細菌素的制作方法

專利名稱：細菌素的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌素、產生所述細菌素的菌株、制備所述細菌素的方法以及所述細菌素和/或產生所述細菌素之菌株在生產食品和化妝品中的應用。
細菌素已從許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中分離出。細菌素是一類其本質為蛋白質而且具有殺菌作用的分子，正因為此，它能夠在其產生菌與一種或多種不同的細菌之間引起拮抗反應。而且，細菌素的抑菌譜通常局限于與產生細菌素菌種非常相關的菌種。
確切地說，細菌素已在乳酸菌中得以證實。例如，EP0643136(Societe des produits Nestle)描述了從嗜熱鏈球菌中鑒定的兩種細菌素。類似地，從乳酸乳球菌中也已分離到一種細菌素(App.and Env.Microbio.58，279-284，1992；J.of Bio.Chem.268，16361-16368，1993)。
然而，至今尚不了解得自易變微球菌中的細菌素。易變微球菌目前被大量地用于食品領域。尤其是用于鮮肉的發酵以制備如意大利香腸和臘腸的熟食制品。因此，易變微球菌將在獲得可抵抗致病因子的產細菌素菌株方面非常有用。本發明的目的就是針對這一需要而提出的。
為此，本發明的細菌素即為易變微球菌細菌素，其具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者是通過1-4個氨基酸的一次取代，缺失和/或插入而不同于序列SEQ ID NO1的任何氨基酸序列。
而且，任何編碼該細菌素的核苷酸片段，尤其是具有序列SEQ ID NO2的核苷酸片段也在本發明的范圍內。
類似地，本發明的菌株為產生該細菌素的易變微球菌，尤其是易變微球菌菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587。
在制備本發明細菌素的方法中，在適于菌株生長的培養基和生長條件下培養產所述細菌素的易變微球菌菌株，特別是菌株CNCM I-1586或菌株CNCMI-1587，以得到含107-1011生物體/ml的培養物培養基，然后將所得培養物離心，制備含細菌素的上清液提取物。
最后，本發明易變微球菌細菌素的用途包括將其核苷酸序列及其信號序列、含細菌素的上清液提取物和產所述細菌素的易變微球菌菌株用于制備食品和化妝品。
本發明的細菌素在下文中將被稱為“易變素”(Variacin)。
在本發明中，任意單位(arbitrary Unit au)被定義為樣品在技術人員已知的“瓊脂孔試驗”中仍然表現出殺菌作用時的最大稀釋值的反比。
在本發明中，術語“片段”或“DNA片段”應理解為作為部分或完整編碼并能被合成，通過例如已知的聚合酶鏈反應方法在體外進行復制或在例如E.coli中進行體內復制的單鏈或雙鏈DNA片段。
在本發明中，“同源片段”被理解為通過小量堿基的取代、缺失或插入而僅僅不同于本發明片段的任何片段。在說明書中，兩個由于遺傳密碼簡并性而編碼一個和相同多肽的DNA片段尤其應該被認為是同源的。與本發明的片段有80％以上同源性的片段也將認為是同源片段。在后一種情況下，同源性由同源片段中的堿基數與本發明片段中的堿基數之比確定。
最后，本發明含義中的“雜交片段”應理解為能夠與本發明的片段經Southern印跡法雜交(Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，1989，Chapter 9.31-9.58)的任何片段。優選地，在苛刻或嚴格條件下進行雜交，以避免非特異性雜交或相對不穩定的雜交。
我們已從菌株CNCM-I-1586和CNCM I-1587分離出一種蛋白質性因子，即具有強力殺菌作用的細菌素。該細菌素得自易變微球菌，并顯示為下文所描述的氨基酸序列SEQ ID NO1，它已被命名為易變素。
根據易變素所提供的意義，本發明還涉及具有不同于SEQ ID NO1之氨基酸序列的任何細菌素，所述的差別是由于1-4個氨基酸的一次取代，缺失和/或插入造成的。因此，上述具有因1-4個氨基酸的一次取代，缺失和/或插入而不同于序列SEQ ID NO1之氨基酸序列的細菌素可以比例如所述易變素有更廣的細菌屬或細菌種的抑菌譜。
