專(zhuān)利名稱(chēng)：骨髓基質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)展的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
骨髓是由造血細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜的，動(dòng)態(tài)的器官系統(tǒng)。骨髓內(nèi)的多能干細(xì)胞增殖并分化成包括紅細(xì)胞和白細(xì)胞的多種細(xì)胞類(lèi)型。一段時(shí)間以來(lái)，已知干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)系對(duì)于此過(guò)程而言是至關(guān)重要的。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的研究已表明在造血干細(xì)胞能生長(zhǎng)和分化之前必需確立貼壁的基質(zhì)細(xì)胞層。
骨髓基質(zhì)細(xì)胞是由其形態(tài)學(xué)和功能確定的細(xì)胞不均一的群體。在細(xì)胞培養(yǎng)中，它們具有特征性的紡錘形形態(tài)，并分泌生長(zhǎng)因子和形成胞外基質(zhì)的成分。在響應(yīng)于表皮生長(zhǎng)因子(EGF；Kimura等人，1988,Br.J.Hematol,69:9-12)，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF；Kimura等人，文獻(xiàn)同上)，和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF；Kimura等人，文獻(xiàn)同上；Oliver等人，1990，生長(zhǎng)因子，3:231-236)的培養(yǎng)中，基質(zhì)細(xì)胞顯示出分裂。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)基于多年前的觀察結(jié)果，即腦的提取物可以刺激成纖維細(xì)胞的分裂(見(jiàn)Thomas,1987，美國(guó)聯(lián)邦實(shí)驗(yàn)生物學(xué)(學(xué)會(huì))聯(lián)合會(huì)雜志(FASEBJ.),1:434-440)。從此分離出特殊的FGF，目前此家族至少含有7個(gè)成員，包括酸性和堿性FGF(aFGF和bFGF)。這兩種因子由不同的單拷貝基因編碼，在氨基酸水平上僅有55％相同(Thomas，文獻(xiàn)同上)。
正如大多數(shù)生長(zhǎng)因子，F(xiàn)GF通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合而發(fā)揮它們的促分裂活性。最近已鑒定出4個(gè)相關(guān)的FGF受體(FGFR1-FGFR4)，每種FGF受體以多種形式存在，對(duì)于每種受體形式而言，aFGF和bFGF的相對(duì)親合力有所不同(參見(jiàn)Burgess等人，1989，生物化學(xué)年鑒(Ann.Rev.Biochem),58:575-606；Dionne等人，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Ann.N.Y.Acad.Sci),638:161-166；Johnson等人，1993，癌癥研究進(jìn)展(Adv.CancerRes.),60:1-41)。堿性和酸性FGF對(duì)肝素的反應(yīng)也有所不同，在細(xì)胞培養(yǎng)中，肝素與兩種FGF都絡(luò)合，但實(shí)際上只增加aFGF的促分裂活性(Thomas，文獻(xiàn)同上)。
對(duì)于涉及造血細(xì)胞的很多疾病而言，骨髓移植或植入是有希望的療法。移植可用于取代被內(nèi)在的疾病，如貧血癥破壞的細(xì)胞，或者在造血細(xì)胞被化學(xué)療法或放射性療法破壞的情況下。移植可以是自身移植，即病人可作為他或她自己的供體?；蛘?，病人可接受組織相容性供體的骨髓。然而，迄今為止，培養(yǎng)能被移植和用于多種基因療法的骨髓，尤其是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的條件仍未最優(yōu)化。基于基質(zhì)細(xì)胞修飾的基因療法的主要障礙是獲得治療上有用數(shù)目的基質(zhì)細(xì)胞。因此，盡管可成功地移植骨髓，但需要成功地移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞的基因療法仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明是培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的新方法，本發(fā)明基于以下的發(fā)現(xiàn)，即酸性FGF(aFGF)，或aFGF和肝素的聯(lián)合能顯著增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的確立和隨后的擴(kuò)展。通過(guò)利用此方法，在培養(yǎng)中骨髓基質(zhì)細(xì)胞可被擴(kuò)展成前所未有的水平，這對(duì)于治療用途顯然是有利的。因此，此培養(yǎng)方法使得骨髓基質(zhì)細(xì)胞可用于多種類(lèi)型的基因療法。
一般情況下，本發(fā)明的特征在于擴(kuò)展骨髓基質(zhì)細(xì)胞以得到總數(shù)至少為107，優(yōu)選為109以上的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法。此方法包括步驟(a)例如從骨髓抽吸液中得到骨髓基質(zhì)細(xì)胞；(b)將基質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)入其內(nèi)壁已被明膠(gelatin)，如1.0％的明膠(gelatin)水溶液預(yù)包被的容器中，該容器中含有包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“aFGF”)多肽的培養(yǎng)基；和(c)在足以得到增加數(shù)目的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的條件和時(shí)間下，在培養(yǎng)基中擴(kuò)展基質(zhì)細(xì)胞。在此方法中，培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)選地包括至少0.05單位/ml的肝素多肽。在導(dǎo)入骨髓基質(zhì)細(xì)胞之前，容器內(nèi)壁還可被胎牛血清預(yù)包被。
