TaKaRa Taq)相比都更為優秀。
本發明的DNA聚合酶的分子量用凝膠過濾法測定約為220千道爾頓或約385千道爾頓，在SDS-PAGE上顯示的是與約90,000道爾頓和約140,000道爾頓相當的兩條帶，它是由兩種蛋白質組成的酶。在本發明中，約90,000道爾頓的蛋白質(相當于下文的ORF3)被稱為第1種DNA聚合酶組成蛋白，約140,000道爾頓的蛋白質(相當于下文的ORF4)被稱為第2種DNA聚合酶組成蛋白。經過推定，本發明的DNA聚合酶是由第1種DNA聚合酶組成蛋白與第2種DNA聚合酶組成蛋白以1∶1或1∶2的摩爾比通過非共價結合形成的復合體。
構成本發明的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列，或也可以是具有與其基本相同活性的功能等價物，而第2種DNA聚合酶組成蛋白含有序列表的序列號3中所示的氨基酸序列，或也可以是具有與其基本相同活性的功能等價物。
在本說明書中記載的“功能等價物”的含義如下。除了天然存在的蛋白質的編碼基因的多形性及變異之外，生成的蛋白質因在體內或純化中的修飾反應等可在氨基酸序列中引起氨基酸的缺失、插入、附加、置換等變異，但已知某些蛋白質能顯示與沒有變異的蛋白質基本上相同的生理活性和生物學活性。這種在構造上有差異但在功能和活性上沒有發現大的差異的蛋白質就被稱為功能等價物。在這里，只要基本上能顯示同等的生理學和生物學活性，變異氨基酸的數目沒有特別的限制。具體的例子為1個以上，如1個或幾個，更具體為1個至約10個變異(缺失、插入、附加、置換等)。
人為地在蛋白質的氨基酸序列中引入上述變異時也一樣，在這種情況下，可以制備各種各樣的變異體。例如，雖然在大腸桿菌中表達的蛋白質的N末端存在的甲硫氨酸殘基在多數情況下用甲硫氨酸氨肽酶來去除。但這種去除是否完全取決于蛋白質的種類，帶有或不帶有甲硫氨酸的蛋白質兩者都可能生成。盡管如此，在大多數情況下，甲硫氨酸殘基的有無并不影響蛋白的活性。而且，已經知道白細胞介素2(IL-2)的氨基酸序列中的特定半胱氨酸殘基被絲氨酸置換時，仍能保持白細胞介素2的活性[《科學)》(Science)，第224卷，1431頁(1984)]。
此外，在用遺傳工程方法進行蛋白質的生產時，常以融合蛋白的形式來進行表達。例如，為了增加目的蛋白的表達量，在目的蛋白的N末端附加來自其他蛋白質N末端的肽鏈，或在N未端或C末端附加適當的肽鏈，表達該蛋白，通過使用與此類肽鏈有親和性的載體來使目的蛋白的純化更加容易進行。因此，與本發明的DNA聚合酶有部分氨基酸的差異的DNA聚合酶，只要能顯示與本發明的DNA聚合酶基本上相同的活性，該酶作為“功能等價物”也屬于本發明的范圍內。(2)本發明的DNA聚合酶的基因編碼構成本發明的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白的DNA，可舉出含有編碼序列表的序列號1中所示氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分的DNA，例如，含有序列表的序列號2中所示的堿基序列的全部或一部分的DNA。即，含有編碼序列號1中所示氨基酸序列的堿基序列的一部分的DNA，例如，含有序列表的序列號2中所示堿基序列的一部分的DNA，編碼具有第1種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質的堿基序列，也在本發明的范圍內。并且，還可舉出編碼包括在序列號1的氨基酸序列中有一個以上如1個或幾個氨基酸缺失、插入、附加或置換的氨基酸序列、并具有第1種DNA聚合酶組成蛋白功能的蛋白質的DNA。并且，能與上述序列在嚴格條件下雜交、并編碼具有第1種DNA聚合酶組成蛋白功能的蛋白質的堿基序列，也在本發明的范圍內。另外，編碼本發明的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白的DNA，可舉出含有編碼序列表的序列號3中所示氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分的DNA，例如，含有序列表的序列號4中所示的堿基序列的全部或一部分的DNA。即，含有編碼序列號3中所示氨基酸序列的堿基序列的一部分的DNA，例如，含有序列表的序列號4中所示的堿基序列的一部分的DNA，編碼具有第2種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質的堿基序列，也在本發明的范圍內。并且，還可舉出編碼包括在序列號3的氨基酸序列中有一個以上如1個或幾個氨基酸缺失、插入、附加或置換的氨基酸序列、并具有第2種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質的DNA。并且，能與上述序列在嚴格條件下雜交、并編碼具有第2種DNA聚合酶組成蛋白功能的蛋白質的堿基序列，也在本發明的范圍內。
在這里，“具有第1種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質”或“具有第2種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質”是指這兩種蛋白質共存時，能夠提供具有前面①～⑥中所示各種理化性質的DNA聚合酶活性。
在這里，“能在嚴格條件下雜交”是指在含有0.5％SDS、0.1％小牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficol 400、0.01％變性鮭精DNA的6×SSC(1×SSC表示0.15 M NaCl、0.0015 M檸檬酸鈉、pH7.0)中與探針在50℃保溫12-20小時后，與探針雜交。
在此對本說明書中記載的“含有編碼氨基酸序列的堿基序列的DNA”這一用語進行如下說明已知在基因上指導氨基酸的密碼子(3堿基組合)依氨基酸的種類存在1-6種。因此編碼氨基酸的DNA根據氨基酸序列可有多種存在方式。在自然界中，基因并不一定穩定存在，基因的堿基序列上發生變異并不少見，有時基因上堿基序列的變異并不引起所編碼氨基酸序列的變異(稱為無聲突變)。在這種情況下，產生了編碼相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使在已經分離了的編碼特定氨基酸序列的基因上，在經過含有此基因的生物傳代后，也不能否定編碼相同氨基酸的多種基因的可能性。
而且，采用各種遺傳工程的方法人工制備編碼相同氨基酸的多種基因也不困難。例如，用遺傳工程方法生產蛋白質時，編碼目的蛋白質的原始基因上使用的密碼子在宿主中的使用頻率很低，此時蛋白質的表達量也低。在這種情況下，在不引起所編碼的氨基酸序列變化的前提下，人工用宿主高頻率使用的密碼子進行變換，能使目的蛋白高表達(例如，特公平7-102146號公報)。因此人工制備編碼特定氨基酸序列的多種基因是可能的，在自然界中也能生成。因此含有與本發明公開的堿基序列相同的堿基序列的基因，以及編碼本發明公開的氨基酸序列的基因都包括在本發明中。(3)本發明的DNA聚合酶的制造方法發明人從極端嗜熱性古細菌激烈熱球菌中發現了新型DNA聚合酶的基因，通過克隆，清楚了該基因編碼新型DNA聚合酶，該基因上的兩種蛋白質在共存時能顯示活性。可以通過制備導入了這種基因的轉化子來大量生產本發明的DNA聚合酶。在這種情況下，可以通過培養含有前面的編碼第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因和編碼第2種DNA聚合酶組成蛋白的基因兩者的轉化子，從培養物中收集DNA聚合酶的方法來進行。也可以通過分別培養含有編碼第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因的轉化子和含有編碼第2種DNA聚合酶組成蛋白的基因的轉化子，然后將培養物中所含的DNA聚合酶組成蛋白混合，然后收集DNA聚合酶的方法來進行。
在這里，“含有編碼第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因和第2種DNA聚合酶組成蛋白的基因兩者的轉化子”，可以是分別含有相應基因的兩種表達載體同時轉化而來的轉化子，或者是通過將兩種基因重組到能分別表達各自蛋白的一個表達載體上而制備的轉化子。(4)下面詳細說明本發明的DNA聚合酶基因的克隆、所獲克隆的分析、表達產物DNA聚合酶的理化性質、活性、對PCR方法的適用性。
本發明使用的菌株沒有特別的限制，例如屬于熱球菌屬的激烈熱球菌(pyrococcus furiosis)DSM3628，該菌株可由DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH獲得。發明人在適當的增殖培養基上培養該菌株，制備培養物的粗抽提物，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時，發現凝膠內存在多條能顯示DNA聚合酶活性的蛋白質帶，推測也存在各自對應的基因。即，新型DNA聚合酶基因及其產物可按如下舉例程序進行克隆。①從激烈熱球菌中抽提DNA。②用適當的限制酶消化①的DNA，用質粒、粘粒等作載體制備DNA文庫。③將②中制備的文庫導入大腸桿菌，外源基因表達后，收集各克隆的粗抽提物制備蛋白文庫。④使用③中制備的蛋白文庫測定DNA聚合酶活性，從粗抽提物中有活性的大腸桿菌克隆中提取外源DNA。⑤分析提取的質粒或粘粒中所含的激烈熱球菌DNA片段，縮小能編碼顯示DNA聚合酶活性的蛋白質的區域。⑥確定預計編碼能顯示DNA聚合酶活性的蛋白質的區域，推導蛋白質的一級結構。⑦構建便于在大腸桿菌中表達⑥中推導的蛋白質的表達載體，純化所產生的蛋白質，并分析其特性。
上述DNA供體激烈熱球菌DSM3638是一種極端嗜熱性古細菌，將此細菌在95℃厭氧培養。破碎增殖的菌體后抽提、純化DNA的方法和用限制酶將所獲得的DNA切斷的方法等都可采用眾所周知的方法。這些方法詳見1982年冷泉港實驗室出版、T.Maniatis等著《分子克隆實驗指南)》(Molecular Coning，A Laboratory Manual)第75-178頁中的記載。
制備DNA文庫時，可以使用例如三股螺旋粘粒載體(Stratagene公司生產)。激烈熱球菌的DNA用Sau 3AI(寶酒造社生產)部分消化，密度梯度離心所獲得的長鏈DNA片段，與上述載體的BamHI位點連接，然后體外包裝。將用此方法制備的DNA文庫所獲得的轉化子分別培養，收集菌體，然后超聲波處理以破碎菌體，進行熱處理使大腸桿菌含有的DNA聚合酶失活。用離心法可以獲得含有耐熱性DNA聚合酶的上清。該上清即命名為粘粒蛋白文庫。用部分上清測定DNA聚合酶活性，可以獲得能表達來自激烈熱球菌的DNA聚合酶的克隆。DNA聚合酶活性的測定方法可以采用眾所周知的方法，該方法在Harparand Row公司出版、D.R.Davis編輯的《大腸桿菌的DNA聚合酶)》(DNApolymerase from Escherichia coli)第263-276頁(C.C.Richardson著)中記載。
發明人已經克隆了一種激烈熱球菌的DNA聚合酶基因，并清楚了其結構，見《核酸研究)》(Nucleic Acids Research)第21卷259-265頁(1993)中記載。該基因的翻譯產物由775個氨基酸組成，是分子量為90,000道爾頓的多肽，該氨基酸序列明顯含有α-型DNA聚合酶的保守序列。實際上，該基因產物所顯示的DNA聚合酶活性可被α-型DNA聚合酶的特異性抑制劑蚜棲菌素(aphidicolin)抑制，與本發明的DNA聚合酶不一樣。因此，需從所獲得的顯示耐熱性DNA聚合酶活性的克隆中將上述已經存在的基因除去，這可通過消化含有各克隆的粘粒，以上述基因作探針進行雜交，選擇不能雜交的克隆來進行。對含有所獲得的新型DNA聚合酶基因克隆的消化粘粒中的DNA插入片段作限制酶切圖譜。下一步，將插入DNA片段按限制酶切圖譜切成各種區域，分別在質粒中亞克隆，導入大腸桿菌后測定所表達的耐熱性DNA聚合酶的活性，從而確定該DNA片段聚合酶基因的位置。通過這種方法能夠獲得含有DNA聚合酶基因的約10千堿基對的XbaI-XbaI DNA片段。
含有整合了該DNA片段的質粒的重組大腸桿菌，其抽提物經90℃、20分鐘熱處理后仍有足夠的DNA合成活性，而沒有整合該DNA片段的質粒則沒有此活性。因此結論是，在該DNA片段上存在產生耐熱性DNA聚合酶的信息，且在大腸桿菌中帶有該信息的基因能夠表達。該DNA片段整合進載體pTV118N(寶酒造社生產)所得到的質粒被命名為pFU1001，用該質粒轉化的大腸桿菌JM109被命名為Escherichia coli JM109/pFU1001。該菌已在1995年8月11日(原始保藏日)按照布達佩斯條約，在日本茨城縣つくば市東一丁目1番3號(郵編305)的通產省工業技術院生命工學工業技術研究所，以保藏號FERM BP-5579進行了保藏。
質粒pFU1001中所插入的DNA片段的堿基序列，可以用常規方法，例如雙脫氧法來測定。并且，通過分析所獲得的堿基序列，就可以推導出該堿基序列中編碼蛋白質的區域-開放閱讀框(ORF)。
質粒pFU1001中所插入的約10千堿基對的XbaI-XbaIDNA片段中8450堿基對的序列在序列表的序列號5中表示。在該堿基序列中存在6個連續的ORF，自5’端依次被命名為ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6。圖2顯示了上述XbaI-XbaI片段的限制酶切圖譜，以及在該片段上存在的ORF的位置(自圖中左側，ORF1-ORF6)。
上述6個ORF中沒有與已知DNA聚合酶顯示同源的序列。但是在ORF1和ORF2中存在與啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中發現的CDC6蛋白或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中發現的CDC18蛋白質同源的序列。CDC6、CDC18據推測是酵母菌在向細胞周期的DNA合成期(S期)轉變過程中必要的蛋白質，這兩種蛋白質調節DNA復制的起始。而ORF6含有與已知在酵母DNA損傷修復及體細胞分裂期和減數分裂期的重組過程中起作用的RAD51蛋白質及其在減數分裂期中的特異性同源物Dmcl蛋白質同源的序列。已知編碼RAD51蛋白質的基因在細胞周期由G1向S期轉變時也被誘導表達。對于其他ORF，即ORF3、ORF4、ORF5，沒有發現與已知蛋白質有同源性的序列。