還有可能選擇編碼得自兩個菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587之本發明易變素的染色體核苷酸片段。所述片段顯示為下文所給出的序列SEQ ID NO2。
根據本發明所提供的意義，本發明還涉及編碼本發明易變素的任何核苷酸片段，尤其是與序列SEQ ID NO2同源或與之雜交的核苷酸片段。
更確切地說，本發明涉及編碼所述易變素信號肽的序列SEQ ID NO2之核苷酸88-153、編碼本發明被分泌易變素的序列SEQ ID NO2之核苷酸154-228和/或編碼與其信號肽融合之所述細菌素的序列SEQ ID NO2之核苷酸88-228。
編碼所述被分泌易變素的片段可以有利地用于在植物或在除了易變微球菌之外的微生物中表達發明的易變素。為此，將序列SEQ ID NO2之核苷酸154-228克隆到表達載體啟動子或信號序列的下游，終止子的上游，對閱讀框給予應有的注意時，再將所述載體導入植物、細菌或酵母中，以便拓寬其針對例如某些細菌的抑菌譜。
對本發明的信號序列加以應用是通過將序列SEQ ID NO2之核苷酸88-153與目的基因融合，對閱讀框給予應有的注意時，再通過將整個融合體克隆到易變微球菌表達載體，以使由所述目的基因編碼的蛋白質在例如易變微球菌中表達和分泌。
序列SEQ ID NO2之核苷酸88-228能夠被克隆到易變微球菌表達載體，并再導入另外的易變微球菌菌株，以使后者產生本發明的易變素。
此外，通過整合入其基因組或借助表達載體而含有編碼本發明易變素之DNA片段的易變微球菌也是本發明主題的一部分。更確切地說，根據布達佩斯條約的規定，已于1995年6月7日在國立微生物培養物保藏中心保藏(INSTITUT PASTEUR，25 Rue du Docteur Roux，F-75724 PARIS CEDEX1.5France)、保藏號為CNCM I-1586和CNCM I-1587的易變微球菌菌株是本發明主題的一部分。
易變微球菌為G+、過氧化氫酶陽性的永久靜止性需氧菌。其形態為球狀，以無規則排列的四分體形式存在。
易變微球菌菌落在BHI培養基上呈黃色，其最適生長溫度為25-37℃。
作為本發明之主題部分的菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587可以代謝葡萄糖和果糖，CNCM I-1587菌另外還代謝蔗糖和呋喃糖。
此外，菌株CNCM I-1586攜帶4kb和12kb的兩個質粒，而菌株CNCM I-1587僅攜帶一個7kb質粒。
菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587的培養物上清液相對其它細菌的生長顯示出了較廣的抑制譜。下列細菌是舉例說明對所述上清液敏感之細菌乳酸乳球菌、瑞士乳芽胞桿菌、德彼利代乳芽胞桿菌保加利亞亞種、德彼利氏乳芽胞桿菌乳酸亞種、德彼利氏乳芽胞桿菌德彼利氏亞種、嗜酸乳芽胞桿菌、約翰遜氏乳芽胞桿菌、植物乳芽胞桿菌、清酒乳芽胞桿菌、彎曲乳芽胞桿菌、Leuconostoc carnosum、腸系膜狀明串珠菌腸系膜狀亞種、嗜熱鏈球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、糞腸球菌糞亞種、枯草芽胞桿菌的孢子和無性細胞、蠟狀芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌、環狀芽胞桿菌、短小芽胞桿菌和液化形芽胞桿菌以及梭狀芽胞桿菌屬。
優選地，在制備所述易變素的方法中，將產所述細菌素的易變微球菌置于培養基中，在適于其生長的條件下培養，以得到含107-1011生物體/ml培養基的培養物培養基，然后將所得的培養物離心，制得含所述細菌素的上清液。
為了制備所述提取物，在適于易變微球菌生長的培養基和條件下培養產所述易變素的易變微球菌，尤其是菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587，為此，更確切地說是可在BHI培養基中，于25-37℃在需氧條件下振蕩培養，直到例如達到107-1011生物體/ml培養基濃度。將如此所得的標準培養物于4000-6000g離心，收集含所述細菌素的上清液提取物。
本發明還涉及易變素(尤其是提取物形式)或者是產所述細菌素之易變微球菌在制備食品和化妝品中的應用。