具體地說(shuō)，培養(yǎng)基中可包括1.0-50.0％(體積百分比)的胎牛血清，0.01-100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100單位/ml的肝素多肽。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中包括16.0％(體積百分比)的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF多肽，和5.0單位/ml的肝素多肽。
在本發(fā)明優(yōu)選的方面，擴(kuò)展步驟(c)包括步驟(ⅰ)從容器中除去培養(yǎng)基和非貼壁的細(xì)胞；(ⅱ)在容器中加入一定量的新鮮培養(yǎng)基；(ⅲ)從容器中除去培養(yǎng)基和非貼壁的細(xì)胞，離心培養(yǎng)基和非貼壁的細(xì)胞以形成非貼壁細(xì)胞的沉淀物；(ⅳ)將非貼壁細(xì)胞的沉淀物重新懸浮于取自容器的一定量的培養(yǎng)基中以形成非貼壁細(xì)胞的混合物；和(ⅴ)將非貼壁細(xì)胞的混合物返回容器中。在此方法中，步驟(ⅱ)中的新鮮培養(yǎng)基的量和步驟(ⅳ)中取自容器以重新懸浮非貼壁細(xì)胞沉淀物的培養(yǎng)基的量相等。具體地說(shuō)，當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞已貼附于容器的內(nèi)壁之后，即可進(jìn)行步驟(ⅰ)，在步驟(ⅰ)之后約1周即可進(jìn)行步驟(ⅱ)和步驟(ⅲ)。
在這些方法的每一種中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以是得自活的或死的脊椎動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物之骨髓原始抽吸液的新鮮的基質(zhì)細(xì)胞，或者可得自取自脊椎動(dòng)物，如人，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，奶牛，狗，豬，或其它動(dòng)物的骨。骨髓基質(zhì)細(xì)胞也可得自骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物或骨髓基質(zhì)細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)液。
本發(fā)明的特征還在于完全的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，它包括大于12.5％(體積百分比)的胎牛血清，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“aFGF”)多肽，和肝素多肽。具體地說(shuō)，培養(yǎng)基可包括12.6-50％(體積百分比)的胎牛血清，0.01-100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100單位/ml的肝素多肽。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中包括16.0％(體積百分比)的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF多肽，和5.0單位/ml的肝素。培養(yǎng)基中可進(jìn)一步地包括殺真菌劑，如濃度為25μg/ml兩性霉素B，和一種或多種抗生素，如25μg/ml的慶大霉素，100單位/ml的青霉素和100μg/ml的硫酸鏈霉素。
另一方面，本發(fā)明的特征在于選擇和擴(kuò)展骨髓基質(zhì)細(xì)胞的試劑盒。此試劑盒包括一種或多種其內(nèi)壁被明膠，如1.0％的明膠水溶液包被的培養(yǎng)容器多肽，和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中包括aFGF多肽和肝素多肽。培養(yǎng)基可以是液體或凍干的粉末，可以在容器內(nèi)或分別地被提供。
本文所用的“aFGF多肽”是與天然產(chǎn)生的aFGF蛋白的全部或部分氨基酸序列相同，或基本上相同的任何多肽，并且對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞而言，所述多肽與天然的或如本文所述的全長(zhǎng)重組aFGF具有基本上相同的功能。因此，術(shù)語(yǔ)包括重組的aFGF(如由LifeTechnologies公司，紐約長(zhǎng)島，制備的#13241-013)，“aFGF類(lèi)似物”，即aFGF的突變形式，和全長(zhǎng)aFGF蛋白及類(lèi)似物的天然或合成的多肽片斷，條件是這些類(lèi)似物和片斷對(duì)于如本文所述的骨髓基質(zhì)細(xì)胞而言，與天然的或全長(zhǎng)重組的aFGF具有基本上相同的功能。通過(guò)使用下述的培養(yǎng)方法可容易地檢測(cè)這些類(lèi)似物和片斷的功能。不能用這些方法提供至少107個(gè)細(xì)胞的酸性FGF類(lèi)似物和片斷不在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
類(lèi)似地，“肝素多肽”是具有與天然產(chǎn)生的肝素蛋白全部或部分氨基酸序列相同，或基本上相同的多肽，對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞而言，所述肝素與如本文所述的天然的肝素具有基本上相同的功能。因此，術(shù)語(yǔ)包括天然的肝素或經(jīng)化學(xué)修飾的天然肝素，如肝素鈉(ElkinsSinn公司，CherryHill,NJ)，重組肝素，“肝素類(lèi)似物”，即突變型肝素，和全長(zhǎng)肝素蛋白及類(lèi)似物的天然或合成的多肽片斷，條件是這些類(lèi)似物和片斷對(duì)于如本文所述的骨髓基質(zhì)細(xì)胞而言，與天然肝素具有基本上相同的功能。使用下述培養(yǎng)方法可檢測(cè)肝素的功能。
“多肽”是指任何鏈型氨基酸，不論其長(zhǎng)度或翻譯后的修飾如何，所述修飾如糖基化，磷酸化或化學(xué)修飾，因此多肽包括天然和合成的肽和蛋白質(zhì)。
