專利名稱：重組人糖基化尿激酶原的制備方法
技術領域：
本發明是利用生物工程技術，對以下六種載體如pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pSV2-pro-UK，pXMT，pMTSV-dhfr上的有用元件，經過重組，構建一個適合在中國地鼠卵母細胞(CHO)中高效表達外源基因的新型載體(pMTSV-du)，然后將轉染篩選獲得的CHO工程細胞株CL-11G用微載體(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培養技術和低血清培基進行高密度培養，并對產品進行四步或一步純化，制備一種治療冠狀動脈梗塞，腦血栓，中央視網膜動靜脈血栓及其他血栓病的藥物—重組人尿激酶原(prourokinase，簡稱pro-UK)，此屬于生物工程技術。
尿激酶原是尿激酶的前體，是一種糖蛋白，由411個氨基酸組成，其本身無活性，經纖維蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之間的肽鏈打開形成尿激酶，才能發揮其溶血拴的效能。
自Bernit1973年發現pro-UK以來，已有人相繼從人的血液，尿液和各種重組宿主細胞培養液中獲得，如用大腸桿菌培養液中獲得的有Holmes，W.E.1985以及安內.布蘭法茲等(中國專利，CN1042181A，1990-05-16)，用酵母表達成功的如Melnick，L.M.等(1990)用中國地鼠卵母細胞(CHO)表達成功的有Nells，L.等(1987)；Avgerinos，G.C.等(1990)。
本發明包括1.人尿激酶原全長cDNA基因的克隆，2.構建在CHO細胞高效表達的轉移載體和工程細胞株，3.對CHO工程細胞的大量培養，獲得大量尿激酶原原料，并加以純化，其目的在于利用生物工程技術制備一種適于臨床應用的糖基化尿激酶原產品。
本發明的技術要點是1.通過對Detroit 562細胞的誘導和提取細胞總RNA，經反轉錄和dG·dC接尾構建了cDNA文庫，再通過篩選和人工合成寡核苷酸等DNA重組技術，構建了尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質粒DNA，獲得pMM-UK重組質粒。
2.將幾種表達載體如pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pSV2-proUK，pXMT，pMTSV-dhfr，等載體上的有用元件，經多次基因操作和重組，構建了一個適合在CHO細胞中高效表達外源基因的新型載體(pMTSV-du)。
3.采用微載體(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培養技術和低血清培基高密度培養CL-11G工程細胞，獲得大量含高活性尿激酶原的原料。
4.采用四步法，即CM陽離子親和層析-MPG吸附層析-Sephacryl S-200凝膠過濾—對氨基苯甲脒色譜，或采用一步法，即用抗體親和層析法純化產品。
實施例1.人尿激酶原全長cDNA基因的構建和克隆采用肉豆寇酯(PMA)誘導Detroit 562細胞，使細胞內尿激酶mRNA含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍—酚—氯仿法提取細胞總RNA，oligo(dT)-纖維素柱層析法分離poly(A+)RNA，通過反轉錄和dG·dC接尾重組技術構建了Detroit 562細胞的cDNA文庫，通過篩選獲得了含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株。再采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重組技術，構建了人尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質粒DNA，獲得了pMM-UK重組質粒。全序列測定結果表明，cDNA基因全長為1565bp，含有60bp(20aa)信號肽序列，1233bp編碼序列(1-411aa)和272bp 3’非編碼序列。該基因5’端含有Hind III和EcoR1單一酶切位點，3’端含有Sal I，Xba I，Sma I，Kpn I和Sac I 5個單一酶切位點，便于尿激原基因的克隆和表達。
2.中間載體1 pSV2-pro-UK的構建將pSV2-dhfr載體用BglII酶切后用Klenow F酶補平，再用Hind III酶切，分離回收載體大片段；從pMM-UK質粒DNA中，用Hind III和Sma I雙酶切，分離pro-UK cDNA；將載體大片段與pro-UK cDNA連接形成可表達pro-UK的重組質粒pSV2-pro-UK。
3.中間載體2 pMTSV-dhfr的構建將pSV2-dhfr表達質粒用Bgl II酶切，并用Klenow F酶將末端補平，再通過T4DNA連接酶將質粒重新環化并消除了質粒中的Bgl II酶切位點。然后將該質粒經BamH 1和pVU II雙酶切及Klenow F酶將末端補平，通過電泳回收1.9Kb DNA片段(內含SV40增強子和二氫葉酸還原酶基因)。將此片段插入經EcoR1酶切，Klenow F酶末端補平的pXMT載體中，從而獲得了長度為8.25Kb的中間載體pMTSV-dhfr.
