專利名稱：蛙病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及水產養殖動物疾病防治的藥物，特別涉及名特優水產養殖動物的疾病預防和治療的抗病毒疫苗。該疫苗包括病毒、用于增殖該病毒的宿主細胞及其制備技術。
沼澤綠牛蛙(Rana grylio)又稱美國青蛙，自80年代后期引入我國后，其養殖業發展很快，但遺憾的是沼澤綠牛蛙的病害也隨之增加。據不完全統計，養蛙業每年因病致死而損失的人民幣在5000萬元以上。其病癥表現有紅腿病、水霉病、氣泡病、脫皮病、腫腿病、爛皮病等，有些病表面上似乎為菌類感染，但實質上很可能是由于病毒首先入侵所致。抗菌素類的藥物對這類疾病不起作用或效果很有限。目前國內尚無蛙病毒病原研究的報道，更無蛙病毒疫苗的研制報告。國外僅局限于蛙病毒病原的研究，尚未見有蛙病毒疫苗的文獻報道。
近年來，我們在國內發現了一種稱之為“蛙的病毒性致死綜合癥”疾病。對蛙的危害極大，發病主要出現在剛剛變態之后的幼蛙，其癥狀及發病特點是精神不振，行動遲緩，食欲減退。發病初期，蛙的體表出現出血點， 頭背部皮膚開始僅局部脫落腐爛，很快爛斑擴大，病勢不斷加重，有的指部及趾部充血、出血或潰爛。病重的蛙體形非常消瘦，解剖發現腸壁嚴重充血，腸內無食物，有的肝或膽囊腫大。此病病程短、漫延極快，死亡率可高達100％。
本發明的目的在于研制出高效、穩定、安全的蛙用病毒疫苗，以防治通過其它藥物難以奏效的蛙病毒性致死綜合癥疾病的傳播和流行。
對蛙病毒感染的細胞超薄切片進行電鏡觀察，結果表明病毒顆粒呈球形，有囊膜，大小約為150nm。病毒在感染的細胞內復制和增殖，有的病毒顆粒分散在細胞之中，也見有大量的病毒顆粒聚集在一起呈晶格狀排列。根據對蛙病毒的核酸性質及基因組大小分析的結果，表明該病毒Wv9510屬虹色病毒科蛙病毒屬的成員。已保藏入中國典型培養物保藏中心(武漢)，保藏編號CCTCC—V96004。
用粗提的蛙病毒懸液直接接種到長成單層的細胞上，可引起CO9510(草魚性腺細胞)等細胞產生病變。在不同溫度下細胞產生病變所需的時間以及病毒的TCID50不同，蛙病毒的滴度隨培養溫度升高而增加，當溫度相同時，不同的細胞對蛙病毒的敏感性亦不同。蛙病毒的回歸感染試驗結果及免疫保護試驗結果分別見表1和見表2。
表1、蛙病毒的回接感染試驗結果
由表1可見該病毒對蛙有很強的致死作用。在注射了病毒兩周內，試驗組蛙的死亡率就達到100％；而注射生理鹽水對照組的蛙則全部正常。
表2、蛙病毒疫苗的免疫保護試驗結果
表2顯示未用疫苗保護的對照組蛙在注射病毒三周內死亡率達到100％，而用疫苗保護的試驗組蛙死亡率僅為4％。
本發明有如下效果1、疫苗的保護力強，經此疫苗免疫的蛙群，對病毒攻擊的保護率可達95％。
2、宿主細胞適于大量穩定增殖病毒的需要。細胞在感染病毒約24小時，80％的細胞出現病變。在普通光鏡下可見細胞的形態、折光率等發生變化，出現壞死、脫落的現象，并在單層培養細胞中局部產生空斑。因此，普通光鏡下直接觀察即可判定病毒感染和增殖的情況。
3、生產周期短，工藝簡單。
4、無毒、安全、不污染環境和水體。
實施本發明的方法與步驟A、制備疫苗所用的病毒Wv9510是虹色病毒科蛙病毒屬的成員。
B、適于病毒復制的宿主細胞為CO9510細胞(草魚性腺細胞)。
C、宿主細胞的培養基為199培養基+10％小牛血清D、培養條件為20-30℃，PH為7.0-7.2。
E、制備疫苗的工藝流程CO9510細胞用199培養基+10％小牛血清培養20-24小時，用0.1ml(含105TCID50)的Wv9510病毒液接種后，繼續培養24-36小時。收集含有擴增病毒的細胞培養液，再用0.1-0.5％分析純甲醛，在35-56℃條件下，滅活2-4小時，制備出蛙病毒疫苗，分裝后凍存于-20℃冰箱中，有效期1-2年。整個制備過程均在無菌條件下進行。
疫苗接種方法腹腔或肌肉注射均可，接種量為0.1ml/只蛙。浸泡接種有一定效果，但疫苗的用量需增加數倍。疫苗免疫后的蛙群，對病毒攻擊的保護率高達95％，且安全、無毒，不污染環境和水體。
權利要求
1.蛙病毒疫苗，其特征是由蛙病毒接種入草魚性腺細胞內增殖，經甲醛滅活而成A、草魚性腺細胞培養20-24小時；B、接種105TCID50滴度0.1ml的蛙病毒，繼續培養24-36小時；C、收集含有擴增病毒的細胞培養液，用甲醛滅活。
2.根據權利要求1所述的蛙病毒，其特征是病毒顆粒呈球形，有囊膜，直徑為150nm，在草魚性細胞上單個分散存在，群體呈晶格狀排列。
3.根據權利要求1所述的草魚性腺細胞培養，其特征是在含有10％小牛血清的199培養基內進行培養，PH7.0-7.2，培養溫度20-30℃。
4.根據權利要求1所述的甲醛滅活方法，其特征是濃度為0.1-0.5％，在35-56℃溫度下滅活2-4小時。
全文摘要
本發明涉及名特優水產動物疾病防治的抗病毒疫苗。以蛙病毒CCTCC-V96004感染草魚性腺細胞CO
文檔編號C12N15/86GK1161862SQ9611971
公開日1997年10月15日 申請日期1996年12月27日 優先權日1996年12月27日
發明者張奇亞, 李正秋, 桂建芳 申請人:中國科學院水生生物研究所