可以通過將缺失各區域的DNA片段插入來制備重組質粒，測定用這種質粒轉化獲得的轉化子的耐熱聚合酶活性，來調查耐熱性DNA聚合酶的活性來自上述哪個ORF。用插入了由上述約10千堿基對的XbaI-XbaI DNA片段中缺失了ORF1、ORF2或ORF5、ORF6的重組質粒轉化的轉化子，保持了耐熱性DNA聚合酶活性，而缺失了ORF3或ORF4則活性喪失。由此可以預測ORF3或ORF4編碼DNA聚合酶活性。
ORF3、ORF4究竟哪一個編碼DNA聚合酶活性，可以通過將各ORF分別插入來制備重組質粒。然后調查所獲得的轉化子中的耐熱性DNA聚合酶活性的表達來進行調查。令人意外的是，單獨含有ORF3或ORF4的轉化子獲得的粗抽提物中僅檢測到極弱的DNA聚合酶活性。而在將兩種抽提物混合時，可以得到與含有ORF3、ORF4兩者的轉化子同樣的耐熱性DNA聚合酶活性，因此這顯示，本發明的新型DNA聚合酶必須有這兩種ORF的翻譯產物起作用。是這兩種蛋白質形成復合體后顯示DNA聚合酶活性，還是其中一方修飾另一方轉變成有活性的酶，可以通過測定DNA聚合酶的分子量來了解。用凝膠過濾法測定該DNA聚合酶分子量的結果表明，上述兩種蛋白質形成復合體。
序列表的序列編號2中顯示ORF3的堿基序列，序列編號1中顯示由該堿基序列推導的ORF3的翻譯產物，即第1種DNA聚合酶組成蛋白的氨基酸序列。而序列表的序列編號4中顯示ORF4的堿基序列，序列編號3中顯示由該堿基序列推導的ORF4的翻譯產物，即第2種DNA聚合酶組成蛋白的氨基酸序列。
本發明的DNA聚合酶可以在常規的培養條件下，例如含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基(蛋白胨10g/升、酵母抽提物5g/升、NaCl 5g/升、pH7.2)中，培養用整合了ORF3及ORF4的重組質粒轉化的轉化子，如大腸桿菌JM109/pFU1001，來在菌體進行表達。該聚合酶可以從上述培養的菌體中，采用諸如超聲波處理、熱處理、以及用陰離子交換柱(RESOURCE Q柱，Pharmacia)、HeparinSepharose柱(HiTrap Heparin，Pharmacia公司生產)、凝膠過濾柱(Superose 6HR，Pharmacia公司生產)等進行色譜，純化至在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上基本上顯示兩種DNA聚合酶組成蛋白的兩條帶。而且，也可將單獨含有ORF3、ORF4的轉化子分別培養后，獲得培養菌體，混合其抽提物、或純化的DNA聚合酶組成蛋白來獲得目的DNA聚合酶。在混合兩種DNA聚合酶組成蛋白時，不需要特別的操作。可以將相應的兩種轉化子的抽提物或由其純化而來的兩種蛋白質簡單地以適當量混合來獲得有活性的DNA聚合酶。
由此獲得的本發明的DNA聚合酶在SDS-PAGE上顯示與約90,000道爾頓、約140,000道爾頓相當的兩條帶，分別與第1及第2種DNA聚合酶組成蛋白相對應。
如圖3所示，本發明的DNA聚合酶在磷酸鉀緩沖液中、750℃時，顯示最適pH在pH6.5-7.0附近。而且在不同的溫度測定該酶的酶活時，該酶在75-85℃顯示最高活性，但由于在高溫時，用作活性測定底物的活化DNA的雙鏈結構會被破壞，該酶活性的準確最適溫度沒有測定。該DNA聚合酶有高熱穩定性，圖4顯示在經過80℃、30分鐘的熱處理后，仍保持80％以上的殘存活性。這種熱穩定性使該酶能用于PCR方法。而且，在調查已知的α型聚合酶的特異性抑制劑蚜棲菌素(aphidicolin)的影響時，該DNA聚合酶的活性在2mM蚜棲菌素存在下仍不被抑制。
分析純化的DNA聚合酶的生物化學活性特性的結果為，本發明的DNA聚合酶在試管內有非常優秀的引物延伸活性，如表1所示，在用引物與單鏈DNA退火形成的底物(M13-HT引物)測定DNA聚合酶的活性時，能獲得比通常活性測定所用的活化DNA(DNAaseI處理的小牛胸腺DNA)高的核苷酸摻入活性。與使用上述M13-HT引物底物的其他DNA聚合酶的引物延伸能力進行比較，本發明的DNA聚合酶能顯示與已知的來自激烈熱球菌的DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶，Stratagene生產)和來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的TaqDNA聚合酶(TaKaRa Taq，寶酒造社生產)相比更優的延伸活性。更進一步，在反應體系中加入活化DNA作為競爭底物時，上述2種DNA聚合酶的引物延伸活性被強烈抑制，而本發明的DNA聚合酶只被輕微抑制，這表明該酶對引物延伸型底物具有高親和性(圖6)。
表1

<p>而且，本發明的DNA聚合酶在用于PCR方法時，能顯示極優的性能。PCR方法中頻繁使用的、來自水生棲熱菌的DNA聚合酶在單獨使用時，擴增10千堿基對以上的DNA片段非常困難，在與其他DNA聚合酶組合使用時，也難以擴增20千堿基對以上的DNA片段《美國國家科學院院報》(Proceeding of the National Academy of Sciencesof the USA，第91卷，第2216-2220頁(1994))。而且，據報道，使用Pfu DNA聚合酶所能擴增的DNA鏈長最大為3千堿基對左右。在使用本發明的DNA聚合酶時，在不添加其他酶的情況下，能夠單獨擴增20千堿基對的DNA片段。
而且，本發明的DNA聚合酶還伴隨有3’→5’外切核酸酶活性，相對于DNA聚合酶活性，外切核酸酶活性很強，已知這種活性強因而DNA合成的準確性非常高，在這點上，本發明的DNA聚合酶能與PfuDNA聚合酶的活性相媲美(圖5)。而且，經測定本發明的DNA聚合酶在DNA合成反應中引起的誤差頻率比Taq DNA聚合酶低。上述各種性質顯示，本發明的DNA聚合酶作為PCR方法等遺傳工程用試劑非常優秀。
而且，本發明的新型DNA聚合酶基因的發現還提供了更有趣的知識。發明人為了了解含有編碼新型DNA聚合酶的ORF3、4的基因的區域在細胞內是怎樣轉錄的，用Northern印跡法、RT PCR法以及引物延伸法對由激烈熱球菌中制備的RNA部份進行了分析，結果證明，ORF1-ORF6以一條信使RNA(mRNA)從緊接ORF1的上游開始轉錄。由此可以設想ORF1和ORF2在細胞內的產生與ORF3、4受到同樣的控制，同時考慮到ORF1、2、5、6與同酵母的DNA復制起始調節有關的CDC6、CDC18有序列上的同源性，本發明的新型DNA聚合酶很可能是DNA復制過程中重要的DNA聚合酶。而且激烈熱球菌屬于古細菌，據推測古細菌的DNA復制系統與真核生物非常接近，由此可以預測在真核生物中存在還沒有被發現的、與本發明的DNA聚合酶類似的重要的DNA聚合酶。
而且，還可以預期與本發明的DNA聚合酶類似的耐熱性DNA聚合酶，可在與激烈熱球菌同屬于極端嗜熱性古細菌的細菌中，例如除激烈熱球菌以外屬于熱球菌屬的細菌、熱網菌屬(Pyrodictium)、熱球菌屬(Thermococcus)、葡萄嗜熱菌屬(staphylothermus)等屬的細菌內產生。當這些酶與本發明的DNA聚合酶一樣由2種DNA聚合酶組成蛋白組成時，可以期待這些酶的一個DNA聚合酶組成蛋白與相當于另一個DNA聚合酶組成蛋白的本發明的DNA聚合酶組成蛋白組合，能夠表現同樣的DNA聚合酶活性。
可以期待上述極端嗜熱性古細菌生產的、與本發明的DNA聚合酶相似的耐熱性DNA聚合酶在有關氨基酸序列、及編碼其的基因的堿基序列上，與本發明的DNA聚合酶的氨基酸序列、及編碼其的基因的堿基序列之間存在同源性。因此，以本發明中分離的基因或其堿基序列的一部分做探針，用雜交的方法從上述嗜熱性古細菌中獲得DNA片段，將其導入適當的微生物，用前面記載的粘粒文庫同樣的方法制備熱處理裂解液，用適當的方式檢測其DNA聚合酶活性，就能夠獲得與本發明的DNA聚合酶的堿基序列不同，但具有同樣酶活性，且與本發明的酶類似的耐熱性DNA聚合酶的基因。
上述雜交可以按下列條件進行。即，固定了DNA的膜與探針在含有0.5％SDS、0.1％小牛血清白蛋白(BSA)、0.01％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficol 400、0.01％變性鮭精DNA的6×SSC(1×SSC表示0.15 MNaCl、0.015 M檸檬酸鈉、pH7.0)中，50℃溫育12-20小時。溫育終止后，于含有0.05％SDS的2×SSC中、在37℃開始洗滌，將SSC的濃度變化至0.1×、溫度變化至50℃，洗凈至來源于固定DNA的信號與背景可以區別。
這樣，以本發明中分離的基因或其堿基序列的一部分作引物，以由上述嗜熱性古細菌中獲得的DNA為模板進行基因擴增，將得到的片段或以該片段為探針進行雜交而從上述嗜熱性古細菌中獲得的片段導入適當的微生物，按與前面一樣的方法檢測DNA聚合酶活性，就能夠獲得與本發明的DNA聚合酶的活性不一樣、但具有同一水平的、與本發明的酶類似的耐熱性DNA聚合酶基因。
下面說明本發明的實施例，但本發明并不限于下面的實施例。而且，實施例中的％的意思是重量％。
實施例1(1)激烈熱球菌基因組DNA的制備激烈熱球菌DSM3638的培養按下面的方法進行
將組成為蛋白胨1％、酵母抽提物0.5％、可溶性淀粉1％、JarmarinS Solid(Jamarin實驗室生產)3.5％、Jarmarin S Liquid(Jamarin實驗室生產)0.5％、MgSO40.003％、NaCl 0.001％、FeSO4·7H2O 0.0001％、CoSO40.0001％、CaCl2·7H2O 0.0001％、ZnSO40.0001％、CuSO4·5H2O0.1ppm、KAl(SO4)20.1ppm、H3BO30.1ppm、NaMoO4·2H2O 0.1ppm、NiCl2·6H2O 0.25ppm的培養基裝入2升的培養瓶中，120℃、20分鐘滅菌，充入氮氣以去除溶解氧后，接種上述細菌，在95℃靜置培養16小時，培養后，離心收集菌體。
然后，在4ml含25％蔗糖的0.05 M Tris-HCl(pH8.0)中懸浮收集的菌體，在懸浮液中加入0.8ml的溶菌酶[5mg/ml、0.25MTris-HCl(pH8.0)]和2ml的0.2M EDTA，在20℃保溫1小時。然后加入24ml的SET溶液[150mM NaCl、1mM EDTA、20mMTris-HCl(pH8.0)]，再加入5％的SDS 4ml和蛋白酶K(10mg/ml)400μl，37℃反應1小時。反應終止后，用酚氯仿抽提，接著用乙醇沉淀，制備了約3.2mg的基因組DNA。(2)粘粒蛋白文庫的制備激烈熱球菌DSM3638的基因組DNA 400μg用Sau 3Al部分消化，用密度梯度離心分離成35-50 kb大小的片段。接著，1μg的三股螺旋粘粒載體(Stratagene公司生產)用XbaI消化，然后用堿性磷酸酶(寶酒造社生產)去磷酸化，并用BamHI消化，與上面分級的30-50 kb的DNA 140μg混合，進行連接，使用GIGAPACK GOLD(Stratagene公司生產)按體外包裝法將激烈熱球菌的基因組DNA片段包裝入λ噬菌體顆粒中，制備文庫。接著，將所得到的文庫的一部分轉入大腸桿菌DH5αMCR中。選擇幾個獲得的轉化子制備粘粒DNA，在證明有適當大小的插入片段后，另從上述文庫中選擇500個轉化子，分別接種在150ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基(蛋白胨10g/升、酵母抽提物5g/升、NaCl 5g/升、pH7.2)中培養。將該培養物離心，收集的菌體懸浮于1ml的20mM Tris-HClpH8.0中，在100℃熱處理10分鐘。接著進行超聲波處理，然后再次在100℃熱處理10分鐘。離心后的上清即獲得的裂解物作為粘粒的蛋白文庫。(3)DNA聚合酶活性的測定DNA聚合酶活性測定用DNAaseI處理而活化的小牛胸腺DNA(Worthington生產)(活化DNA)作底物。DNA的活化和DNA聚合酶活性的測定按Harpar and Row公司出版、D.R.Davis編輯的《大腸桿菌的DNA聚合酶》(DNA polymerase from Escherichia coli)第263-276頁(C.C.Richardson著)中記載的方法進行。
酶活性的測定按下面的方法進行。即，制備50μl含有待測定活性樣品的反應液[20 mM Tris-鹽酸(pH7.7)、15 mN MgCl2、2 mM 2-巰基乙醇、0.2mg/ml活化DNA、40μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、60 nM[3H]dTTP(Amersham公司生產)]，在75℃反應15分鐘。將此反應液40μl點于DE濾紙(Whatman公司生產)，用5％Na2HPO4洗滌5次，然后用液閃計數器測定DE濾紙上殘留的放射活性。按上述酶活性測定方法，在30分鐘內將10 nmol的[3H]dTMP摻入底物DNA的酶量定義為1個單位。(4)含有DNA聚合酶基因的粘粒文庫的選擇制備含有20mM Tris-鹽酸(pH7.7)、2mM MgCl2、2 mM 2-巰基乙醇、0.2mg/ml活化DNA、40μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、60 nM[3H]dTTP(Amersham公司生產)的反應液，在45μl此反應液中加入分別來自粘粒文庫的5個克隆的抽提物各1μl。即每個反應加入5μl，在75℃反應15分鐘后。分別在DE濾紙(Whatman公司生產)點樣40μl。用5％Na2HPO4洗滌5次，然后用液閃計數器測定DE濾紙上殘留的放射活性。在第一次檢測中被確認含有活性的含有5個克隆的一組，接著將5個克隆分成單個克隆進行第二次檢測。粘粒文庫中含有已知的DNA聚合酶的克隆，這是以該基因為探針進行雜交而推測的，它們分別為克隆No.57、154、162、363。除此之外，還發現5個克隆No.41、153、264、462、491含有DNA合成活性。(5)限制酶切圖譜的制備從上述5個克隆中分離粘粒，分別用BamHI消化，檢測電泳圖譜，發現幾條相同的帶。預計5個克隆整合有重疊和輕微錯動的區域。因而制作克隆No.264和491的插入DNA片段的限制酶切圖譜。從兩個克隆制備的粘粒用各種限制酶消化的結果是，KpnI、NotI、PstI、SmaI、XbaI、XhoI(均為寶酒造社生產)都能切出適當大小的片段，其相應的酶切位點確定的結果就獲得了圖1所示的圖譜。(6)DNA聚合酶基因的亞克隆在圖1所示的限制酶切圖譜的基礎上，由來自克隆264或491的粘粒切下10千堿基對左右的各種DNA片段，亞克隆到pTV118N或pTV119N載體(寶酒造社生產)。對來自所獲重組質粒的轉化子檢測耐熱性DNA聚合酶活性的結果，證明約10千堿基對的XbaI-XbaI片段上有能產生強耐熱性DNA聚合酶的基因。重組了該XbaI-XbaI片段的pTV118N載體被命名為pFU1001，用該質粒轉化的大腸桿菌JM109被命名為Escherichia coli JM109/pFU1001。實施例2含有新型DNA聚合酶基因的DNA片段的堿基序列的測定從實施例1中獲得的質粒pFU1001中再次用XbaI將含有DNA聚合酶基因的上述XbaI-XbaI片段切出，用DNA平末端化試劑盒(寶酒造社生產)平末端化，然后與用SmaI線性化的新載體pTV118N連接，來制備用于制備缺失突變體的質粒，依插入片段方向的不同，質粒被分別命名為pFU1002和pFU1003。使用這兩種質粒，由插入DNA片段的兩端開始，順次制備缺失突變體。制備應用Henikoff的方法(《基因》(Gene)第28卷、第351-359頁)，并使用kilo-sequence用缺失試劑盒(寶酒造社生產)。3’突出型和5’突出型限制酶分別采用PstI和XbaI。以得到的各種缺失突變體為模板，用BcaBE-ST雙脫氧測序試劑盒(寶酒造社生產)按雙脫氧法確定插入DNA片段的堿基序列。