更確切地說，本發明易變微球菌菌株之一的培養物在制備意大利香腸時可用于肉類的發酵，以防止例如梭狀芽胞桿菌屬的污染。
在制備奶酪，尤其是mozzarella型奶酪過程中，粗制提取物或純化形式的易變素可以使用，當其被加入利用對所述易變素有抗性的細菌獲得的發酵劑中時，可避免由于多粘芽胞桿菌的芽胞幸存于發酵物中所產生的孔眼；在制備vacherin型奶酪時，上述易變素的利用用來對抗例如單核細胞增生李斯特氏菌的污染。
易變素(特別是粗提物或純化形式)或所述兩菌株之一可以在制甜點奶油凍(如經巴斯德法消毒的牛奶蛋凍)中用作添加劑或能有效對抗病原菌的成分，以抵抗例如梭狀芽胞桿菌和蠟狀芽胞桿菌的芽胞或李斯特氏菌屬的菌株生長。
此外，易變素的粗提物或純化形式或所述兩菌株之一可在制備化妝品(如保濕乳或除臭劑)中用作添加劑或抗病原菌的活性劑，以對抗例如皮膚病原菌的生長。
本發明易變素的特征借助下文說明其特性的微生物學、生物化學和遺傳學結果得以更詳細的說明。所給出的百分數為重量百分比。抗菌活性單位——“瓊脂孔試驗”在本發明書的敘述中，抗菌活性是根據任意單位定義的。
本發明例如在實施例所述條件下制備的本發明易變微球菌標準培養物的上清液一般的是顯示640au/ml活性。類似地，例如在實施例2所述條件下制備的所述上清液濃縮物一般顯示大約24000au/ml活性。
所述瓊脂孔試驗是用于確定某一樣品在一特定稀釋度時是否仍然顯示殺菌活性。
為此，將含有濃度為105-106CFU/ml的指示菌的15ml MRS瓊脂培養基接種到平皿中。對易變素敏感的菌株用作指示菌，在上述情況下，例如可用保加利亞乳芽胞桿菌(YL5)或瑞士乳芽胞桿菌(N2)。
在培養基中打出直徑5mm的孔。待測上清或上清濃縮物樣品以50μl/孔的比例注入。該平皿在4℃預培養2小時，然后于30℃或37℃(取決于所用指示菌過夜培養。經過上述培養之后，指示菌生長，并可看見受抑制的孔。樣品不再表現出殺菌活性的稀釋值就是從此開始不再能辯認出抑制孔的稀釋值。酶所致的失活所述瓊脂孔試驗用于確定根據本發明分離的易變素是否在蛋白酶或過氧化氫酶存在下失活。
為此，將5mg/ml酶加入實施例2所述培養物上清濃縮物中。在樣品被置于瓊脂孔試驗孔中之前，使酶在保溫溫度下作用60分鐘。
利用相同濃縮物(pH7)而不加入酶平行制備對照物。該對照樣品在其被置于瓊脂孔試驗孔中之后在37℃先保溫60分鐘，以比較在酶存在時所得的抑制孔和對照的抑制孔。對照抑制孔的直徑為27mm。
表I所示結果是在酶存在條件下用指示菌瑞士乳芽胞桿菌(N2)進行試驗得到的。在該表及表II中，所述酶是用其類型、供應商的名稱及供應商之目錄號命名的。數字0表示不再存在任何孔，換句話說，易變素的殺菌活性因后者與所述酶一起保溫而喪失。數字27表示仍然存在27mm孔，相應于易變素全部的殺菌活性。
表I
下表II所示結果是在所述酶存在條件下用指示菌保加利亞乳芽胞桿菌(YL5)進行試驗得到的。
表II
表I和表II所示結果表明，所有蛋白質水解性酶類都抑制所述易變素的殺菌活性。這些結果證明了這樣一個事實，所述易變素的本質是蛋白質，而該蛋白質部分與殺菌活性有關。
未發現過氧化氫酶對所述易變素的殺菌活性產生任何影響的事實還說明，雖然已知H2O2與細菌素有類似的活性，但兩指示菌生長受抑制并非是H2O2的抗菌活性，因為H2O2將被過氧化氫酶降解。含所述易變素培養物上清液的抑菌譜本瓊脂孔試驗用于確定含有本發明易變素培養物上清液的殺菌活性是否表現為對于不同芽胞和細菌的菌株生長的抑制活性。由此確定所述上清液的抑菌譜。
為了進行上述測定，將15ml標準培養基注入平皿中以得到105-106/ml標準培養基的菌濃度。其中，標準培養基是用15μl頭一夜制備的待測菌株培養物接種的，該培養基適于待測菌的生長。
而且，當待測菌由芽胞生長時，覆蓋培養基中以105-106芽胞/ml接種。
在每個平皿中打一個直徑5mm的孔。將如實施例1所述的50μl培養物上清液樣品置于其中。平皿于4℃預培養2小時，然后在所述菌適宜生長的溫度下培養直至出現肉眼可見的菌苔覆蓋平皿。
抑制作用的效果或程度的特征是所觀察到的抑制孔直徑。如果孔的直徑為18-28mm，抑制作用被認為非常強(++++)；如果孔的直徑為10-17mm，抑制作用強(+++)；如果直徑為5-9mm，抑制作用一般(++)；如果直徑為1-4mm，抑制作用弱；如果觀察不到孔存在，則抑制作用為0(-)。