4.新型高效表達載體pMTSV-du的構建將pSV2-pro-UK重組質粒經Sal I酶切，Klenow F酶末端補平，再通過T4 DNA連接酶將質粒重新環化并消除了質粒中的Sal I酶切位點。然后將該質粒經pVU I和EcoR V雙酶切及Klenow F酶將末端補平，通過電泳回收3.8Kb片段含全長尿激酶原cDNA)，并將該片段插入經BglII酶切，Klenow F酶末端補平的pMTSV-dhfr中間載體，從而獲得長度為12Kb，可高效表達尿激酶原的載體pMTSV-du.該載體的特點是A.將表達尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個轉錄單位置于同一載體，分別受金屬硫蛋白(MT)和SV40早期啟動子控制，使之具有用氨甲喋呤(MTX)使基因擴增和用金屬Zn++誘導的雙重放大功能，這有利于尿激酶原的高表達。
B.將SV40增強子置于兩個啟動子之間，為兩個啟動子公用。由于SV40增強子的增強作用廣譜性強，有利于尿激酶原基因在多種細胞中獲得高效表達。
C.在載體的非必需區，有一Sal I單一酶切位點，可方便地進行重組載體的線性化，有利于通過電擊介導法獲得多考貝尿激酶原基因，并整合在細胞染色體上使穩定表達。
D.使表達尿激酶原和二氫葉酸還原酶的兩個轉錄單位轉錄方向相反，這可減少dhfr基因轉錄時對尿激酶原基因轉錄的影響，有利于尿激酶原的高表達。
5.轉染和篩選高效表達的CHO工程細胞將20-40μgpMTSV-du質粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉染CHO-dhfr-細胞，先用HAT選擇培基篩選，10天后換成含1-3×10-8M MTX的選擇培基進行dhfr和MTX雙重篩選，并對33株表達有尿激酶原活性的陽性轉化細胞經多次亞克隆和MTX加壓擴增基因，鋅離子誘導，最終篩選到三株能高效表達尿激酶原的細胞株，其中一株CL-11G表達的活性可達500-800 IU/106細胞/天。該株細胞經長期液氮保存和一百多次轉代培養，表達水平基本不變。表達產物經抗原性和Western印跡分析，其分子量為52Kd，較大腸桿菌表達的分子量(47Kd)大，表明它確與天然的相似，是糖基化了的尿激酶原。
6.CHO工程細胞的高密度培養采用固體的聚苯乙烯微載體如Biosilon，SH-2，和多孔纖維素微載體如Cytopore，在我們改進了的灌流培養控制系統(已獲中國國家專利，專利號ZL91208893.1，1994-08-24)控制下，用攪拌式生物反應器(如Celligen)培養，灌流量自0.5個工作體積/天逐漸增加至2個工作體積/天，細胞密度可達1-2×107/ml，尿激酶原產量可高達8096 IU/ml。培養時間可長達53天。
7.放大生產規模是利用該細胞能在微載體之間自動轉移的特點，直接將已長有細胞的微載體從小反應器轉入加有3倍，5倍或7倍量培基和新微載體的大反應器內。
8.研制和采用低血清培基通過對培養過程中培基成份的氨基酸分析，以及通過正交試驗，確定以DMEM/F12(1∶1)為基礎培基的低血清培基，佐以天冬氨酸，胱氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，絲氨酸，谷氨酰胺，蛋白胨，葉酸以及抑肽酶(aprotinin)，Hepes，葡萄糖等。血清量從原來的5％減少到1％和0.5％。
9.四步法純化尿激酶原第一步，CM-徑向離子交換法該色譜柱是由聚乙烯與纖維素共聚膜共價結合羧甲基繞在多孔軸管上并固定在有機玻璃柱內構成。先用0.15mol/L，pH5.7的磷酸緩沖液平衡。尿激酶原原液經3000×g，4℃離心后用6mol/L HCl調pH至5.7后上柱，流速為12-15ml/分(柱床體積250ml)或25-30ml/分(柱床體積700ml)。當洗液中蛋白吸收峰值低于0.005以下時改用0.025mol/L，pH6.8的醋酸緩沖液(含0.75mol/L硫酸銨)，0.005％Tween-80)洗脫，收集活性蛋白峰流出液。
第二步，MPG吸附色譜法它是由微孔高硅玻璃珠組成的色譜柱。將第一步的收集液直接上柱，用0.5mol/LTris-HCl，pH9.5的緩沖液洗去雜蛋白，再用0.02mol/L，pH8.0的磷酸緩沖液(含0.1mol/L NaCl)洗至吸收峰值低于0.005以下后，分別用含1mol/L和2mol/L硫酸銨的0.5mol/L，pH9.25的Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫并收集蛋白吸收峰流出液。