序列表的序列號5顯示了所獲得的堿基序列的8450堿基對的序列。對該堿基序列進行分析的結果發現了6個編碼蛋白質的開放閱讀框(ORF)，分別存在于序列表的序列號5中所示的堿基序列的堿基號123-614、(ORF1)、611-1381(ORF2)、1384-3222(ORF3)、3225-7013(ORF4)、7068-7697(ORF5)、7711-8385(ORF6)的位置。圖2中顯示了重組在質粒pFU1001中的約10千堿基對的XbaI-XbaI DNA片段的限制酶切圖譜和該片段上上述ORF的位置。
此外，用上述各種缺失突變體檢測了DNA聚合酶活性，結果顯示不管是從上游缺失還是從下游缺失，當ORF3和ORF4區域缺失時，DNA聚合酶的活性都喪失。這顯示ORF3和ORF4的翻譯產物對DNA聚合酶活性的表達都非常重要。ORF3的堿基序列在序列表的序列號2中顯示，由該堿基序列推導的ORF3的翻譯產物的氨基酸序列在序列號1中顯示。ORF4的堿基序列在序列表的序列號4中顯示，由該堿基序列推導的ORF4的翻譯產物的氨基酸序列在序列號3中顯示。
實施例3純化DNA聚合酶標準品的制備將實施例1中獲得的Escherichia coli JM109/pFU1001在含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的500ml LB培養基(蛋白胨10 g/升、酵母抽提物5g/升、NaCl 5g/升、pH7.2)中培養。當培養物的濁度達到0.6 A600時，加入誘導物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培養16小時，收集菌體，然后用37ml的超聲緩沖液(50mMTris-HCl、pH8.0、2 mM 2-巰基乙醇、10％甘油、2.4 mM PMSF(苯甲基磺酰氟)懸浮菌體，用于超聲波破碎儀。12000rpm、10分鐘離心，回收42ml作為粗抽提物的上清，然后在80℃熱處理15分鐘。然后再以12000rpm、10分鐘離心，獲得33ml的熱處理酶液。接著將此溶液以800ml緩沖液A(50mM磷酸鉀、pH6.5、2mM 2-巰基乙醇、10％甘油)作外液透析2小時×4。透析后的酶液32ml上用緩沖液A平衡的RESOURSE Q柱(Pharmacia公司生產)，使用FPLC系統(Pharmacia公司生產)進行色譜。展開用0→500 mM線性濃度梯度的NaCl進行。DNA聚合酶活性在340mM NaCl時洗脫。
收集含活性的級分所得到的10ml酶液用超濾進行脫鹽、濃縮，溶于緩沖液A+150 mM NaCl，得到3.5ml酶液，然后將其上用同樣的緩沖液平衡的HiTrap Heparin柱(Pharmacia公司生產)，用FPLC系統以150→650mM線性濃度梯度的NaCl進行展開。在400mM NaCl的洗脫級分中獲得活性成分。將此級分5ml用超濾反復脫鹽、濃縮，使之最后濃縮為120μl含50mM磷酸鉀、pH6.5、2mM 2-巰基乙醇、75 mM NaCl的溶液。將此溶液上用同一緩沖液平衡的Superose 6凝膠過濾柱(Pharmacia公司生產)，并用同一緩沖液進行洗脫，結果，DNA聚合酶活性在保留時間為34.7分鐘和38.3分鐘的位置洗脫出來。與同一條件下分子量標準的洗脫位置進行比較的結果，預計此活性具有的分子量分別為約385千道爾頓和約220千道爾頓，這些分子量相當于0RF3的翻譯產物與ORF4的翻譯產物以1∶2的摩爾比形成的復合體以及以1∶1的摩爾比形成的復合體。由于在高分子量時，分子量測定的誤差較大，不能否定前者是2種翻譯產物以2∶2的摩爾比形成復合體的可能性。
實施例4(1)DNA聚合酶的生物化學特性對于實施例3中獲得的0RF3和ORF4的翻譯產物，即第1種DNA聚合酶組成蛋白和第2種DNA聚合酶組成蛋白以1∶1形成的復合體的DNA聚合酶標準品，首先尋找其最適MgCl2和KCl濃度。在反應體系為20 mM Tris-鹽酸、pH7.7、2 mM 2-巰基乙醇、0.2mg/ml活化DNA、40μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP，并存在2 mM MgCl2時，KCl的濃度在0-200 mM的范圍內以20mM進行增加，測定DNA聚合酶活性。結果為在KCl為60mM時顯示最大活性。然后用上述反應體系，并在60mM KCl的條件下，這次MgCl2在0.5-25 mM范圍內每次增加2.5mM進行比較，結果在10mM時顯示最大活性，在不含KCl的情況下進行比較時，在17.5mM時顯示最大活性。
然后調查最適pH。使用各種pH的磷酸鉀緩沖液，制備含有20mM磷酸鉀、15mM MgCl2、2mM 2-巰基乙醇、0.2mg/ml活化DNA、40μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、60 nM[3H]dTTP的反應液，用來在75℃時測定DNA聚合酶活性。其結果在圖3中顯示。圖中橫軸表示pH，縱軸表示摻入高分子DNA的放射活性。圖中顯示本發明的DNA聚合酶在pH6.5-7.0時顯示最大活性，在用Tris-鹽酸取代磷酸鉀的情況下，在堿性一側活性較高，在測定所用最高的pH8.02時，顯示最大活性。
本發明的DNA聚合酶的熱穩定性按以下的方法進行調查，制備含有純化DNA聚合酶的20 mM Tris-鹽酸(pH7.7)、2 mM 2-巰基乙醇、10％甘油、0.1％小牛血清白蛋白的溶液，在各種溫度下保溫30分鐘，檢測殘存的DNA聚合酶活性。結果示于圖4。圖中橫軸表示保溫溫度，縱軸表示殘存的活性。圖中顯示，本發明的酶在80℃、30分鐘的熱處理后，仍能保持80％以上的殘存活性。
為比較抑制劑的抑制模式，使用α型DNA聚合酶的特異性抑制劑蚜棲菌素，將本發明的DNA聚合酶與已知的來自激烈熱球菌的α型DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶，Stratagene公司生產)的抑制方式進行比較。在20 mM Tris-鹽酸(pH7.7)、15 mM MgCl2、2 mM 2-巰基乙醇、0.2 mg/ml活化DNA、40μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP存在下，蚜棲菌素從0到2.0 mM增加，檢測活性的變化，Pfu DNA聚合酶在1.0mM時活性減少至20％，而與之相對，本發明的新型DNA聚合酶在2.0mM時，也完全未被抑制。(2)引物延伸反應接著，為比較本發明的DNA聚合酶對底物DNA形式的選擇性，檢測了下面的模板-引物。除常規的活性檢測中使用的活化DNA外，制備的底物還包括85℃熱處理5分鐘的活化DNA(熱變性DNA)、M13噬菌體單鏈DNA(M13mp18ss DNA，寶酒造社生產)以序列表的序列號6所示序列的45個堿基的合成脫氧核糖寡核苷酸為引物退火的產物(M13-HT引物)、相同的M13噬菌體單鏈DNA以序列表的序列號7中所示序列的17個堿基的合成脫氧核糖寡核苷酸為引物退火的產物(M13-RNA引物)、聚脫氧腺苷酸(poly dA，Pharmacia公司生產)與寡聚胸苷酸(Oligo dT、Pharmacia公司生產)以20∶1的摩爾比混合(polydA-Oligo dT)的產物、聚腺苷酸(poly A，Pharmacia公司生產)與寡聚脫氧胸苷酸以20∶1的摩爾比混合的產物(polyA-Oligo dT)。
用這些底物代替活化DNA測定DNA聚合酶活性，以底物用活化DNA時所獲得的活性為100，表1中顯示用各底物時的相對活性。為了比較，對Pfu DNA聚合酶、來自水生棲熱菌的Taq DNA聚合酶(TaKaRa Taq，寶酒造社生產)也進行了同樣的檢測。如表1所示，本發明的新型DNA聚合酶與其他DNA聚合酶相比，在用M13-HT引物而不是以活化DNA為底物時，所得到的活性高，因而對引物延伸反應有特別高的適用性。
接著對引物延伸活性進行更詳細的檢測。使用M13-HT引物作底物，引物的5’端用[γ-32P]ATP(Amersham公司生產)和T4多聚核苷酸激酶(寶酒造社生產)標記。制備10μl含終濃度為0.05μg/μl的上述底物和在以活化DNA為底物的活性測定中的酶量為0.05單位的各種聚合酶的反應液(20 mM Tris-鹽酸(pH7.7)、15 mM MgCl2、2 mM 2-巰基乙醇、270μM dATP、d CTP、dGTP、dTTP)，在75℃反應1、2、3、4分鐘，反應結束后，加入2μl的反應終止液(95％甲醛、20 mM EDTA、0.05％溴酚蘭、0.05％二甲苯青)，在95℃熱變性處理3分鐘，然后取2μl反應液用含8M尿素的聚丙烯酰胺進行凝膠電泳，然后制備放射性自顯影。并且，為調查在作為競爭底物的活化DNA存在下的引物延伸活性，在上述反應液中加入活化DNA至終濃度為0.4μg/μl，按上面同樣的方法制備放射性自顯影，所得到的放射性自顯影在圖6中顯示。
在圖中，Pol、Pfu、Taq分別表示本發明的DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶所獲得的結果，1、2、3、4分別表示反應時間(分鐘)。而且，圖中的-、+分別代表在活化DNA不存在和存在下所獲得的結果。而圖左端用G、A、T、C表示的條帶是用與上面相同的底物用雙脫氧法終止反應所得到的反應物的電泳結果，用來推定延伸反應的長度。圖中顯示本發明的DNA聚合酶與Pfu DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶相比顯示更優的引物延伸活性。而且還顯示，在活化DNA不存在時顯示比較高的引物延伸活性的Taq DNA聚合酶在加入大量過剩的活化DNA時明顯被抑制，而與之相對，本發明的DNA聚合酶不被活化DNA抑制。這證明，本發明的DNA聚合酶特別對引物與單鏈模板退火形成的引物延伸型底物具有高親和性。(3)伴隨外切核酸酶活性的有無本發明的DNA聚合酶伴隨的外切核酸酶活性用下述方法進行調查。5’→3’外切核酸酶活性檢測所用的底物是pUC119載體(寶酒造社生產)用SspI(寶酒造社生產)消化，用瓊脂糖凝膠電泳分離所獲得的386堿基對的DNA片段，純化，用[γ-32P]ATP和多聚核苷酸激酶制備5’末端32P標記的DNA片段。3’→5’外切核酸酶活性檢測所用的底物是pUC119載體(寶酒造社生產)用Sau3AI消化，所獲得的341堿基對的DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳分離、純化，用[γ-32P]CTP(Amersham公司生產)和Klenow片段(寶酒造社生產)進行補平反應制備3’末端32P標記的DNA片段。標記DNA用NICK柱(Pharmacia公司生產)凝膠過濾進行純化，并用于以下反應。在含有這種標記DNA 1 ng的反應液(20 mM Tris-鹽酸(pH7.7)、15 mM MgCl2、2mM2-巰基乙醇)中，加入0.015單位的DNA聚合酶，在75℃反應2.5、5、7.5分鐘后，加入乙醇沉淀DNA。上清中存在的放射性活性用液體閃爍計數器進行測定，求出外切核酸酶活性的分解量。在本發明的DNA聚合酶中沒有發現5’→3’外切核酸酶活性，而顯示帶有很強的3’→5’外切核酸酶活性。已知3’→5’外切核酸酶活性很強的Pfu DNA聚合酶也用同樣的方法測定3’→5’外切核酸酶活性，其結果一起在圖5中顯示。
圖中橫軸表示反應時間，縱軸表示上清中游離的放射性活性在全部反應液的放射性活性中的比例。而圖中空心圈表示本發明的DNA聚合酶所測得的結果，實心圈表示Pfu DNA聚合酶所測得的結果。圖中顯示本發明的DNA聚合酶具有與Pfu DNA聚合酶相同程度的3’→5’外切核酸酶活性，已知由于具有很強的3’→5’外切核酸酶活性的PfuDNA聚合酶的DNA合成的忠實性很高。(4)DNA合成反應的正確性的比較DNA聚合酶在DNA合成反應中的正確性，以部分單鏈化的pUC118載體(寶酒造社生產)(開環型雙螺旋質粒)為模板來檢測。單鏈pUC118以大腸桿菌MV1184(寶酒造社生產)為宿主，使用輔助噬菌體M13K07(寶酒造社生產)，按1989年冷泉港實驗室出版、T.Maniatis等編輯、《分子克隆實驗室指南第2版》4.44-4.48中記載的方法，進行制備。而雙鏈DNA用PvuII(寶酒造社生產)消化pUC118載體后，進行瓊脂糖凝膠電泳，回收約2.8千堿基對的DNA片段，進行制備。
將上述單鏈DNA 1μg和雙鏈DNA 2μg混合在180μl的滅菌蒸餾水中，在70℃保溫10分鐘，然后加入20μl的20×SSC，在60℃靜置10分鐘。進行乙醇沉淀以回收DNA，取一部分進行瓊脂糖凝膠電泳，證明獲得了開環型雙鏈質粒。制備含1/10量的所獲開環型雙鏈DNA質粒的反應液(10mM Tris-鹽酸pH8.5、50mM KCl、10mMMgCl2、1mM dATP、d CTP、dGTP、dTTP)30μl，在70℃保溫3分鐘后，加入0.5單位的DNA聚合酶，在70℃進行10分鐘的DNA合成反應。反應結束后，用10μl的反應液轉化大腸桿菌DHSα(BRL公司生產)。在含有100μg/ml氨芐青霉素、0.1mM IPTG、40μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷的LB平板上，于37℃培養18小時。記錄平板上出現的白色及青色克隆數。計算DNA合成時由于錯誤而產生的白色克隆的出現率。結果為，用Taq DNA聚合酶作為DNA聚合酶時的出現率為3.18％，而相應地，用本發明的DNA聚合酶的出現率為較低的數值1.61％。(5)PCR中的應用在本發明的DNA聚合酶在PCR反應中的性能與Taq DNA聚合酶進行比較時，以λ-DNA為模板進行PCR反應。本發明的DNA聚合酶所用的反應液的組成包括10mM Tris-鹽酸(pH9.2)、3.5mM MgCl2、75mM KCl、400μM dATP、d CTP、dGTP、dTTP、0.01％牛血清白蛋白、0.1％Triton X-100，Taq DNA聚合酶所用的反應液的組成包括10mM Tris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、400μM dATP、d CTP、dGTP、dTTP。制備50μl含有5.0 ng/50μl λ-DNA(寶酒造社生產)、10pmol/50μl引物λ1和引物λ11、3.7單位/50μl DNA聚合酶的反應液。引物λ1和引物λ11的堿基序列分別表示在序列表的序列號8和序列號9中。上述反應液按每循環98℃、10秒～68℃、10分鐘進行30個循環的PCR反應，然后取5μl反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙啶染色來確認擴增的DNA片段。結果證明，在使用Taq DNA聚合酶時沒有發現DNA片段的擴增，而用本發明的DNA聚合酶時，有約20千堿基對的DNA片段的擴增。