用上述方法測試了不同種和亞種的32株乳酸菌，值得注意的是，它們之中無一對上清液有抗性。這些試驗的詳細結果示于下表III中。表III象下列各表一樣，菌株命名或所示菌株號是Neslte保藏中心所給的號(地址NESTECS.A.，Centre de Recherche，Vers-Chez-les-Blane，CH-1000 Lausanne26，Switzerland)。所示溫度為試驗過程中的培養溫度。所示培養基是適于待測菌生長的標準培養基。表III
從表III中注意到，上清液的抑菌譜很廣是從抑制程度對于所測試的不同菌種差不多在同一水平這一意義上講。
產生本發明易變素的培養物上清液之抑菌譜還被認為很廣是從它不限于乳酸菌菌種而且還擴展到G+菌的其它種這一意義上而言，尤其是例如人們不歡迎或病原性菌無害李斯特氏菌，Listeria Welhia、單核細胞增生李斯特氏菌，以及芽胞桿菌的芽胞，這一點正如由下表IV所示結果所證實的。表IV
表IV所示結果使得可以預測所述上清液或純化的易變素作為添加劑在制備食品中有吸引力的應用前景，其作用是抗病原菌的活性劑，尤其是抗肉制品中的梭狀芽胞桿菌，抗奶酪中的單核細胞增生李斯特氏菌、抗甜點奶油凍中的蠟狀芽胞桿菌和李斯特氏菌，或者抗鮮油面或做鮮油面之醬汁中的芽胞桿菌。
最后，如從下表V所示結果所能注意到的，易變素對G-菌的生長不產生任何抑制作用。表V
含易變素之上清液濃縮物的抑菌譜本方法如上所述，除了所確定的對不同芽胞和細菌的菌株生長產生的抑制作用是利用實施例2所述得到的上清液濃縮物。
與前文一樣測試相同的菌種和亞種。其結果示于下表VI、VII和VIII。菌株的命名或所示菌號是在Nestte保藏中心給出的(地址NESTEC S.A.，Centre de Recherche，Vers-Chez-Les-Blanc，CH-1000 Lausanne 26，Switzerland)所示溫度為試驗過程中的培養溫度。所示培養基是適于待測菌生長的標準培養基。
表VI
表VII
表VIII
表VI、VII和VIII所示結果證明，與上清液相比，上清液濃縮物在抑制許多待測菌生長方面的有效性增強了。觀察到了對相同菌種和亞種的抑制譜，但都是在更高的抑制水平上。
上文表明了如實施例2所述的易變素上清液濃縮物的制備及其在制備例如食品和化妝品中對抗病原菌的應用。pH耐受性本瓊脂孔試驗用于確定根據本發明分離出的易變素是否為pH依賴性。
為此，如前文“瓊脂孔試驗”中所述，用一指示菌接種瓊脂。瑞士乳芽胞桿菌(N2)被用作指示菌。
用2N NaOH和/或2N HCL將實施例2所述培養物上清液濃縮物提取物的pH值調節為2-10，該提取物在37℃保溫60分鐘，然后在將提取物樣品置于瓊脂孔試驗孔之前，將pH值再調至6-7。
利用pH7的相同上清液濃縮物平行地建立對照，在對照樣品置于瓊脂孔試驗孔之前先于37℃保溫60分鐘，以比較試驗樣品的抑制孔和對照的抑制孔。對照的抑制孔直徑為27mm。
象表X和XI中一樣，表IX中的數字27表示仍然存在27mm孔，相應于易變素的全部殺菌活性。表IX
上表所示結果表明易變素的殺菌活性并未受損。由此可以得出結論，易變素的殺菌活性不是pH依賴性的。對熱的耐受性本瓊脂孔試驗用于確定根據本發明分離出的易變素是否為熱依賴性。
為此，如前文瓊脂孔試驗中所述，用一指示菌接種瓊脂。用瑞士乳芽胞桿菌(N2)作為指示菌。
將實施例2中所述的培養物上清液之濃縮提取物的pH值調節為7，在其被置入瓊脂孔試驗孔之前，先于100℃保溫15-60分鐘。
利用所得的上清液濃縮物(pH7)平行地建立對照，并于37℃保溫60分鐘。這樣使得將該溫度下的試驗樣品抑制作用孔與對照的抑制作用孔相比較。對照的抑制作用孔直徑為27mm。表X
所得結果證明易變素不是熱依賴性的。因此，甚至在100℃保溫60分鐘之后易變素的殺菌活性也未受到損失。
易變素對熱的耐受性是將其用于制備食品和化妝品時的一個非常重要的生化特征。因此，可以將易變素(尤其是其粗提物或純化形式)用于制備經巴斯德法消毒的食品，以便對抗例如有耐熱性的芽胞桿菌的芽胞生長。對熱和對pH的耐受性除上述之外，還測試了易變素對pH和熱兩種因素相結合時的穩定性。
為此，用一指示菌接種瓊脂(如前文“瓊脂孔試驗”所示)。
瑞士乳芽胞桿菌(N2)被用作指示菌。
