專利名稱：利用家蠶系統生產重組日本血吸蟲谷胱甘肽-轉移酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及多肽藥物的生產工藝，具體涉及重組日本血吸蟲谷胱甘肽-轉移酶的生產工藝。
谷胱甘肽-轉移酶(GTS)是抗血吸蟲病的首選疫苗之一，在國內外已廣泛研究。法國巴斯德研究院Capron實驗室最早報道了編碼曼氏血吸蟲28kDaGST(Sm28)的克隆和在大腸桿菌中的表達，重組抗原在動物免疫試驗中獲得較高的保護力和減蟲卵效果，并證明重組Sm28具有GTS活力，見Nature(1987)326149、Parasite Immunol(1991)13473和EMBOJ(1988)7465報道。Sm28和日本血吸蟲28kDaDGST(Sj28)的核甘酸和氨基酸序列具有77％的同源性，但兩者含T細胞抗原決定簇功能區有所不同。澳大利亞Mitchell實驗室進行了日本血吸蟲菲律賓株26 kDa-GST(SjP26)的克隆、重組和表達工作，見ProNatl Acad SciUSA(1986)838703與MOL Biochem Parasitol(1988)27249報道，但其免疫效果不穩定，而且Sj28和Sj26截然不同，氨基酸序列同源性不列20％，見Trans RSOC Trop Med Hyg(1988)82885與Mol Biothem Parasitol(1990)4023報道。
本發明的目的在于克服上述不足之處，研究開發以家蠶為宿主，替代大腸桿菌等其它表達系統，在家蠶幼蟲(或蛹)中高效表達具有酶活性的SjC28kDaGST。
本發明提供了重組日本血吸蟲谷胱甘肽-轉移酶的一種新的生產工藝。
本發明的工藝是利用家蠶系統生產重組日本血吸蟲谷胱甘肽S-轉移酶。
本發明的生產工藝具體包括下列步驟(見
圖1)圖1 轉移質粒SjC28-pBacPAK8的構建SjC28基因； 融合基因AcNPV旁側序列MCS，多克隆位點；Tac，Tac啟動子；Ph多角體啟動子。(1)含SjC28kDaGST基因的重組家蠶核型多角體病毒Bm-Sj28的構建；SjC28kDaGST基因編碼區為636bp，編碼211個氨基酸，基因5’端Bam HI識別序列ATG相隔2bp，由于pBacPAK8多克隆位點下游的旁側序列中存在僅有的HindIII位點，而SjC28基因的21bp處亦有一個HindIII位點，所以當SjC28基因以Bam HI、KpnI定向裝入pBacPAK8后，重組質粒經HindIII酶切電泳，顯示出5Kb和1.1Kb兩種片段，非重組質粒則只出現5.1Kb一種片段，擴增純化后的重組轉移質粒DNA和酶切線性化的BmNPV DNA在Lipofectin作用下共轉染單層培養的家蠶BmN細胞，進行細胞內DNA同源重組，27℃培養1周后，收集上清液，分別作10-a、5×10-4和10-4稀釋，感染1×105細胞1小時，鋪上含0.2mg/1X-gal的低熔點瓊脂糖27℃4天后，出現藍、白空斑，挑取多個白斑于24孔培養板(1×104細胞/孔)，于27℃培養72小時，收集細胞進行SDS-PAGE(12％分離膠)，350mA、1小時電轉移至硝酸纖維素膜(NC)上，用大腸桿菌表達的SjC28kDaGST免疫綿羊血清(r-SjC28ISS)篩選出陽性重組病毒空斑。然后進行第二輪空斑分析，得到純化的重組病毒Bm-8j28，滴度為7×105PFU/ml；SjC38 KDaGST基因除一個HindIII外位點，在90bp、111bp各有一個Eco RI位點，503bp有一個Bel I位點，Bm-Sj28經這三種酶酶切后，均能于[α-32P]-dCTP標記的Sjc28探針雜交，進一步證明SjC基因插入到BmNPV DNA中的正確位置(見圖2)。