aFGF或肝素的“突變形式”是指與天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相比，其氨基酸序列中包含任何變化的多肽，條件是突變形式對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞而言，與天然的或如本文所述的全長(zhǎng)重組的蛋白質(zhì)具有基本上相同的功能。通過(guò)例如化學(xué)能量，如X-射線可自發(fā)產(chǎn)生這些變化，或者通過(guò)其它形式的誘變，基因工程，或作為編碼aFGF多肽的遺傳信息交配或其它形式的交換結(jié)果也可產(chǎn)生這些變化。突變可包括例如取代，缺失，插入，倒位，易位或重復(fù)。優(yōu)選突變是保守的取代，如在下列組內(nèi)的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸，賴(lài)氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
本文所用的與多肽相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“相同的”是指兩個(gè)多肽之間氨基酸序列的相似性。當(dāng)兩個(gè)多肽的氨基酸位置被相同的氨基酸所占據(jù)時(shí)，則它們?cè)谒鑫恢蒙鲜窍嗤?。因此，“基本上相同”是指與參照的氨基酸序列有至少80％，優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％相同的氨基酸序列，并且該序列保留了與參照序列相同的功能活性。典型地，可使用序列分析軟件(如序列分析軟件程序包，GeneticsComputerGroup，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，1710UniversityAvenue,Madison,Wi53705)檢測(cè)氨基酸序列的同一性。
本文所用的細(xì)胞的“擴(kuò)展”是指在使細(xì)胞不僅能生長(zhǎng)和興旺，還能增殖以使在擴(kuò)展結(jié)束時(shí)比擴(kuò)展開(kāi)始時(shí)得到更多數(shù)目的細(xì)胞。
本文所用的“傳代”是指這樣的過(guò)程，在此過(guò)程中從組織培養(yǎng)容器上脫附達(dá)到一定數(shù)目，或一定密度，直到，包括并超過(guò)鋪滿(mǎn)狀態(tài)的細(xì)胞，收集于聚集體，如通過(guò)離心形成的沉淀物中，并重新懸浮于組織培養(yǎng)基中。然后將懸浮液分布于組織培養(yǎng)容器，如培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，采取的方式應(yīng)使細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂所能利用的總的表面積比它們先前能利用的要大。通過(guò)增加容器的數(shù)目可以做到這一點(diǎn)。例如，在一個(gè)容器中生長(zhǎng)的細(xì)胞可被脫附，收集，重新懸浮，并分布到兩個(gè)或更多個(gè)容器中。此過(guò)程也包括給細(xì)胞提供支持細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的一定量的組織培養(yǎng)基。
除非另有定義，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義相同。盡管可以在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中使用與本文所述相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧希挛闹袑⒁枋鰞?yōu)選的方法和材料。另外，材料，方法和實(shí)施例只是為了闡明而不是限制本發(fā)明。
從下文詳細(xì)的描述和權(quán)利要求書(shū)看，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。
圖的簡(jiǎn)述
圖1是顯示在存在或缺乏aFGF和肝素時(shí)培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)每次傳代細(xì)胞數(shù)目百分比變化測(cè)量生長(zhǎng)。
圖2是顯示在存在或缺乏aFGF和肝素時(shí)培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的總生長(zhǎng)曲線。
圖3是顯示通過(guò)被轉(zhuǎn)染的犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外表達(dá)和分泌人生長(zhǎng)激素(hGH)的圖。
詳細(xì)的說(shuō)明為了產(chǎn)生能用于移植的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，從人或狗體內(nèi)得到骨髓，并在特殊制備的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)之。另外，用酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)和肝素修飾培養(yǎng)基，并根據(jù)特殊的制度更新培養(yǎng)基。使用此新方法，可在培養(yǎng)中確立大量骨髓基質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞可被擴(kuò)展以產(chǎn)生前所未有的大量的細(xì)胞，這對(duì)于使用基質(zhì)細(xì)胞的有效的基因療法是必要的。