用2N HCl和/或2N NaOH將實驗例2所述培養物上清液濃縮提取物之pH調至4-7，并于115℃保溫20分鐘。在其樣品被置入瓊脂孔試驗孔中之前，再將提取物的pH調至6-7。
用在pH7所得的提取物平行地建立對照，在將對照樣品置入瓊脂孔試驗孔之前先于37℃保溫20分鐘，以便將試驗樣品的抑制孔與對照的抑制孔進行比較。對照抑制孔的直徑為27mm。
表XI
上表所示結果表明，易變素的殺菌活性在pH4或7并在伴隨溫度升高的條件下并不受損。易變素的純化用能夠產生本發明易變素的易變微球菌培養物接種4L BHI培養基。該標準培養物在需氧條件下于30℃搖育過夜，在此之后以5000g離心，以在加入了72g XAD-7樹脂(Amberlite(R))的收集管中收集所得上清液。
將混合物在25℃攪拌30分鐘，以便易變素分子易于粘附至樹脂上，然后將其整個轉移至多孔玻璃上，上清液在此以真空過濾。
用含20mM檸檬酸鈉(pH4)和異丙醇的3種緩沖液相繼洗滌樹脂。第一種緩中液含10％異丙醇；第二種緩沖液含15％異丙醇，第三種緩沖液含20％異丙醇。
將樹脂轉移至柱中，并用700ml含20mM檸檬酸鈉(pH4)和25％異丙醇的緩沖液洗脫。用前述瓊脂孔試驗監測易變素的殺菌活性。
將活性級分混合，異丙醇蒸發。通過以20mM檸檬酸鈉緩沖液平衡來制備進行FPLC的5ml S-Resource柱(Pharmacia)。將被蒸發的活性級分混合物上樣至柱上，用100-400mM梯度的NaCl緩沖液洗脫柱成分。
收集級分，用瓊脂孔試驗核查已被如此純化的易變素的殺菌活性。易變素的測序利用Applied Biosystem 4774自動測序儀對自菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587純化的易變素之N端部分測序。
結果顯示了與如下所示序列SEQ ID NO1之N端相同的5個氨基酸肽序列。
測序過程中不可能證明多于5個氨基酸的肽存在。
此外，將自菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587中純化的易變素用6N HCl水解10分鐘。得到了用常規方法經HPLC分離的三肽。測定已分離出的三肽之一是唯一的可能，因為其它的兩個很可能有肽修飾。
以上述方法分離的所述肽序列與下文所示序列SEQ ID NO1之氨基酸19-22相同。
最后，將含有自菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587分離的易變素之級分進行質譜分析，發現所述易變素分子量為2659道爾頓。同源性已證實了乳酸乳球菌乳酸素(Lacticin)481的序列與本發明易變素序列之間的同源性。該同源性具體地涉及到兩種細菌素的N端部分之序列。因此，易變素N端序列的氨基酸1-5等同于下文所示乳酸素481之序列SEQ ID NO8的氨基酸3-7。不過，這僅僅是部分同源而非完全相同。
此外，被分泌的乳酸素481經質譜分析顯示出分子量為2900道爾頓，而如我們前文所見，被分泌的易變素分子量為2659道爾頓。
當產生乳酸素481的乳酸乳球菌菌株在如上文抑菌譜試驗中所述的易變素提取物存在條件下進行接種時，可見所述菌株的生長受抑。產生乳酸素481的乳酸乳球菌菌株對其自身的細菌素乳酸素481有免疫力，但對由本發明的任一種易變微球菌菌株產生的易變素都沒有免疫力。以上述抑制譜試驗所得的這些結果證實了兩種細菌素是不同的。
上述的遺傳學結果表明了乳酸素481與易變素顯示出序列同源性，但其序列是不同的。生物化學以及微生物學結果也證明了乳酸素481和易變素是兩種不同的細菌素。易變素基因測序用常規方法構建簡并的核苷酸序列SEQ ID NO4，該序列如下文所列序列所示，并且相應于前文已測序易變素肽的C端部分。然后通過T4多核苷酸激酶向SEQ ID NO4序列的混合物提供放射活性。
以常規方法從菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587制備染色體DNA。根據所用酶供應商的說明，用SalI、SacI、SphI和BamHI消化所述DNA制備物。然后將2μg消化產物跑電泳。用250mM HCl洗電泳凝膠上的DNA，然后在堿性介質中將遷移產物從膠上轉移至“Zetaprobe”(Biorad)膜上。接下來將Zetaprobe膜于55℃預雜交，其溫度每2小時降5℃直至40℃，所用介質含6×SSC1％ SDS和0.25％脫脂奶粉。該膜在前述雜交液中與顯示序列SEQ IDNO4的變性放射性探針于相同溫度條件下雜交。然后置于40℃保溫4小時，之后用6×SSC于40℃漂洗膜。最后，將其于-80℃暴露于放射自顯影膜16小時。