圖2重組病毒Bm-Sj28的Southern雜交(2)SjC28kDaGST基因在家蠶幼蟲(或蛹)中的高效表達；純化的Bm-Sj28以200ul(感染指數Mol＝1.4PFU/細胞)感染1×106BmN細胞，27℃培養3天后，收集上清液作為毒種，桑葉飼養的家蠶5齡起蠶(或蛹)，在節間膜下注射10ul(7×104PFU/蠶)重組病毒，于感染后第4日分別收集血淋巴和去除中腸的蠶體組織；見圖3，圖3是家蠶幼蟲血淋巴中表達SjC28的SDS-PAGE圖譜和Western Blotting分析。
其中1-4感染Bm-Sj28的家蠶血淋巴(感染后第2至第5日)，5-6感染BmNPV的家蠶血淋巴(感染后第2、第4日)7-8健康家蠶血淋巴(第2、第5日)(3)從家蠶血淋巴和組織中分離純化SjC28kDaGST；將上述步驟得到的家蠶血淋巴和組織加入事先用PBST(含1％Triton X-100的PH7.2PBS)平衡的谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱，緩緩循環3-5次，然后依次用PBST和PBS充分洗柱，最后用PH9.1，50mmol/L Tris-7mmol GSH洗脫，收集各組份。見圖4，圖4是SDS-PAGE純化圖譜。
其中H家蠶幼蟲血淋巴的純化產物，T家蠶幼蟲組織中的純化產物，A家蠶幼蟲血淋巴或組織勻漿上清，B過柱后的流出液，1-10或1-7；各洗脫組份。
本發明工藝中含SjC28基因的質粒pTrcHiSB由英國倫敦大學衛生和熱帶醫學院醫學寄生蟲系Huggins M.C博士惠贈，轉移質粒pBacPAK8(clontech公司產品)是帶多角體基因啟動子的非融合蛋白轉移載體。感染Sj28KDaGST的家蠶血淋巴和組織中純化得到的SjC28kDaGST能和不同稀釋度的r-SJC28ISS起顯著的免疫結合反應，證明家蠶中表達的SjC28kDaGST具有較強的日本血吸蟲28kD GST抗原性。初步的小鼠免疫保護性試驗結果表明，家蠶表達的SjC28kDaGST在BALB/c小鼠中誘導了17.26％的減蟲率，第6周糞便減卵率達到85.38％。
用本發明工藝生產重組日本血吸蟲谷胱甘肽-轉移酶通過Southern雜交鑒定。
用本發明工藝生產重組日本血吸蟲谷胱甘肽-轉移酶的特性測定結果如下按文獻方法(Nethodes in Enzymology(1985)113499)進行，總反應體積為1ml，其中PH6.0，0.1mol/L磷酸鈉緩沖液880ul，底物GSH和2、4-二硝基氯苯(CDNB)終濃度為1mmol/l，各取20ul樣品進行測定，25℃反應1分鐘，以不加樣品的底物緩沖液作空白對照，于751分光光度計測定OD340，然后換算成比活力。
(2)抗原性測定按本實驗室建立的方法進行(中國獸醫科技(1991)2142)，純化SjC28以5ug/ml濃度包被96孔酶標板，4℃過夜，PBST(含0.05％Tween-20的PH7.2PBS)洗滌后，2％牛血清白蛋白37℃封閉1小時，PBST洗滌后，加入從1∶50開始對倍稀釋的r-SjC28ISS，共作12個稀釋度，重復2孔，37℃作用2小時，PBST洗滌后加入1∶12000稀釋的辣根過氧化物酶標記抗綿羊IgG，37℃反應1小時，PBST洗滌后進行0.1％鄰苯二胺底物溶液顯色，最后用BIO-TEK 312自動酶標儀測定OD490。