接著，將引物變為引物λ1和引物λ10進行實驗。引物λ10的堿基序列在序列表的序列號10中表示。按上面同樣的反應液組成，制備25μl含有2.5 ng的λ-DNA、10 pmol的引物λ1和引物λ10、3.7單位的DNA聚合酶的反應液。按上面同樣的反應條件進行5個循環的反應，取5μl反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙啶進行染色。結果證明，在使用Taq DNA聚合酶時沒有發現特異性擴增，而用發明的DNA聚合酶擴增了約15千堿基對的DNA片段。
實施例5(1)用于單獨ORF3翻譯產物表達的質粒的構建以通過將實施例2中記載的質粒pFU1002(在該載體上ORF1-6位于載體上的lac啟動子的下游)中插入DNA片段中ORF3的緊鄰下游部分缺失而制備的突變體質粒6-82為模板，用引物M4(寶酒造社生產)及堿基序列示于序列表的序列號11的引物NO3進行PCR反應。并在PCR反應中使用DNA聚合酶的合成反應正確性較高的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司生產)。制備100μl含有1ng模板DNA、各25 pmol的兩種引物和2.5單位的Pfu DNA聚合酶的PCR反應液[20 mM Tris-鹽酸、pH8.2、10mM KCl、20mM MgCl2、6mM(NH4)2SO4、0.2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、1％Triton X-100、0.01％小牛血清白蛋白]，以每循環94℃、0.5分鐘～55°、0.5分鐘～72℃、2分鐘進行25個循環的PCR反應。所擴增的約2千堿基對的DNA片段用NcoI、SphI(均為寶酒造社生產)消化，然后整合到pTV118N載體(寶酒造社生產)的NcoI-SphI位點間，制備質粒pFU-ORF3。該質粒的插入DNA片段中含有可翻譯的單獨的ORF3。(2)用于單獨ORF4翻譯產物表達的質粒的構建以通過將上述質粒pFU1002中的插入DNA片段中ORF4中央部分的下游部分缺失而制備的突變體質粒6-2為模板，用引物M4及堿基序列示于序列表的序列號12的引物NO4進行PCR反應。除模板DNA變為質粒6-2、引物NO3變為NO4外，按上述實施例5(1)相同的條件進行反應。所擴增的DNA片段用NcoI、NheI(寶酒造社生產)消化，獲得約1.6千堿基對的DNA片段，將此片段與由上述質粒pFU1002中分離的約3.3千堿基對的NheI-Sal片段(含有ORF4的后半部分)一起重組到pET15b載體(Novagen公司生產)的NcoI-XhoI位點間，制備質粒pFU-ORF4。該質粒的插入DNA片段中含有可翻譯的單獨的ORF4。(3)由ORF3、ORF4的翻譯產物重新組成DNA聚合酶分別培養用上述質粒pFU-ORF3轉化大腸桿菌JM109所得到的Escherichia coli JM109/pFU-ORF3及用上述質粒pFU-ORF4轉化大腸桿菌HMS174所得到的Escherichia coli HMS174/pFU-ORF4，純化菌體中表達的兩種ORF的翻譯產物。轉化子的培養及粗抽提物的制備按實施例3中記載的方法進行。而兩種翻譯產物的純化用RESOURCEQ、Hitrap Heparin、Superose 6等柱進行，并用SDS-PAGE上翻譯產物的表現進行確定。已經確認，雖然這樣純化的兩種ORF翻譯產物單獨都不顯示DNA聚合酶活性，但將2者混合時，能表現出耐熱性DNA聚合酶活性。
工業上的利用可能性本發明提供具有高的引物延伸活性和3’→5’外切核酸酶活性的新型DNA聚合酶。該酶適用于PCR方法，在遺傳工程研究中非常有用。而且該酶可通過遺傳工程的方法用編碼本發明的DNA聚合酶的基因進行生產。序列表序列號1序列長度613序列類型氨基酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類多肽序列Met Asp Glu Phe Val Lys Ser Leu Leu Lys Ala Asn Tyr Leu Ile5 10 15Thr Pro Ser Ala Tyr Tyr Leu Leu Arg Glu Tyr Tyr Glu Lys Gly20 25 30Glu Phe Ser Ile Val Glu Leu Val Lys Phe Ala Arg Ser Arg Glu35 40 45Ser Tyr Ile Ile Thr Asp Ala Leu Ala Thr Glu Phe Leu Lys Val50 55 60Lys Gly Leu Glu Pro Ile Leu Pro Val Glu Thr Lys Gly Gly Phe65 70 75Val Ser Thr Gly Glu Ser Gln Lys Glu Gln Ser Tyr Glu Glu Ser80 85 90Phe Gly Thr Lys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Ile Lys Glu Gly Glu95 100 105Ser Phe Ile Ser Thr Gly Ser Glu Pro Leu Glu Glu Glu Leu Asn110 115 120Ser Ile Gly Ile Glu Glu Ile Gly Ala Asn Glu Glu Leu Val Ser125 130 135Asn Gly Asn Asp Asn Gly Gly Glu Ala Ile Val Phe Asp Lys Tyr140 145 150Gly Tyr Pro Met Val Tyr Ala Pro Glu Glu Ile Glu Val Glu Glu155 160 165Lys Glu Tyr Ser Lys Tyr Glu Asp Leu Thr Ile Pro Met Asn Pro170 175 180Asp Phe Asn Tyr Val Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Asp Val Val Phe185 190 195Asp Val Arg Asn Val Lys Leu Lys Pro Pro Lys Val Lys Asn Gly200 205 210Asn Gly Lys Glu Gly Glu Ile Ile Val Glu Ala Tyr Ala Ser Leu215 220 225Phe Arg Ser Arg Leu Lys Lys Leu Arg Lys Ile Leu Arg Glu Asn230 235 240Pro Glu Leu Asp Asn Val Val Asp Ile Gly Lys Leu Lys Tyr Val245 250 255Lys Glu Asp Glu Thr Val Thr Ile Ile Gly Leu Val Asn Ser Lys260 265 270Arg Glu Val Asn Lys Gly Leu Ile Phe Glu Ile Glu Asp Leu Thr275 280 285Gly Lys Val Lys Val Phe Leu Pro Lys Asp Ser Glu Asp Tyr Arg290 295 300Glu Ala Phe Lys Val Leu Pro Asp Ala Val Val Ala Phe Lys Gly305 310 315Val Tyr Ser Lys Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Asn Lys Phe Tyr Leu320 325 330Pro Asp Val Pro Leu Tyr Arg Arg Gln Lys Pro Pro Leu Glu Glu335 340 345Lys Val Tyr Ala Ile Leu Ile Ser Asp Ile His Val Gly Ser Lys350 355 360Glu Phe Cys Glu Asn Ala Phe Ile Lys Phe Leu Glu Trp Leu Asn365 370 375Gly Asn Val Glu Thr Lys Glu Glu Glu Glu Ile Val Ser Arg Val380 385 390Lys Tyr Leu Ile Ile Ala Gly Asp Val Val Asp Gly Val Gly Val395 400 405Tyr Pro Gly Gln Tyr Ala Asp Leu Thr Ile Pro Asp Ile Phe Asp410 415 420Gln Tyr Glu Ala Leu Ala Asn Leu Leu Ser His Val Pro Lys His425 430 435Ile Thr Met Phe Ile Ala Pro Gly Asn His Asp Ala Ala Arg Gln440 445 450Ala Ile Pro Gln Pro Glu Phe Tyr Lys Glu Tyr Ala Lys Pro Ile455 460 465Tyr Lys Leu Lys Asn Ala Val Ile Ile Ser Asn Pro Ala Val Ile470 475 480Arg Leu His Gly Arg Asp Phe Leu Ile Ala His Gly Arg Gly Ile485 490 495Glu Asp Val Val Gly Ser Val Pro Gly Leu Thr His His Lys Pro500 505 510Gly Leu Pro Met Val Glu Leu Leu Lys Met Arg His Val Ala Pro515 520 525Met Phe Gly Gly Lys Val Pro Ile Ala Pro Asp Pro Glu Asp Leu530 535 540Leu Val Ile Glu Glu Val Pro Asp Val Val His Met Gly His Val545 550 555His Val Tyr Asp Ala Val Val Tyr Arg Gly Val Gln Leu Val Asn560 565 570Ser Ala Thr Trp Gln Ala Gln Thr Glu Phe Gln Lys Met Val Asn575 580 585Ile Val Pro Thr Pro Ala Lys Val Pra Val Val Asp Ile Asp Thr590 595 600Ala Lys Val Val Lys Val Leu Asp Phe Ser Gly Trp Cys605 610序列號2序列長度1839序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲構型直鏈型序列種類基因組DNA序列ATGGATGAAT TTGTAAAATC ACTTCTAAAA GCTAACTATC TAATAACTCC CTCTGCCTAC 60TATCTCTTGA GAGAATACTA TGAAAAAGGT GAATTCTCAA TTGTGGAGCT GGTAAAATTT 120GCAAGATCAA GAGAGAGCTA CATAATTACT GATGCTTTAG CAACAGAATT CCTTAAAGTT 180AAAGGCCTTG AACCAATTCT TCCAGTGGAA ACAAAGGGGG GTTTTGTTTC CACTGGAGAG 240TCCCAAAAAG AGCAGTCTTA TGAAGAGTCT TTTGGGACTA AAGAAGAAAT TTCCCAGGAG 300ATTAAAGAAG GAGAGAGTTT TATTTCCACT GGAAGTGAAC CACTTGAAGA GGAGCTCAAT 360AGCATTGGAA TTGAGGAAAT TGGGGCAAAT GAAGAGTTAG TTTCTAATGG AAATGACAAT 420GGTGGAGAGG CAATTGTCTT TGACAAATAT GGCTATCCAA TGGTATATGC TCCAGAAGAA 480ATAGAGGTTG ACGAGAAGGA GTACTCGAAG TATGAAGATC TGACAATACC CATGAACCCC 540GACTTCAATT ATGTGGAAAT AAAGGAAGAT TATGATGTTG TCTTCGATGT TAGGAATGTA 600AAGCTGAAGC CTCCTAAGGT AAAGAACGGT AATGGGAAGG AAGGTGAAAT AATTGTTGAA 660GCTTATGCTT CTCTCTTCAG GAGTAGGTTG AAGAAGTTAA GGAAAATACT AAGGGAAAAT 720CCTGAATTGG ACAATGTTGT TGATATTGGG AAGCTGAAGT ATGTGAAGGA AGATGAAACC 780GTGACAATAA TAGGGCTTGT CAATTCCAAG AGGGAAGTGA ATAAAGGATT GATATTTGAA 840ATAGAAGATC TCACAGGAAA GGTTAAAGTT TTCTTGCCGA AAGATTCGGA AGATTATAGG 900GAGGCATTTA AGGTTCTTCC AGATGCCGTC GTCGCTTTTA