雜交結果顯示了不同的遷移帶7kb的SalI帶，1.4kb SacI帶；1.8kbBamHI帶和大于15kb的SphI帶。
用BamHI消化菌株CNCM I-1586的5μg基因組DNA，經瓊脂糖凝膠層析并洗脫含所述片段的凝膠部分分離出1.6-2kb的片段。被洗脫的DNA片段與載體pK19(Gene，56(1987)309-312)連接，所述載體在進行連接之前已用BamHI消化，然后用牛小腸磷酸酶處理(Boehringer Mannheim，part No.713023)。
然后用連接反應介質以常規方法轉化已呈感受態的E.coli BZ 234(Biozentrum Collection-University of Basle，Switzerland)。在加入了50μg/ml卡那霉素60ng/ml IPTG(Boehringer Mannheim，part NO.724815)和300ng/ml X-gal(Boehringer Mannheim part NO.651745)并于37℃培養16小時的瓊脂培養基上鑒定含有插入片段的克隆。
白色菌落通常含有插入片段。將其挑出置入96孔微量滴定板中。每個白色菌落對應一個所述孔，每個孔含150μl補充了50μg/ml卡那霉素的LB培養基，在37℃保溫20小時，以產生微量培養物。
制備兩個方向相反的引物，因為載體PK19中基因的方向是未知的。為此，所述引物的構建是通過由顯示部分編碼乳酸素481的序列SEQ ID NO5的核苷酸片段將其組裝，該序列與PUC載體的通用探針中的兩者之一相連，所述探針具有序列SEQ ID NO6或序列SEQ ID NO7。
每孔取1μl與100Pmol所述引物之一，ZmM dNTP各6μl和2.5μlTaq緩沖液(P.H.Stehelin & Cie AG，Cat.No.TPO5b)混和，再用一滴Dyna-Wax(Finnzymes Oy，62201 Espoo，Finland)將整個封住，加熱至98℃持續10分鐘以裂解細菌，然后進行PCR。
陽性克隆在電泳凝膠上產生一條800bp帶。
以這種方法挑選陽性克隆，并提取這些克隆的質粒DNA。利用測序試劑盒(Pharmacia Bioteeh，part NO.27-1682-01)和通用引物，繼而再用以所得序列為基礎的特異性引物經雙脫氧核苷酸法測定克隆到載體pK19中的DNA片段。
這樣就得到了下文所示的核苷酸序列SEQ ID NO2。所述核苷酸序列編碼序列SEQ ID NO1，后者相當于成熟之前的易變素氨基酸序列。
下面的實施例通過說明本發明細菌素的生產方法及其應用來進行描述。實施例中除非另外指明，所給出的百分比都是重量百分比。實施例1BHI培養基被接種，含易變微球菌菌株的培養物被加至其中。將其于30℃C在需氧條件下搖育過夜，之后，培養基達到108菌體/ml。將如此所得的標準培養物離心。收集標準上清液。實施例2從如實施例1所述的750ml上清液中得到上清液濃縮物，向其中加入15gXAD-7樹脂(Am-berlite(R))。混合物于4℃振搖60分鐘，然后通過No.604Schleicher & Schuell(Germany)濾器過濾。用1％檸檬酸鈉沖洗濾器，以便洗脫所有非吸附蛋白。分離樹脂，并轉移至含檸檬酸鈉的收集管中，搖動2分鐘。樹脂與檸檬酸鈉一起轉移至柱中，以50％乙腈和0.1％TFA洗脫檸檬酸鈉。將洗脫液蒸發，殘余物重懸于50mM磷酸鹽緩沖液中(pH6.8)。實施例3在BHI培養基中，于30℃在需氧條件下搖育過夜，產生10升易變微球菌培養物。然后將200g XAD-7樹脂(Amberlite)直接加入培養物中，兩者一起于4℃緩和振搖1小時。然后將混合物通過No.604 Schleicher & Schuell(Germany)濾器過濾。滯留于濾器上的樹脂用10升50mM乙酸(pH5.2)溶液沖洗以除菌。之后，將含100％乙醇和20mM乙酸銨的450ml溶液加到樹脂上；濾液被凍干以得到含本發明易變素的粉末，它可用于食品工業。