(3)小鼠免疫保護性試驗6周齡雌性BALB/c小鼠購自中科院上海細胞研究所實驗動物房。純化SjC28kDaGST平均分三次免疫小鼠，第一次結合弗氏完全佐劑(CFA)注射小鼠腳墊和背部皮下，2周后結合弗氏不完全佐劑(IFA)注射小鼠背部皮下，2周后肌肉注射加強免疫，第三次免疫后1周，每只小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴40條(本組釘螺房提供)。以弗氏佐劑組為對照組，感染后第6周收集小鼠糞便，計算糞便減卵率；感染后第7周解剖小鼠，用門靜脈灌注術收集血吸蟲成蟲，計算減蟲率。
EPG每克糞便蟲卵數上述結果表明本發明構建的重組家蠶核型多角體病毒Bm-Sj28，多角體蛋白基因被SjC28kDaGST結構基因替代，位于BmNPV強大的多角體基因啟動子控制下，在家蠶幼蟲中，隨著重組病毒的感染和復制，SjC28kDaGST得到高效表達，表達產物通過簡便的一步法純化得到SDS-PAGE電泳純產物，其純度能夠滿足家畜血防疫苗的要求，這是一條簡便可行的生產工藝。與利用大腸桿菌系統表達的SjC28kDaGST相比一條家蠶的純化SjC28kDaGST產量相當于50ml以上大腸桿菌培養物；GST比活力相當(大腸桿菌表達產物3.94umol/min.mg)；抗原性高近1倍(大腸桿菌表達產物對r-SjC28ISS反應的最高OD值為1.5)；對小鼠的保護力，則與大腸桿菌表達的SjC28kDaGST(25-31％)及蟲體提純天然GST的保護力相近(中國獸醫寄生蟲病(1996)45)，而糞便減卵率則高達85.38％。曾有動物試驗表明，重組或天然GST雖然減蟲效果不理想，但減卵率較高(ParasiteImmunol(1991)13473；(1993)15383)。因為蟲卵是血吸蟲傳播的重要環節，所以大幅度降低宿主糞便中的蟲卵排出數對控制血吸蟲病有著非常重要的實際意義。另外，用大腸桿菌系統表達的產物是融合蛋白，而用BmNPV系統表達的是非融合蛋白，因此更接近于天然GST的空間構象。家蠶易于飼養，生產成本低，近年建立的家蠶人工飼養技術，為大規模工業化無菌生產提供了條件，利用BmNPV-家蠶系統生產血吸蟲病疫苗無疑具有廣闊前景和經濟效益。
實例1、轉移質粒SjC28-pBacPAK8構建將SjC28kDaGST基因以BumHI、KpnI定向裝入pBacPAK8，重組質粒經HindIII酶切電泳，顯示出5Kb和1.1Kb兩種片段，非重組質粒只有5.1Kb一種片段。重組轉移質粒DNA和酶切線性化的BmNPV DNA在Lipofetin作用下共轉染單層培養家蠶BmN細胞，進行細胞內同源重組。27℃培養1周后，收集上清分別作10-a、5×10-4和10-4稀釋，感染1×105BmN細胞1小時，鋪上含0.2mg/ml X-gal的低熔點瓊酯糖，27℃4天后挑取20個白斑于24孔培養板(1×104細胞/孔)，27℃培養72小時，收集細胞進行SDS-PAGE(12％分離膠)和Western Blotting，應用r-SjC28ISS篩選到19個陽性重組病毒空斑，再進行第二輪空斑分析，得到純化的重組病毒Bm-Sj28，滴度為7×106PFU/ml。
實例2、SjC28kDaGST基因在家蠶幼蟲(或蛹)中的高效表達及純化。
5齡家蠶幼蟲(中國農科院蠶業研究所提供)，品系為57A.57B×24.46，以7×104PFU/蠶的劑量感染重組病毒，第4天剪去腹足，收集血淋巴和去除中腸的家蠶組織，分別用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱純化，經Folin-酚法(JBiol Chem(1951)193265)測定計算，以每條家蠶得0.35ml血淋巴計，每條家蠶血淋巴中得純化SjC28kDaGST 1.66mg，GST比活力為3.98umol/min.mg；整條家蠶組織平均以0.8g計(濕重)，可得純化SjC28kDaGST 4.03mg，GST比活力為3.74umol/min.mg。