AGGGGGTGTA TTCAAAGAGG 960GGAATTTTGT ACGCCAACAA CTTTTACCTT CCAGACGTTC CCCTCTATAG GAGACAAAAG 1020CCTCCACTGG AAGAGAAAGT TTATGCTATT CTCATAAGTG ATATACACGT CGGAAGTAAA 1080GAGTTCTGCG AAAATGCCTT CATAAAGTTC TTAGAGTGGC TCAATGGAAA CGTTGAAACT 1140AAGGAAGAGG AAGAAATCGT GAGTAGGGTT AAGTATCTAA TCATTGCAGG AGATGTTGTT 1200GATGGTGTTG GCGTTTATCC GGGCCAGTAT GCCGACTTGA CGATTCCAGA TATATTCGAC 1260CAGTATGAGG CCCTCGCAAA CCTTCTCTCT CACGTTCCTA AGCACATAAC AATGTTCATT 1320GCCCCAGGAA ACCACGATGC TGCTAGGCAA GCTATTCCCC AACCAGAATT CTACAAAGAG 1380TATGCAAAAC CTATATACAA GCTCAAGAAC GCCGTGATAA TAAGCAATCC TGCTGTAATA 1440AGACTACATG GTAGGGACTT TCTGATAGCT CATGGTAGGG GGATAGAGGA TGTCGTTGGA 1500AGTGTTCCTG GGTTGACCCA TCACAAGCCC GGCCTCCCAA TGGTTGAACT ATTGAAGATG 1560AGGCATGTAG CTCCAATGTT TGGAGGAAAG GTTCCAATAG CTCCTGATCC AGAAGATTTG 1620CTTGTTATAG AAGAAGTTCC TGATGTAGTT CACATGGGTC ACGTTCACGT TTACGATGCG 1680GTAGTTTATA GGGGAGTTCA GCTGGTTAAC TCCGCCACCT GGCAGGCTCA GACCGAGTTC 1740CAGAAGATGG TGAACATAGT TCCAACGCCT GCAAAGGTTC CCGTTGTTGA TATTGATACT 1800GCAAAAGTTG TCAAGGTTTT GGACTTTAGT GGGTGGTGC 1839序列號3序列長度1263序列類型氨基酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類多肽序列Met Glu Leu Pro Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Phe Glu Met Leu Gln5 10 15Arg Glu Ile Asp Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Lys Ala Arg Ser20 25 30Gln Gly Lys Asp Pro Ser Thr Asp Val Glu Ile Pro Gln Ala Thr35 40 45Asp Met Ala Gly Arg Val Glu Ser Leu Val Gly Pro Pro Gly Val50 55 60Ala Gln Arg Ile Arg Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Asp Lys Glu Ile65 70 75Val Ala Leu Lys Ile Val Asp Glu Ile Ile Glu Gly Lys Phe Gly80 85 90Asp Phe Gly Ser Lys Glu Lys Tyr Ala Glu Gln Ala Val Arg Thr95 100 105Ala Leu Ala Ile Leu Thr Glu Gly Ile Val Ser Ala Pro Leu Glu110 115 120Gly Ile Ala Asp Val Lys Ile Lys Arg Asn Thr Trp Ala Asp Asn125 130 135Ser Glu Tyr Leu Ala Leu Tyr Tyr Ala Gly Pro Ile Arg Ser Ser
140 145 150Gly Gly Thr Ala Gln Ala Leu Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Val155 160 165Arg Arg Lys Leu Gly Leu Asp Arg Phe Lys Pro Ser Gly Lys His170 175 180Ile Glu Arg Met Val Glu Glu Val Asp Leu Tyr His Arg Ala Val185 190 195Ser Arg Leu Gln Tyr His Pro Ser Pro Asp Glu Val Arg Leu Ala200 205 210Met Arg Asn Ile Pro Ile Glu Ile Thr Gly Glu Ala Thr Asp Asp215 220 225Val Glu Val Ser His Arg Asp Val Glu Gly Val Glu Thr Asn Gln230 235 240Leu Arg Gly Gly Ala Ile Leu Val Leu Ala Glu Gly Val Leu Gln245 250 255Lys Ala Lys Lys Leu Val Lys Tyr Ile Asp Lys Met Gly Ile Asp260 265 270Gly Trp Glu Trp Leu Lys Glu Phe Val Glu Ala Lys Glu Lys Gly275 280 285Glu Glu Ile Glu Glu Ser Glu Ser Lys Ala Glu Glu Ser Lys Val290 295 300Glu Thr Arg Val Glu Val Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Lys Leu Tyr305 310 315Glu Lys Phe Arg Ala Glu Ile Ala Pro Ser Glu Lys Tyr Ala Lys320 325 330Glu Ile Ile Gly Gly Arg Pro Leu Phe Ala Gly Pro Ser Glu Asn
335 340 345Gly Gly Phe Arg Leu Arg Tyr Gly Arg Ser Arg Val Ser Gly Phe350 355 360Ala Thr Trp Ser Ile Asn Pro Ala Thr Met Val Leu Val Asp Glu365 370 375Phe Leu Ala Ile Gly Thr Gln Met Lys Thr Glu Arg Pro Gly Lys380 385 390Gly Ala Val Val Thr Pro Ala Thr Thr Ala Glu Gly Pro Ile Val395 400 405Lys Leu Lys Asp Gly Ser Val Val Arg Val Asp Asp Tyr Asn Leu410 415 420Ala Leu Lys Ile Arg Asp Glu Val Glu Glu Ile Leu Tyr Leu Gly425 430 435Asp Ala Ile Ile Ala Phe Gly Asp Phe Val Glu Asn Asn Gln Thr440 445 450Leu Leu Pro Ala Asn Tyr Val Glu Glu Trp Trp Ile Gln Glu Phe455 460 465Val Lys Ala Val Asn Glu Ala Tyr Glu Val Glu Leu Arg Pro Phe470 475 480Glu Glu Asn Pro Arg Glu Ser Val Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Leu485 490 495Glu Val Asp Pro Glu Phe Leu Ala Lys Met Leu Tyr Asp Pro Leu500 505 510Arg Val Lys Pro Pro Val Glu Leu Ala Ile His Phe Ser Glu Ile515 520 525Leu Glu Ile Pro Leu His Pro Tyr Tyr Thr Leu Tyr Trp Asn Thr
530 535 540Val Asn Pro Lys Asp Val Glu Arg Leu Trp Gly Val Leu Lys Asp545 550 555Lys Ala Thr Ile Glu Trp Gly Thr Phe Arg Gly Ile Lys Phe Ala560 565 570Lys Lys Ile Glu Ile Ser Leu Asp Asp Leu Gly Ser Leu Lys Arg575 580 585Thr Leu Glu Leu Leu Gly Leu Pro His Thr Val Arg Glu Gly Ile590 595 600Val Val Val Asp Tyr Pro Trp Ser Ala Ala Leu Leu Thr Pro Leu605 610 615Gly Asn Leu Glu Trp Glu Phe Lys Ala Lys Pro Phe Tyr Thr Val620 625 630Ile Asp Ile Ile Asn Glu Asn Asn Gln Ile Lys Leu Arg Asp Arg635 640 645Gly Ile Ser Trp Ile Gly Ala Arg Met Gly Arg Pro Glu Lys Ala650 655 660Lys Glu Arg Lys Met Lys Pro Pro Val Gln Val Leu Phe Pro Ile665 670 675Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Lys Lys Ala Ala Glu680 685 690Glu Gly Lys Ile Ala Glu Val Glu Ile Ala Phe Phe Lys Cys Pro695 700 705Lys Cys Gly His Val Gly Pro Glu Thr Leu Cys Pro Glu Cys Gly710 715 720Ile Arg Lys Glu Leu Ile Trp Thr Cys Pro Lys Cys Gly Ala Glu
725 730 735Tyr Thr Asn Ser Gln Ala Glu Gly Tyr Ser Tyr Ser Cys Pro Lys740 745 750Cys Asn Val Lys Leu Lys Pro Phe Thr Lys Arg Lys Ile Lys Pro755 760 765Ser Glu Leu Leu Asn Arg Ala Met Glu Asn Val Lys Val Tyr Gly770 775 780Val Asp Lys Leu Lys Gly Val Met Gly Met Thr Ser Gly Trp Lys785 790 795Ile Ala Glu Pro Leu Glu Lys Gly Leu Leu Arg Ala Lys Asn Glu800 805 810Val Tyr Val Phe Lys Asp Gly Thr Ile Arg Phe Asp Ala Thr Asp815 820 825Ala Pro Ile Thr His Phe Arg Pro Arg Glu Ile Gly Val Ser Val830 835 840Glu Lys Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Thr His Asp Phe Glu Gly Lys845 850 855Pro Leu Val Ser Glu Asp Gln Ile Val Glu Leu Lys Pro Gln Asp860 865 870Val Ile Leu Ser Lys Glu Ala Gly Lys Tyr Leu Leu Arg Val Ala875 880 885Arg Phe Val Asp Asp Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu Pro Arg890 895 900Phe Tyr Asn Ala Glu Lys Met Glu Asp Leu Ile Gly His Leu Val905 910 915Ile Gly Leu Ala Pro His Thr Ser Ala Gly Ile Val Gly Arg Ile
920 925 930Ile Gly Phe Val Asp Ala Leu Val Gly Tyr Ala His Pro Tyr Phe935 940 945His Ala Ala Lys Arg Arg Asn Cys Asp Gly Asp Glu Asp Ser Val950 955 960Met Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Asn Phe Ser Arg Tyr Tyr Leu965 970 975Pro Glu Lys Arg Gly Gly Lys Met Asp Ala Pro Leu Val Ile Thr980 985 990Thr Arg Leu Asp Pro Arg Glu Val Asp Ser Glu Val His Asn Met99510001005Asp Val Val Arg Tyr Tyr Pro Leu Glu Phe Tyr Glu Ala Thr Tyr101010151020Glu Leu Lys Ser Pro Lys Glu Leu Val Arg Val Ile Glu Gly Val102510301035Glu Asp Arg Leu Gly Lys Pro Glu Met Tyr Tyr Gly Ile Lys Phe104010451050Thr His Asp Thr Asp Asp Ile Ala Leu Gly Pro Lys Met Ser Leu105510601065Tyr Lys Gln Leu Gly Asp Met Glu Glu Lys Val Lys Arg Gln Leu107010751080Thr Leu Ala Glu Arg Ile Arg Ala Val Asp Gln His Tyr Val Ala108510901095Glu Thr Ile Leu Asn Ser His Leu Ile Pro Asp Leu Arg Gly Asn110011051110Leu Arg Ser Phe Thr Arg Gln Glu Phe Arg Cys Val Lys Cys Asn