利用上文描述的瓊脂孔試驗確定先經水稀釋的易變素粉末的殺菌活性。該粉末具有至少105au/g粉末。
最后，將上述粉末以0.5g/kg加入按傳統方法正在制備的肉泡沫中。這樣使得每克肉泡沫含50au細菌素，這足以完全抑制病原菌的發育，尤其是梭狀芽胞桿菌。實施例4本實施例涉及用于護膚的保濕霜的制備，它含有0.05g/kg的實施例3所述粉末，這就是說所含能夠抑制皮膚上不希望有的細菌發育， 尤其是金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌的易變素比例為5au/g。
為了制備所述乳劑，將脂相A的成分混合，并加熱至75℃。制備水相B，也加熱至75℃；在緩慢混合的同時再加入脂相A，之后在緩慢混合的同時將其冷卻至室溫，即大約25℃。在該溫度下緩慢加入C成分完成配制。脂相A
水相B
添加劑C
實施例5將實施例3所述細菌素粉末以0.5g/kg的比例加入漱口藥中。該漱口藥繼而能夠抑制病原菌，尤其是Streptococcus sobrinus、血鏈球菌、變異鏈球菌和粘性放線菌在頰腔中生長。實施例6將含有用水稀釋為1％的實施例3細菌素粉末噴霧至意欲消毒的食品上，以防止包裝過程中的后續污染。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名SOCIETE DES PRODUITS NESTLE(B)街道AVENUE NESTLE 55(C)城市VEVEY(D)州或省CANTON DE VAUD(E)國家SWITZERLAND(F)郵編1800(G)電話(041) 21 924 34 20(H)電傳(041) 21 924 28 80(ii)發明名稱細菌素(iii)序列數8(iv)計算機的可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體易變微球菌(C)個體分離物兩個克隆，CNCM I-1586和CNCM I-1587(xi)SEQ ID NO1的序列描述
Gly Ser Gly Val Ile Pro Thr Ile Ser His Glu Cys His Met Asn1 5 10 15Ser Phe Gln Phe Val Phe Thr Cys Cys Ser20 25(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度287bp(B)類型氨基酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體易變微球菌(C)個體分離物兩個克隆，CNCM I-1586和CNCM I-1587(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置88..228(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)特征88..153(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat_peptide(B)位置154..228(xi)序列描述SEQ ID NO2GTTGAAAATC ATCCGGAAGG ATGATTCTGT GTTCATGCGA GGCCACCCGG AATCGCGGCA60GCCACACCCA CTGAGAGGAC TAGAACA ATG ACG AAC GCA TTT CAG GCA CTG 111Met Thr Asn Ala Phe Gln Ala Leu-22 -20 -15GAC GAA GTC ACG GAC GCC GAG CTC GAC GCC ATC CTT GGC GGG GGC AGT159Asp Glu Val Thr Asp Ala Glu Leu Asp Ala Ile Leu Gly Gly Gly Ser-10 -51GGT GTT ATT CCC ACG ATC AGC CAC GAG TGC CAC ATG AAC TCC TTC CAG207Gly Val Ile Pro Thr Ile Ser His Glu Cys His Met Asn Ser Phe Gln5 10 15TTC GTG TTC ACC TGC TGC TCC TGAGAAACTC CTCCGATGCT