權利要求
1.一種利用家蠶系統生產重組日本血吸蟲谷胱甘肽-轉移酶的生產工藝，其特征在于該生產工藝包括下列步驟(1)含SjC28kDaGST基因的重組家蠶核型多角體病毒Bm-Sj28的構建；SjC28kDaGST基因編碼區為636bp，編碼211個氨基酸，基因5′端Bam HI識別序列ATG相隔2bp，由于pBacPAK8多克隆位點下游的旁側序列中存在僅有的HindIII位點，而SjC28基因的21bp處亦有一個HindIII位點，所以當SjC28基因以Bam HI、KpnI定向裝入pBacPAK8后，重組質粒經HindIII酶切電泳，顯示出5Kb和1.1Kb兩種片段，非重組質粒則只出現5.1Kb一種片段，擴增純化后的重組轉移質粒DNA和酶切線性化的BmNPV DNA在Lipofectin作用下共轉染單層培養的家蠶BmN細胞，進行細胞內DNA同源重組，27℃培養1周后，收集上清液，分別作10-3、5×10-4和10-4稀釋，感染1×105細胞1小時，鋪上含0.2mg/lX-gal的低熔點瓊脂糖27℃4天后，出現藍、白空斑，挑取多個白斑于24孔培養板(1×104細胞/孔)，于27℃培養72小時，收集細胞進行SDS-PAGE(12％分離膠)，350mA、1小時電轉移至硝酸纖維素膜(NC)上，用大腸桿菌表達的SjC28kDaGST免疫綿羊血清(r-SjC28ISS)篩選出陽性重組病毒空斑。然后進行第二輪空斑分析，得到純化的重組病毒Bm-Sj28，滴度為7×106PFU/ml ；SjC28 KDaGST基因除一個HindIII外位點，在90bp、111bp各有一個Eco RI位點，503bp有一個Bcl I位點，Bm-Sj28經這三種酶酶切后，均能于[α-32P]-dCTP標記的Sjc28探針雜交，進一步證明SjC基因插入到BmNPV DNA中的正確位置；(2)SjC28kDaGST基因在家蠶幼蟲(或蛹)中的高效表達；純化的Bm-Sj28以200ul(感染指數Mol＝1.4PFU/細胞)感染1×106BmN細胞，27℃培養3天后，收集上清液作為毒種，桑葉飼養的家蠶5齡起蠶(或蛹)，在節間膜下注射10ul(7×104PFU/蠶)重組病毒，于感染后第4日分別收集血淋巴和去除中腸的蠶體組織；(3)從家蠶血淋巴和組織中分離純化SjC28kDaGST；將上述步驟得到的家蠶血淋巴和組織加入事先用PBST(含1％Triton X-100的PH7.2PBS)平衡的谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱，緩緩循環3-5次，然后依次用PBST和PBS充分洗柱，最后用PH9.1，50mmol/L Tris-7mmol GSH洗脫，收集各組份。
全文摘要
本發明涉及多肽藥物的生產工藝。本發明提供了重組日本血吸蟲谷胱甘肽—轉移酶的生產工藝，該工藝以家蠶核型多角體病毒為載體、以家蠶(或蛹)為生物反應器表達系統，具有表達效率高、產物活性好、生產成本低等特點，家蠶資源豐富，用以表達血吸蟲抗原基因是具有廣闊前景和效益的新技術途徑，宜于規模型工業化生產。
文檔編號C12N15/54GK1162017SQ9611631
公開日1997年10月15日 申請日期1996年4月8日 優先權日1996年4月8日
發明者施福恢, 吳祥甫, 蔡幼民, 田鍔, 楊冠珍, 沈緯, 葉萍, 傅志強, 林邦發, 錢承貴 申請人:中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所, 中國科學院上海生物化學研究所