接下去將描述培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法，并描述通過(guò)轉(zhuǎn)染的犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外分泌人生長(zhǎng)激素(hGH)。培養(yǎng)犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法將犬全身麻醉，從髂嵴處無(wú)菌抽取全部的骨髓，抽取用的注射器中含有肝素以防止凝血。將骨髓從注射器中轉(zhuǎn)移到含有15ml預(yù)冷的組織培養(yǎng)基，如RPMI或DMEM的50ml的錐形管中，所述培養(yǎng)基中含有抗真菌劑和抗生素(50μg/ml兩性霉素B；50μg/ml的慶大霉素；100單位/ml的青霉素；100μg/ml的硫酸鏈霉素)。在每管培養(yǎng)基中加入大約10-15ml骨髓抽取液，將混合物置于冰上。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll墊層技術(shù)(Ficoll cushion technique)由骨髓樣品制備成核細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將15ml的FICOLL-PAQLUETM(PharmaciaBiotech)置于50ml的錐形管中，每份骨髓-培養(yǎng)基樣品中的一半在Ficoll的頂端小心成層，在18℃下，以400×g將樣品離心30分鐘，離心時(shí)關(guān)掉制動(dòng)器以使離心時(shí)間過(guò)后，離心用的轉(zhuǎn)頭能緩慢地減速。移出并棄去所得制品的上層，上層中含有無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基。小心收集含有成核細(xì)胞的中層，并將中層置于含有20ml如上所述的組織培養(yǎng)基的新用的50ml管中。加入另外的培養(yǎng)基以使終體積為50ml。
成核細(xì)胞包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞，然而，基質(zhì)細(xì)胞僅占得自骨髓抽取液的成核骨髓細(xì)胞總數(shù)的一小部分，即約千分之一。
通過(guò)在100×g下離心10分鐘將成核細(xì)胞收集到沉淀物中，用組織培養(yǎng)基(含有25μg/ml兩性霉素B,25μg/ml慶大霉素，100單位/ml青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI或DMEM)洗滌細(xì)胞沉淀物，并重新懸浮于5-10ml“完全的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基”(complete bone marrow stromal cellmedium)(“完全培養(yǎng)基”)中，重新懸浮后計(jì)數(shù)細(xì)胞。
一般情況下，完全的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基含有下列量或濃度范圍內(nèi)的下列成分，含有1-50％，優(yōu)選大于12.5％的胎牛血清(FBS)；0.01-100ng/ml的aFGF多肽，如重組的aFGF；0.05-100單位/ml的肝素，如肝素鈉；0.25-250μg/ml兩性霉素B；0.25-250μg/ml的慶大霉素；1-1000單位/ml的青霉素；和1-1000μg/ml的硫酸鏈霉素的DMEM。在下述實(shí)驗(yàn)中所用的完全培養(yǎng)基為含有16％(體積百分比)熱滅活的FBS,aFGF(1ng/ml)，肝素(5單位/ml)，兩性霉素B(25μg/ml)，慶大霉素(25μg/ml)，青霉素(100單位/ml)和硫酸鏈霉素(100μg/ml)的DMEM。
優(yōu)選首先用明膠和FBS包被組織培養(yǎng)瓶(T150cm2)。具體地說(shuō)，在每個(gè)瓶中加入明膠溶液(Sigma；1％的水溶液)直至瓶的底部剛好被覆蓋。除去過(guò)量的溶液，在室溫下將培養(yǎng)瓶底朝下(bottom side down)靜置至少30分鐘。此時(shí)冷藏培養(yǎng)瓶以供下一步使用。然后在明膠化的培養(yǎng)瓶中加入熱滅活的FBS，如前所述，除去過(guò)量的溶液，在室溫下將培養(yǎng)瓶底朝下靜置至少30分鐘。此時(shí)可使用該培養(yǎng)瓶，也可冷藏。
以大約1×108個(gè)細(xì)胞/T150培養(yǎng)瓶的密度將如上制備的骨髓成核細(xì)胞加入制備好的培養(yǎng)瓶中。在33℃,5％的CO2存在下，在15ml骨髓完全培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞。3-4天后，或者當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞已貼附至組織培養(yǎng)容器的內(nèi)壁時(shí)，在培養(yǎng)物中滴加15ml新鮮的完全培養(yǎng)基，因此細(xì)胞未受干擾。1周后，在培養(yǎng)基中重要的成分耗盡之前，除去所謂的“條件培養(yǎng)基”，即培養(yǎng)瓶中含有非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)瓶中加入15ml新鮮的完全培養(yǎng)基。通過(guò)在500×g下離心5分鐘沉淀非貼壁的細(xì)胞，重新懸浮于15ml條件培養(yǎng)基中，并返回到最初的培養(yǎng)瓶中。因此，非貼壁的細(xì)胞被返回到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基以含有一部分新鮮培養(yǎng)基，一部分條件培養(yǎng)基的方式被改變。
一般情況下，細(xì)胞培養(yǎng)制度的關(guān)鍵在于(1)用明膠溶液包被組織培養(yǎng)容器的內(nèi)壁，(2)當(dāng)交換培養(yǎng)基時(shí)，一直將非貼壁的細(xì)胞返回培養(yǎng)物中，(3)加入含有足夠營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基以維持生長(zhǎng)，無(wú)需取出由骨髓細(xì)胞分泌的能增強(qiáng)其生長(zhǎng)的所有物質(zhì)，(4)補(bǔ)充含有aFGF的組織培養(yǎng)基，和(5)補(bǔ)充含有肝素的組織培養(yǎng)基。
非貼壁細(xì)胞被取出，沉淀，并返回到含有等量新鮮和條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中的此過(guò)程被1周重復(fù)1次，達(dá)2-3周，或直至形成單層貼壁細(xì)胞。一旦形成骨髓基質(zhì)細(xì)胞單層，可通過(guò)將它們以1∶2或1∶3分開(kāi)至新用的培養(yǎng)瓶中以使細(xì)胞傳代。此時(shí)，和從此時(shí)開(kāi)始，用明膠，而不是FBS包被用于進(jìn)一步傳代的培養(yǎng)瓶。也不再需要用條件培養(yǎng)基飼養(yǎng)確立的基質(zhì)細(xì)胞，或者將非貼壁的細(xì)胞返回到培養(yǎng)物中?？梢砸源朔绞綄⒓?xì)胞至少傳代8次或更多次。