CAGAGGGCCG258Phe Val Phe Thr Cys Cys Ser20 25CGCTAGGAAA ATCTAGTAAG278(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度47個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Thr Asn Ala Phe Gln Ala Leu Asp Glu Val Thr Asp Ala Glu Leu-22 -20 -15 -10Asp Ala Ile Leu Gly Gly Gly Ser Gly Val Ile Pro Thr Ile Ser His-5 1 5 10Glu Cys His Met Asn Ser Phe Gln Phe Val Phe Thr Cys Cys Ser15 20 25(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度 23bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(iii)假設序列是(xi)序列描述SEQ ID NO4TGGCARTTYG TNTTYACNTG YTG 23(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度44bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(iii)假設序列是(xi)序列描述SEQ ID NO5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(iii)假設序列是(xi)序列描述SEQ ID NO6ATAACAATTT CACACAGG 18(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(iii)假設序列是(xi)序列描述SEQ ID NO7GGTTTTCCCA GTCACGAC 18(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO8Lys Gly Gly Ser Gly Val Ile1 權利要求
1.得自易變微球菌的細菌素，其特征在于它具有氨基酸序列SEQ ID NO1
2.根據權利要求1的細菌素，其特征在于因1-4個氨基酸的一次取代、一次缺失和/或一次插入而不同于序列SEQ ID NO1。
3.編碼權利要求1之易變微球菌細菌素的核苷酸片段。
4.根據權利要求3的片段，其特征在于它含有序列SEQ ID NO2的核苷酸88-228。
5.根據權利要求3或4的核苷酸片段，其特征在于它含有序列SEQ ID NO2的核苷酸154-228。
6.根據權利要求3或4的核苷酸片段，其特征在于它含有序列SEQ ID NO2的核苷酸88-153。
7.由權利要求6之核苷酸序列編碼的易變微球菌信號肽。
8.產生權利要求1或2之細菌素的易變微球菌菌株，特別是菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587。
9.制備權利要求1或2之細菌素的方法，其特征在于在培養基中和適于菌株生長的條件下培養產生所述細菌素的易變微球菌，以得到107-1011菌體/ml的培養基，在此之后將所得培養物離心，制備含所述細菌素的上清液提取物。
10.根據權利要求9的方法，其特征在于所述易變微球菌菌株是菌株CNCM I-1586或CNCM I-1587。
11.根據權利要求1或2的細菌素，尤其是根據權利要求9所得的提取物形式的細菌素和/或產生所述細菌素的易變微球菌在制備食品、化妝品和藥品中的應用，尤其是在皮膚學和口腔-牙齒用品中的應用。
全文摘要
本發明涉及易變微球菌細菌素、產生所述細菌素的菌株，尤其是菌株CNCM I-1586和CNCM I-1587以及制備該細菌素的方法和該細菌素在制備食品和化妝品中作為抗病原菌活性劑的應用。
文檔編號A23L3/3526GK1150601SQ9611215
公開日1997年5月28日 申請日期1996年8月6日 優先權日1995年8月7日
發明者B·莫列特, J·皮爾, D·普里莫爾, N·列基夫, B·蘇里 申請人:雀巢制品公司