第三步，凝膠色譜Sephacryl S-200 HR高效凝膠色譜先用0.092mol/L，pH5.3(含0.1mol/L NaCl)醋酸緩沖液平衡，然后將第二步的收集液上柱，繼續用該緩沖液洗柱并收集第二蛋白峰組分。
第四步，對氨基苯甲脒親和色譜先用0.092mol/L，pH5.3(含0.2mol/L NaCl)的醋酸緩沖液平衡，然后將第三步收集液上柱，繼續用該緩沖液洗柱并收集穿過蛋白流出液。
10.一步抗體親和層析法純化用制備的單克隆抗體和Sepherose 4B偶聯并裝成層析柱。將收集的尿激酶原原液先與0.002M苯甲醚在室溫保溫0.5h，然后上柱。用0.1M，pH2.2的Gly-HCl緩沖液洗脫，收集活性峰。
11.純化產品的理化性能測定純化后的產品的活性可被抗尿激酶的抗體中和，但不能被DFP抑制。分子量為52Kd，等電點為8.9，N-末端氨基酸序列為SNELHQVPSNCDCLN，這些結果表明，它與天然的糖基化的尿激酶原完全一致。
圖1.pMTSV-du高效表達載體的構建。
權利要求
1.一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其組成包括(1)人尿激酶原全長cDNA基因的構建和克隆，(2)構建中間載體1(pSV2-pro-UK)，構建中間載體2(pMTSV-dhfr)和新型高效表達載體(pMTSV-du)，(3)轉染和篩選高效表達CHO工程細胞，(4)高密度培養和放大培養CHO工程細胞技術，(5)低血清培基成份配比以及(6)工程細胞分泌產物的純化技術，其特征在于利用基因重組技術，將各種載體(pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pXMT，pSV2-pro-UK)上的有用元件，進行重組，構建一個適合于在中國地鼠卵母細胞(CHO)中高效表達其外源基因的新型載體(pMTSV-du)，通過轉染篩選獲得高效表達的CHO工程細胞株CL-11G，并用微載體(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培養技術高密度培養和放大培養CL-11G工程細胞及其產物的純化。
2.如權利要求1所述的一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于(1)人尿激酶原全長cDNA基因的克隆，是采用肉豆寇酯(PMA)誘導Detroit 562細胞，使細胞中尿激酶mRNA的含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍—酚—氯仿法提取細胞總RNA，oligo(dT)-纖維素柱層析法分離poly(A+)RNA，通過反轉錄和dG·dC接尾重組技術構建成Detroit 562細胞的cDNA文庫，通過篩選而獲得含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株，采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重組技術，構建尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質粒DNA，獲得一個pMM-UK重組質粒，經全序列測定證明，cDNA基因全長為1565bp，含有60bp(20aa)信號肽序列，1233bp編碼序列(1-411aa)和272bp 3’非編碼序列，該基因5’端含有HindIII和EcoR1單一酶切位點，3’端含有SalI，XbaI，SmaI，KpnI和SacI 5個單一酶切位點，便于尿激酶原的克隆和表達，(2)中間載體1(pSV2-pro-UK)的構建，是將pSV2-dhfr載體用BglII酶切后用Klenow F酶末端補平，再用Hind III酶切，分離回收載體大片段；從pMM-UK質粒DNA中，用Hind III和Sma I雙酶切，分離pro-UK cDNA；再將載體大片段與pro-UK cDNA連接形成可表達pro-UK的重組質粒pSV2-pro-UK，(3)中間載體2(pMTSV-dhfr)的構建，是將pSV2-dhfr表達質粒用Bgl II酶切，并用Klenow F酶將末端補平，再通過T4 DNA連接酶將質粒重新環化，并消除質粒中的Bgl II酶切位點，然后將該質粒經BamH 1和pVU II雙酶切及Klenow F酶將末端補平，通過電泳回收1.9Kb