使用此方法可從犬或人(或其它脊椎動(dòng)物)的個(gè)體受試者的骨髓抽取液中體外選擇和擴(kuò)展骨髓基質(zhì)細(xì)胞，以使總細(xì)胞數(shù)超過(guò)108，甚至超過(guò)3×109。也可使用得到骨髓的其它技術(shù)。通過(guò)此方法得自狗的骨髓基質(zhì)細(xì)胞顯示出成纖維細(xì)胞-樣骨髓基質(zhì)細(xì)胞的特征性表現(xiàn)。假定基因療法的成功取決于足夠水平的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細(xì)胞生產(chǎn)，該水平可能很低，在培養(yǎng)中將基質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)展為108-109或更多的能力即可代表實(shí)質(zhì)上的改善。
盡管不論存在aFGF和肝素與否，得自原始的犬骨髓抽取液的基質(zhì)細(xì)胞在P0(第0代)都可確立其自身，但只有在這兩種因子存在時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞在第一次或第二次傳代后才能繼續(xù)生長(zhǎng)良好。另外，與不用這兩種因子培養(yǎng)的細(xì)胞相比，用aFGF和肝素培養(yǎng)的細(xì)胞能將成纖維細(xì)胞-樣基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)維持更長(zhǎng)的時(shí)間。
實(shí)施例如上所述，從被稱(chēng)為ALG-5的狗體內(nèi)制備髂嵴骨髓抽取液，將所述抽取液分成兩份，以使一半細(xì)胞可以用aFGF和肝素培養(yǎng)，另一半細(xì)胞可以不用aFGF和肝素培養(yǎng)。用2.75×107個(gè)原代骨髓細(xì)胞接種組織培養(yǎng)瓶并通過(guò)上述方法培養(yǎng)，其中在第一次傳代時(shí)將基質(zhì)細(xì)胞-條件培養(yǎng)基和非貼壁細(xì)胞返回到培養(yǎng)瓶中。當(dāng)所有的培養(yǎng)瓶中含有基質(zhì)細(xì)胞的鋪滿(mǎn)層時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用得自各個(gè)P0培養(yǎng)瓶的2.5×106個(gè)細(xì)胞接種T75培養(yǎng)瓶(第1代，P1)。1周后收集這些細(xì)胞，仍在存在或缺乏aFGF和肝素時(shí)下將每個(gè)培養(yǎng)瓶中的2×106個(gè)細(xì)胞傳代(P2)。
類(lèi)似地，接種后8天收獲P2細(xì)胞，將1×106個(gè)細(xì)胞傳代至P3培養(yǎng)瓶中。此時(shí)由于在缺乏aFGF和肝素時(shí)，經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目受到限制，故被傳代的細(xì)胞數(shù)目有所減少；只有1×106個(gè)細(xì)胞可用于再接種。用此數(shù)目的細(xì)胞再接種所有的培養(yǎng)瓶以使每個(gè)培養(yǎng)瓶能繼續(xù)維持差不多大小的群體。
接種后8天收獲第3代(P3)細(xì)胞，將1×106個(gè)細(xì)胞接種至P4培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)使細(xì)胞傳代，并在每次收獲和再接種時(shí)仔細(xì)計(jì)數(shù)細(xì)胞。第4次傳代之后，在存在aFGF和肝素時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞(7天)比缺乏這兩種因子時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞(14天)能更快地達(dá)到鋪滿(mǎn)狀態(tài)。
通過(guò)將每次傳代結(jié)束時(shí)收獲的細(xì)胞數(shù)目與每次傳代開(kāi)始時(shí)接種到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)目相比較，測(cè)定出細(xì)胞數(shù)目的百分比變化，正數(shù)表示細(xì)胞數(shù)目的增加，負(fù)數(shù)表示細(xì)胞數(shù)目的減少，零值表示細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有變化。在所有原代培養(yǎng)(P0)的培養(yǎng)瓶中都確立了貼壁的基質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)P0結(jié)束時(shí)，在缺乏aFGF和肝素的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞數(shù)較多(圖1)。盡管兩組細(xì)胞在P1的過(guò)程中都擴(kuò)展，但在存在aFGF和肝素時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)比缺乏aFGF和肝素時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞要高2.5倍。也許更重要的是，用aFGF和肝素培養(yǎng)的細(xì)胞在第2,3,4和5代仍能在數(shù)目上有所增加，而不用aFGF和肝素培養(yǎng)的細(xì)胞在這些代中生長(zhǎng)得很差，或者根本就不生長(zhǎng)。
圖1中在P0時(shí)對(duì)所有培養(yǎng)瓶而言的負(fù)數(shù)反映了這樣一個(gè)事實(shí)，即在原始的骨髓抽取液中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞僅是成核細(xì)胞總?cè)旱囊恍〔糠?，并進(jìn)一步闡明了aFGF和肝素對(duì)體外犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。
也在存在或缺乏aFGF和肝素時(shí)計(jì)算了得自狗ALG-5的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的總的生長(zhǎng)。通過(guò)將確立期結(jié)束時(shí)每個(gè)培養(yǎng)瓶中基質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)(+/-aFGF和肝素)乘以第一次傳代時(shí)細(xì)胞數(shù)目的平均百分比變化測(cè)定出此圖(總生長(zhǎng))。對(duì)于隨后的每次傳代，按類(lèi)似方法計(jì)算出總生長(zhǎng)(圖2)，如圖2所示，不用aFGF和肝素的培養(yǎng)基本上未顯示生長(zhǎng)。另一方面，到P6為止，添加了aFGF和肝素的培養(yǎng)顯示出顯著的經(jīng)計(jì)算的生長(zhǎng)，直至超過(guò)60×107個(gè)細(xì)胞。