111511201125Thr Lys Tyr Arg Arg Pro Pro Leu Asp Gly Lys Cys Pro Val Cys113011351140Gly Gly Lys Ile Val Leu Thr Val Ser Lys Gly Ala Ile Glu Lys114511501155Tyr Leu Gly Thr Ala Lys Met Leu Val Ala Asn Tyr Asn Val Lys116011651170Pro Tyr Thr Arg Gln Arg Ile Cys Leu Thr Glu Lys Asp Ile Asp117511801185Ser Leu Phe Glu Tyr Leu Phe Pro Glu Ala Gln Leu Thr Leu Ile119011951200Val Asp Pro Asn Asp Ile Cys Met Lys Met Ile Lys Glu Arg Thr120512101215Gly Glu Thr Val Gln Gly Gly Leu Leu Glu Asn Phe Asn Ser Ser122012251230Gly Asn Asn Gly Lys Lys Ile Glu Lys Lys Glu Lys Lys Ala Lys123512401245Glu Lys Pro Lys Lys Lys Lys Val Ile Ser Leu Asp Asp Phe Phe125012551260Ser Lys Arg序列號4序列長度3789序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲構型直鏈型序列種類基因組DNA序列ATGGAGCTTC CAAAGGAAAT TGAGGAGTAT TTTGAGATGC TTCAAAGGGA AATTGACAAA60GCTTACGAGA TTGCTAAGAA GGCTAGGAGT CAGGGTAAAG ACCCCTCAAC CGATGTTGAG 120ATTCCCCAGG CTACAGACAT GGCTGGAAGA GTTGAGAGCT TAGTTGGCCC TCCCGGAGTT 180GCTCAGAGAA TTAGGGAGCT TTTAAAAGAG TATGATAAGG AAATTGTTGC TTTAAAGATA 240GTTGATGAGA TAATTGAGGG CAAATTTGGT GATTTTGGAA GTAAAGAGAA GTACGCTGAA 300CAGGCTGTAA GGACAGCCTT GGCAATATTA ACTGAGGGTA TTGTTTCTGC TCCACTTGAG 360GGTATAGCTG ATGTTAAAAT CAAGCGAAAC ACCTGGGCTG ATAACTCTGA ATACCTCGCC 420CTTTACTATG CTGGGCCAAT TAGGAGTTCT GGTGGAACTG CTCAAGCTCT CAGTGTACTT 480GTTGGTGATT ACGTTAGGCG AAAGCTTGGC CTTGATAGGT TTAAGCCAAG TGGGAAGCAT 540ATAGAGAGAA TGGTTGAGGA AGTTGACCTC TATCATAGAG CTGTTTCAAG GCTTCAATAT 600CATCCCTCAC CTGATGAAGT GAGATTAGCA ATGAGGAATA TTCCCATAGA AATCACTGGT 660GAAGCCACTG ACGATGTGGA GGTTTCCCAT AGAGATGTAG AGGGAGTTGA GACAAATCAG 720CTGAGAGGAG GAGCGATCCT AGTTTTGGCG GAGGGTGTTC TCCAGAAGGC TAAAAAGCTC 780GTGAAATACA TTGACAAGAT GGGGATTGAT GGATGGGAGT GGCTTAAAGA GTTTGTAGAG 840GCTAAAGAAA AAGGTGAAGA AATCGAAGAG AGTGAAAGTA AAGCCGAGGA GTCAAAAGTT 900GAAACAAGGG TGGAGGTAGA GAAGGGATTC TACTACAAGC TCTATGAGAA ATTTAGGGCT 960GAGATTGCCC CAAGCGAAAA GTATGCAAAG GAAATAATTG GTGGGAGGCC GTTATTCGCT 1020GGACCCTCGG AAAATGGGGG ATTTAGGCTT AGATATGGTA GAAGTAGGGT GAGTGGATTT 1080GCAACATGGA GCATAAATCC AGCAACAATG GTTTTGGTTG ACGAGTTCTT GGCCATTGGA 1140ACTCAAATGA AAACCGAGAG GCCTGGGAAA GGTGCAGTAG TGACTCCAGC AACAACCGCT 1200GAAGGGCCGA TTGTTAAGCT AAAGGATGGG AGTGTTGTTA GGGTTGATGA TTACAACTTG 1260GCCCTCAAAA TAAGGGATGA AGTCGAAGAG ATACTTTATT TGGGAGATGC AATCATAGCC 1320TTTGGAGACT TTGTGGAGAA CAATCAAACT CTCCTTCCTG CAAACTATGT AGAGGAGTGG 1380TGGATCCAAG AGTTCGTAAA GGCCGTTAAT GAGGCATATG AAGTTGAGCT TAGACCCTTT 1440GAGGAAAATC CCAGGGAGAG CGTTGAGGAA GCAGCAGAGT ACCTTGAAGT TGACCCAGAA 1500TTCTTGGCTA AGATGCTTTA CGATCCTCTA AGGGTTAAGC CTCCCGTGGA GCTAGCCATA 1560CACTTCTCGG AAATCCTGGA AATTCCTCTC CACCCATACT ACACCCTTTA TTGGAATACT 1620GTAAATCCTA AAGATGTTGA AAGACTTTGG GGAGTATTAA AAGACAAGGC CACCATAGAA 1680TGGGGCACTT TCAGAGGTAT AAAGTTTGCA AAGAAAATTG AAATTAGCCT GGACGACCTG 1740GGAAGTCTTA AGAGAACCCT AGAGCTCCTG GGACTTCCTC ATACGGTAAG AGAAGGGATT 1800GTAGTGGTTG ATTATCCGTG GAGTGCAGCT CTTCTCACTC CATTGGGCAA TCTTGAATGG 1860GAGTTTAAGG CCAAGCCCTT CTACACTGTA ATAGACATCA TTAACGAGAA CAATCAGATA 1920AAGCTCAGGG ACAGGGGAAT AAGCTGGATA GGGGCAAGAA TGGGAAGGCC AGAGAAGGCA 1980AAAGAAAGAA AAATGAAGCC ACCTGTTCAA GTCCTCTTCC CAATTGGCTT GGCAGGGGGT 2040TCTAGCAGAG ATATAAAGAA GGCTGCTGAA GAGGGAAAAA TAGCTGAAGT TGAGATTGCT 2100TTCTTCAAGT GTCCGAAGTG TGGCCATGTA GGGCCTGAAA CTCTCTGTCC CGAGTGTGGG 2160ATTAGGAAAG AGTTGATATG GACATGTCCC AAGTGTGGGG CTGAATACAC CAATTCCCAG 2220GCTGAGGGGT ACTCGTATTC ATGTCCAAAG TGCAATGTGA AGCTAAAGCC ATTCACAAAG 2280AGGAAGATAA AGCCCTCAGA GCTCTTAAAC AGGGCCATGG AAAACGTGAA GGTTTATGGA 2340GTTGACAAGC TTAAGGGCGT AATGGGAATG ACTTCTGGCT GGAAGATTGC AGAGCCGCTG 2400GAGAAAGGTC TTTTGAGAGC AAAAAATGAA GTTTACGTCT TTAAGGATGG AACCATAAGA 2460TTTGATGCCA CAGATGCTCC AATAACTCAC TTTAGGCCTA GGGAGATAGG AGTTTCAGTG 2520GAAAAGCTGA GAGAGCTTGG CTACACCCAT GACTTCGAAG GGAAACCTCT GGTGAGTGAA 2580GACCAGATAG TTGAGCTTAA GCCCCAAGAT GTAATCCTCT CAAAGGAGGC TGGCAAGTAC 2640CTCTTAAGAG TGGCCAGGTT TGTTGATGAT CTTCTTGAGA AGTTCTACGG ACTTCCCAGG 2700TTCTACAACG CCGAAAAAAT GGAGGATTTA ATTGGTCACC TAGTGATAGG ATTGGCCCCT 2760CACACTTCAG CCGGAATCGT GGGGAGGATA ATAGGCTTTG TAGATGCTCT GGTTGGCTAC 2820GCTCACCCCT ACTTCCATGC GGCCAAGAGA AGGAACTGTG ATGGAGATGA GGATAGTGTA 2880ATGCTACTCC TTGATGCCCT ATTGAACTTC TCCAGATACT ACCTCCCCGA AAAAAGAGGA 2940GGAAAAATGG ACGCTCCTCT TGTCATAACC ACGAGGCTTG ATCCAAGAGA GGTGGACAGT 3000GAAGTGCACA ACATGGATGT CGTTAGATAC TATCCATTAG AGTTCTATGA AGCAACTTAC 3060GAGCTTAAAT CACCAAAGGA ACTTGTGAGA GTTATAGAGG GAGTTGAAGA TAGATTAGGA 3120AAGCCTGAAA TGTATTACGG AATAAAGTTC ACCCACGATA CCGACGACAT AGCTCTAGGA 3180CCAAAGATGA GCCTCTACAA GCAGTTGGGA GATATGGAGG AGAAAGTGAA GAGGCAATTG 3240ACATTGGCAG AGAGAATTAG AGCTGTGGAT CAACACTATG TTGCTGAAAC AATCCTCAAC 3300TCCCACTTAA TTCCCGACTT GAGGGGTAAC CTAAGGAGCT TTACTAGACA AGAATTTCGC 3360TGTGTGAAGT GTAACACAAA GTACAGAAGG CCGCCCTTGG ATGGAAAATG CCCAGTCTGT 3420GGAGGAAAGA TAGTGCTGAC AGTTAGCAAA GGAGCCATTG AAAAGTACTT GGGGACTGCC 3480AAGATGCTCG TAGCTAACTA CAACGTAAAG CCATATACAA GGCAGAGAAT ATGCTTGACG 3540GAGAAGGATA TTGATTCACT CTTTGAGTAC TTATTCCCAG AAGCCCAGTT AACGCTCATT 3600GTAGATCCAA ACGACATCTG TATGAAAATG ATCAAGGAAA GAACGGGGGA AACAGTTCAA 3660GGAGGCCTGC TTGAGAACTT TAATTCCTCT GGAAATAATG GGAAGAAAAT AGAGAAGAAG 3720GAGAAAAAGG CAAAGGAAAA GCCTAAAAAG AAGAAAGTTA TAAGCTTGGA CGACTTCTTC 3780TCCAAACGC 3789序列號5序列長度8450序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲構型直鏈型序列種類基因組DNA序列CATAACTAAA TTATTACATT TAGTTATATG GATGGGGGAA AAATTAACAA CATGTGTTAT 60GTTTCCTCTG GAAAATTGAT CTATAATAAT CTAGGAGCAC AATTTCCAAT GGAGGGTCAT 120CAATGAACGA AGGTGAACAT CAAATAAAGC TTGACGACCT ATTCGAAAAG TTGCTCCGAG 180CTAGGAAGAT ATTCAAAAAC AAAGATGTCC TTAGGCATAG CTATACTCCC AAGGATCTAC240CTCACAGACA TGAGCAAATA GAAACTCTCG CCCAAATTTT AGTACCAGTT CTCAGAGGAG300AAACTCCATC AAACATATTC GTTTATGGGA AGACTGGAAC TGGAAAGACT GTAACTGTAA360AATTTGTAAC TGAAGAGCTG AAAAGAATAT CTGAAAAATA CAACATTCCA GTTGATGTGA420TCTACATTAA TTGTGAGATT GTCGATACTC ACTATAGAGT TCTTGCTAAC ATAGTTAACT480ACTTCAAAGA TGAGACTGGG ATTGAAGTTC CAATGGTAGG TTGGCCTACC GATGAAGTTT540ACGCAAAGCT TAAGCAGGTT ATAGATATGA AGGAGAGGTT TGTGATAATT GTGTTGGATG600AAATTGACAA GTGGTAAAGA AGAGTGGTGA TGAGGTTCTC TATTCATTAA CAAGAATAAA660TACTGAACTT AAAAGGGCTA AAGTGAGTGT AATTGGTATA TCAAACGACC TTAAATTTAA720AGAGTATCTA