DNA片段(內含SV40增強子和二氫葉酸還原酶基因)，將此片段插入經EcoR1酶切，Klenow F酶末端補平的pXMT載體中，從而獲得了長度為8.25Kb的中間載體pMTSV-dhfr，(4)新型高效表達載體(pMTSV-du)的構建，將pSV2-pro-UK重組質粒經Sal1酶切，Klenow F酶末端補平，再通過T4 DNA連接酶將質粒重新環化并消除了質粒中的Sal1酶切位點，然后將該質粒經pVU1和EcoR V雙酶切及Klenow F酶將末端補平，通過電泳回收3.8Kb片段(含全長尿激酶原cDNA)，并將該片段插入經Bgl II酶切，Klenow F酶末端補平的pMTSV-dhfr中間載體，從而獲得一個長度為12 Kb，能高效表達尿激酶原的載體pMTSV-du，3.如權利要求1所述一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于轉染和篩選高效表達的CHO工程細胞是將20-40μg高效表達載體(pMTSV-du)質粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉染CHO-dhfr-細胞，先用HAT選擇培養基篩選，10天后換成含1-3×10-8M MTX選擇培基進行dhfr和MTX雙重篩選，并對33株表達有尿激酶原活性的陽性轉化細胞多次亞克隆和MTX加壓擴增基因，再經鋅離子誘導篩選出高效表達，活性達到500-800IU/106細胞/天的尿激酶原工程細胞株CL-11G，
4.如權利要求1所述一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于CHO工程細胞的高密度培養是用固體聚乙烯微載體(Biosilon，SH-2)和多孔纖維素微載體(Cytopore)在一個由改進的灌流培養控制裝置(中國專利ZL 91208893.1)的反應器內進行灌流培養，灌流量逐漸增加，使細胞密度達1-2×107/ml，尿激酶原的產量隨細胞密度的增加而增加，
5.如權利要求1所述一種人重組糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于利用該CHO工程細胞在培養中能在微載體之間自動轉移的特點，用以放大生產規模，即直接將小反應器內已長有細胞的微載體，轉入加有3倍，5倍或7倍量的培養基和新鮮微載體的大反應器內，繼續灌流培養，
6.如權利要求1所述一種人重組糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于低血清培基的研制是通過對培養過程中培基成份的氨基酸分析，以及通過正交試驗確定以DMEM/F12(1∶1)培基為基礎，佐以天門冬氨酸，胱氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，絲氨酸，谷氨酰胺，蛋白胨，葉酸，抑肽酶(aprotinin)，Hepes以及葡萄糖等，同時將原來培基中的小牛血清用量從5％減至1％和0.5％，
7.如權利要求1所述一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于(1)尿激酶原產品采用四步純化方法，如第一步CM-徑向離子交換色譜，色譜柱的構成是用聚乙烯與纖維素共聚膜共價結合羧甲基繞在多孔軸管上，并固定在有機玻璃柱內，柱層析時的pH值為5.7，柱床體積700ml時流速為25-30ml，第二步微孔高硅玻璃珠色譜，用微孔高硅玻璃珠裝填層析柱，層析后收集其蛋白吸收峰流出液，第三步凝膠色譜，收集其第二蛋白峰組份，第四步對氨基苯甲脒親和色譜，層析其第三步的收集液，并繼續收集穿過蛋白的流出液。(2)或采用一步法，即抗體親和層析法，將尿激酶原先與苯甲脒在室溫保溫0.5小時，再上單抗與Sepherose 4B偶聯的層析柱，然后收集活性峰。
全文摘要
本發明是利用生物工程的方法,通過基因工程技 術構建了一種有雙重放大功能的表達載體,并獲得一株高效表 達的CHO工程細胞。經微載體和低血清培基高密度灌流培養 和純化,制備一種治療冠狀動脈梗塞,腦血栓,中央視網膜動靜脈 血栓和其他血栓病的藥物一重組人糖基化尿激酶原。
文檔編號C12N15/06GK1178244SQ9611983
公開日1998年4月8日 申請日期1996年9月27日 優先權日1996年9月27日
發明者方繼明, 肖成祖, 余煒源, 張正光, 李風知, 黃子才, 陳昭烈, 葉建新 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所