在每次傳代結(jié)束時(shí)，就在它們被胰蛋白酶消化和收獲前，也可以肉眼觀察到得自狗ALG-5的細(xì)胞。用aFGF和肝素培養(yǎng)的細(xì)胞將其成纖維細(xì)胞-樣的形態(tài)維持了很多代，而不用aFGF和肝素培養(yǎng)的細(xì)胞在第一或第二代之后即變成平扁的形態(tài)。
總之，這些結(jié)果表明aFGF和肝素能明顯地增強(qiáng)犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能在培養(yǎng)中維持這些細(xì)胞的特征性的成纖維細(xì)胞-樣形態(tài)。
培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法從髖部復(fù)位(hip replacement)手術(shù)過(guò)程中丟棄的股骨頭中抽取人骨髓，也可使用其它得到骨髓的技術(shù)。將骨髓置于含有組織培養(yǎng)基的管中，所述培養(yǎng)基如含有50μg/ml兩性霉素B和50μg/ml慶大霉素的RPMI或DMEM。使用無(wú)菌剪刀將懸浮在培養(yǎng)基中的骨和組織細(xì)細(xì)地切碎，在500×g下離心10分鐘，并通過(guò)緩慢地倒轉(zhuǎn)試管使沉淀物重新懸浮于含有16％熱滅活的FBS的組織培養(yǎng)基中。然后放置約1分鐘以使較大的骨和組織片段沉至試管的底部。小心移出含有懸浮細(xì)胞的上清液，并在500×g下離心10分鐘。通過(guò)在完全的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中離心將細(xì)胞沉淀物洗滌1次，并重新懸浮于新鮮的完全培養(yǎng)基中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。與上文對(duì)狗的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)所描述的相同，最初在被明膠和FBS預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中，以1×108個(gè)細(xì)胞/T150培養(yǎng)瓶培養(yǎng)這些原代骨髓細(xì)胞。
使用相同的技術(shù)和上述的完全培養(yǎng)基體外選擇和擴(kuò)展人骨髓基質(zhì)細(xì)胞。另外，將人股骨的小片段導(dǎo)入含有完全培養(yǎng)基的制備好的組織培養(yǎng)瓶中。骨髓基質(zhì)細(xì)胞從這些片段中長(zhǎng)出，貼附在培養(yǎng)瓶中，隨后按與其它骨髓基質(zhì)細(xì)胞相同的方法對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行處理。從得自幾個(gè)個(gè)體的原始骨髓中選擇和擴(kuò)展人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，將細(xì)胞擴(kuò)展至至少2×108個(gè)細(xì)胞。
通過(guò)被轉(zhuǎn)染的犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外表達(dá)和分泌人生長(zhǎng)激素為了測(cè)定根據(jù)上述方法培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞是否能被轉(zhuǎn)染，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備質(zhì)粒表達(dá)載體pETKhGH，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犬基質(zhì)細(xì)胞。狗模型是人骨髓系統(tǒng)可以接受的動(dòng)物模型，對(duì)狗研究的結(jié)果可合理地預(yù)測(cè)對(duì)人患者的效力。
由質(zhì)粒pTKGH(Selden等人，1986，分子細(xì)胞生物學(xué)，6:3173-3179)構(gòu)建載體，該質(zhì)粒中含有在HSV胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄控制下的包括內(nèi)含子的人生長(zhǎng)激素(hGH)基因，(NicholsInstituteDiagnostics′,SanJuanCapistrano,CA)。另外，通過(guò)使用pSV(E)-MLP質(zhì)粒的衍生物(Hurwitz等人，1987，核酸研究，15:7137-7153)作為模板的PCR使得自SV40增強(qiáng)子的179個(gè)堿基對(duì)的FokI-PvuⅡ限制性酶切片段的尾部接上HindⅢ位點(diǎn)，并將此片段克隆到緊接TK啟動(dòng)子上游的pTKGH的HindⅢ位點(diǎn)。pETKhGH質(zhì)粒缺乏真核生物的復(fù)制起點(diǎn)，不能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此，此載體只是瞬時(shí)表達(dá)hGH。
通過(guò)使用MBS哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla,CA)的CaPO4-DNA共沉淀法，或者通過(guò)使用LIPOFECTAMINE試劑和OPTI-MEMⅠ減少的-血清培養(yǎng)基(LifeTechnologies)的陽(yáng)離子脂質(zhì)-DNA絡(luò)合物法，根據(jù)廠商的說(shuō)明用pETKhGH轉(zhuǎn)染犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞。使用CaPO4法轉(zhuǎn)染得自狗ALG-3的細(xì)胞，使用脂染法轉(zhuǎn)染得自狗ALG-9的細(xì)胞。在P2時(shí)，當(dāng)細(xì)胞被接種到T150培養(yǎng)瓶之后的第2天，通過(guò)CaPO4法將DNA轉(zhuǎn)染給3.2×104個(gè)細(xì)胞。用150μgpETKhGH質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)，這些細(xì)胞活躍地生長(zhǎng)并表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞-樣的形態(tài)。