GATCCAAGAG TTCTCTCAAG TTTGAGTGAG GAAGAGGTGG TATTCCCACC780CTATGATGCA AATCAGCTTA GGGATATACT GACCCAAAGA GCTGAAGAGG CCTTTTATCC840TGGGGTTTTA GACGAAGGTG TGATTCCCCT CTGTGCAGCA TTAGCTGCTA GAGAGCATGG900AGATGCAAGA AAGGCACTTG ACCTTCTAAG AGTTGCAGGG GAAATAGCGG AAAGAGAAGG960GGCAAGTAAA GTAACTGAAA AGCATGTTTG GAAAGCCCAG GAAAAGATTG AACAGGACAT 1020GATGGAGGAG GTAATAAAAA CTCTACCCCT TCAGTCAAAA GTTCTCCTCT ATGCCATAGT 1080TCTTTTGGAC GAAAACGGCG ATTTACCAGC AAATACTGGG GATGTTTACG CTGTTTATAG 1140GGAATTGTGC GAGTACATTG ACTTGGAACC TCTCACCCAA AGAAGGATAA GTGATCTAAT 1200TAATGAGCTT GACATGCTTG GAATAATAAA TGCAAAAGTT GTTAGTAAGG GGAGATATGG 1260GAGGACAAAG GAAATAAGGC TTAACGTTAC CTCATATAAG ATAAGAAATG TGCTGAGATA 1320TGATTACTCT ATTCAGCCCC TCCTCACAAT TTCCCTTAAG AGTGAGCAGA GGAGGTTGAT 1380CTAATGGATG AATTTGTAAA ATCACTTCTA AAAGCTAACT ATCTAATAAC TCCCTCTGCC 1440TACTATCTCT TGAGAGAATA CTATGAAAAA GGTGAATTCT CAATTGTGGA GCTGGTAAAA 1500TTTGCAAGAT CAAGAGAGAG CTACATAATT ACTGATGCTT TAGCAACAGA ATTCCTTAAA 1560GTTAAAGGCC TTGAACCAAT TCTTCCAGTG GAAACAAAGG GGGGTTTTGT TTCCACTGGA 1620GAGTCCCAAA AAGAGCAGTC TTATGAAGAG TCTTTTGGGA CTAAAGAAGA AATTTCCCAG 1680GAGATTAAAG AAGGAGAGAG TTTTATTTCC ACTGGAAGTG AACCACTTGA AGAGGAGCTC 1740AATAGCATTG GAATTGAGGA AATTGGGGCA AATGAAGAGT TAGTTTCTAA TGGAAATGAC 1800AATGGTGGAG AGGCAATTGT CTTTGACAAA TATGGCTATC CAATGGTATA TGCTCCAGAA 1860GAAATAGAGG TTGAGGAGAA GGAGTACTCG AAGTATGAAG ATCTGACAAT ACCCATGAAC 1920CCCGACTTCA ATTATGTGGA AATAAAGGAA GATTATGATG TTGTCTTCGA TGTTAGGAAT 1980GTAAAGCTGA AGCCTCCTAA GGTAAAGAAC GGTAATGGGA AGGAAGGTGA AATAATTGTT 2040GAAGCTTATG CTTCTCTCTT CAGGAGTAGG TTGAAGAAGT TAAGGAAAAT ACTAAGGGAA 2100AATCCTGAAT TGGACAATGT TGTTGATATT GGGAAGCTGA AGTATGTGAA GGAAGATGAA 2160ACCGTGACAA TAATAGGGCT TGTCAATTCC AAGAGGGAAG TGAATAAAGG ATTGATATTT 2220GAAATAGAAG ATCTCACAGG AAAGGTTAAA GTTTTCTTGC CGAAAGATTC GGAAGATTAT 2280AGGGAGGCAT TTAAGGTTCT TCCAGATGCC GTCGTCGCTT TTAAGGGGGT GTATTCAAAG 2340AGGGGAATTT TGTACGCCAA CAAGTTTTAC CTTCCAGACG TTCCCCTCTA TAGGAGACAA 2400AAGCCTCCAC TGGAAGAGAA AGTTTATGCT ATTCTCATAA GTGATATACA CGTCGGAAGT 2460AAAGAGTTCT GCGAAAATGC CTTCATAAAG TTCTTAGAGT GGCTCAATGG AAACGTTGAA 2520ACTAAGGAAG AGGAAGAAAT CGTGAGTAGG GTTAAGTATC TAATCATTGC AGGAGATGTT 2580GTTGATGGTG TTGGCGTTTA TCCGGGCCAG TATGCCGACT TGACGATTCC AGATATATTC 2640GACCAGTATG AGGCCCTCGC AAACCTTCTC TCTCACGTTC CTAAGCACAT AACAATGTTC 2700ATTGCCCCAG GAAACCACGA TGCTGCTAGG CAAGCTATTC CCCAACCAGA ATTCTACAAA 2760GAGTATGCAA AACCTATATA CAAGCTCAAG AACGCCGTGA TAATAAGCAA TCCTGCTGTA 2820ATAAGACTAC ATGGTAGGGA CTTTCTGATA GCTCATGGTA GGGGGATAGA GGATGTCGTT 2880GGAAGTGTTC CTGGGTTGAC CCATCACAAG CCCGGCCTCC CAATGGTTGA ACTATTGAAG 2940ATGAGGCATG TAGCTCCAAT GTTTGGAGGA AAGGTTCCAA TAGCTCCTGA TCCAGAAGAT 3000TTGCTTGTTA TAGAAGAAGT TCCTGATGTA GTTCACATGG GTCACGTTCA CGTTTACGAT 3060GCGGTAGTTT ATAGGGGAGT TCAGCTGGTT AACTCCGCCA CCTGGCAGGC TCAGACCGAG 3120TTCCAGAAGA TGGTGAACAT AGTTCCAACG CCTGCAAAGG TTCCCGTTGT TGATATTGAT 3180ACTGCAAAAG TTGTCAAGGT TTTGGACTTT AGTGGGTGGT GCTGATGGAG CTTCCAAAGG 3240AAATTGAGGA GTATTTTGAG ATGCTTCAAA GGGAAATTGA CAAAGCTTAC GAGATTGCTA 3300AGAAGGCTAG GAGTCAGGGT AAAGACCCCT CAACCGATGT TGAGATTCCC CAGGCTACAG 3360ACATGGCTGG AAGAGTTGAG AGCTTAGTTG GCCCTCCCGG AGTTGCTCAG AGAATTAGGG 3420AGCTTTTAAA AGAGTATGAT AAGGAAATTG TTGCTTTAAA GATAGTTGAT GAGATAATTG 3480AGGGCAAATT TGGTGATTTT GGAAGTAAAG AGAAGTACGC TGAACAGGCT GTAAGGACAG 3540CCTTGGCAAT ATTAACTGAG GGTATTGTTT CTGCTCCACT TGAGGGTATA GCTGATGTTA 3600AAATCAAGCG AAACACCTGG GCTGATAACT CTGAATACCT CGCCCTTTAC TATGCTGGGC 3660CAATTAGGAG TTCTGGTGGA ACTGCTCAAG CTCTCAGTGT ACTTGTTGGT GATTACGTTA 3720GGCGAAAGCT TGGCCTTGAT AGGTTTAAGC CAAGTGGGAA GCATATAGAG AGAATGGTTG 3780AGGAAGTTGA CCTCTATCAT AGAGCTGTTT CAAGGCTTCA ATATCATCCC TCACCTGATG 3840AAGTGAGATT AGCAATGAGG AATATTCCCA TAGAAATCAC TGGTGAAGCC ACTGACGATG 3900TGGAGGTTTC CCATAGAGAT GTAGAGGGAG TTGAGACAAA TCAGCTGAGA GGAGGAGCGA 3960TCCTAGTTTT GGCGGAGGGT GTTCTCCAGA AGGCTAAAAA GCTCGTGAAA TACATTGACA 4020AGATGGGGAT TGATGGATGG GAGTGGCTTA AAGAGTTTGT AGAGGCTAAA GAAAAAGGTG 4080AAGAAATCGA AGAGAGTGAA AGTAAAGCCG AGGAGTCAAA AGTTGAAACA AGGGTGGAGG 4140TAGAGAAGGG ATTCTACTAC AAGCTCTATG AGAAATTTAG GGCTGAGATT GCCCCAAGCG 4200AAAAGTATGC AAAGGAAATA ATTGGTGGGA GGCCGTTATT CGCTGGACCC TCGGAAAATG 4260GGGGATTTAG GCTTAGATAT GGTAGAAGTA GGGTGAGTGG ATTTGCAACA TGGAGCATAA 4320ATCCAGCAAC AATGGTTTTG GTTGACGAGT TCTTGGCCAT TGGAACTCAA ATGAAAACCG 4380AGAGGCCTGG GAAAGGTGCA GTAGTGACTC CAGCAACAAC CGCTGAAGGG CCGATTGTTA 4440AGCTAAAGGA TGGGAGTGTT GTTAGGGTTG ATGATTACAA CTTGGCCCTC AAAATAAGGG 4500ATGAAGTCGA AGAGATACTT TATTTGGGAG ATGCAATCAT AGCCTTTGGA GACTTTGTGG 4560AGAACAATCA AACTCTCCTT CCTGCAAACT ATGTAGAGGA GTGGTGGATC CAAGAGTTCG 4620TAAAGGCCGT TAATGAGGCA TATGAAGTTG AGCTTAGACC CTTTGAGGAA AATCCCAGGG 4680AGAGCGTTGA GGAAGCAGCA GAGTACCTTG AAGTTGACCC AGAATTCTTG GCTAAGATGC 4740TTTACGATCC TCTAAGGGTT AAGCCTCCCG TGGAGCTAGC CATACACTTC TCGGAAATCC 4800TGGAAATTCC TCTCCACCCA TACTACACCC TTTATTGGAA TACTGTAAAT CCTAAAGATG 4860TTGAAAGACT TTGGGGAGTA TTAAAAGACA AGGCCACCAT AGAATGGGGC ACTTTCAGAG 4920GTATAAAGTT TGCAAAGAAA ATTGAAATTA GCCTGGACGA CCTGGGAAGT CTTAAGAGAA 4980CCCTAGAGCT CCTGGGACTT CCTCATACGG TAAGAGAAGG GATTGTAGTG GTTGATTATC 5040CGTGGAGTGC AGCTCTTCTC ACTCCATTGG GCAATCTTGA ATGGGAGTTT AAGGCCAAGC 5100CCTTCTACAC TGTAATAGAC ATCATTAACG AGAACAATCA GATAAAGCTC AGGGACAGGG 5160GAATAAGCTG GATAGGGGCA AGAATGGGAA GGCCAGAGAA GGCAAAAGAA AGAAAAATGA 5220AGCCACCTGT TCAAGTCCTC TTCCCAATTG GCTTGGCAGG GGGTTCTAGC AGAGATATAA 5280AGAAGGCTGC TGAAGAGGGA AAAATAGCTG AAGTTGAGAT TGCTTTCTTC AAGTGTCCGA 5340AGTGTGGCCA TGTAGGGCCT GAAACTCTCT GTCCCGAGTG TGGGATTAGG AAAGAGTTGA 5400TATGGACATG TCCCAAGTGT GGGGCTGAAT ACACCAATTC CCAGGCTGAG GGGTACTCGT 5460ATTCATGTCC AAAGTGCAAT GTGAAGCTAA AGCCATTCAC AAAGAGGAAG ATAAAGCCCT 5520CAGAGCTCTT AAACAGGGCC ATGGAAAACG TGAAGGTTTA TGGAGTTGAC AAGCTTAAGG 5580GCGTAATGGG AATGACTTCT GGCTGGAAGA TTGCAGAGCC GCTGGAGAAA GGTCTTTTGA 5640GAGCAAAAAA TGAAGTTTAC GTCTTTAAGG ATGGAACCAT AAGATTTGAT GCCACAGATG 5700CTCCAATAAC TCACTTTAGG CCTAGGGAGA TAGGAGTTTC AGTGGAAAAG CTGAGAGAGC 5760TTGGCTACAC CCATGACTTC GAAGGGAAAC CTCTGGTGAG TGAAGACCAG ATAGTTGAGC 5820TTAAGCCCCA AGATGTAATC CTCTCAAAGG AGGCTGGCAA GTACCTCTTA AGAGTGGCCA 5880GGTTTGTTGA TGATCTTCTT GAGAAGTTCT ACGGACTTCC CAGGTTCTAC AACGCCGAAA 5940AAATGGAGGA TTTAATTGGT CACCTAGTGA TAGGATTGGC CCCTCACACT TCAGCCGGAA 6000TCGTGGGGAG GATAATAGGC TTTGTAGATG CTCTGGTTGG CTACGCTCAC CCCTACTTCC 6060ATGCGGCCAA GAGAAGGAAC TGTGATGGAG ATGAGGATAG TGTAATGCTA CTCCTTGATG 6120CCCTATTGAA CTTCTCCAGA TACTACCTCC CCGAAAAAAG AGGAGGAAAA