在P6時(shí)，當(dāng)細(xì)胞被接種到T150培養(yǎng)瓶之后的第2天，通過(guò)脂染法將DNA轉(zhuǎn)染給1.2×106個(gè)細(xì)胞。與在較早的代中觀察的結(jié)果相比，這些細(xì)胞的生長(zhǎng)速率有所降低，細(xì)胞形態(tài)已有所改變以使細(xì)胞顯得更加平扁和分散。在含有0.24mlLIPOFECTAMINE試劑的總體積為4.28ml的OPTI-MEM中用40μgpETKhGH質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞6小時(shí)。
通過(guò)使用hGH-TGES試劑盒(NicholsInstituteDiagnostics)的放射免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)定hGH的分泌水平。結(jié)果表示成重復(fù)試驗(yàn)測(cè)量結(jié)果的平均值。被表達(dá)質(zhì)粒pETKhGH轉(zhuǎn)染之后，早(P2)和晚(P6)代的犬基質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)和分泌高水平的hGH轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(圖3)。根據(jù)被檢測(cè)的各個(gè)動(dòng)物，細(xì)胞已被傳代的次數(shù)和轉(zhuǎn)染的方法的不同，hGH表達(dá)的絕對(duì)水平也有所不同。
如圖3所示，由狗ALG-3的細(xì)胞表達(dá)的hGH的絕對(duì)水平在大于1至約2.5μg/24小時(shí)/106個(gè)細(xì)胞之間變化。從P6-P7，由狗ALG-9的細(xì)胞表達(dá)的hGH的絕對(duì)水平在接近3至約5μg/24小時(shí)/106個(gè)細(xì)胞之間變化，然后降低至約0.5，在P8和P9時(shí)，分別降低至接近于0。
其它實(shí)施方案在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可在于組織培養(yǎng)中擴(kuò)展之前或之后深低溫保藏骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
為了深低溫保藏骨髓的原始抽取液，使用上述的Ficoll梯度技術(shù)制備成核細(xì)胞，并以例如2-5×107個(gè)細(xì)胞/ml的密度將所述細(xì)胞懸浮于50％的培養(yǎng)基，50％的FBS中。將如900μl的懸浮液的量等分于含有100μlDMSO的小管，如2ml無(wú)菌深低溫管(Corning#25704)中。將小管在-80℃下儲(chǔ)存24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到-150℃的冰箱中或液氮罐中長(zhǎng)期保存。
為了深低溫保藏在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的基質(zhì)細(xì)胞，從組織培養(yǎng)容器中抽取培養(yǎng)基，用Dulbecco氏磷酸緩沖鹽水(Gibco14190-144)將細(xì)胞漂洗一次。然后用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶，0.53mMEDTA；Gibco25300-062)使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶或板的表面脫附。通過(guò)加入等體積的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，在500×g下離心細(xì)胞懸浮液直至細(xì)胞被沉淀，將沉淀下來(lái)的細(xì)胞重新懸浮于例如3ml的培養(yǎng)基中并計(jì)數(shù)。用含有10％二甲基亞砜(DMSO；SigmaD-8779)的培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至1×106個(gè)細(xì)胞/ml。以1ml的體積將細(xì)胞等分于無(wú)菌的深低溫管(Corning#25704)中，立即在-80℃下儲(chǔ)存過(guò)夜，24小時(shí)后，將小管轉(zhuǎn)移到液氮罐或-150℃的冰箱中長(zhǎng)期保存。
也已使方法得以發(fā)展以深低溫保藏大量經(jīng)培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞。例如，按上述收獲細(xì)胞之后，將200ml細(xì)胞懸浮液置于250ml的離心管中，在500×g下離心以沉淀細(xì)胞，將沉淀下來(lái)的細(xì)胞重新懸浮于10-20ml的培養(yǎng)基中并計(jì)數(shù)。然后用培養(yǎng)基將懸浮液的體積加至45ml，并將所得懸浮液用無(wú)菌注射器加入轉(zhuǎn)移包裝容器(BaxterFenwal,4R2001)中，所述注射器上配備有18號(hào)針頭。然后加入5mlDMSO，將此包裝在-80℃下儲(chǔ)存過(guò)夜，24小時(shí)后，將該包裝轉(zhuǎn)移到液氮罐或150℃的冰箱中長(zhǎng)期保存。
應(yīng)理解盡管結(jié)合其詳細(xì)的說(shuō)明書(shū)描述了本發(fā)明，前面的說(shuō)明書(shū)只是為了闡明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍確定。本發(fā)明的其它方面，優(yōu)點(diǎn)和變更在下列權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1．?dāng)U展骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法，該方法包括(a)得到骨髓基質(zhì)細(xì)胞；(b)將基質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)入其內(nèi)表面已被明膠預(yù)包被的容器中，該容器中含有包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“aFGF”)多肽的培養(yǎng)基；和(c)在足以得到增加數(shù)目的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的條件和時(shí)間下，在培養(yǎng)基中擴(kuò)展基質(zhì)細(xì)胞。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中進(jìn)一步地含有至少0.05單位/毫升的肝素多肽。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)基含有1.0-50.0％體積百分比的胎牛血清，0.01-100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100單位/毫升的肝素多肽。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述培養(yǎng)基中包括16.0％體積百分比的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF多肽，和5.0單位/毫升的肝素多肽。
5．權(quán)利要求1的方法，其中明膠是1.0％的明膠水溶液。
6．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在導(dǎo)入骨髓基質(zhì)細(xì)胞之前，用胎牛血清另外預(yù)包被容器的內(nèi)表面。
7．權(quán)利要求1的方法，其中擴(kuò)展步驟(c)包括步驟(ⅰ)從容器中除去培養(yǎng)基和非貼壁的細(xì)胞；(ⅱ)在容器中加入一定量的新鮮培養(yǎng)基；(ⅲ)從容器中除去培養(yǎng)基和非貼壁的細(xì)胞，離心所述培養(yǎng)基和非貼壁的細(xì)胞以形成非貼壁細(xì)胞的沉淀物；(ⅳ)將非貼壁細(xì)胞的沉淀物重新懸浮于取自容器的一定量的培養(yǎng)基中以形成非貼壁細(xì)胞的混合物；和(ⅴ)將非貼壁細(xì)胞的混合物返回容器中。
8．權(quán)利要求7的方法，其中步驟(ⅱ)中的新鮮培養(yǎng)基的量和步驟(ⅳ)中取自容器以重新懸浮非貼壁細(xì)胞沉淀物的培養(yǎng)基的量相等。
9．權(quán)利要求7的方法，其中當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞已貼附于容器的內(nèi)表面之后進(jìn)行步驟(ⅰ)。
10．權(quán)利要求7的方法，其中在步驟(ⅰ)之后約1周進(jìn)行步驟(ⅱ)和步驟(ⅲ)。
11．權(quán)利要求1的方法，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞是得自脊椎動(dòng)物之骨髓原始抽吸液的新鮮的基質(zhì)細(xì)胞。
12．權(quán)利要求1的方法，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞得自取自脊椎動(dòng)物的骨。
13．權(quán)利要求1的方法，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞得自骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物或骨髓基質(zhì)細(xì)胞的冷凍貯存物。
14．權(quán)利要求1的方法，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的。
15．權(quán)利要求14的方法，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞是人的。
16．權(quán)利要求14的方法，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞是犬的。
17．完全的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，它包括大于12.5％體積百分比的胎牛血清，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“aFGF”)多肽，和肝素多肽。
18．權(quán)利要求17的培養(yǎng)基，包括12.6-50％體積百分比的胎牛血清，0.01-100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100單位/毫升的肝素多肽。
19．權(quán)利要求17的培養(yǎng)基，包括16.0％體積百分比的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF，和5.0單位/毫升的肝素。
20．權(quán)利要求17的培養(yǎng)基，進(jìn)一步地包括殺真菌劑和一種或多種抗生素。
21．權(quán)利要求20的培養(yǎng)基，其中殺真菌劑是濃度為25μg/ml的兩性霉素B，一種或多種抗生素包括25μg/ml的慶大霉素，100單位/毫升的青霉素和100μg/ml的硫酸鏈霉素。
22．選擇和擴(kuò)展骨髓基質(zhì)細(xì)胞的試劑盒，此試劑盒包括(a)其內(nèi)表面被明膠包被的培養(yǎng)容器，和(b)含有aFGF多肽和肝素多肽的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于選擇和擴(kuò)展骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法,此方法包括的步驟有:得到骨髓基質(zhì)細(xì)胞,將基質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)入其內(nèi)壁已被明膠預(yù)包被的容器中,該容器中含有包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“aFGF”)多肽的培養(yǎng)基,和在足以得到增加數(shù)目的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的條件和時(shí)間下,在培養(yǎng)基中擴(kuò)展基質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)基中另外可包括肝素,容器另外可被胎牛血清預(yù)包被。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1209836SQ95198024
公開(kāi)日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1995年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月29日
發(fā)明者喬爾·S·格林伯格, 戴維·R·赫維茨 申請(qǐng)人:阿爾格公司