ATGGACGCTC 6180CTCTTGTCAT AACCACGAGG CTTGATCCAA GAGAGGTGGA CAGTGAAGTG CACAACATGG 6240ATGTCGTTAG ATACTATCCA TTAGAGTTCT ATGAAGCAAC TTACGAGCTT AAATCACCAA 6300AGGAACTTGT GAGAGTTATA GAGGGAGTTG AAGATAGATT AGGAAAGCCT GAAATGTATT 6360ACGGAATAAA GTTCACCCAC GATACCGACG ACATAGCTCT AGGACCAAAG ATGAGCCTCT 6420ACAAGCAGTT GGGAGATATG GAGGAGAAAG TGAAGAGGCA ATTGACATTG GCAGAGAGAA 6480TTAGAGCTGT GGATCAACAC TATGTTGCTG AAACAATCCT CAACTCCCAC TTAATTCCCG 6540ACTTGAGGGG TAACCTAAGG AGCTTTACTA GACAAGAATT TCGCTGTGTG AAGTGTAACA 6600CAAAGTACAG AAGGCCGCCC TTGGATGGAA AATGCCCAGT CTGTGGAGGA AAGATAGTGC 6660TGACAGTTAG CAAAGGAGCC ATTGAAAAGT ACTTGGGGAC TGCCAAGATG CTCGTAGCTA 6720ACTACAACGT AAAGCCATAT ACAAGGCAGA GAATATGCTT GACGGAGAAG GATATTGATT 6780CACTCTTTGA GTACTTATTC CCAGAAGCCC AGTTAACGCT CATTGTAGAT CCAAACGACA 6840TCTGTATGAA AATGATCAAG GAAAGAACGG GGGAAACAGT TCAAGGAGGC CTGCTTGAGA 6900ACTTTAATTC CTCTGGAAAT AATGGGAAGA AAATAGAGAA GAAGGAGAAA AAGGCAAAGG 6960AAAAGCCTAA AAAGAAGAAA GTTATAAGCT TGGACGACTT CTTCTCCAAA CGCTGACCAC 7020AACTTTTAAG TTCTTTCTTG AGAATAAATT CCCAGGTGGC TTAGAGAATG AAGATTGTGT 7080GGTGTGGTCA TGCCTGCTTC TTGGTGGAGG ATAGGGGGAC TAAGATACTA ATCGATCCAT 7140ACCCAGACGT TGATGAAGAC AGAATAGGCA AGGTCGATTA CATTCTAGTT ACCCACGAGC 7200ACATGGATCA CTACGGTAAG ACCCCACTAA TAGCAAAGCT CAGTGATGCC GAGGTTATAG 7260GGCCGAAAAC AGTTTATCTC ATGGCAATAA GTGATGGGCT AACAAAGGTC AGAGAGATAG 7320AGGTGGGACA GGAAATCGAG CTGGGAGATA TTAGGGTTAG GGCATTTTTC ACAGAGCATC 7380CAACAAGCCA GTATCCCCTG GGATATCTAA TTGAAGGAAG CAAAAGAGTG GCTCACTTGG 7440GAGATACATA CTACAGTCCA GCTTTTACAG AGTTGAGGGG AAAGGTTGAT GTTCTTTTGG 7500TTCCAATAGG TGGGAAGTCC ACCGCTAGTG TAAGGGAGGC TGCGGATATA GTGGAGATGA 7560TAAGGCCCAG GATAGCAGTT CCAATGCACT ATGGAACGTA CAGCGAGGCC GATCCTGAAG 7620AGTTCAAGAA GGAGCTCCAA AAAAGGCGCA TATGGGTTTT AGTAAAGGAT CTTAAGCCCT 7680ATGAGGGTTT TGAAATCTGA AGGTGTTTCA ATGCTAAATA CTGAGCTCTT AACCACTGGA 7740GTCAAGGGGT TAGATGAGCT TTTAGGTGGT GGAGTTGCTA AGGGAGTAAT ACTCCAAGTT 7800TACGGGCCAT TTGCCACCGG GAAGACAACT TTTGCAATGC AGGTTGGATT ATTGAATGAG 7860GGAAAAGTGG CTTATGTTGA TACTGAGGGG GGATTCTCCC CCGAAAGGTT AGCTCAAATG 7920GCAGAATCAA GGAACTTGGA TGTGGAGAAA GCACTTGAAA AGTTCGTGAT ATTCGAACCT 7980ATGGATTTAA ACGAGCAAAG ACAGGTAATT GCGAGGTTGA AAAATATCGT GAATGAAAAG 8040TTTTCTTTAG TTGTGGTCGA CTCCTTTACG GCCCATTATA GAGCGGAGGG GAGTAGAGAG 8100TATGGAGAAC TTTCCAAGCA ACTCCAAGTT CTTCAGTGGA TTGCCAGAAG AAAAAACGTT 8160GCCGTTATAG TTGTCAATCA AGTTTATTAC GATTCAAACT CAGGAATTCT TAAACCAATA 8220GCTGAGCACA CCCTGGGGTA CAAAACAAAG GACATCCTCC GCTTTGAAAG GCTTAGGGTT 8280GGAGTGAGAA TTGCAGTTCT GGAAAGGCAT AGGTTTAGGC CAGAGGGTGG GATGGTATAC 8340TTCAAAATAA CAGATAAAGG ATTGGAGGAT GTAAAAAACG AAGATTAGAG CCTGTCGTAG 8400ACCTCCTGGG CAATCCTCAG CGTTGCCTTA TAGAGCTTCT CACTAATAAT8450序列號6序列長度45序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成DNA)序列CCGGAACCGC CTCCCTCAGA GCCGCCACCC TCAGAACCGC CACCC 45序列號7序列長度17序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成RNA)序列GUUUUCCCAG UCACGAC 17序列號8序列長度23序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成DNA)序列GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACT 23序列號9序列長度22序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成DNA)序列ACAAAGCCAG CCGGAATATC TG 22序列號10序列長度22序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成DNA)序列TACAATACGA TGCCCCGTTA AG 22序列號11序列長度32序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成DNA)序列CAGAGGAGGT TGATCCCATG GATGAATTTG TA 32序列號12序列長度32序列類型核酸鏈型單鏈拓撲構型直鏈型序列種類其他核酸(合成DNA)序列TTTAGTGGGT GGTGCCCATG GAGCTTCCAA AG 3權利要求
1.特征為具有下列性質的DNA聚合酶①在以單鏈模板DNA與引物退火形成的復合物為底物時，測定的聚合酶活性比以活化的DNA為底物時顯示的活性高；②具有3’→5’外切核酸酶活性；③在按下述條件以λ-DNA為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)時，能夠擴增約20千堿基對的DNA片段；PCR的條件(a)反應液組成含10 mM Tris-鹽酸(pH9.2)、3.5mM MgCl2、75 mM KCl、400μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、0.01％小牛血清白蛋白、0.1％Triton X-100、5.0 ng/50μlλ-DNA、10 pmol/50μl引物λ1(序列表的序列號8)、以及引物λ11(序列表的序列號9)、3.7單位/50μl DNA聚合酶；(b)反應條件以每循環98℃、10秒～68℃、10分鐘進行30個循環的PCR反應。
2.權利要求1記載的DNA聚合酶，其特征為與Taq DNA聚合酶相比，在DNA合成時的錯誤頻率低。
3.權利要求1或2記載的DNA聚合酶，用凝膠過濾法測得的分子量為約220千道爾頓或約385千道爾頓。
4.權利要求1～3中任一項記載的DNA聚合酶，其特征為在兩種DNA聚合酶組成蛋白(第1種DNA聚合酶組成蛋白和第2種DNA聚合酶組成蛋白)共存時能顯示活性。
5.權利要求4記載的DNA聚合酶，其特征是，第1種DNA聚合酶組成蛋白和第2種DNA聚合酶組成蛋白用SDS-PAGE測得的分子量分別為約90,000道爾頓和約14,000道爾頓。
6.權利要求4或5中記載的DNA聚合酶，其特征為，構成權利要求4或5中記載的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物。
7.權利要求4或5中記載的DNA聚合酶，其特征為，構成權利要求4或5中記載的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號3中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物。
8.權利要求4或5中記載的DNA聚合酶，其特征為，構成權利要求4或5中記載的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物；構成權利要求4或5中記載的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白包括序列表的序列號3中所示的氨基酸序列或是在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換并具有基本相同的活性的功能等價物。
9.構成權利要求4或5中記載的DNA聚合酶的第1種DNA聚合酶組成蛋白，包括序列表的序列號1中所示的氨基酸序列，或包括在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換且具有基本相同的活性的功能等價物的氨基酸序列。
10.構成權利要求4或5中記載的DNA聚合酶的第2種DNA聚合酶組成蛋白，包括序列表的序列號3中所示的氨基酸序列，或包括在該氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換且具有基本相同的活性的功能等價物的氨基酸序列。
11.含有編碼權利要求9中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有編碼序列表的序列號1中所示的氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分，或者編碼含有在序列號1的氨基酸序列中有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換的氨基酸序列且具有第1種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質。
12.含有編碼權利要求9中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有序列表的序列號2中所示的堿基序列的全部或一部分，或者含有在嚴格條件下能與該序列雜交的堿基序列。
13.含有編碼權利要求10中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有編碼序列表的序列號3中所示的氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分，或者編碼含有在序列號3的氨基酸序列上有一個以上的氨基酸缺失、插入、附加或置換的氨基酸序列且具有第2種DNA聚合酶組成蛋白的功能的蛋白質。
14.含有編碼權利要求10中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的堿基序列的DNA，其特征為含有序列表的序列號4中所示的堿基序列的全部或一部分，或者含有在嚴格條件下能與該序列雜交的堿基序列。
15.DNA聚合酶的制造方法，其特征為，培養含有編碼權利要求11或12中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因和編碼權利要求13或14中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的基因兩者的轉化子，從該培養物中收集DNA聚合酶。
16.DNA聚合酶的制造方法，其特征為分別培養含有編碼權利要求11或12中記載的第1種DNA聚合酶組成蛋白的基因的轉化子和含有編碼權利要求13或14中記載的第2種DNA聚合酶組成蛋白的轉化子，混合培養物中所含的DNA聚合酶組成蛋白，收集DNA聚合酶。
全文摘要
本發明涉及具有如下性質的DNA聚合酶:(1)在以單鏈模板與引物退火形成的復合物為底物時測定的聚合酶活性,比以活化的DNA作模板時顯示的聚合酶活性高。(2)具有3’→5’外切核酸酶活性。(3)在使用λDNA作為模板進行PCR反應時,能夠擴增約20千堿基對的DNA片段而不需要加入任何其他的酶;構成該DNA聚合酶的蛋白質;含有編碼該酶的堿基序列的DNA;以及制備該DNA聚合酶的方法。本發明所提供的是一種同時含有高引物延伸活性和3’→5’外切核酸酶活性的新型DNA聚合酶。
文檔編號C12N15/54GK1209170SQ9618012
公開日1999年2月24日 申請日期1996年12月26日 優先權日1995年12月27日
發明者上森隆司, 石野良純, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社 被以下專利引用 (3),